Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компактизация хроматиновых фибрилл, различающихся длиной линкерной ДНК

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Компактизация хроматиновых фибрилл, различающихся длиной линкерной ДНК"

Г6 од

российская академия наук институт цитологии

На правах рукописи

КАРПОВА

Елена Владиленовна

КОМПАКТИЗАЦИЯ ХРОМАТИНОВЫХ ФИБРИЛЛ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ДЛИНОЙ ЛИНКЕРНОЙ ДНК

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

А ВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

санкт-петербург

1993

Работа выполнена в лаборатории биохимических основ репродукции клеток института цитологии Российской академии наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. И. Воробьев; кандидат физико-математических наук Т. Н. Осипова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. Н. Борхсе-ниус; доктор биологических наук В. Л. Карпов.

Ведущее учреждение — Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета.

Защита состоится « $Ьч> ЦЦО-РС-'О- 1993 г. в <3 часов

на заседании Специализированного совета Д.002.03.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан 1993 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. В , инторФазных ядрах эукариотических леток ДНК находится в составе сложного нуклеопротевдного омплекса, называемого хроматином. В последние годы взгляд на роматин, как на структуру• обеспечивающую компактную упаковку данной заряженной молекулы ДНК внутри клеточного ядра, сменяется ризнанием его активной роли в сложном процессе управления Иффвренциальнои экспрессией генома (Elgin, 1<?90¡ Feisenfeid,

972).

Говоря о структуре хроматина, традиционно выделяют три уровня го структурной организации: нуклеосомныя. наднуклеосомныа хроматиновая Фибрилла диаметром 30 нм) и петлевой. 30-нм .Фибрилла редставляет собой структурное состояние основной массы хроматина а протяжении большей части клеточного цикла. Несмотря на чевиднуга важность этоя структуры ' и на десятилетия интенсивных сследования в этоя области, до сих пор не сформировались общие редставления о способе её организации. Свидетельством далёкой от кончательного разрешения ситуации является одновременное уществование множества моделей наднуклеосомноя структуры роматина twidom, 1989). а общим для всех моделея недостатком вляется отсутствие связи с проблемами Функционирования хроматина, этя имеются данные в- пользу того, что именно на этом уровне адается активное или репрессированное состояние определённой

ЗСТИ.генома (Weintraub, 19В5; Wolffe and Brown, 1788; Kamakaka id Thomas, 1990).

Большинство дискуссионных моментов, касающихся эднуклеосомноя структуры хроматина в тоя или иной степени связаны влиянием длины межнуклеосомноя (линкерной) ДНК на параметры фуктуры, а также с выяснением её точной траектории в составе Э-нм Фибриллы. Поэтому сравнительные исследования препаратов эоматина, различающихся длиной линкерной ДНК, представляют собой тодотворный подход к проблеме высшей структуры хроматина.

Известно, что наблюдается обратная корреляция между длиной шкернои ДНК и уровнем транскрипционной активности. Такие данные >лучены как для тотальных :препаратов хроматина (Morris, i97¿), ж и'для индивидуальных генов, принадлежащих одному, и. тому же ШУ ПДер (Vil Ipponteau et al., 1992). ЭТО ДЭбТ ВОЗМОЖНОСТЬ 5язать структурные. изменения, вносимые этим параметром, с смежными Функциональными последствиями таких изменения.-

Цели и задачи исследования. Цель предлагаемой работа состояла в том," чтобы выявить особенности, вносимые изменением длины линкернои ДНК в процесс Формирования и характер наднуклеосомной структуры хроматина. Для её осуществления помимо классического объекта - хроматина тимуса крысы, были выбраны экстремальные по данному параметру варианты:- хроматин нейронов больших полушарий мозга голубя с одной из самых коротких линкерных ДНК, а также хроматин сгармиев морского ежа, характеризующийся самоа длинной из наблюдавшихся линкерных ДНК.

В соответствии с далью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Методом скоростной седиментации изучить процесс компактизации олигонуклеосомных Фрагментов хроматина трех указанных типов, индуцируемый увеличением ионной силы раствора (традиционно используемый при исследованиях m vitra . аналог процесса конденсации-декондансации хромагиновых Фибрилл).

2. Применяя модельные расчёты для анализа полученных седиментационных данных, . оценить структурные. параметры олигонуклеосомных Фибрилл различных типов и характер их изменений при зависимой от ионной силы компактизации.

¿1 3. Исследовать процесс образования специфических ассоциатов, характерный для части олигонуклеосомных Фрагментов компактного реппрессированного хроматина спермиев морского ежа.

Научная новизна и научно-практическая ценность рабовц.

Показано, что длина линкерноя ДНК не является лимигтирующим1 Фактором при зависимой от ионной силы конденсации олигонуклеосомных Фрагментов хроматина. Имеются механизмы, позволяющие преодолеть ограничения, связанные как .с ' очень коротким, так л с очень длинным линкером. ' ..

Анализ . динамики - расчитанных структурных параметров олигонуклеосомных Фрагментов- хроматина на различных этапах, компактизации позволил: 1. предложить модели структуры ' хроматиновон Фибриллы в растворах низкой и высокой ионной силы;.

Z. подучить информации о механизме Формирования наднуклеосомной • структур« хроматина. * •

. Показано, что в растворе низкой ; ионной силы .структура рлигонуклеосомной цепи соответствует модели расположения нуклеосом в виде .пространственного зигзага. . При зтом впервые' продемонстрирована возможность изгибания линкерной ДНК различной

ДЛИНЫ (Osipova et al-, 1770). ВГОСЛЭДОТВИИ ЭТО бЫЛО П0Д1^врЖДЭН0

данными других авторов (Уао et.al., 1790).

