Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Использование метода микроинъекции чужеродных генов для получения трансгенных свиней

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Использование метода микроинъекции чужеродных генов для получения трансгенных свиней"

:^С(^)ЗНЕРРордена ТР^ДОШЭ

1 ^СЕС(Ж)ЗНЬ11гг ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

(ВИЖ)

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Иван Михайлович

УДК 577.21

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МИКРОИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ

(06.02.01 - РАЗВЕДЕНИЕ, СЕЛЕКЦИЯ И ВОСПРОИЗВОДСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУБРОВИЦЫ — 1989

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетической инженерии с.-х. животных ВНИИЖа.

Научные руководители:

доктор биологических наук И. Я. Шихов доктор биологических наук Б. А. Кузин

Официальные оппоненты: доктор биол. наук Н. И. Сергеев

кандидат биол. наук А. А. Языков

Ведущее учреждение: ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных

Защита состоится «—0—ъ на заседании Специализированного совгга Д. 020.16.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес: 142012, Московская обл.. Подольский р-н, пос. Дубро-внцы, ВНИИ животноводства.

С диссертацией можно ознакомиться^^н^луотеке института. Автореферат разослан « ^ -^ 989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор

сельскохозяйственных наук А. И. Филатов

мтщ

; / - 1 -

'. ; I

- .¡¡X ч '

. -1 _

1 " Актуальность темы. Значительные успехи, достнгнутне в

£Г''.ЦЧгЬ;_

шЕяеднее десятилетие в области гепэтаческой трансформации соматических клеток еивотных, стали возыоэяыин благодаря развитию генно-инпзнериоЭ - технологии. Закономерный интерес к генетической трансформации половах клеток илекопитагцях Еиззвп тем, что в случае успеха ко~зо огадать пгмэнения фенотипа на уровне целого организма и наследования трансфоргяровЕШОго признака потомки л. Особенно зачанчзвой представляется генетическая трансформация половых клеток сельскохозяйственных гивотных. Ее использование делает возгзояом направленное изменение генома ' с целью создания пород г^воткых, обладащпх новыми, цонтт:."д продуктивными прпзнвкшн, или глвотных, продуцирующих технологически вагине белки, чего швос:лозно добиться традициопшая методами селекции. Правомочность тапоЗ постановки вопроса вытекает из результатов работ,

проводившихся с начала 80-х годов советская и зарубэгзшки ученшги по генетической трансформации лабораториях еивотных, в основной мышей ( РаЗж^ег И.Б., Вг1пв1:ог И.Ь., 1986 ).

Однако, к началу выполнения данной диссертацкогшоЗ работа в печати, было опубликовано лишь три статьи зарубежных авторов ( Вгеп вt а1., 1985 ; Нашшег а1., 1985 1985 ), в которых сообщалось об успешных попытках получения трапсгошшх зельскохозяйствешшх ствотпых. Эти статьи нэ только не зодерзали . подробного описания хода выполнения работы, но п доставили целый ряд методических проблем, ресенпе которых ютребовало дальнейшего рпстарения работ в етой области.

Цель и задачи исследования. Цель исследования зостояла в изучении влияния шпсрошгьекцпЗ, в сочетании с готодами визуализации ядерного материала, на гшзнеспособность

- г -

ранних эмбрионов свиней, а также получение трансгенных свине! посредством микроинъекции чужеродной ДНК в ранние эмбрионы.

Для достижения намеченной цели необходимо было решил следующие задачи:

1) детально разработать и усовершенствовать техник! микроинъекции чужеродных генов в зиготы свиней;

2) определить стадию развития ранних эмбрионов свиней, наиболее подходящую для проведения микроманипуляций;

3) изучить влияние процедур предварительной обработки и микроинъекций ранних зародышей свиней на их выживаемость к жизне способность;

4) определить эффективность интеграции чужеродной ДНК е состав генома свиней и экспрессию интегрированного гена.

Научная новизна полученных результатов:

- показано, что метод микроинъекции чужеродных ДНК в ранние эмбрионы применим для получения трансгенных свиней с обще5 эффективностью - 4,8%;

- установлено, что микроинъекция, центрифугирование или га сочетание вызывают появление видимых нарушений целостности ранних эмбрионов свиней на незначительном уровне, не превышавдек ?■%. Сочетание центрифугирования и микроинъекции резко снижает их жизнеспособность, так как только 10,6% от числе центрифугированных и микроинъецированных эмбрионов развивались до рождения;

- показано, что для проведения микроинъеций чужеродных ДНК с целью получения трансгенных свиней целесообразно использовать эмбрионы на стадии зиготы, так как при достоверно более высокое жизнеспособности микроинъецированных зигот посравнению с микроинъецированными 2-клеточными эмбрионами общая эффективность

получения трансгенных животных после микроинъекции в зиготы достигает 8,9% и достовено превышает таковую в случае использования 2-клеточных эмбрионов;

получены трансгенные свиньи с по дтв-э рждо иной радаоиммунологическим и шмуноферментным методами экспрессией генов соматотропина быка и поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Продукты экспрессии этих генов могут иметь медицинское и народнохозяйственное значение.

