Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиационно-индуцированная трансформация клеток NIH ЗТЗ при трансфекции в них препаратов опухолевой ДНК

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиационно-индуцированная трансформация клеток NIH ЗТЗ при трансфекции в них препаратов опухолевой ДНК"

, .1о ■■ ^ Ч> /МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮПЖ И ОРДЕМ ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. И ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ОСТРОВСКАЯ ЛЮБОВЬ БОРИСОВНА

РАШ1АТШОННО- ИНЛУПИРОВАННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК N1Н ЗТЗ ПРИ ТРАНСФЕКТТКИ В НИХ ПРЕПАРАТОВ ОПУХОЛЕВОЙ лнк

03. 00.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

»Москва - 1932

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук старший научный сотрудник В. Г. Безлепкин

дс-ктор биологических наук, профессор И. И. Пелевина,

доктор биологических наук, профессор Л. А. Носкин

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится " ^ " /^¿¿с&З^&^Я 1992 г. в /5 часов на заседании Специализированного Совета Д 053. 05. 74 в Московском государственном университете им. М. Е Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " / " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

. Колье

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов радиационного канцерогенеза - одна из актуальных задач радиобиологии, так как наиболее часто проявляемым отдаленным последствием действия радиации является возникновение опухолей у животных и человека. На развитие опухоли в организме оказывает влияние целый ряд физиологических факторов,что затрудняет анализ наиболее ранних стадий индукции и развития опухолей. Изучение клеточной трансформации in vitro дает дополнительный экспериментальный подход к пониманию молекулярных механизмов инициации канцерогенеза.

Большинство конечных биологических эффектов радиации на живые клетки является результатом начального молекулярного повреждения, продуцируемого радиацией, и его последующей модуляции репарационными процессами. Хотя при действии ионизирующей радиации повреждаются все клеточные компоненты, считается, что летальный и канцерогенный эффект радиации осуществляется на уровне клеточной ДНК. Предполагается, что пострадиационные изменения в геноме способствуют активации клеточных онкогенов, причем важную роль в этом процессе может играть репарация повреждений ДНК, возникающих при действии радиации. Однако данных, подтверждающих это положение, в литературе недостаточно.

С другой стороны в настоящее время интенсивно ведется поиск веществ, обладающих антимутагенными, антиканцерогенными радиопротекторными свойствами. Среди них одну из главных ролей играют ингибиторы протеаз. Однако механизм их действия пока неизвестен, а сведения об их использовании на клеточном уровне фрагментарны и противоречивы.

К началу нашего исследования прямые данные о взаимосвязи процессов репарации с инициацией трансформации и влиянии ингибиторов протеаз на начальные стадии этого процесса в литературе отсутствовали.

В экспериментальных исследованиях механизмов канцерогенеза весьма плодотворной оказалась модель клеточной трансформации после трансфекции экзогенной ДНК В этой связи изучение роли индуцируемых. гамма-излучением и УФ-светом повреждений ДНК и их репарации в трансформации клеток NIH ЗТЗ при интеграции в fix геном опухолевой ДНК, содержащей онкогены, и влияния ингибиторов протеаз на этот процесс представляется достаточно актуальны)/.

Дель и задачи исследования. 'Основной целью нашей работы было исследование радиационноеиндуцированной трансформации культивируемых клеток 'ШН ЗТЗ при введении в них экзогенной ДНК в зависимости от особенностей функционирования системы репарации ДНК в этих клетках.

Для реализации указанной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

- исследовать количественные закономерности гибели клеток ЗТЗ после гамма- и УФ-облучения и их способность к репарации повреждений ДНК;

- изучить зависимость эффективности трансформации N1Н ЗТЗ препаратами ДНК, выделенными из клеток асцитиой карциномы Эрлиха, от дозы гамма- и УФ-излучения и времени мевду облучением и транс-фекцией;

- выявить изменения в эффективности трансформации ¡теток ЗТЗ опухолевой ДНК при модулировании скорости репарации с помощью ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ).

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей-работе впервые описаны радиобиологические характеристики линии мышиных фибробластов К1Н ЗТЗ. Показано дозо-зависимое повышение числа трансформированных локусов при трансфекции опухолевой ДНК после гамма- и УФ-облучения.

Изучены законохюрности репарации гамма- и УФ-повреждений в клетках ЗТЗ, выявлено наличие преинцизионного этапа эксцизионной репарации, сущностью которого является обеспечение доступа повреждений ДНК для ферментов репарации путем протеолиза белков хроматина При этом ингибитор протеаз СШСФ полностью нивелирует активирующее действие гамма- и УФ-излучения на трансформацию клеток ЗТЗ экзогенной ДНК, содержащей активированные онкогены, что свидетельствует о связи процессов репарации и трансформации в этих ' клетках.