Изогнутое или свёрнутое в петло состояние линкерноя ДНК сохраняется на всех этапах компактизации хроматина и представляется важным для его Функционирования. Предложенная модель высшей структуры хроматина представляет собой двухстартовую двойную суперспираль с расположенными внутри петлями линкерной ДНК. Данная модель позволяет преодолеть ряд трудностей других типов моделей.

Впервые обнаружено и исследовано явление специфической ассоциации части олигонуклеосомных Фрагментов хроматина спврмиэв морского ежа, наблюдающееся в растворах низкой ионной, силы и сопровождающее процесс их компактизации. До сих пор подобное явление было известно только для хроматиновых Фибрилл из ядер терминально дифференцированных клеток эритроцитов цыпленка, содержащих гены, не экспрессиругащиеся в данном типе клеток

(Weintraub, 1704; Grigoryev et al., 1771). Сопоставление СВОЙСТВ

этих двух типов ассоциатов позволяет рассматривать это свойство в качестве отличительного признака структуры хроматина необратимо репрессированной части генома, характерной для состояния терминальной дифференцировки.

Полученные данные углубляют понимание способа организации структуры хроматиновоя Фибриллы и механизмов процесса конденсации-денонденсации хроматина, а также уточняют наши представления о структурно-Функциональных взаимоотношениях в хроматине.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на i Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на симпозиуме "Ядерные белки и -экспрессия генома" (Канев, 1983), на viii (Цущино, 1984) и IX (Черноголовка, 1987) Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра", на симпозиуме с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985), на vi Всесоюзном симпозиуме по «информационным ' изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), на vi конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1988), на ш конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Армянской ССР (Ереван, 1988), на viii двухстороннем симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция "активности, генов" (Иркутск, 1989), на и двухстороннем симпозиуме СССР-США•"Структура зукариотического генома и -регуляция

его экспрессии" (Тбилиси, 1989), на Международном симпозиум! "Структура и функции клеточного ядра" • (Суздаль, 1989), на VI Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетически: процессов" (Москва, 1990), на VIII международном биореологическо! конгрессе (Токио, 1992) а также на научной конференции молода учёных Института цитологии АН СССР (1987) и на семинарах Институт; цитологии РАН.

Публикации. По тема диссертации опубликовано 7 статей. Объём работы. Диссертация изложена на стр. машинописное текста и состоит из введения, обзора литературы, отшеанш материалов и методов исследования, результатов . и обсуждени? собственных исследований, выводов и списка.литературы, содержащего названий. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение растворимого хроматина и препаратов олигонуклеосом. Процедуры приготовления хроматина из различных типов • клеток различались в части выделения ядер. Ядра нейронов больших полушарии мозга беспородных голубев получали согласно методу (Tompson, 1973), ядра тимоцитов белых беспородных крыс - согласно процедуре (Поспелов и др., 1977),. ядра спермиев морского едаа

Strongylotentrotus intermedius (ЯПОНСКОе Море) - КЭК . ОПИСЭНО В рабОТЭ (Zalenskaya et al..1981).

Осадок ядер подвергали гидролизу микрококковои нуклеазой в буфере (0.25 М сахароза, 10 мМ Трис-нса pH 7.5, 1 мМ cacii, Q.i мМ pmsf) при 37°С. Реакцию останавливали охлаждением в ледяной бане. Ядерный осадок суспендировали в гипотоническом буфере (5 мМ Трис-нс1 pH 7.5, 4 мМ ЭДТА, O.ImM pmsf) и оставляли на 20-30 мин при 4°С. Супернатант посла низкоскоростного центрифугирования' гидролизата ядер представлял собой растворимую Фракцию хроматина.

Степень гидролиза ядер микрококковои"нуклеазой'контролировали по количеству продуктов гидролиза, растворимых в 0.5 n нею«. Обычно доля кислоторастворимых продуктов не превышала 2S тотальной ДНК ядер. к . ■

Препараты олигонуклеосом получали центрифугированием солюбилизированного хроматина в линейном градиенте коцэнтрации сахарозы (5-20%), приготовленной на Б мМ буфере Трис-HCi pH 7.5, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0.1 мМ pmsf, в роторе sw27 при 4°С в течение 16 час при 250Ю об/мин.

. О размерах и гетерогенности Фрагментов ДНК, выделенных • из Фракций олигонуклеосом, судили по данным электрофореза ДНК в 1.2-2%-ном агарозном геле (uoening, 1967), Средневесовое число нуклеосой в олигояуклеосомах определяли по площадям пиков ДНК на денситограммах агарозных гелей, окрашенных бромистым этидаем и сфотографированных в проходящем ультрафиолетовом свете.

Для определения весового соотношения белок/ДНК концентрацию ДНК 1сизмеряли 'спекроФотометрически, ' исходя из соотношения Meo =20 для концентрации ДНК 1мг/мл, а концентрацию белка определяли по методу (Hartree, 1972).Электрофорез белков хроматина

проводили В 15% полиакриламицяом геле в системе (Laemmli, 'l970) .

Метод скоростной седиментации. Коэффициент седиментации в определяли да аналитической ультрацентриФуге Фирмы "Beckman", модель Е с использованием ультрафиолетовой оптики. Опыты проводили при комнатной температуре в области концентраций хроматина, соответствующих 0.5-0.6 ед. Azao. Денситометрирование пленок

проводили, на' мйкроденсигометре ИФО-451. Величину коэффициента седиментации определяли по скорости движения середины седиментационной границы, что для полидисперсных систем дает средневесовое значение. Приведение коэффициентов седиментации к стандартным условиям ejow выполняли обычным методом с введением

поправки' на вязкость и плотность растворителя. Ионную' силу растворов меняли добавлением к растворам олигонуклеосом раствора

Метод расчета структурных параметров олигонуклеосомйой цепи Ш зависимости величины коэффициента седименташиот числа субъединиц в не пи. Для жестких и полужестких полимерных цепей существуют теории, описывающие зависимость коэффициента седиментации цепи v от ее молекулярного веса, аппроксимируя

полимерную цепь, так называемой, червеобразной цепью или цилиндром. Осиповся Т.Н.. было предложено применить модельные теоретические расчёты для анализа полученных • нами экспериментальных зависимостей s°o от числа нукдеосом в Цепи <п)

(Осипова, 1980; osipova, 19в7). При этом предполагается, что короткие олигонуклеосомные Фрагменты представляют собой жёсткие цепи, и их гидродинамические свойства могут быть аппроксимированы эквивалентным толстым цилиндром. Этот подход позволяет рассчитать такие структурные параметры Фибриллы, как её диаметр и массу единицы длины.