Практическая значимость результатов исследования. Полученные данные могут быть использованы для увеличения выхода трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности свиней. Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на конференции

молодых ученых института вирусологии АМН СССР им. Д.И. Ивановского в декабре 1987 года; на 41-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВНИИЗКа в мае 1988 года.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Объем работы - 70 страниц, включая 7 таблиц и 8рисунков. Список литературы включает 77 работ, в том числе 69 на иностраннкх. языках.

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве доноров эмбрионов были использованы помесные ремонтные свиноматки ( Крупная белая х Ландрас ) в возрасте 7-8 мае. живой массой I00-II5 кг. Для увеличения числа овуляций часть животных была подвергнута гормональной обработке.

В качестве реципиентов использовали неосемененных помесных

( Крупная белая х Ландрас ) ремонтных свинок возрасте 7-8 гас. живай массой 100-115 кг, синхронных то половому циклу с донорами.

Эмбрионы свиней на ранних стадаях развития получали через 48-50 часов после введения ХГ или через 24-26 часов после покрытия хряком посредством прошвания яйцеводов, выделенных при. убое животных-доноров. В некоторых случаях извлечение вибрионов проводили хирургически по описанному A.A. Некрасовым и соавторами ( 1968 ) методу.

Качество эмбрионов оценивали под поляризационно-интерференционным микроскопом "Еиолар-Ш" ( ПНР ). Эмбрионы на стадии 1-ой клетки считали оплодотворенными, если у них были видны. . 2 направительных тельца и/или многочисленные сперматозоиды, прикрепленные к прозрачной оболочке.

Для микроинъекций в ранние эмбрионы свиней использовали предоставленные Г.Н. Ениколопвым ( лаб. нуклеиновых кислот института молекулярной биологии АН СССР ) рекомбинвнтные линеализированные ДНК, содержащие ген ъон или ген HBSAg. . Рекомбинантные конструкции помимо клонированной комплементарной ДНК генов bGH или HBSAg, содержали промоторную область вклоталцуп енхансер, промотор и часть Б'-концевой яетранслируемой области MFHK ) гена ЫТ-1 мыш, донорвый и акцепторный участки сплайсинга из ранней области вируса st 40 и участок полифденелирования из этой же области. Перед микроинъекцией маточный раствор инъецируемых рекомбинантных ДНК разводили до концентрации I мкг/мл средой Виттена ( Whitten, 1976 ).

В целях выполнения поставленных задач нами было проведено 2 эксперимента. В эксперименте N I для визуализации ядерного

материала ранние эмбрионы свиней исследовали методом золяризационно-интерференционного контраста в однородном поле с томощью микроскопа "Биолар-ПИ". В эксперименте N 2 эмбрионы таред визуализацией -ядерного материала подвергали тредварительному центрифугированию по методу, предложенному (аммором и соавторами ( Налпюг et al., 1935 ).

При микроинъекциях использовали микроманипуляторы КМ-2. В эбласть одного из пронуклеусов или каждого ядра инъецировали [-1,5 шг раствора чужеродное ДНК в концентрации I мг/мл. Введение раствора ДНК обеспечивалось с помощью пневматического ручного инъектора.

Микроинъецированные эмбрлопы после оценки их травмируемости трансплантировали свиньям-реципиентам. Критерием травмируемости служило появление видимых признаков нарушения целостности >мбрионов в течение 1-1,5 часов, непосредственно предшествующих трансплантации. Травмированные эмбрионы реципиентам не "ранспл актировали.

Иизнеспособность микроинъецированных и трансплантированных )мбрионов оценивали по результатам опороса реципиентов.

ДНК из тканей полученного потомства выделяли по методу ¡лина и Стаффорда ( Blin, Stafford, 1976 ).

Гидролиз ДНК рестрикционными эндонуклеазвми, препаративный !Лектрофорез, перенос на нитроцеллшозный фильтр и гибридизацию [роводили по Маниатису и соавторам ( 1984 ).

Экспрессию генов HB&Ag и bGH определяли по наличию оответствупцих белков в сыворотке крови анализируемых животных.

Наличие HBsAg в сыворотке крови свиней определяли методом ммуноферментного анализа ( ИФА ) с помощью пммуноферментной ест-системы , разработанной в институте вирусологии им. Д.И.

Иваницкого АОДН СССР на основе МКА к ЕВвао ( Кущ и др., 1987 ).

