Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Прямое.введение чужеродных генов в эмбрионы, ткани и органы животных с помощью высокоскоростной инъекции ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Прямое.введение чужеродных генов в эмбрионы, ткани и органы животных с помощью высокоскоростной инъекции ДНК"

РО^ИИСКЛЯ АКАДЕМИЯ НАУК. ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЗНГЕЛЬГАРЯТА

на правах рукописи УЖ 577.21

Алимов Андрея Анатольевич

Прямое.введение чужеродных генов в эмбриона,ткани и органы гмвотных с помощью высокоскоростной инъекции ДНК

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА- 1992

Работа выполнена в лаборатории функциональной корфологим хроиосоы Института молекулярной биологии ми.В.А. Экгельгардта Российской Академии Наук.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ :доктор биологических наук А.В.Иткес

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова

заседании специаяязированного совета Д.002.79.01. при Институте молекулярной биологии ни. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984,Москва,ул. Вавилова ,д.32.

С диссертацией ыозно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгелъгардта РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин

доктор биологических наук В.Ю.Поляков

Зашита состоится

Автореферат Ученый секретарь Специализированного совет

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

. Актуальность проблемы. Последние годы характеризуется -^повышенным вниманием к области молекулярной биологии,изучавшей функциональную роль и экспрессию генов на уровне целого организма.В этой связи интерес к проблеме переноса чужеродной генетической информации в отдельные группы клеток,органы,ткани развивающихся и зрелых организмов непрерывно возрастает.

Ряд исследователей предполагает,что создание эктопических участков экспрессии тех или иных регуляторных генов в ходе индивидуального развития организма позволит точнее определить их функцию ( Jackson,1988,Ло et al.,1986).Другие считают,что введение чужеродных генов позволит проводить коррекцию генетических заболеваний (Friedmarm ,1989i.Третьи надеются,что такой подход позволит точнее охарактеризовать регуляторные участки целого ряда про-клонированных генов (Дыбан,1990¡.Однако,до недавнего времени решение перечисленных задач при помощи традиционных способов переноса ДНК в клетки (кальция- фосфатный метод,электропарация,микроинъекция и др. ) представлялось крайне трудоемким и мало перспективным,что значительно усложняло интерпретации уже существующих научных данных. -• ■

В 1987 году появилось первое сообщение о -том,что ДНК в растительные клетки можно переносить на частицах тяжелых металлов (Klein,Nature, 19S7).Подход <5ыл предложи для переноса ДНК сквозь толстую растительнуо стенку.В 1986 году"в Лаборатории Функциональной морфологии хромосом института молекулярной биологии им. В.А.Знгельгардта В.А.Колесниковым был сконструирован своя вариант устройства для придачи ускорения вольфрамовым частицам с преци-питированноя на них ДНК.В этом же году после высокоскоростного механического переноса ллазиидной ДНК рЗУЭ-neo в перевиваемые клетки мьшм NIH ЗТЗ были получены устойчивые к антибиотику G41S клоны (Колесников и др.,ДАН СССР,3938). Появившаяся примерно в это же время техника амплификации ДНК (Saifcl, Science,1908) и хорошо разработанная система репортерных генов позволила перейти к решению принципиально новой задачи - переносу ДНК в отдельные ткани и глубоколежашие группы клеток.

Цель я задачи исследования. Цель данное работы - анализ применимости высокоскоростной иеханнчесхоа инъекции ДНК для трансформации : (травсфекиин) отдельных органов,тканей и групп клеток восоставе. целого .организма < ln vivo).Для.этого необходимо было провести.следующие серии экспериментов:

1.Выяснить возможность экспрессии перенесенных рекоыбинантных плазюишыхоДНК в-.гаш$:х ¡эхсплантатах! различных органов.

2.Перенести рек£ж5инмп;к*е пдазмидные ДНК в .часть органа(печень) 1л vivo.Оценить возиоэсюсть экспрессии перенесенных генов.

3.На примере пшешаг=.' выяснить возиоэность передачи следующему поколение перенесенной при помоси высокоскоростной механической инъекции "ЛНК. -

4.Провести высокоскоростную механическую инъекцию рекомбинактных плазммдных.ЛНК в развивающиеся яяца рыб.Проанализировать судьбу перенесенной ЛНК в ходе последних этапов иадавядуального (пред-лкчинха.иолодь) развития рыб. .

5.Провести высокоскоростную инъекцию рекомЗикантных ЛНК в ранние эмбрионы кыш на;разных стадиях развития.Выяснить возможность трансформации клеток внутренней клетечноа кассы бластоцисты при условии сохранения ее целостности и зязнеслосоЗяости.

Научная яовкзка и поактяческея ценность работ»-В ходе работы была впервые показана возможность переноса Сио&огичгскоя информации в эксплантаты егченя и молочной хедези крае и швея.Впервые при гоиатзи ызсхжасжарасткоа уахвэтгаесхоа тает» {трасфехцих} щрввалав веретгж рекозезяаавтвых ДИК в ззвчань к?ыс 1ю vivo,при этом зерЕвесенвая ÜSÜ со кран яда свою функщеваЕьну» ахпщность.

«Сстрава хевеигаеашя "laiiEjactaioJ через жзюз.Взв;ааае погазава-хриигязддоть ланшягв-заяхаха для лаяучЕшш трггггенных рыб, леракЕсвввш с. ношшью oí стрела rea ввшащинфохфэтоансферазы 2 экспрасс-ировался sa лезджх стадиях кндакзодальзэго развитая ры£>-Проведен херввзс Д5К з клетки внутренней мвточноя кассы йластшшсты пыша .После ВЕреыоса •йазстсшкст.ы .-сохраняли ísod ■депогтногть л ззгзвесюсойаость.Регультяти работа «огут быть широко испьльзовагы ъ тегргткчееккх зжследсЕаюигх ,а такза "в медицинекоа (гек&гя терапия! и сельскохозяйственно® (получение тргнегеккиа животеухЗ тиргаггике.