Зависимость s°ou от числа субъединиц в цэпи для цилиндров, .состоящих из ñ субъединиц с молекулярной массой Мо, мотет быть представлена в следующем виде:

М (l-vp ) _ lo

S = — -(ln n +• ln — + y) ,

20.V bl .

N Зтг r> d

_ A 'o

itue v - удельный парциальный объем, po и no - плотность и вязкость

растворителя, na - число Авогадро,. Мо - молекулярная масса

субъединицы цепи, ML - масса, приходящаяся на единицу длины цепи,

i'o= j¡p - длина цепи, приходящаяся на субъединицу массой Мо, d -

гидро^цинамический диаметр полимерной цепи, г - параметр, зависящий от соотношения диаметра цепи и ее длины (t.) и имеющий различное выражение в различных гидродинамических теориях.

Показано, что. наилучшее совпадение с экспериментальными результатами дает применение теории Tirado-de la Torre (1977) для модели цилиндра (Osipova, 19в7). в рамках этой теории- параметр г можно принять постоянным в ограниченной области отношений L/d. Тогда зависимость s°o от in п будет представлять собой прямую,

тангенс угла наклона которой, позволяет определить массу на единицу длины и длину участка цепи, приходящегося на нуклбосому, а

координата точки пересечения с осью . ординат - величину

- ь -

гидродинамического диаметра цепи. Такой подход позволяет расчитать величины Мь и 1о более точно-, чем диаметр. Для уточнения значения

«1, зависящие друг от друга величины «1 и г определялись методом последовательных приближений, причем каждое последующее значение г принималось за константу.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика состава растворимого хроматина нейронов болши ПО-ТОРИЙ. козта ГРЛУРя. ТИМОВДТО.В . крысы И спермиев морского ежа. Сравнительный состав трех типов • хроматина, исследованных в данной работе представлен в таблице 1.

Таблица

Сравнительный состав растворимого хроматина нейронов больших полушарий мозга голубя, тимоцитов крысы и спермиев морского ежа

Источник хроматина Величина нуклеосомного повтора (п.н.) Весовое соотношние белок/ ДНК Наличие НГБ Тканеспецифи-ческие модификации гистонов

1 Нейроны больших полушарие мозга голуб? 165-5 1 1.8*0.1 -н- Обеднён: HI - на -18Ж, Н2А - на ЗОЖ за счёт иН2А

2Тимус крысы 198*6 1.3*0.1 ■f ■ соматич.. варианты,

3Спермш морского ежа Btr. int. 1 248-3 1.00-0.05 - аргинин-богатые Ш. (2мол/нукл), Н2В-2подФракции

Примечание: 1. Поспелов и др., 1984.

2. Osipqva et al., 19B0. v .

3. Zalenskaya et al., 1981-1 ОСИПОВЭ И Др., 1990.

Выше отмечалось, что низкая величина нуклеосомного повтора в большинстве' случаев _ коррелирует с высокой транскрипционной активностью хроматина. В нашем , случае такие имеются данные в пользу этого предположения.

Хроматин нейронов мозга голубя помимо очень короткого нуклеосомного повтора", практически совпадающего по величине- с размером Фрагмента ДНК,,необходимого для образования хроматосомы, характеризуется пониженным'содержанием щстонов Н1 и Н2А (ТаблЛ) по'сравнению с нормальным их количеством (1 молекула' Ш и 2. молекулы Н2А на нуклеосому). Часть молекул гистона Н2А. заменяется их убиквштшированной Формой иН2А, которую можно рассматривать в качестве Фактора, препятствующего конденсации, хроматина (м^эи! е!

ai., 1977). Вместе с этим увеличено содержание негйстоновых белков, и в частности, нмб 14 и 17 (Светликова и Поспелов, 1986), что видно также из величины соотношения белок/ДНК, возрастание которой не покрывается простым увеличением массы гистонов при уменьшении нуклеосомного повтора. Все вышеуказанные изменения состава характерны для хроматина активно работающих участков генома. Аналогичные изменения состава хроматина нейронов больших полушарий мозга кролика сопровождаются увеличением размеров ядра.

Которое СТаНОВИТСЯ ПраКТИЧеСКИ ПОЛНОСТЬЮ ЭУХрОМаТПНОВЫМ (Austoker,

1772), à также возрастанием скорости транскрипции и доли транскрибируемой ДНК (Thomas and Tompson, 1777).

Противоположные процессы протекают в ходе сперматогенеза. Постепенное уменьшение размеров ядра - и увеличение доли гетерохроматиновых областей завершается его полной инактивацией. в спермиях морского ежа Strpgylocentrotus lntermedlus ЭТО достигается заменой соматических гистонов HI и Н2В на их

СПерМИЙСГОЦИФИЧвСКИе варианты (Zalenskaya and Zalensky, 1980). ОНИ

обогащепы аргинином и характеризуются более длинной полипептидной цепью по сравнению с' соответствующими соматическими гистонами. Удлиннение цепи происходит за счет повторяющихся вставок типа

Ser-Pro-Lys(flrg)-Lys(flrg) В N-КОНЦОВЫХ ДОМеНЭХ ОбОИХ ТИПОВ ГИСТОНОВ И в С-Концевом домене ГИСТОНЭ HI (Van-Hal t et al., 1777). Так как в хроматине спемиев морского ежа практически . нет негистоновых белков, то величина отношения белок/ДНК равная 1.00 указывает на повышенное содержание гистона HI, что было обнаружено также ДЛЯ другого вида морских ежей (Echinus esculentis) (Thomas et ai., 19B6) . Наши оценки дают величину 2 молекулы HI на нуклеосому. Эта величина вполне ' соответствует имеющимся в литературе оценкам количества лизин-богатых гистонов в компактном неактивном хроматине (эритроциты дапдёнка), имеющим разброс от 1.3 ДО 2.4 молекул на нуклеосому (van Holde, 19ВЗ).