Данные, полученные при выполнении диссертационной работы, имеют важное значение для фундаментальной и прикладной радиобиологии. Результаты данной работы расширяют наши представления- о механизмах функционирования систем репарации в сложно организованных структурах хроматина клеток животных и инициации процесса трансформации. Подученные данные важны для понимания механизма формирования проканцерогенных изменений в геноме клетки и могут найти применение при решении задач модификации радиочувствительности и поиска антиканцерогенов.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на Конференции молодых ученых Научного Центра Биологических Игаедований АН СССР (Пуцпно, 1988) и на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989). Работа в целом апробирована на межлабораторном семинаре в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (1992) и семинаре отдела молекулярных основ семиотики Института биохимии им. А. В. Палладина АН Украины (1991).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, состоящего из 4 глав, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения в Зх главах, а тагаэ заключения, выводов и списка цитированной литературы (317 наименований, из них 264 зарубежные публикации). Работа изложена на 134 стр. , содержит 28 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЕ Работа выполнена на асинхронной культуре минимально трансформированных мышиных фиброблас-тов NIH ЗТЗ. Клетки зыращивали в стеклянных флаконах в среде DMEM с 20 мМ Hepes и с 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в присутствии 80 мкг/мл гентамицина.

Культуру клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) поддерживали перевивкой внутрибркшинно на мышах Balb/c.

Выживаемость клеток после облучения определяли по их клоно-генной способности.

Для изучения трансформации клетки высевали в пластиковые флаконы в среде DMEM с 10% эмбриональной сыворотки. ДНК, выделенную из АКЭ, трансфицировали в клетки NIH ЗТЗ с помощью метода Са-фос-фатной преципитации /Graham, 1973/. В контроле использовали ДНК спермы лосося или преципитат без ДНК. Клетки инкубировали при 37°С и 5Z С02три недели до формирования фокусов трансформации на фоне монослоя нетрансформированных клеток. Частоту трансформации выражали отношением числа фокусов к количеству выживших клеток.

Колонии в агаре получали по методу Macpherson /1973/.

Результаты представлены в виде средних арифметических из 4-6 экспериментов с указанием величин среднеквадратичных отклонений.

Проницаемые клетки. Проницаемость клеточных мембран для нук-леотидов обеспечивалась обработкой гипотоническим буфером /Edwards et а1,1982/. Спермин и спермидин использовали в концентрациях 0,05 мМ и 0,5 мМ соответственно.

Условия облучения. . Для индукции репаративных процессов сус-

пензйю клеток в питательной среде в ледяной бане облучали tf-кван-. тами 60Со (мощность дозы 52,7 Гр/мин.) на установке РХ- $ -30. Для определения клоногенной способности и частоты трансформации облу-

137

чали клеточный монослой на стекле на установке ГУПОС ( Cs., мощность дозы 2,34 Гр/мин.) и после трипсинизации готовили необходимые разведения клеточной суспензии для посева.

УФ-облучение клеток и растворов ДНК проводили в открытых чашках с помощью лампы БУВ-15 (длина волны преимущественно 254 нм) при мощностях дозы 80 Дж/мг/мин. и 141 Дх/мг/тя. соответственно.

Синтез ДНК в клетках ЗТЗ определяли по включению [3Н]-тимидина в их кислотонерастворимые фракции.

Однонитевые разрывы (ОР) в ДНК определяли методом седиментации на градиенте концентрации щелочной сахарозы /Ус Grath,1966/.

Использование ингибиторов. При необходимости инкубацию клеток проводили в среде с добавлением ингибиторов ДНК-полимераз оксимо-чевины (10 м},0, арабинозидцитозина (0,1 мВД и афидиколина (2,5 мкг/мл). Ингибитор сериновых протеаз ФМСФ (1 мМ) растворяли в ди-метилсульфоксиде (ДМСО). Конечная концентрация ДЫСО в питательной среде составляла 1Z.

Препараты ДНК выделяли методом фенольной экстракции из клеток АКЭ. Определение количества ДНК в пробе проводилось по методу Спирина /1958/. Молекулярная масса асцитной ДНК, определенная методом горизонтального электрофореза в агарозном геле, составляла. 6,5х106 Дальтон. При необходимости ДНК разрушали озвучиванием, гидродинамическим способом. В ряде экспериментов использовали ДНК спермы лосося (Sigma).

I. РАДИОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ ШШНЫХ

ФИБРОБЛАСТОВ NIH ЗТЗ

В соответствии с задачей наших исследований, заключающейся в изучении клеточных и молекулярных механизмов индуцированного ра-

диацией канцерогенеза, наше внимание было привлечено к иммортали-

зованной культуре мышиных фибробдастов NIH ЗТЗ, пермиссивной для проявления трансформирующей способности трансфицированной ДНК. В предсужествуюших нашим исследованиям работах данная клеточная модель использовалась преимущественно в качестве реципиента при трансфекции трансформирующих генов из различных опухолевых и нормальных клеток. Поэтому в наших исследованиях мы должны были установить количественные закономерности гибели клеток при действии ионизирующих излучений, уровня их злокачественной трансформации и

оценить их способность к репарации ДНК На рис. 1 представлена до-

зовая кривая выживаемости клеток ЗТЗ, определенной по их клоно-генной способности. Основные параметры кривой выживаемости соответствуют 0о--1,3 Гр^ Е^-5 Гр; 04=5,3 Гр. Сравнительный анализ позволяет отнести клетки N111 ЗТЗ к относительно радиорезистентным культурам. Если согласно №е1ег еЬ а1. /1987/ точка перегиба до-зовой кривой соответствует дозе излучения, при которой происходит насыщение медленной фазы репарации ДНК, то в соответствии с полученными данными, мы можем отнести изучаемую нами линию ЗТЗ к числу клеток с выраженной репарационной потенцией относительно гамма -индуцированных повреждений.

Клоногенная способность клеток ЗТЗ под действием УФ-облуче-ния ингибируется по дозовой характеристике, представленной на рис. 2. И в данном случае характер дозовой кривой отражает выраженную способность клеток к репарации индуцированных в ДНК УФ-повреждений (0о=0,8 Дж/мг; 037 =6,1 Дж/мг; 0ч=5 Дж/мг).'

Факт репарационной полноценности клеточной линии ЗТЗ на основе интерпретации дозопых кривых выживаемости не вызывает сомнений и подтверждается результатами экспериментов с использованием общепринятых молекулярно-биологических подходов (метода седиментации в градиенте концентрации щелочной сахарозы). Сразу после гамма-облучения скорость седиментации ДНК снижалась по сравнению с контролем вследствие образования разрывов. Однако уже через 30

Луи'

Рис.1. Дозовая зависимость выживаемости клеток №Н ЗТЗ после гамма-облучения;

Рис. 2. Дозовая зависимость выживаемости клеток N1Н ЗТЗ после УФ-облучения;

по оси абсцисс - доза облучения (Гр); по-оси ординат-доля выживших клеток.

по оси абсцисс - доза облучения (Дж/мг); по оси ординат - доля выживших клеток.

- б -

минут инкубации происходило восстановление молекулярного веса ДНК в облученных клетках и, соответственно, скорости седиментации.

Следующей нашей задачей было изучение гамма- и индуцированной ДНК-опосредованной трансформации клеток ЗТЗ. Прежде, чем исследовать индуцибельные эффекты гамма- и УФ-излучения, необходимо было оптимизировать условия трансфекции клеток ЗТЗ, а также установить роль активированных онкогенов в эффекте трансформации этих клеток. Для ответа на поставленные вопросы клетки Л1Н ЗТЗ в идентичных условиях трансформировались препаратами ДНК из спермы лосося и выделенными из АКЭ. ДНК АКЭ обладала значительно большей трансформирующей способностью по сравнению с ДНК спермы лосося, вероятно, за счет того, что она содержит активированные онкогены, фрагментация ДНК любым способом: гидродинамическим или ультразвуковым снижала ее трансформирующую способность.

При исследовании трансформирующего эффекта гамма- и УФ-излучения нас интересовали 2 аспекта данной проблемы: 1) частота и дозовая зависимость эффекта трансформации исходной линии ЗТЗ и 2) влияние гамма- и УФ-облучения на трансформацию клеток ЗТЗ после трансфекции в них экзогенной ДНК, выделенной из асцитной карциномы Эрлиха. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 3. Видно, что максимум эффекта отмечается в диапазоне доз насыщения Репарации Юч, определяемых по кривой клоногенной инактивации. Приведенные данные позволяют предполагать, что для реализации трансформирующего потенциала облучения и опухолевой ДНК в клетках

Рис.3. Дозовая зависимость трансформации клеток ШН ЗТЗ * после гамма- (А) и УФ-облучения (Б); 1 - без трансфекции ДНК; 2 - при трансфекции ДНК АКЭ; по оси абсцисс - доза облучения; по оси ординат - частота трансформации в пересчете на выжившие клетки.