два ¡ЯРЖНГЯГГЬ переда1» ЕВЕГЖШЕЗ С понакою

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Втором двустороннем симпозиуме СССР-США "Структура эукарио-тического генома и регуляция его экспрессии",Тбилиси,1909. На Четвертом Европейском конгрессе по биологии клетки, Флоренция, 1990.На первом Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растения",Пушно ,1991 .На объединенном семинаре департаментов клеточной биологии и биохимии Университета Сан-Пола, США 13991 I.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работ.

Объем диссертация.Диссертация изложена на страницах машинописного текста,состоит из введения,обзора литературы.главы "Материалы и методы",экспериментальной части,обсуждения полученных результатов,выводов и списка литературы.Диссертация содержит 11 рисунков и 2 таблицы.Список цитируемся литературы насчитывает наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Методика высокоскоростного механического переноса.

В наших опытах по высокоскоростной механической инъекции ДНК для ускорения вольфрамовых частиц мы использовали устройство ^конструированное к.О.н. В.А.Колесниковым в лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологииим В.А.Знгель-гардта РАН.

В этом устройстве микрочастицы металлического вольфрама размером 1 - 3 мкм приобретает ускорение с помощьо заряда гремучей ртути.По ориентировочным оценкам начальная скорость частиц вольфрама достигает 450 м/с.Расстояние от конца ствола до поверхности обстреливаемой ткани составляет 10-18 см и подбирается, исходя из особенностей объекта.Для уменьшения повреждения клеток токсичными пороховыми продуктами между стволом и планыетоя (чашкой Петри) расположены две диафрагмы с увеличивающимся внутренним диаметром. В блияашея к стволу диафрагме установлена сетка с ячейками размером 1 км х 1 мм,а во второй -сетка размером 0.1 мм х 0.1 мм.Пер-

\

вая сетка уменьшает повреждение клеток частицами макронссителя.а вторая дезинтегрирует конгломераты частиц вольфрама,образовавшиеся в ходе преципитацию ДНК.

Ео всех опытах для обстрела использовали смесь частиц диаметром 0,1-3 мни с преципитированноя на их поверхности плазмид-ной ДНК.Преципитация ДНК на вольфрамовые частицы осуществляли при помоши кальций-фосфатного метода,используя 10 мг частиц на 1 мл раствора ДНК (1ыг/мл).На один выстрел использовали 0,1 мг частиц с преципитированноя на них ДНК.

2.Перенос ДНК плазииды pSV3neo в мышиные клетки, растуиие в культуре.

Возможность переноса плазмидной ДНК при помоги высокоскоростной механической инъекции в спонтанно иммортализованные мышиные клетки впервые была продемонстрирована на клетках NIH ЗТЗ (Колесников и др.,1568),0 факте переноса судили по устойчивости к антибиотику гекетицияу и результатам молекулярнобиологического анализа.Б качестве ДНК для переноса авторами был использован классический вектор Берга pSV3-neo,который содержит кодирующую часть гена устойчивости к антибиотику генетиц/ну (G416) - neo под промотором вируса SV40,a также область ранних генов вируса SY40. Проыоторная область вируса перекрывается с областью начала репликации. Для доказательства того,что выросшие после трансфекции клоны содержат плазмидную ДНК их наращивали и выделяли суммарную ДНК.При помощи двух методов дот и блот гибридизации было показано наличие рекоыбинантной плазмидной ДНК рБУЗ-пео в суммарной ДНК устойчивых к антибиотику G416 клеток NIH3T3.

Длительный промежуток времени этот результат оставался • единственным примером использования данного подхода для трансформации животных клеток.Поэтому было совершенно необходимо получить подтверждение первого результатам другой стороны было интересно оценить возможность трансформации данным способом клеток других линий.включая злокачественные и эмбриональные клетки мыши.

С этой.цель» мы использовали клетки перевиваемой клеточной линии L929 и первичные фибробласты мыыи.Клетки культивировали на пластиковых чашках Петри в среде Игла в модификации Дульбекко с 10 % эмбриональной сывороткой в С02 инкубаторе.Для предотвращения

4fP

л * i^jî'z.

L.K 1Ш1 - V

л > щ

i 2 3 Î 5

1Б

1B

рис.1 A.Клон устойчивых к антибиотику G418 клеток L929 на 10-ый день селекции.

рис.1 Б.Анализ продуктов реакции амплификации ЛНК кэ отдельных устойчивых к G41S клоков клеток!1000 к.). 1-положтельный контроль.амплифицирозанкая ЛНК pSY2-nso. 2,3,4-отрицательные контроля. 5-амплифицирозаиная ДНК кз клона мышиных клеток 1.929.6-амплифицированяая ДНК первичных фибробластов мыши. рис^В-Гибридизанионный анализ продуктов реакции аетлифккаши. 1-положительный контроль.2,3-отриаагельнае контроли. 4-ДНК. из кло;-1й~-мышиных клеток L929.5-JIHK лерзичних фиброблас-тов МЫПВ! .

микробной контаминации в среду добавляли антибиотик гентамицин (40 мкг/мл).

За 1В-20 ч. до опыта клетки рассевали на пластиковые чашки Петри на среду без антибиотика генэтицина с таким расчетом,чтобы к моменту начала эксперимента клетки покрывали 50-70 % поверхности чашки.Далее сливали среду и проводили высокоскоростную механическую инъекцио ДНК, используя на один выстрел 10 мкг плазмид-ной ДНК,находящаяся на 70-S0 % в линейной форме.

Для трансакции использовали плазмидный вектор pSV3-neo, который наращивали и выделяли общепринятым методом с последующей очисткой равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия.

Через 6-12 часов после обстрела клетки рассевали на чашки Петри и через 46 ч. после начала эксперимента проводили селекцию • на антибиотик G418 ( 400ыкг/мл),меняя среду чэрез каждые три дня.

Опыты показали,что в результате трансфекции клеток (как перевиваемых,так и-первичных) с помощью высокоскоростной механической инъекции ДНК происходит их генетическая трансформация,приводящая к возникновению клонов трансформантов(рис1А).Клоны (100 клеток)

вырастали за. 2-3 недели.Эффективность трансформации колебалась в

-з —ч

разных опытах и составляла от 1x10 до 1x10 на клетку на 1 мкг кольцевой плазмидноя. ДНК.Контролем служили клетки,обработанные вольфрамовыми частицами, не содержащими ДНК.