Хроматин тимуса крысы занимает промежуточное положение менщу этими двумя экстремальными вариантами. Он представляет собой пример умеренно конденсированного, умеренно активного хроматина дифференцированных соматических клеток. Его величина нуклеосомного повтора- (около 200 п.н.) и содержание гистона HI (1 молекула на нуклеосому) принадлежат к разряду наиболее часто встречающихся в различных' типах клеток.

Sia,w (S)

ЬО 70 60

50 40

30

.20

10

ть

: pbn__яг

sus а

•f5.fi V2.5

8.0

5.2

---3.2

2.0

1к0

15/9 12.0

no

6.8

5.9

2.3

1.0

8Л 7.7

6.7 6.0

W"

. '3.5

2.5

f.0

25 «5 65 85

Рис. 1 Зависимость коаффициентоа седиментации '(s ) от ионной'

ZO.V

силы раствора (I) для олигонуклеосомных Фрагментов хроматина нейронов мозга голубя <PBN), тимуса крысы (RT и сг^рмиев морского.ежа (SUS). Размер, фрагментов хроматина, выраженный в виде средневесового числа нухлеосом в цепи (п), представлен в правой части рисунка.

Компактизания различных типов олигояуклеосом при увеличении ионной сиш раствора. Способность компактизоваться при увеличении ионной силы является одним из типичных свойств изолированных Фрагментов хроматина. Неизвестно, сколь Физиологичен этот процесс, однако совпадение структурных параметров Фибрилл ядерного хроматина.и выделенных ксмпактизовавшихся Фрагментов'при близких к Физиологическим значениях ионной силы может указывать на соответствие этих структур. Возможно, реально происходящие процессы локального сворачивания-разворачивания хроматина реализуются подобным образом за счёт локальных изменений концентрация различных катионов. Поэтому представляется интересным сравнить способности к компактизации у хроматинов с различной длиной линкерной ДНК.

На рис.1 в двойном, логарифмическом масштабе представлены зависимости коэффициентов седиментации (зго ^ олигонуклеосомных . Фрагментов хроматина трёх типов от ионной силы раствора. Прежде всего, необходимо отметить сходный характер процесса компактизации для всех типов • исследованного хроматина, несмотря на" большие различия в длинах линкерной ' ДНК. Седиментационное поведение олигонуклеосом определяется длиной их цепи, выраженной в Форме средневесового числа нуклеосом в цепи (п).

Фрагменты хроматина, содержащие ■ менее 6 нуклеосом демонстрируют слабую зависимость коэффициента седиментации от ионной силы. Некоторое возрастание коэффициента седиментации наблюдается лишь при изменении Ионной силы от Б до 25 мМ. Оно может быть связано с дополнительной закруткой части линкерной ДНК вокруг гисгонового кора вплоть до, образования хроматосомы. В пользу этого предположения свидетельствуют данные по круговому дахроизму (Поспелов и др., 1984), а также проведенные нами расчёты параметров хроматиновой Фибриллы <см_ ниже). Постоянство величины коэффициента седиментации, при дальнейшем увеличении ионной силы указывает на неспособность таких коротких Фрагментов к образованию какои-лио'о структуры высшего порядка.

Кооперативное изменение характера компактизации наблюдаются для. олигомэров, содержащих".более шести нуклеосом. В этом случае . седиментациояный коэффициент демонстрирует степенную зависимость от ионной силы: « 1°. причём величина показателя степени а (наклон прямой на рис.и , характеризующего степень компактности макромолекул, одинакова для всех типов хроматина 'и . равна

0.09*0.01. Дальнейшее, одинаковое для всех видов хроматина, 'значительное увеличение степени компактности имеет место для Фрагментов размером более 10-12 нунлеосом и проявляется как возрастание показателя степени а до величины 0.14*0.01.

Следует отметить, что представленные седиментационные данные хорошо согласуются с аналогичными результатами других авторов

(Butler and Thomas, 1980; Pearson et al., 1983; Thomas et al.,

19B6). Указанные ' выше изменения седимёнтационных свойств олигонуклеосоМ связаны с их способностью к Формированию структур высшего порядка.

С целью получения более детальной информации о характере изменения структуры хроматина при индуцируемой ионной силон : конденсации седиментационные данные были использованы для расчета следующих структурных параметров хроматиновой Фибриллы: массы единицы длины цепи <ML>; длины цепи, приходящейся в среднем на одну нуклеосому <io>; гидродинамического диаметра цепи (di и степени упаковки ДНК (/), равной отношению длины ДНК' полной вуклеосомы к величине i и. характеризующей ' степень сокращения линейных размеров ДНК в составе хроматиновой Фибриллы. Результаты расчётов,' проведенных, по крайней мере, по досяги сериям измерений для каждого типа хроматина, представлены в таблице 2.' Полученные . параметры были использованы для построения моделей укладки ДНК . в хроматиновой Фибрилле, а также для "выяснения механизмов ее конденсации при увеличении ионной силы.