ЗТЗ необходим такой уровень поврежденности клеточного генома, который индуцируется излучением в дозах, вызывающих состояние насыщения системы репарации ДНК.

Эффект трансформации при трансфекции в реципиентные клетки экзогенной ДНК обычно объясняют интеграцией в геном генов, экспрессия или регулягорные функции которых меняют клеточный фенотип в сторону опухолевого. Если учесть, что интеграция фрагментов экзогенной ДНК может зависеть от количества инцизионных разрывов и брешей, то в таком случае с уменьшением дозы облучения или увеличением периода времени, отведенного на репарацию, и, следовательно, уменьшения числа повреждений в геноме, можно ожидать снижение эффективности трансформации. Именно такую закономерность мы выявили при трансфекции ДНК в клетки в разные сроки после гамма- и УФ-облучения. На рис.4 видно, что наиболее эффективно клетки трансформировались, если трансфекция опухолевой ДНК в них начиналась не позле 15-ти минут после гамма-облучения, когда радиационных повреждений в геноме еще достаточно много и активно функционируют нуклеазы, полимеразы, лигазы и другие ферменты, входящие в состав репарационных комплексов. Спустя час, когда репарирована большая часть повреждений и через сутки после облучения эффективность трансформации снижается, хотя и остается несколько выше исходного уровня в необлученных клетках, что может свидетельствовать о наличии остаточной медленно репарируемой фракции повреждений.

Й

Рис. 4. Трансформация клеток ЗТЗ при трансфекции препаратов ДНК АКЭ в разные сроки после гамма-облучения в дозе 3 Гр; 1 - спонтанный уровень трансформации; 2 - трансфекция необлученных клеток; 3 - трансфекция через 15 мин. после облучения; 4 -через 60 мин.; 5 - через 6 часов; 6 - через 24 часа; по оси ординат -частота трансформации с учетом выживаемости клеток.

При трансфекции асцитной ДНК в разные сроки после УФ-облуче-ния обнаружен наибольший уровень трансформации при внесении ДНК через 6 часов после облучения (рис.5). Учитывая, что тип повреждений, индуцированный гамма- и УФ-радиацией, и кинетика их репарации существенно отличаются друг от друга, различия в эффектив-

1Cf

3 л

г J, ГП

Рис.5. Трансформация клеток ЗТЗ при трансфекции препаратов ДНК And в разные сроки после УФ-облучения в дозе 6 Дж/мг; 1 - спонтанный уровень трансформации; 2 - УФ-облучение; 3 -трансфекция ДНК в необлученные клетки; 4 - трансфекция через 1 час после облучения; 5 - то же через 3 часа; б -через 6 часов; 7 - через 24 часа; 8 -через 30 часов; по оси ординат - частота трансформации с учетом выживаемости клеток.

ности трансформации при внесении ДНК в различные сроки после облучения можно связать с активностью функционирования в эти сроки системы репарации ДНК в облученных клетках.

Это, безусловно, предполагает тесную взаимосвязь процессов репарации с процессами пострадиационной трансформации.

Прежде, чем обсудить возможный механизм этой взаимосвязи, мы должны были более детально изучить особенности репарационных процессов в данной клеточной популяции.

2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СИСТЕМ РЕПАРАЦИИ ГАММА- И У^ПОВРЕДЦЕНИИ В ДНК КЛЕТОК ЗТЗ Установлено, что уровень внепланового синтеза (ВС) ДНК пропорционален количеству повреждений в геноме и, вероятно, обратно пррпорционален доступности этих повреждений для репарационных комплексов /йагхеу А. I. еЬ а1. ,1982/. Можно полагать, что в условиях насыщения репарации, когда количество повреждений в ДНК значительно превышает число репарационных комплексов, ВС ДНК может быть одним из факторов, определяющих дестабилизацию генома. Вышеизложенное приводит к постановке вопроса о возможной взаимосвязи уровня синтеза ДНК и его типа, определяемых физиологическим состоянием клетки (или клеточной популяции), и эффективности пострадиационной репарации повреждений ДНК в гамма-облученных клетках. В качестве этапа на пути решения этого вопроса мы поставили задачу анализировать особенности репликативного и ВС ДНК в пролифери-рующих и покоящихся клетках N1Н ЗТЗ после гамма-облучения.