Для доказательства того,что выросшие клоны содержат плазмидную ДНК,их изолировали стандартным методом,наращивали до тысячи клеток'и выделяли суммарную ДНК.Полученную ДНК на наличие . гена неомицинфосфотрансфэразы анализировали при помощи полимераз-ноя цепной реакции.Во всех проанализированных случаях выделенная из клеточных клонов ДНК содержала последовательности гена неоыицин-фосфотрансферазн (рис.1 Б и В).

Прозедвнныа исследования,таким образом,подтвердили возможность использования высокоскоростной механической инъекции ДНК для введения чужеродной информации в культивируемые клетки животных.

3. Перекос ЛИК. плазмид: рТАТ-са.1:,р&-саз-са1:,рх-саз-саЛ -в эксплантаты печени.почки и молочной яелезы иыии и крысы.

Была предпринята попытка при помощи высокоскоростной механической инъекции осуществить перенос чужеродной ДНК сразу в нес-•колько слоев клеток.К моменту начала работы у нас не было даже ориентировочных данных.позволявших оценить возможность такой транс-фекции.В литературе этот вопрос также не обсуждался.Поэтому были проведены предварительные модельные эксперименты на желатиновых кубиках,которые- показали,что при принятых наыи условиях обстрела вольфрамовые частицы проникают на глубину до 100 мкм,а следовательно можно ожидать трансфекци» по меньшей мере .восьми клеточных слоев(исходя из допущения,что размер клетки составляет 10-12 мкм).

В качестве экспериментальной модели были использованы эксплантаты печени,почки и молочной яалезы мышея и крыс.Главная отличительная особенность этих объектов состоит в том,что эксплантаты сохраняют функциональные свойства и анатоьшческие связи тканей родительского органа.Поэтому проведенные эксперименты мы рассматривали не просто как факт переноса ЛИК в несколько слоев однотипных клеток,а как шаг к трансфекции отдельных органов.

Эксплантаты печени,почки и молочной железы получали в стерильном боксе от животных,только что умерщзленных путем транслокации веяных позвонкоз.Все послздуоиие манипуляции проводили в ламинарном шкафу.Ткань рассекали на кусочки 0,5x1,0 си.промывали средой для культивирования (199) с антибиотиками 12О0 ЕД/мл пеницилина и 200 мкг/мл стрептомицина).Затем эксплантаты переносили в чашки Петри на миллипоровые фильтры,добавляли среду для культивирования и культивировали 60 мин в С02 инкубаторе при 37°С.После инкубации удаляли избыток среды и эксплантаты подвергали обстрелу вольфрамовыми микрочастицами.Для всех типов тканей использовали одинаковые условия переноса.

Рекомбинантные плазмидные ДНК были получены из Лаборатории г генетической инкенерии ИОГен им. Н.И.Вавилова РАН (-заа.лаб. С.И. • Городецкий). Анализ хлорамфекикол-ацетилтрансферазы проводила совместно с Лабораторией генетической инженерии стандартным методой.

Использованные в опытах плазмидные ДНК содержали клонированную в рВИ322 ксдирувшув часть гека -иораифеникол-ацегилтрансфяразьг

(CAT).которая в зависимости от плаэыиды в 5' области была слита с 5' фланкирующими областями g-казеинового,х-казеинового или тиро-зинаминотрансфэразного(ТАТ) генов; в 3' области ген CAT имал сигнал полиаденилирования казеинового гена или вируса SV-40.

К моменту качала опытов было известно,что экспрессия казеиновых генов находится под сложным регуляторным' контролем.5' фланкирующая область казеиновых генов содержит хорошо^соответствующий канонической последовательности TATA бокс,слабо выраженный СААГ бокс.САСС бокс,а также сайты связывания h'Fl-белкового ядерного фактора 1,который впервые был описан как белок, необходимый для эффективной репликации ДНК аденовируса in vitro .сайты связывания глюко-кортикоидного рецептора,сайты связывания прогестеронового рецептора и ряд последовательностей с неизвестной функцией I Городецкий и др.,1936).В этой связи было интересно оценить возможность работы регуляторных областей казеиновых генов в неспецифичных для них органах. .

Преципитацию и подготезку рекомбинантных плазмидных ДНК для высокоскоростной механической инъекции проводили по той же методике, что и е случае культуру клеток!сы. выше).

Через двадцать часов после высокоскоростной механической инъекции эксплантаты мышей анализировали на наличие знзиыатической активности хлораыфениколацетилтрансферазы.В качестве отрицательного контроля использовали ткань тех же органов,но без трансфекции.

Результаты анализа приведены на рисунке 2.Во всех случаях, независимо от промотора, была зарегистрирована экспрессия перенесенного гена в эксплантатах печени.В эксплантатах почки и молочной железы уровень ее был незначителен и наблюдался не во всех проанализированных случаях.Возможно эта связано с особенностями гистологического строения почки и молочной железы мыии.

Во второй серии зксперинентоБ эксплантаты получали из молочной железы крысы. Условия переноса и плазмиды были теми же. Эксплантаты анализировали на наличие ферментативной активности САГ гека через 24 и 46 часов после обстрела.Б качество отрицательного контроля использовали нетрансфецированные эксплантаты молочной жлезы, по лученные от того же животного.

Результаты анализа приведены ка рисунке 3. Через 24 часа экспрессию гека наблюдали ео всех случаях переноса.Через 48 ча-

• '' 4-САТ

О, О 0 9 О

> к ■ л 4 3 « •

2А 2В 2С ЗА . 38

рис.2. Активность хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) в эксплантатах почки:.печени и молочной жалезы мыши, а - ».галочная железа,б - печень,в - почка 1 - рк-саз-са1;,2 - рТАТ-са1;,3 - рб-саэ-са-Ь.

.о.'сГс> 9 В

рис.3. Активность хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) в эксплантатах молочной железы крысы.

I - положительный контроль,2 рх-саэ-са-из - рЗ-саэ-саг, 4 - рТАТ-саг,5 - негативный контроль.