Прежде всего, обращает на себя внимание прогрессивное" возрастание степени упаковки ДНК в хроматине рз различных источников в ряду нейроны мозга голубя - тимус крысы - спермин морского ежа, коррелирующее с .ростом компактности ядер и длины линкерной ДНКк и находящееся в обратной зависимости от уровня транскрипционной активности ядер. При этом неизменной и практически одинаковой ,дпя 'всех типов хроматина оказывается величина гидродинамического диаметра хроматиновой Фибриллы. Эта ' корреляция сохраняется на всех этапах конденсации хроматина ,• происходящей при увеличении ионной силы. Более низкая степень упаковки «ДНК в хроматине .с коротким линкером при сохранении величины гидродинамического диаметра цепи свидетельствует о её • мавдэ плотвой укладке в структуре хроматиновой Фибриллы, а следовательно, о её большей доступности для взаимодействий с различными лигандами,' и в частности,- с Факторами, обеспечивающими

кспрессию генов. Возможно, именно этим объясняется тенденция к нижению величины нуклэосомного повтора в активно ранскрийирующихся генах (УШеро^еаи а1. , 1992).

Таблица 2х

Структурные параметры олигонуклвосомных Фрагментов хроматина, различающихся длиной линкернси ДНК, при различных ионных силах, расчщ-анные на основе модели цилиндра.

[сточник Размер Ионная нъ y io а

роматина линкера, сила, к'о/пш пш _ nm

Ь.р. м

1ейроны 0 .005 25. ,9-1 .3 4. 7±С. 3 11 .8—0. ,7 19—5

газга 20 0 .025 40. tii .в 7. 5±0. 3 7 . 5-0. 3 21-5

"олубя 0 .063 47. В^З .4 В. 8—1 ■ 0 6 .4—0 • 7 22-10

0 .005 25. .7 5. Bio. 1 11 3 20-3

"имус крысы 50 0 .025 42. о±2 .3 9. з±о. 5 7 .1±0. 4 22-7

• 0 .065 49- 4-3 .5' 11. 0-0. в 6 .1-0. 4 22-7

Зпермии 0 .005 31. + 4-0 .4 8. 0-0. 2 10 , 6—0 . 2 22-2

юрского 100 о .025 зв. 7-0 .5 9. В—О'. 2 0 .6±0. 2 21-2

)жа 0 .065 49. в-о .9 12. б±о. 4 6 • 7—0. 2 20-2

Мы рассматривали полученные • значения гидродинамического циаметра и средней длины цепи, приходящейся на нуклеосому, с точки зрения их соответствия различным вариаптам укладки цепи нуклеосом. Пля этого использовали известные размеры нуклоосомной коровой истины (ДИЗМОТр диска Ним, высота 5.Сям) (Richmond at л!., L904), одинаковые для всох типов хроматина. Величины d (20-22нм) и i (изменяется от 11 до 7 нм), хорошо согласуются с- моделью расположения нуклеосом в виде трехмерного зигзага (рис.2). По цанным электронной микроскопии, такая структура характерна для кроматиповых Фибрилл в условиях низкой ионной силы при условии адекватного способа приготовления препаратов (Thome et ai., 1979).

Цепь олиголуклеосом тимуса, имеющих относительно длинный

линкер, монет быть уложена в такую структуру, независимо от того, как ориентированы коры нуклеосом. Ери этом часть линкерной ДНК (пс 10 п.н. с каждой стороны) закручена вокруг гистонового октамерг так, что уже в условиях низкой ионной силы замкнуты два витка ДНИ хроматосомы (Simpson, 1978). Оставшаяся часть линкерной ДНК (околс 30 п.н.) развернута в растворе низкой ионной силы, аогласнс значению io=ll.B нм, а при увеличении ионной силы до 25 мК частично сворачивается do=7.1 нм>, образуя петлю или изгиб.

Для олигонуклеосом мозга, имеющих очень короткий линкер, необходимо предположить, что в условиях низкой ионной силы (5 мМ) линкерная ДНК, а может быть, также и небольшие наружные участку коровой ДНК, полностью развернуты оо=11.а нм). При увеличении ионной силы происходит ее частичное наворачивание на окггамер, однако не происходит замыкание второго витка ДНК и образование хроматосомы. Это предположение подтверждается данными кругового дихроизма (Поспелов и др., 1984j Рамм и др., 1986).

Что касается хроматина спермиев морского ежа, то оставшаяся после образования хроматосомы часть линкерной ДНК (около 80 п.н.) не может быть полностью развернута в условиях низкой ионной' силы, как это,'по-видимому, имеет место в' случае хроматина . тимуса, а должна быть свернута в виде петли, чтобы обеспечить сближение соседних нуклеосом до 1о=10.6 нм (рис.2). При увеличении ионной силы до 25 мМ уменьшается расстояние между соседними нуклеойомами без значительного изменения диаметра цепи, что указывает на дополнительное сворачивание петли линкерной ДНК.

Таким образом, первый этап комрактизации нуклеосомных Фибрилл, происходящий при возрастании'ионной силы от Б до .25 мМ, для ■ всех трех типов исследоваяого хроматина , связан ' с наворачиванием на октамер части линкерной ДНК и с Формированием изгиба или пвтли из её оставшейся части. Именно на атом этапе происходит основное сближение соседних нуклеосом (табл. 2). Этот процесс происходит в рамках структуры пространственного зигзага к ' не сопровождается Формированием какой-либо высшей структуры.