Как следует из полученных наш данных, облучение в дозе 50 Гр заметно снижает синтез ДНК в делящихся клетках и индуцирует прирост синтеза в покоящихся клетках. По-видимому, это является следствием подавления инициации репликации ДНК в делящихся клетках и индукции ВС ДНК по местам радиационных повреждений ДНК в

жоящихся клетках. При этом соотношение типов ДНК-полимеразных ливностей в покоящихся и делящихся клетках существенно различа-■ся. Несом -ненно, это вносит специфику в характер пострадиацион-к изменений синтеза ДНК, выявляемых в экспериментах с использо-шием ингибиторов ДНК-полимераз (рис.6).

Рис.6. Действие ингибиторов ДНК-полимераз на синтез ДНК в гамма-облучен-ных делящихся (А) и покоящихся (Б) клетках ЗТЗ. Включение С3Н]-тимидина за 60 мин. регистрировалось в аликво-тах суспензии делящихся и покоящихся клеток 1 - без ингибиторов; 2 - ок-симочевина, 10 мМ; 3 - афидиколин,2,5 мкг/мл; 4 - арабинозидцитозин,0,1 мМ; по оси абсцисс - доза гамма-излучения (Гр); по оси ординат С5Ш-радиоактивность, имп/мин. х мкг ДНК х 10"-3.

Видно, что репликативный синтез ДНК в пролиферирующих клет-х ЗТЗ подавляется примерно в одинаковой мере оксимочевиной, ара-нозидцитозином и афидиколином. Существенных различий уровней таточного синтеза, резистентного к каждому из ингибиторов, при соком исходном уровне синтеза ДНК наблюдать не удалось. В покоя-хся клетках, необработанных ингибиторами, уровень синтеза ДНК зле гамма-облучения в интервале доз от 5 до 100 Гр повышается ксимум на 507,. Предварительная инкубация клеток с оксимочевиной ягибитор дезоксирибонуклеозидредуктазы) приводит к понижению в рвую очередь репликативного синтеза ДНК, более чувствительного концентрации предшественников, чем ВС, и поэтому обеспечивает гистрацию более высокого относительного прироста ВС ДНК. Повыше в 2 раза уровня синтеза ДНК, резистентного к арабинозидци-зину или афидиколину (ингибиторы ДНК-полимеразы,с увеличени-дозы облучения до 100 Гр еще .раз демонстрирует участие ДНК-1имеразы£> в гамма-индуцированном ВС ДНК При исходном различии >вней синтеза ДНК в покоящихся клетках, обработанных и необра-?анных АраЦ и афидиколином, скорость относительного прироста ВС С с увеличением дозы облучения намного выше в клетках без инги-■оров, по крайней мере, в интервале доз-5-50 Гр. Аналогичная »бенность характерна и для клеток, обработанных оксимочвиной. I обстоятельство можно интерпретировать как заметный вклад ДНК-шмеразы Л в ВС ДНК в гамма-облученных покоящихся клетках ЗТЗ.

При обсуждении молекулярных механизмов репарации ДНК в клетках эукариот часто затрагивается вопрос об ограниченной доступности поврежденных участков для ферментов репарации в связи со сложной структурой и компактной упаковкой хроматина эукариот. Учитывая, что ДНК в клетке находится в сложном комплексе с белками в виде компактизованного хроматина, логично предполагать, что для обеспечения доступности ферментов к поврежденным участкам ДНК необходима расчистка его от белков. Возможность существования протеолитической преинцизионной стадии в процессе элиминации радиационных повреждений ДНК в составе компактизованного хроматина допускает, по крайней мере, два варианта модулирования эффективности инцизионного процесса, не затрагивающих специфическую активность нуклеаз. Если первый состоит в ингибировании протеазной активности, то второй может быть реализован путем дополнительной защиты ДНК в составе хроматина от.нуклеазной атаки. Мы попытались экспериментально реализовать второй путь модулирования инцизион-ной активности, сравнивая скорость накопления однонитевых разрывов в ДНК гамма-облученных клеток ЗТЗ, обработанных и необработанных полиаминами (спермин и спермидин). Спустя 30 минут инкубации после гамма-облучения деградация ДНК в клетках с полиаминами была много меньше, чем без них. Поскольку пострадиационная деградация в значительной мере обусловлена ферментативной инцизией и расчисткой брешей, то можно заключить, что интенсивность этих процессов понижена в присутствии полиаминов, по-видимому, вследствие уменьшения числа доступных для нуклеаз участков ДНК в хроматине проницаемых клеток ЗТЗ.