сов уровень ее оказался незначительным,а в некоторых случаях экспрессия совсем отсутствовала.Можно предположить,что экспрессия носила транэиторныя характер.

Таким образом,в ходе экспериментов на эксллантатах из органов мышея и крас была показана возможность переноса чужеродной генетической информации в отдельные ткани iruvltro.Перенесенный ген СЛТ сохранял свою функциональную активность.В ходе опытов была отмечена некоторая вариабельность в уровне экспрессии САТ гена в зависимости от используемого промотора и типа ткани .

4. Перенос ДНК в клетки печени in vivo.

Удачная трансфекция эксплантатов мыши и крысы сделала воэмот жныы постановку серии экспериментов по переносу ДНК в печень in vivo.Для этого использовали плазмиду - рТАТ-са1,так как она показала высоким уровень экспрессии в предыдущих экспериментах.

На имбредных крысах линии Вистер (в возрасте 2-3 ыес.) проводили в стерильных условиях лапоротоми» по средней линии и с помощью марлевых салфеток приподнимали печень.В ходе операции использовали эфирный наркоз s сочетании с местным обезболиванием.Тело животного закрывали пластиковым экраном,имевшим в участке.прилегавшем к печени.отверстие диаметром 3 сы.Расстояние между стволом "пуш<и" и поверхностью печени составляло 15-20 см.

Немедленно после обстрела печень опускали в брошнуо полость. Брюимну задавали кетгутом и на коку накладывали узловой шелковый шов.Спустя 24 ч животных умертвляли путем транслскации шейных позвонков.Обстреленные микрочастицами участки печени иссекали и анализировали на активность хлорамфениколацетилтрансферазы по стандартному методу..

Результаты анализа приведены на рисунке 4.В двух случаях из пяти при переносе плазмидной ДНК в печень крысы была зарегистрирована экспрессия хлорамфениколацетилтрансферазы.

Таким образом,проведенные эксперименты позволяют считать возможным перенос чужеродной ДНК сразу в несколько слоев клеток, ДНК при этом сохраняет свою функциональную активность.

рис.4.Активность хлорамфениколацетилтрансферазы ÍCAT) в печени крысы ln vivo.

1,2- результаты анализа печени двух трансфецированных крыс.З - отрицательный контроль,4 - положительный контроль.

5.Перенос алазнидноя ДИК. pSV3-neo в дробящиеся зароднки рыб.

Несомненным достоинством высокоскоростной механической инъекции ДНК является то,что этот метод позволяет практически одновременно инъецировать любую ДНК в неограниченно большое число клеток независимо от стадии их развития.Поэтому.использовать этот метод для создания трансгенных рыб представляется особенно заманчиЕым,так как традиционная техника мккроинъекций обычно не позволяет в ходе одного опыта проинъецировать достаточно большое количество дробящихся зародышей на одной и топ же стадии эмбрионального развития.

Нами была предпринята попытка переноса чужеродной генетической информации в ранние дробящиеся, зародыши рыб данио (Eranchyda-nlo rerlohB качестве ДНК для переноса использовали успешно апробированный на клетках мыши.растущих в культуре(Н1Н ЗТЗ, L929,первичные фибробласты).вектор pSV3-neo.

Особенности эмбрионального развития рыб потребовали соблюдения некоторых дополнительных условии при высокоскоростной механи-

ческол инъекции.В связи с тем,что яйца рыб относятся ¡. тедолеци-талыюму типу,а на первых этапах дробления бластомеры представляет собой шапочку клеток на большой массе желтка,правильная ориентация их по отношении к потоку частиц вольфрама является обязательным дополнительным условием высокоскоростной инъекции.Условия • обстрела подбирались таким образом,чтобы гибель яиц после обстрела составляла не белее 302.

Работа проводилась совместно с кафедрой эмбриологии КГУ им. Ы.В.Ломоносова.Есего проведено три серии экспериментов.В первой серии были отработаны условия селекции личинок и ¡¿альков рыбок данио на актнбиотг.ке С118.Показано,что при концентрации антибиотика в воде 600 - 60Э мкг/мя гибель личинок и мальков наступает на 3 - 5 сутки.

В следующей серии экспериментов пдазыидния'вектор р5УЗ-пео при помощи вусокоскоростноп механической инъекции вводили в ранние дробяагаеея зародыш данио.Было предположено.что введенный ген неомешшфосфотрансфгрьз^ предаст клеткам данио устоячиьссть к антибиотику G438.il б контроле,и в опыта наблюдали гибель личинок. Различия между ними были обнаружены на 3 - 5-е суг.чи посла начала селекции.Динамика гибели личинок приведена в таблице 1.

. Таблица 1

Выживание лпчтюк в мальков данпо в селекяшаой среде с 6518 поспи

. з:раисфекцпа яйцеклеток плазашдой рБУЗпео . ' .'¿5. ^¡У.'Г-

.V! опыта Стадия развития Концентрация <3418, ыкг/мя Время -• инкуСа-цин с '' ОИ8 до. начала т:!беяп, ДМ ' -.л-Нуынулятивнся сксртноать■ (р дплы). '¿X. ■■ ■ ^ .'••ГЕОсле-кпктбьциа ;

I4 ' , 2

•V'1 -м ' — .чЛ" ¿Т^Ч-.'.'Щ-'.;

■ 1 Личинки ■ 500 ■ .5 . : -5/0.** ' • 15/7 -". 50/20 У. 30/67;:?

■ 2 ' . » 300 3 ' - 12/1 *30/И ■ .- 65/27.д{ ¿.90/507? ••5100/80;;

■ 3 • Мальки 600 6 •• .1/0 " • 17/5 •• V-: во/.', о;- •; -Я00/70?-;;

АУ | " ■ » . ООО д 5/1 ¡2/2" ■-•40/20'»' Й 80/Я51-?

ч. 1 / ■ ■ .. '

' Лик после шгиуСт^ц;:. ' Числитель — контроль, анамгнатег.ь —• скит.