Мы предполагаем, что сворачивание линкерной ДНК различной длины моцет осуществляться, благодаря вариабельности специфических •свойств гистонов семейства HI, а также концевых доменов, гистоное

Н2А И Н2В (Von—Holt et а 1. , 1979). В ПОЛЬЗУ ЭТОГО ПрвДПОЛОЖбНЩ

свидетельствуют.недавние данные о том, что •коровые' гистоны е отсутствие HI способны компактизовать динуклеосомы, то есть

полушириной ОКОЛО 30 п.H. (Lohr Ht al., 1777; Strauss and Prune 1, 1ЧВ2), в регулярную структуру высшего порядка. Это является трудноразрешимой проблемой для всех типов моделей с растянутым

линкером (Staynov, 19ВЗ; Woodcock et al., 1984¡ Bardas et al., 1936; Williams et al., 1986). ВО-ВТОрЫХ, ИЗОГНУТЫЙ ЛИНКер М0Ж6Т

обеспечивать свободу, необходимую для локального разворачивания структуры хроматина, происходящего при взаимодействии с рядом транскрипционных Факторов и обеспечивающего эффективную инициацию транскрипции (Beato, 1990; Hayes and Wol-ffe, 1992).

Таким образом, для всех типов исследованного хроматина общий план организации 30-нм Фибриллы одинаков. По-видимому, ее параметры важны для правильного Функционирования хроматина. Отличия в типе наднуклеосомнои структуры между хроматинами различпой транскрипционной активности наблюдаются в способе укладки изогнутой линкерной ДНК соответствующей длины, чем определяется степень доступности и стабильности образующейся

СТРУКТУРЫ. Изучению ЭТИХ ОТЛИЧИЙ При МаНИЦуЛЯЦИЯХ in vitro с

растворимым хроматином и посвящена следующая часть работы.

Образование специфических ассониатов олигонуклеосомными Фрагментами хроматина спермиев морского ежа. Для проведения опытов по аналитической седиментации мы использовали олигонуклеосомные фрагменты хроматина, полученные при разделении тотального растворимого хроматина в линейном сахарозном градиенте в условиях низкой ионной силы (5 мМ Трие-HCi рН 7.5, 1 мМ ЭДТА).' При изучении' хроматина спермиев морского ежа наблюдается .удивительное явление: на седимэнтограммах помимо компонента, соответствующего по подвижности исследуемому Фрагменту хроматина, присутствует ещй быстро седиментирующий компонент. Типичный пример денситограммы седиментационного опыта, содержащего два . компонента с коэффициентами седиментации 36.7s и 71.1s представлен на рис. 4. Оба компонента наблюдаются во всей исследованной области ионных сил от 5 до ' 85 мМ, при этом их коэффициенты седиментации возрастают от 70s до 180S с повышением ионной силы (рис. 5). Наличие четкой быстро седиментирущей границу и резкое увеличение коэффициента, седиментации быстрого компонента с ростом ионной силы указывает на то, что он представляет собой ассоциат нуклеосом. Как следует из данных, приведенных на рис.'5, ассоциация наблюдается для- .Фрагментов хроматина, содержащих от 2 до . 14 нуклеосом. Д*я Фрагментов' большего размера разделение ассоциата и

- IB -

Рис.

S!1,W

Wh-

160 -

140 -120 -• WO -

so -10 -

u-

Рис. 4 Денснтограмма типичного седи-мептациоиного опыта с олигопуклео-сомной фракцией хроматина спермиев морского ежа, содержащей л = 10,1 нуклеосом в растворе с низкой ионной силой "(0,005). Седиментация — слева направо. Скорость .вращения 29500 об/мин.; интервал между кадрами 4 мин

W

' tl'l

25 15 65 IS /, мМ Рис. 5;

Рис. 5. Зависимость коэффициентов се-димситации от ионной силы раствора: а — олигонуклеосомныс фракции хро-'матина спермиев морского ежа, содержащие указанное число нуклсоссм в псин; б — их ассоциаты

неассоциирующего компонента затруднено. Величина коэффициентов седиментации ассоциатов на зависит от размеров образующих их олигонуклеосомных Фрагментов.

. Подобная ассоциация не наблюдается для других исследовавшихся типов хроматина (хроматин тимуса крысы и хроматин нейронов больших подущарий мозга голубя) ни в низкой ионной силе, ни при ей .повышении вплоть до 85 мМ.

До сих пор подобное явление, но возникающее при более высокой ионной силе (ВО мМ), было известно только для Фрагментов растворимого хроматина из терминально дифференцированных клеток эритроцитов цышйнка (Weintraub,1984; Thomas et al., 19B5J Muyldermans et al., 1985; СПИрИН И Др.» 1988¡ Sriqoryev et al.,

1990). Этот процесс, являющийся, скорее всего, артефактом выделения хроматина, не заслуживал бы большого.внимания, если бы не его связь с необратимой супрессией части генома. Гак Ваинтраубу '(Weintraub, 1984) впервые удалось показать, что способная .к образованию ассоциатов часть растворимого хроматина обогащена генами, не экспрессирующимися в данном типе клеток (ген вителлогенина). Таким образом, интерес к явлению специфической ассоциации вызван тем, что оно может пролить свет на особенности структуры необратимо репрессированной части генома.

Необычайная стабильность ассоциатов. На ' электрофорезе ДНК, выделенной из Фракций олигонуклеосом спермиев морского ежа; во всех образцах наряду с ДНК, соответствующего размера,.видна также полоса с низкой электроФоретической подвижностью. После традиционной ' процедуры депротеинизации ДНК, включающей обработку проназой, Фенолом и смесью хлороформа с изоамиловым спиртом. .(Маниатис и' др., 1984), высокомолекулярный компонент ДНК не исчезает. Вероятно, ассоциаты образуются за счёт очень прочных связей,. которые не разрушаются при выделении ДНК обычными методами.