При изучении репарации ДНК в УФ-облученных клетках методом седиментационного анализа мы обнаружили эффект задержки образования разрывов при обработке клеток фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ) - ингибитором сериновых и тиоловых протеиназ (рис.7). Чтобы "законсервировать" инцизионные разрывы (предотвратить застройку брешей и лигирование концов по местам репаративного синтеза ДНК) облучение и пострадиационную инкубацию клеток ЗТЗ в этих экс периментах мы проводили в присутствии оксимочевины и арабинозид-цитозина, подавляющих репаративный синтез ДНК. Выявленная задержка образования инцизионных разрывов, по-видимому, происходит за счет ингибирования протеиназ, обеспечивающих доступность инцизионных ферментов к поврежденным участкам ДНК

На основании этих данных и данных о снижении скорости деградации ДНК при введении полиаминов в проницаемые клетки, мы предположили существование преинцизионного этапа репарации ДНК, сущ-

Рис. 7. Влияние ФМСФ на седиментацию в градиенте концентрации щелочной сахарозы ДНК клеток ЗТЗ, облученных УФ-излучением в присутствии ингибиторов синтеза ДНК; 1 - необлу-ченные клетки + ДМСО; 2 - УФ-облу-чение,20 Дж/м2 + ДМСО; 3 - УФ-облу-чение + ДМСО + ФМСФ,1мМ. Контрольные и УФ-облученные клетки инкубировали в присутствии ЮмМ оксимо-чевины и 0,1мМ арабинозиддитозина при 37°С 30 мин. до и 30 мин. после облучения с добавлением ФМСФ и/или ДМСО. Конечная концентрация ДМСО (как растворителя для ФМСФ) в клеточной суспензии составляла 1%; по оси абсцисс - номер фракции; по оси ординат -3Н-радиоактивность, % от суммарной в градиенте.

)стью которого является частичный протеолиз белков хроматина в йонах повреждений ДНК Мы показали, что эту стадию можно моди-щировать с помощью ФМСФ.

Приведенный экспериментальный материал позволяет утверждать, :о одной из лимитирующих стадий многоэтапного репарационного юцесса, направленного на элиминацию гамма- и УФ-повреждений в юматине клеток ЗТЗ, является узнавание и инцизия самих повреж->ний, экранируемых ДНК-белковыми взаимодействиями. В этом отно-!нии ингибитор протеиназ ФМСФ представляет собой модулятор репа-щионной активности, поскольку в широких пределах варьирует щечный эффект репарационного процесса. Наш интерес к ингибиторам ютеиназ обусловлен предполагаемым их участием в инициации >ансформации, которое широко обсуждается в литературе.

3. ВОПРОСЫ ВЗАИМОСВЯЗИ ПРОЦЕССОВ ГАММА- И УФ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК ЗТЗ С УРОВНЕМ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ РЕПАРАЦИОННЫХ СИСТЕМ

Нами установлено, что в присутствии ингибитора протеаз ФМСФ, >епятствующего декомпактизации хроматина, отмечается снижение кода однонитевых разрывов в ДНК облученных клеток. Нам казалось лшым установить количественную взаимосвязь между снижением скости инцизионных процессов и уровнем индуцированной трансформа-:и клеток ЗТЗ.

В экспериментах по трансфекции в интактные клетки изолирован-й облученной ДНК, результаты которых представлены на рис. 8, об-ружено повышение эффективности трансформации при дозе УФ-облу-

чения 210 Дж/м2- и выше. Мэжно допустить, что клеточная система ре парации активируется экзогенной ДНК с УФ-повреждениями. Учитывая, что в результате трансфекции в акцепторные клетки попадает примерно 1% донорной ДНК /ЬоуЬег еЬ а1. ,1982/, можно предполагать, что количество УФ-повреждений, вносимых в клетки ЗТЗ с экзогенной ДНК, довольно мало, и необходимы высокие дозы УФ-облучения очищенной донорной ДНК, чтобы активировать систему репарации. Если перед трансфекцией клетки обработать £ШФ, то трансформирующая способность экзогенной ДНК снижается.

|Ь

О

Г*1

Рис. 8. Трансформация клеток ЗТЗ препаратами УФ-облученной ДНК АКЭ; 1 - спонтанный уровень трансформации; 2 - трансфекция необлученной ДНК АКЭ; 3 - трансфекция ДНК АКЭ, облученной в дозе 10 Дж/м2; 4 -20 Дж/мг; 5-30 Дж/м , 6 - 105 Дж/м2; 7 - 210 Дж/мг; 8 - 350Дж/мг; по оси ординат - частота трансформации с учетом выживаемости клеток.