Из таблицы зидно.что введение гена неомицинфосфотрансфэразн предавай части зародывея устойчивость к антибиотику С418.Данные этих экспериментов согласуется с результатами аналогичных исследований,с- которых ген нео:,(ицинфосфотрансферазы вводили з яйцеклетки рыб при л омам микроинъекцил-(Уооп еЪ а!., 1990).

От личинок,переживших селекции.получили мальков,из которых зняелмли тотальную ДНК для последующего анализа,который проводили при помоши полимеразноя цепной реакции, подтверждая специфичность полос Слот гибридизацией.Проведенный анализ 1рис5Аи5) пока-

п

рис.5А.Анализ продуктов реакции амплификации ДНЯ личинок данио.

1 - 9 - амплифицированная ДНК данио.10 - амллифииированнэ-я ДНК р5У2-пео (положительный контроль).

I -V'

)Г

I ^ 1

т-

II

К Г-Л .-*«-< Л «Л'*»

-А

' г

г 1

аг-

е1Ла 2а

рис.5Б.Гибридизационный анализ продуктов реакции амплификации ДНК личинок данио.

1 и 1а - ДНК данио N4; 2 и 2г. - ДНК даниэ ¡47:3 и За -положительный контроль.

зал. что ДНК,полученная от данио N 4 и 7 .содержит лослэдователь-ности .аналогичные последовательностям гена neo.Всего в этой серии било проанализировано 16 личинок дакио.

В третьей серии экспериментов после высокоскоростной механической инъекции плазмиды pSY3-neo в ранние дробящиеся зародыши данио селекцию веди на стадии мальков ( таблица Л ).Из мальков,переживших селекцию,выделили ДНК .которую проанализировали при помоем полиыэразной цепной реакции на наличие ДНК последовательности гена neo(рис.6I.ДНК всех трех переживших селекцию мальков содержала последовательности,аналогичные последовательности гена neo.

Таким образом,проведзнные эксперименты показали принципиальную возможность использования высокоскоростной механической инъекции для введения чузвродной ДНК в оплодотворенные яйца рыб.Следует отметить тот факт,что при селекции личинок количество устойчивых к генетицкну особэя значительно превышало количество тех особея, в которых удалось обнару>:о:ть ДНК гена неомецинфосфотрансферазы. Этот факт нуждается в дополнительном разъяснении.

í__________________

1 .2 3 4

рис.6. Анализ продуктов реакции амплификации ДНК малькор данио. 1,2,3,4 - ашлиоицксозая.чая ДНК данио,где 2 - отрицательная контроль.

Как отмечалось зыше .селекцию дакио после высокоскоростной механической инъекции плазмидноя ДНК рБУЗ-пео проводили сразу же после вылупления на стадии личинки до момента активного питания. В это время Еыяупивииеся зародыши рыб продолжают эндогенное питание за сче'г .желточного мешка,сосуды которого кроме этого выполняют еще и дыхательнуя функцию.С определенными оговорками желточный мешок можно считать внезародышевым органом,который утрачизается в ходе дальнейшего развития.С течки зрения эмбрионального происхождения, желточный мешок -одно из самых первых эмбриональных образования, уже полностью сформировавшихся к концу гаструляпяи.3 его формировании принимают участие все клетки перибласта и большая часть бластодермы,в то время как собственно тело будущей рыбы формируется из утолщенной части бластсдиска - зародышевого еоттка.Эти рассуждения позволяат предположить,что после высокоскоростной инъекции не все бластомеры трансформированы , и вероятность получения генетических химер очень высока.

6.Перенос плаз!мд::оп ДНК pSY3-r.cc> в ранние эмбрионы мким.

Опыты по использования высокоскоростной механической инъекции для переноса чужеродной ДНК в ранниа эмбрионы мыш проводились совместно с кафэгрой эмбриологии МГУ иы.М.В.Лоыоноссза. Ранние эмбрионы получал» от мыпея линии С57 Ыас!^ и ЭНК стандартным методом.Непосредственно пере.л обстрелом эмбрионы помеиали на подложку.состоящую из 2 2 агара, г; минимальном количестве среды.3 эксперимент брали 60-100 эмбрионов.Псследушэе культивирование и трансплантацию псевдобеременным мыпам прозодили по общепринятому методу.

Два основных фактора определяют гибель з>.;брконоз в ходе обстрела: первый - размер микрочастиц и степень их рассэивания, зтороя-стадия развития.Бо всех наших опытах размер микрочастиц колебался от1 до 3 мкМ.а степень рассеивания подбиралась таким образом.чтобы гибель эмбрионов после обстрела составляла не более 30 7. .

Выбор стадии развития эмбриона для провидения еысокосксростнол механической инъекции составляет самостоятельную задачу.Это связано с тем,что з настояцзе вреья нет точных экспериментальных дан-

ных,позволяющих предсказать пути последующей дифферекцировки конкретного бластомера,оценить возможный зклад той или иной к ки е формирование собственно тела будущего животного .Бее суш вувкие предположения на этот счет строятся только на основе к венных данных! Дыбан, 1986).

Проведенные эксперименты можно подразделить на три этап, первый - высокоскоростная механическая инъекция ДНК в дзух-," четырех-клеточные эмбрионы; второй - высокоскоростная инъекции иорулу и третий' - инъекция в бластоцисту(таол.2 ) .Как видно из результатов,предстазлеккых в таблице,лучае всех после високос! ростной механической инъекции ДНК развиваются эмбрионы,обстре; кие на двух-,четырех- клеточной стадии,Однако,анализ ДНК, пол'. ' ней от 27 мышей,развившихся из этих эмбрионоз.не обнаружил в I последовательности гена пео.В то же время,цитологический анал1 двух-,четырех- клеточных эмбрионов показал ,что частицы вольф£

Таблица 2

Выживаемость змбвионзв после высокоскоростной механической инъекции ДЦК

!