Задача разрушения ДНК-белковых взаимодействии,' обеспечивающих • объединение- нескольких Фрагментов хроматина спермиев морского ежа В асссоциат, оказалась очень непростой. Традиционные способы разрушения ДНК-гастоновых взаимодействий, имеющих в основном ионную природу- повышение ионной силы до 2. M Nací, также как и её понижение до 0.2 мМ ЭДТА оказались малоэффективными в данном случае. ' -

Тогда был применен способ, описанный для некоторых ядерных белков, прочно связанных С ДНК (A1 tier! et al., 1986) , совместное воздействие нескольких Факторов. Ассоциаты наносились на градиент сахарозы (5-20Ж), содержавший 3 М Naci,' 4 м гуанидан гвдрохлорид и 5 И мочевину. В этих условиях происходит почти полное разрушение ассоциата -на составляющие его Фрагменты ДНК. Другим способом разрушения .ассоциатов является электрофорез ДНК, выделенной по традиционной методике, .в денатурирующих условиях (30-50 мМ маон) Представляется, что в щелочной среде развал ассоциатов происходит не столько за счет денатурации ДНК, сколько благодаря тому, тго лизин и аргинин, играющие основную роль в ДНК-гистоновых взаимодействиях, находятся при значениях рН выше своей изозлектрической точки.

На поддающиеся разрушению ДНК-полипептидйЫе комплексы были обнаружены при изучений тандемно повторённых тетрапептидов < sei Рго-Lys/flrg-Lys/Arg) s, выделенных из С-концевого домена гистона sHl спермиев морского ежа (Suzuki,519В9). Автор считает, что взаимодействие таких тетрапептидов с ДНК представляет собой новый тип очень прочных ДНК-белковых взаимодействий, необходимых для осуществления очень компактной и стабильной упаковки ДНК в спермиях. Разрушение подобных взаимодействий и деконденсация хроматина. происходит только после оплодотворения. В цитоплазме Яйцеклеток морского ежа тем же автором была обнаружена особая 'протеаза, специфическая по - отношению к данной аминокислотной последовательности (Suzuki et д!., i<?90), .выполняющая эту функцию. По-видимому,' обнаруженные нами ассоциаты являются проявлением именно такого типэьвзаидадействия в хроматине спермиев морского, ежа.

Механизм образования ассоциатов. При сравнении величины Фрагментов ДНК,-., из- ассоциирующей и неассоциирующей части олигонуклеосомных Фрагментов хроматина спермиев морского ежа, 'обращает на себя внимание некоторый сдвиг между соответствующими полосами нуклеосомной ■ лестнщда. Неассоциирующие Фрагменты ДНК несколько короче ассоциирующих без изменения величины нуклеосомного повтора. То есть, Фрагмента хроматина, способные к ассоциации имеют несколько удлинённый концевой линкерный участок. Сравнение неассоциировавшей ДНК с тотальным растворимым хроматином обнаруживает такой же сдвиг. Следовательно, концевой линкерный участок у неассоциирующих Фрагментов ДНК утерян в ходе выделения

хроматина, что может свидетельствовать о его меньшей защищённости в составе хроматиновои структуры.

Мы провели также тщательное сравнение белкового состава ассоциагов и неассощшрущего хроматина путём электрофореза в системе Лэммли (Laemmii, 1970), денмггометрирования и статистической обработки результатов. Наши данные свидетельствуют о том,'что содержание гистона HI в ассоциатах приблизительно на 20-3056 выше, чем в не ассоциирующих олигонуклеосомах.

Таким образом, по-видимому, эти два Фактора: сохранение ' длинного, интактного концевого линкера и расположенного на нём гистона (или гистонов, так как мы предполагаем в хроматине спермиев морского ежа две молекулы гистона sHl на нуклеосому), в совокупности со специфическими свойствами гистона HI из спермиев •морского ежа, - играют решающую роль в образовании ассоциатов, способствуя "сшиванию" нескольких Фрагментов хроматина. Если это, действительно так, ' то увеличение степени гидролиза ядер микрококковой нуклеазой при выделении хроматина должно приводить к уменьшению доли ассоциирующих Фрагментов хроматина вплоть до полного их исчезновения. Экспериментальная проверка полностью подтвердила это предположение:' при гидролизе. . до 0,756 кислоторастворимых продуктов доля ассоциатов составляет около 40Ж; при увеличении степени гидролиза до 1.456 эта величина падает более, чем вдвое; а при 3-4Ж кислоторастворимых продуктов ассоциация практически не наблюдается.

Именно такой механизм образования гомогенных. ассоциатов наблюдался нами при сравнительном исследовании олигонуклеосомных Фрагментов хроматина эритроцитов голубя, полученных путём ограниченного гидролиза ядер микрококковой нуклеазой и ДНКазои i, При достаточно высоких уровнях гидролиза (7-1ОЖ) только олйгомеры ■ нуклёосом, полученных с помощью ДНКазы i, обладают способностью к ассоциации при 65 мМ. Это объясняется спецификой действия ДНКазы г, которая не имеет предпочтения к линкерной ДНК, а атакует.участки, отстоящие на 20 п.н. от обоих концов коровой ДНК

(Pospelov and Svetlifcova, 1962). ПОЭТОМУ ЧЭСТЬ Образующихся

Фрагментов хроматина имеют удлинненныи концевой участок ДНК за счёт собственного- линкера' и небольшого участка коровой ДНК соседней нуклёосомы. и сохраняет- на нём интактное расположение линкерных гистонов. По-видимому, именно эта . часть растворимого хроматина обладает способностью к ассоциации.