5

При изучении влияния ФМСФ на трансформацию гамма-облученных клеток установлено, что добавление ФМСФ как до, так и сразу после облучения несколько снижает эффект гамма-индуцированной трансформации клеток ЗТЗ (рис.9). Невысокую выраженность эффекта можно объяснить тем, что степень модуляции инцизии гамма-сайтов в присутствии ингибиторов протеаз очень незначительна, так как основ-

ю'

10'

3

А.

ЙЙ

! 2 И

4 5

Рис. 9. Влияние ФМСФ на трансформацию гамма-облученных клеток ЗТЗ без (А) или при трансфекции ДНК АКЭ (Б); 1 - необлученный контроль; 2 - уровень трансформации при добавлении ФМСФ, 1мМ; 3 - гамма-облучение клеток (3 Гр); 4 -добавление ФМСФ за 1 час до облучения; 5 - добавление ШЗФ сразу после гамма-облучения; по оси ординат - частота трансформации с учетом выживаемости клеток.

ной процесс образования однонитевых разрывов при гамма-облучении является неэнзиматическим, а связан с прямой радиационно-химической атакой сахаро-фосфатного остова ДНК. Поэтому незначительная

>дуляция эффективности трансформации, скорее всего, связана со гаженным участием ферментативной инцизии в репарации гамма-пов-!ждений.

В случае активации процесса трансформации клеток ЗТЗ при обмотке донорной ДНК АКЭ, наблюдаемой после гамма-облучения, ин-[битор протеаз существенно снижает эффективность индуцибельного «тора (в данном случае гамма-облучения) при добавлении как до, к.и сразу после облучения (рис.9 Б). А это уже прямое свиде-льство того, что для реализации индуцибельного эффекта наиболее щественно, чтобы модификатор действовал в процессе репарации, а в момент индукции гамма-повреддений.

Как следует из данных о влиянии ФМСФ на трансформацию УФ-об-ченных клеток, представленных на рис. 10, и в данной серии экс-риментов ФМСФ практически не изменял уровень спонтанной транс-рмации интактных клеток. Вместе с тем, обработка Ф},ЮФ клеток 3 перед УФ-облучением полностью нивелирует его индуцибельный фект, (рис. 10 А). Различия в эффективности ФМСФ, выявленные на дели УФ-индуцированной трансформации по сравнению с моделью мма-индуцированной трансформации, целиком коррелируют со сте-нью участия энзиматической инцизии в гамма- и УФ-репарации.

Наконец, наибольшая степень модуляции эффекта трансформации в исутствии ФМСФ наблюдалась наш в условиях усиления эффекта ансформации при трансфекции ДНК АКЭ в УФ-облученные клетки ЗТЗ. к, согласно данным, представленным на рис. 10 Б, 15-кратный эф-ет усиления трансформирующей активности трансфицированных кле-■с ЗТЗ под действием УФ-облучения практически полностью нивели-зался при обработке клеток ФМСФ перед облучением. В то же время т было показано, что ФМСФ задерживает формирование инцизионных

б2

гЬ

М

I2

Рис. 10. Влияние ®.*СФ на трансформацию УФ-облученных клеток ШН ЗТЗ без (А) или при трансфекции ДНК АКЭ (Б); 1 - необлученный контроль; 2 - уровень трансформации при добавлении ФМСФ, 1мМ; 3 - УФ-облучение 6 Дж/м2; 4 - добавление ФМСФ за 1 час до облучения; по оси ординат - частота трансформации с учетом выживаемости клеток.

разрывов в ДНК облученных клеток. В таком случае мы можем объяснить снижение эффективности трансформации клеток ЗТЗ при обработке ингибитором протеиназ именно недостатком"брешей в ДНК, пригодных для. интеграции фрагментов опухолевой ДНК. В клетках, где протеолитическая активность не заингибирована, вероятность нукле-азной инцизии растет. Это приводит к общей дестабилизации генома, к повышению частоты внутригеномных перестроек и увеличению интеграции в клеточный геном экзогенной ДНК, трансфицируемой в клетку.