СТ4ДИЯ рйЗ&КТИЯ 8 мемопт о-З стрела Исследо-змбрнонсз Повреждено посте обстрелз. Дегенернрсзг-то при султ,тнпнрсвд-кт-:к ш 'Л1го 24 ч ....... Трансплантировано змбрнсноЕ

" вегге имплантировалось ■ резорбн-ровное:

Ддухклеточнме эмбриона 5 - 2й 22 . 4

Морули 34 С iS - 4 4

Бл&СТО({НСТЫ 1 52 - Траислд&ледоя 0£3 кул^тнпировь,-нмя 52 гз 6

находятся не только .в цитоплазме и ядрах бластомеров,но в отдельных случаях лезкат "на митотических хромо сомах I рис.7Аи5) .Наблюдаемое противоречие можно объяснить,если прилера^ваться теории композиционной гетерогенности дробящихся зародышей! ДабанЛЭбО ).Суть

............. к.

• " « 1

5 | {

- ^^ Г

(

Ш

1

\г Л

Р'лс .7А.Суховоздуда:ия цитологичэския препарат 2-4-клеточных эмбрионов уыши! окраска Гкмза ) после высокоскоростной механическое ин«екции ДНК .Частицы вольфрама указаны, стрелкой.(¿мкрофото об. бОх,ок.15х.

ряс.7о.Митотнчэские хроиэсоик мыли (охр&ска Ггиза) после аысох^скоростяоа дехаинчевхоя иябоди»: ДКК ь ранние эмСриом* НУ.ИИ.Частицы вольфрама '/казаны стрзлкг.й. ¡-•лкро^ото об ЛООх.ок Л5х.

теории сводится к толу,что во внутренней клеточной массе бласто-цисты преимущественно распределяются потомки бластомеров.быстрее завершавших клеточные циклы.Хорошо известно,что в ходе микроинъекции скорость дробления бластомеров несколько снижается. По нашим наблюдениям,распределение частиц вольфрама по бластомерам одного эмбриона носит ярко выраженный гетерогенный характер,что, по-видимому.должно увеличивать композиционную гетерогенность дробящихся зародышей.Очевидно,с этой точки зрения внутренняя масса бластошсты преимущественно должна формироваться из потомков бластомера, получившего наименьшее число вольфрамовых частиц.Это несомненно сказывается на числе полученных в итоге трансгенных животных.Хотелось бы еще раз отметить,что данные рассуждения носят предположительный характер.

В опытах на морулах был отмечен большой процент гибели эмбрионов после высокоскоростной механической инъекции в ходе последующего индивидуального развития ( таблица 2 ).Так из 16 трансплантированных, внешне нормально развивающихся морул, на семнадцатый день развития было получено только четыре эмбриона. По-видимому, это связано с некоторыми особенностями данной стадии развития.Главная из них состоит з том,что на стадии морулы бластомеры впервые подразделяются на два типа клеток: наружные полярные и внутренние аполярные (коыпактиэация и поляризация бластомеров).Решающее значение для последующего развития имеат перестройки мембраны полярных клеток.Проведенный цитологический анализ показал,что после инъекции большая часть частиц вольфрама концентрируется в районе апикального полюса наружных бластомеров.Можно предположить,что повреждение апикального полоса поверхностных бластомеров блокирует в ряде случаев последующий процесс формирования бластошсты - кавитацию.

Более перспективным кажется перенос чужеродной ДНК во внутренней клеточную массу бластоцисты (таблица 2).Предварительная серия экспериментов позволила охарактеризовать распределение частиц вольфрама в эмбриональной ткани бластоцисты (рис.7В).Из 22 проанализированных посла высокоскоростной инъекции бластоцист в 20 обнаружены частицы вольфрама; из них 12 бластоцист содержали вольфрамовые гранулы во внутренней клеточной ыассе.

Следующая серия опытов была посвящена выяснению возможности

рис .ТЕ.Сериикыя полутоккия срез бластошсты мыши после

высокоскоростной мехаклчэскоя инъекция ДНИ (окраска толуидиновым синим).Частицы вольфоама указаны стрелкой. Микрофото о0.1ООх,ок.15х.

переноса плазмидноя ДНК в клетки,формирующие постимплантационные эмбрионы.Для этого использовали хорошо апробированную в предыдущих опытах на рыбах ллазмиду рЗУЗ-пео.В первом опыте ДНК мышея проанализировали на наличие гена неомицинфосфотрансферазы при по-

ыоши поликеразной цепной реакции с последующая гибридизацией (рис. 6). Зарегистрирован один положительный сигнал.Во втором опыте при помош полимеразной цепной реакции получен eme один положительный ответ.В третьем опыте методом амплификации и дот-блот гибридизации показано наличие гена neo в тотальной ДНК .полученной от мыши,родившейся посла имплантации!рис.9 ).В целом из 27 проанализирован-

рис.е.

Гибридизационный анализ продукте реакции амплификации ДНК. мыши. 1 к 4а - амплифицированная ДНК рЗУ2-пео (положительный контроль ); 2 и За -амплифицированная ДНК мыш (отрицательный контроль); 3 и 2а - амплифицированна ДНК мыки;4 и 1а - ДНК фага X.

рис.3.Дот-гибридизация тотальной ДНК мыши с плазмидной ДНК рЗУ2-пео.

1,2 - ДНК мышея опытной группы;3 - отрицательный контроль.

рис.10.Анализ результатов реакции амплификации ДНК мыши.

1,3,5,7 - ДНК из околоплодных оболочек;2,4,6,б - ДНК из собственно тела эмбриона.

^iSri

'cid

1 _

Vía 2а За -'le

ных после рождения животных ДНК трех содержала последовательности, аналогичные последовательности гена пео.Из этих трех животных в двух случаях положительный результат был зарегистрирован при переносе плаэмидноп ЛИК в бластоциету ,и в одном - при переносе в морулу.

Заключительная серия опытов была посвящена доказательству высказанного выше предположения о том,что в ходе высокоскоростной механической инъекции ДНК высока вероятность получения генетических химер.Для этого при помоши полимеразноя цепной реакции проанализировали серию постимплантационных эмбрионов 14 - 17 дня развития.При этом помимо собственно эмбриона независимо от него анализировали соответствующие ему околоплодные оболочки,которые происходят от значительно большего,чем сан эмбрион,числа клеток внутриклеточной массы бластоцисты.В этой серии опытов перенос проводили только на стадии бластоцисты.Результаты анализа приведены на рисунке 10.Из трех положительных сигналов в двух случаях ген псо детектировали в околоплодных оболочках.