Точно такой же механизм определяет образование ассоциатов Фрагментами хроматина ь эритроцитов цыплёнка, обогащенными репрессированными генами (Спирин и др., 1988; Srigoryev et ai.,

. Это позволяет авторам сделать вывод о большей доступности линкерной ДНК в активных, участках хроматина и, следовательно, о более рыхлой наднуклеосомной структуре. /

Образование специфических ассоциатов - отличительное свойство олигонуклеосомных Фрагментов репрессированного хроматина. Уже •неоднократно подчёркивалось сходство свойств наблюдавшихся нами ассоциатов с наблюдавшимися для части, хроматина эритроцитов •цыплёнка, содержащей гены, не экспрессирующиэся в данном тиш клеток (Weintraub, 1784; СПИрИН И Др. , 1988i Grigoryev et al., 1770). ,j '

Результаты, полученные при исследовании . искусственных комплексов гистонов семейства HI с ДНК , на наш взгляд, объясняют механизм образования олигонуклеосомных ассэциатов. Кооперативный характер взаимодействий /гистона EL, с ДНК определяется совместным действием трех факторов: концентрации соли, соотношения - белок/ДНК и ДЛИНЫ фрагмента ДНК (Clark and Thomas, 1786; De Bernardin et ai., 17B6). Поразительно, что при сравнениии различных тканеспецифических вариантов гистона HI (соматический Hi, Н5 и sHl из спермиев морского ежа) по плотности их.распределения по.ДНК при кооперативных взаимодействиях, имеет место корреляция со средними значениями длины линкерной ДНК в ядрах, послуживших источниками ДЛЯ выделения хроматина (Clark and Thomas, 1788). ВарИЭНТЫ линкерных. гистонов, характерные для высоко конденсированного хроматина (Н5 зрелых эритроцитов птиц и sHI спермиев морского . ежа), способны к кооперативным взаимодействиям в составе . ДНК-белковых комплексов уже при ионной силе в 5 мМ, при условии достаточного количества белка вд комплексе, а • их соматические аналоги - только при 35 мМ, причём последние комплексы гораздо менее стабильны (CJijrk and Thomas, 17В8).

Таким образом, общность механизма образования ассоциатов олигонкулеосомными Фрагментами хроматина двух типов, а также соответствие их свойств•специфическим особенностям соответствующих линкерных гистонов, позволяют представить это явление в качестве характерного признака изолированных Фрагментов неактивного хроматина.

выводу

1. Длина линкерной ДНК нэ является лимитирующим Фактором при зависимой от ионной силы конденсации олигонуклэосомных Фрагментов хроматина. Процесс компактизации всех типов исследованного хроматина имеет сходный характер, несмотря на большие различия в длинах-их лиякерных ДНК. Седиментационное поведение олигонуклеосом всех типов определяется исключительно количеством входящих в их состав нуклеосом.

2. На всех этапах конденсации длина линкерной ДНК определяет степень упаковки ДНК - параметр, характеризующий сокращение линейных размеров ДНК в составе хроматиновои Фибриллы. Более низкая степень упаковки ДНК в хроматине с коротким линкером свидетельствует о её больней доступности для взаимодействий с различными лигандами, и в частности, с Факторами, обеспечивающими экспрессию генов. Возможно, именно этим объясняется тенденция к сокращению длины линкерной ДНК в активно транскрибируемых генах.

3. Показано, что в растворе низкой ионной силы структура олигонуклеосомной цепи соответствует модели расположения нуклеосом в виде, пространственного зигзага. При этом длинная лилкэрная ДНК хроматина спермиев морского ежа может быть изогнута в петлю уже при низкой ионной силы (5 мМ), а более короткий линкер хроматина тимуса крысы может сгибаться при более высокой ионной силе (25 мМ), обеспечивая быстрый переход к двустартовой двойной суперспирали с расположенными внутри участками линкерной ДНК. Последняя предлагается . в ' качестве модели высшей структуры хроматина. •

4. Обнаружена специфическая ассоциация олигонуклеосомных. Фрагментов хроматина спермиев морского ежа, возникающая при'низкой ■ионной силе (5 мМ). До сих пор подобное явление наблюдалось только для необратимо репрессированных генов ядерных эритроцитов птиц. Сопоставление свойств ассоциатов двух типов позволяет рассматривать это свойство в качестве отличительного признака репрессированного хроматина.

5. К образованию ассоциатов способны только те Фрагменты хроматина, которые^ в силу особенностей наднуклеосомной структуры, при.выделении сохраняют интактными концевые . Фрагменты линкерной ДНК-вместе с расположенными на них лшкерны'ми гистонами.

СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Karpova E.V., Osipova T.N., Svetlikova S.B., Pospelov V.«. Hydrodynamic properties of pigeon erythrocyte oligonucleosomes. — Studia biophysica, X9B4, v.101, p.65-66.

2. Т.Н.Осипова, Е.В.Карпова, С.Б.Светликова, А.Н.Кукушкин, В.А.Посшлов. Структура- хроматина- мозга голубя, хI;Седиментационный анализ^компактизации олигонуклеосом. - Мол. биол., 1986, т.20, с.78-85.

3. Т.Н.Осипова, Е.В.Карпова* Е.И.Рамм, С.Б.Светликова, ;В.А.Поспелов. Структурные превращения олигонуклеосом хроматина эритроцитов голубя. - Мол. биол., 1986, т..20, с.853-881.

4. Vorob'ev V.I., Osipova T.N., Karpova E.V., Electrochemical properties of chromatin fiber and higher ordered chromatin structure. - Studia biophysica, 19B9., v.130, p.17-20.

5. Vorob'ev V.I., Karpova E.V., Osipova T.N. Higher order

chromatin structure in transcriptionally active and inactive

cells. - In "Nuclear Structure and FuncticA", ed. by Harris F.R. « . and Zbars'ky Г.В.. 1990, Plenum Press, New York, p.297-300.

6. Осмпова Т.Н.", Карпова E.B., Кондитеров С.В.-, Воробьев В.И. Структура хроматина с длинной линкерной ДНК. - Мол. биол., 1990, т..24, с.69-78.

7. Osipova T.N., Karpova E.V., Vorob'ev V.I. Chromatin higherorder structure: double superhelix formed by zig-zag. shaped nucleosome chain with folded'linker DNft. — J. Biomolecul. Struct, and Dynamics, 1990, v.B', p. 11-22-,

РШ.Ти1.ВЕР.Зак.361.Т2р.ГОО. 14,00.03.