Совокупность полученных экспериментальных фактов и имеющиеся литературные сведения позволяют формирование гипотезы, в которой эффективность трансформации клеток ЗТЗ препаратами опухолевой ДНК определяется количеством и спецификой радиационных повреждений генома. Последние обеспечивают активацию клеточных протоонкогенов или сайт-специфическую интеграцию (позволяющую интенсивную-экспрессию) активированных онкогенов, трансфицированных в клетки в составе экзогенной ДНК Протеолитическая активность модулирует скорость репарации ДНК и может быть одним из возможных факторов, определяющих реализацию генотоксического воздействия на клеточную популяцию и предканцерогенные изменения на уровне генома индивидуальной клетки. Поэтому в перспективе дальнейших исследований в круг поисков эффективных препаратов, снижающих степень риска пострадиационного канцерогенеза, должен быть вовлечен многочисленный класс ингибиторов протеаз.

ВЫВОДЫ

1.'Показано, что клетки Ы1Н ЗТЗ обладают умеренно выраженной гамма- и УФ-резистентностью (Бо =1,3 Гр; 1^=5 Гр; Dq=5,3 Гр для гамма- и Бо=0,8 Дж/мг; 1^-6,1 Дж/м2; 0д=5 Дж/мг для УФ-излуче ния).

Получены дозовые зависимости частоты трансформации клеток ЗТЗ после их гамма- и УФ-облучения. В пострадиационном периоде в клетках ЗТЗ наблюдается дозозависимое повышение числа трансформированных локусов, причем, при УФ-облучении эффект трансформации в расчете на число выживших клеток выражен заметно сильнее, чем при гамма- Облучении.

2. Показана зависимость частоты трансформации облученных клеток ЫГН ЗТЗ после их трансфекции экзогенной опухолевой ДНК от

...... функционирования систем репарации первичных повреждений в

ДНК этих клеток. Установлен максимум выраженности эффектов трансформации при дозах гамма- и УФ-облучения, близких к дозам насыще--

и репарации №) по кривы;,! инактивации клоногенных эффектов.

3. Выявлено наличие протеиназо-зависимого преинцизионного *апа зксцизионной репарации гамма- и УФ-повреждений в клетках '3. В пострадиационном периоде у этих клеток наблюдается резкое ¡давление репликативного синтеза ДНК и активация репаративного. шаративный синтез протекает с преимущественным участием ДНК-по-шеразы (к.

Получены данные, свидетельствующие о том, что эффективность тжционирования пострадиационных систем репарации ДНК клеток тцественно зависит от активности протеиназ.

4. Показано, что трансформация клеток ЗТЗ резкое возрастает >и траясфекции в них экзогенной ДНК, содержащей фракции активи-1ванных онкогенов. При этом дополнительная индукция в до'норной К УФ-повреждений приводит к дальнейшему увеличению частоты шсформации клеток.

5. Выявлено, что дозы УФ- и гамма-радиации, активирующие про-ссы трансформации в клетках ЗТЗ, оказывают выраженный стимули-кщий эффект на трансформирующую активность экзогенной ДНК, обо-щенной активированными онкогенами (УФ более сильный активатор, м гамма-излучение).

6. Ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), не ияющий на уровень спонтанной трансформации клеток ЗТЗ, заметно ижает частоту трансформации, индуцируемой УФ-сблучением клеток, стота трансформации гамма-облученных клеток в присутствии ФЖФ давляется в меньшей степени. Этот ингибитор полностью нивелиру-

активирующее действие гамма- и УФ-облучения на трансформацию еток ЗТЗ экзогенной ДНК, обогащенной активированными онко^ена-

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Безлепкина Т. А., Островская Л. Б. , Безлепкин Е Г. , Газиев А. И. Синтез ДНК в делящихся и покоящихся ¡тетках ЗТЗ после их облучения. - Радиобиология, 1988, т. 28, вып. 5, с. 591-596. Островская Л. Б. , Безлепкин Е Г. , Газиев А. И. О возможности существования преинцизионного этапа репарации ДНК - Радиобиология, 1988, т. 28, вып. 5, с. 601-606.

Безлепкин В. Г. , Островская Л. Б. , Безлепкина Т. А. , Ломаева М. Г. , Газиев А. И. Роль репарации ДНК в радиационной трансформации клеток животных. - I Всес. радиобиол. съезд, М. , 21-24 авг. 1989: Тез. докл. - Пущино, 1989, т. 1, с. 93-94.

4. Безлепкин Е Г. , Островская Л..Б. , Безлепкина Т. А. , Газиев А. И. ДНК-опосредованная трансформация фибробластов мышей после радиационного повреждения клеточного хроматина. - Радиобиология, 1991, т. 31, вып. 2, с. 188-194.

ГО.06.92 г. Зак.4074Р Тир.125 э*з. Уч.-изз.л. Г.О Отпечатано на ротапринте в СНТИ ПНЦ РАК