Таким образом,проведенные эксперименты показали принципиальную возможность использования высокоскоростной механической инъекции ДНК для введения чужеродных генов в ранние эмбрионы иит, что открывает широкие возможности по применению этого метода при получении трансгенкых животных.С другой стороны,суммируя опыты на рыбах и мышах,можно сказать,что продемонстрирована новая возможность высокоскоростной механической инъекции ДНК как способа мечения клеток в ходе индивидуального развития.

Т.Генетическая трансформация пюаяшхы.

Опыты на рыбах и мышиных эмбрионах показали,что перенесенная при помощи высокоскоростной инъекции ДНК может передаваться последующим поколениям клеток в ходе индивидуального развития.Тем не менее,оставалось неясным, могут ли. клетки, проходящие в своем развитии стадию мейоза, передавать перенесенную на вольфрамовых шарах чуякродну» ДНК последующим поколениям.Для ответа на птот вопрос мы воспользовались единственной для нас доступной биологической моделью - халлусноя тканью озимой пис-ницн.Для переноса был использован растительный вектор рСА471.

Вектор pGA471 представляет собой классическую челночную плазмиду на основе pBR322,которая содержит кодирующую часть гена неомецикфосфотрансферазы из Tn5 (ntp 11) под промотором гена нопа-лин-синтетазы (nos ) .Участок ms-ntpll фланкирован Т-ДНК из Т1 плаз-миды.Данный вектор.был успешно использован для трансформации каллусов двудольных растений! G.An,1965).К моменту начала наших опытов возможность получения трансформированных однодольных растения при помощи pGA471 продемонстрирована не была.К этому необходимо добавить, что пшеница относится к числу слозкнотрансформируемых объект-тов и любой положительный результат в этом направлении представляется интересны«.Эта часть работы была выполнена совместно с Институтом физиологии растений и генетики АН Украины.

В трехдневную каллуснув ткань озимой пшеницы,индуцированную из незрелых зародышей селекционной линии УК 8,проводили высоко-скорсткую механическую инъекцию ДНК .Через трое суток каллусную ткань переносили на среду МС,содержащую 2 мг/л 2,4-Д и 50 мг/л канамицина как селективного агента.По лученные канамицинустсйчл-

12 12

Рис.11. Анализ продуктов реакции амплификации и Дот-гибридизация тотальной ДНК пшеницы.

1. отрицательный контроль (ДНК пшеницы УК-8)

2. ДНК пшеницы УК-3 из опытной партии

вые клоны спустя месяц вновь переносили на безгормональную среду с канамицином (100 мг/л).Среди 135 растения.регенерировавших из канамицинустойчиаых клонов, в условиях теплицы выжило с образованием семян в колосе 15.Давшие семена растения имели большую степень стерильности,что выразилось в существенной черезэерни-це.Полученные семена высеяли в поле,получили следующее поколение семян,а из самих растений выделили ДНК для последующего анализа.

Полученную ДНК анализировали на наличие гена неомецинфос-фотрансферазы при помощи двух независимых методов: дот-блот гибридизации и при помоши полимеразноя цепной реакции.В одном случае обнаружено наличие последовательности ДНК. гена неомицинфосфо-трансфераэы в суммарной ДНК пшеницы,полученной из семян растений трансформированных плазмидои pGA471(pnc .11 ).

Таким образом,полученный результат позволяет сделать вывод о том,что перенесенная при помощи высокоскоростной механической инъекции ДНК в ряде случаев может быть передана последующим поколениям высших организмов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Высокоскоростная механическая инъекция в клетки животных (состояние проблемы и перспективы использования).

Выше уже говорилось о том,что первоначально высокоскоростная механическая инъекция была предложена з 1987 году б Корнельском университете (СШ) группой Клеяна и Сэндфорда для трансформации клеток растений ,в первую очередь тех,регенерация которых из протопластов не проходит,а трансакция каллуса с помошь» обычных методов не осуществима из-за толстой клеточной стенки.При помощи этого метода группе Клейна и Сэнфорда удалось трансформировать табак (протопласты)/кукурузу, ссевые.бобы и т.д.В последующие годы данный подход получил распространение на различных биотехнологических фирмах.

Для трансформации животных клеток высокоскоростная механическая инъекция ДКК впервые была успешно использована в лаборатории А.В.Зеленина.При помоши этого подхода удалось получить устойчивые к антибиотику G416 клетки мыши NIH ЗТЗ.Впервые эти результаты были опубликованы б 1980 году.Возможность такого рода транс-

формации клеток In vitro была позднее подтверждена в других исследованиях (Yangret al., 1991).

Перенос чужеродной генетической информации в эксплантаты (ткани ) различных органов явился новым шагом в развитии техники трансгеноза,значительно расширяющим область ее применения.Впервые возможность высокоскоростной механической инъекции в эксплантаты печени,почки и молочной железы мышей и крыс была продемонстрирована нами в 1989 .Позднее аналогичный результат был получен и рядом других авторов (Yang et al.,1991,Williams et al.,1991),что позволило перейти к трансфекции отдельных органов in vivo.

Перенос плазмиднов ДНК pTAT-cat в клетки печени крысы in vivo (А.А.Алимов и др. Д990 i ,плазшдной ДНК RSY-cat в печень, мыицы и кожу мышей in vivo (Yang et al.,1990) позволяют надеяться,что данный подход может быть широко использован в медицине для коррекции генетических заболеваний и в биотехнологической практике.Так,в 1992 Tang и др. использовали высокоскоростную механическую инъекцию для получения специфических антител к гормону роста человека.

Одновременно с переносом чужеродной генетической информации б группы клеток отдельных тканей и органов in vivo были предприняты попытки по переносу рекомбинантных плазмидных ЛИК в развивающиеся эмбриона различных видов.Впервые возможность такого рода переноса Оыла продемонстрирована в наших экспериментах на рыбах Перенесенная плазмидная ДНК pSV'3-neo придала личинкам и малькам рыбок Erachyd&nlo rerio устойчивость к антибиотику G418.Несколько позднее была показана возможность переноса плазмидных ДНК в клетки внутренней клеточной масса бластоцисты mulm.Интересные результата получила другая группа исследователей на дрозофиле (Baidareiii et al.,1990).При помощи высокоскоростной механической инъекции репортерньги ген ß-gal переносили в раззивающиеся эмбриона дрозофилы.Экспрессию гена наблюдали в течении последующих двух дней после переноса.Таким образом,предложенный подход может быть с успехом использован для получения организмов с трансформированным генотипом.

В настоящее время интерес к высокоскоростной механической инъекции непрерывно возрастает. Она успевно используется для трансформации клеток растений, животных,простеяших,микроорганизмов и трансформации клеточных органел.

выводы.

1.С ломошь» высокоскоростной механической инъекции(трансфекции ) Сил осуществлен перенос ллазмидноя ДНК pSV3neo в.культуру первичных фибропластов мыши и в клетки перевиваемой клеточной линии L929.Получена серия устойчивых к антибиотику G418 клонов первичных и перевиваемых клеток мыши,что подтвердило возможность использования данного подхода для генетической трансформации клеток ¡животных.

2.С помок!ью высокоскоростной механической инъекции осуществлен перенос ДНК плаэмид pTAT-cat,p0cas-cat,pxcas-cat в эксплантаты печени,почки и молочной железы мышей и крыс.Показано,что через 24 часа после высокоскоростной инъекции перенесенный ген зкспрес-сируетг.я в эксплантатах печени и молочной железы.Таким образом, перенесенная ДНК сохраняла свою функциональную активность.

3.Проведена высокоскоростная механическая инъекция плазмидной ДНК pTAT-cat з клетки печени крысы in vivo.Через 24 часа после инъекции в клетках обстреленкой части печени обнаружена экспрессия перенесенного гена.Показана принципиальная возможность использования высокоскоростной механической инъекции для переноса чухэродной ДНК в клетки печени in vivo.

4.С ломояшю высокоскоростной механической инъекции ДКК осуществлен перенос плазнидной ДНК pSY3-neo в оплодотворенные развивающиеся яйца рыб.Получен ряд устойчивых к антибиотику G418 рыб Brachydanlo rerio.Анализ ДНК этих рыб показал в ней присутствие перенесенной ДНК гена neo.Таким образом продемонстрировано, что данный подход мояат быть успешно использован для получения трансгенных рыб.

5.При помош высокоскоростной ыеханическоя инъекции ДНК удалось осуществить перенос плазмидной ДНК pSY3-neo в группу клеток внутренней клеточной массы бластоцисты,мыши.При помощи полимераз-ноя цепной реакции показано наличие пересенкого гена neo в тотальной ДНК мышея развившихся из этих бластоцист.Сделан вывод о том,

что подход поззоляет метить и прослеживать судьбу отдельных клеточных групп в ходе индивидуального развития организма и может быть использован для получения трансгенных млекопитающих.

6.При помощи высокоскоростной инъекции ДНК получены устойчивые к антибиотику канамицину каллусы пшеницы,из которых удалось регене-ровать взрослые растения.Потомки регенерантов содержали ДНК перенесенного гена неомицинфосфотрансферазы 2.Продемонстрировано, что перенесенная при помощи высокоскоростной механической инъекции ДНК передается последующим поколениям через клетки зародышевого пути.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Алимов А.А..Колесников В.А..Титомиров А.В..Казанский А.В., Городецкий С.И.,Зеленин А.В. Введение чужеродных генов в клетки печени,почки и молочной железы с помощью высокоскоростной механической инъекции ДНК,ДАН СССР 1990,т.315,6,1473-1474.

2. Zelenln A.V. .Titomlrov A.V. .Kolesnikov Y.A..Zelenlna

I. A.,Barmtntsev V.A. .Zhadanov A.V. .Graslnchuk M. A. .Goroctetsky S.I., Allmov A. A. .Kazansky A.V. In vivo trans feet ion of fish and rodent cells with the aid of high-velocity mechanical DNA injection. Тезисы докл. 2-го двустороннего симп. СССР-США (Тбилиси, 16-20 октября 19S9 г.) М. 1989, с.66-67.

3. Колесников В.А., Алимов А.А., Барминцез В.А., Бенюмов А.О., Зеленина И.А., Краснов A.M., Джабур Р., Зеленин А.В. Высокоскоростная механическая инъекция чужеродной &НК в яицек-. летки рыбы. Генетика 1990, 26, 12, 2122-2125.

4. Zeler.in A.V., Alimov А.А. , Titomlrov A.V., Kazansky A.V. Gorodetsky 5.1., KolesnVnov Y.A. Higti-velosity mechanical DMA transfer of the chloramfenlcolacetyl transferase gene into rodent liver, kidney and camaary gland cells in organ explants and in vivo. rEBS LETTERS 1991, 280, 94-96.

5. Zelenln A.V., Alimov A.A., Barmintsev V.A., Beniimov A.O., Zelenina I.A., Krasnov A.M., KolesnlKov Y.A. The delivery of foreign genes into fertilized fish eggs using high-velocity

microprojectiles. FEBS LETTERS 1991, 207,110-120.

6. Зеленина И.А., Семенова М.Л., Алимов A.A., Колесников В.А., Голиченков В.А., Зеленин A.B. Использование высокоскоростной механической инъекции для переноса чужеродной ДНК в ранние эмбрионы иышя. Генетика 1991, 27, 12, 2182-2166.

7.Zelenln А.V..Kolesnlkov V.A..Titomlrov A.V.,2elenlna I.A..Baraitzev V.A..Benyuaov A.V..Gorodetsky S.I.,Aliaov A.A., Kazansky A.Г.,Cell Biol.Intern.Hep.,1990,v.14,ais.sup.,p.219.

6.Сидорова H.B..Колесников В.А.,Алииов А.А.,Иоргун В.В., Логвиненхов В.Ф.,Зеленин A.B. Генетическая трансформация с помошъв высокоскоростной механической инъекции ДНК и характеристика канамицинустоячивых клеточных линия озимой пшеницы. Новые методы биотехнологии растения,Пугошо,1991.с.79.