Наличие bGH в сыворотка крови свиней проводили по методу твердофазного РИА на основе метода двойных антител ( Исвченков и др.. 1981 ).

Для статистической обработки полученных данных использовали критерий Стьсдента для долей.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В ходе выполнения данного исследования было использовано. 83 донора, от которых получили 1128 эмбрионов ( 89,3% от числа овуляций ) на ранних .стадиях развития. 1051 эмбрионов ( 93,2% ). были оценены как пригодные для дальнейших манипуляций. Остальные эмбрионы ( 6,8% ) оказались либо дегенерированшми, либо неоплодотворенными. В экспериментах нами были использованы эмбрионы 3-х групп: 551 эмбрион на стадии зиготы; 446 эмбриона на 'стадии 2-х бластомеров; 54 эмбриона на стадии 3-х и более Сластоыеров. Так как последнюю группу эмбрионов не подвергали микровньекции чужеродных ДНК, ее не учитывали при анализе результатов опытов, направленных на получение трансгенных свиней. Вместе с тем эмбрионы этой группы включали в общее число трансплантированных свиньям-реципиентам эмбрионов, так как в большинстве случаев их трансплантировали в целях поддержания супоросности.

В ходе выполнения экспериментов 48 реципиентам трансплантировали 1012 ранних эмбрионов свиней, 958 из которых подвергали микроинъекции чужеродных ДНК. В результате экспериментов у 28 реципиентов родилось 209 поросят, что составило 20,7% от общего числа трансплантированных эмбрионов и

31, За от числа эмбрионов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам. Поросята роздались фенотипичоски нормальными. Средний вес при роадении составил 1,3 кг.

2.1. влияние микроинъекции и методов визуализации ядерного материала на травмируе!.к>сть и яизнеспо-способность ранних эмбрионов свиней.

В эксперименте N I было использовано 706 ранних эмбрионов свиней, 297 из которых находились на стадии зкготн, 361 - на 2-клеточной стадии и 48 - на более поздних стадиях развития. Результаты эксперимента приведены в таблицах N I и к 2.

При изучении вибрионов методом голяризацнонно-интерфе-ренционного контраста в однородном поле ядерный материал был визуализирован у 30,3% зигот и 39,1% 2-клеточных эмбрионов. Уровень визуализации ядерного материала у 2-клеточных эмбрионов достоверно превышал таковой у зигот ( р<0,05 ).

Микроинъекция не оказывала существенного влияппя на травмируемость эмбрионов. Так 93,62 зигот и 96,1% эмбрионов на стадии 2-х бластомеров благополучно перенесли микроинъекцию. Травмируемость зигот з эксперименте N I была достоверно выпе ( <0,05 ) таковой у 2-клеточных эмбрионов.

После микроинъекции экзогеной ДНК 673 ранних эмбриона свиной, 625 из которых были подвергнуты микроинъекции и находились на стадии зиготы или 2-х бластомеров, трансплантировали 32 реципиентам. Супоросными стало 23 реципиента ( 71,8% ). В результате родилось 173- поросенка, включая мертворожденных. Уровень рождаемости составил 25,7% от эбщего числа трансплантированных эмбрионов и 36,0% от числа

Таблица N 1

Визуализация ядерного материала и травмируемость после микроманипуляций с ранними эмбрионами свиней.

I Ранние эмбрионы свиней на стадии: I

I-------------------------------------------1 всего

I зиготы (X) I . 2-х бластомеров (2) I

Эксперимент N 1 1

со

90/297 (30,32) 141/361 (39,12) 231/658 '

19/297 (6,4%)х) 14/361 ( 3,92) 33/658

278 347 625

Эксперимент N 2

Центрифугировано Визуализация Травмируемость Трансплантировано эмбрионов

Визуализация Травмируемость Трансплантировано эмбрионов

254 85 339

181/254 (71,32)хгс> 79/85 ( 92,92) 260/339

5/254 1/85 6/339

249 84 333

х) р < 0,05; хх) р < 0,01; ххх) р < 0,001

Трансплантация ыикроинъецированных эмбрионов

Таблица N 2

1 Эксперимент N 1 1 Эксперимент N 2

Использовано реципиентов 32 23 (71,82) Х' 16

Стало супоросными 7 ( 43,82)

Трансплантировано эмбрионов 673 339

в т.ч. ставшим супоросными реципиентам 481 156

Рождено поросят, включая мертворож-

денных 173 36

Уровень рождаемости:

а) от обпего числа трансплантиро- 25,72

ванных эмбрионов 10,62

б) от числа эмбрионов, трансплан-

тированных супоросным реципи- 36,02 1x5

ентам 23,12

х) р < 0,05 хх) р < 0,01

эмбрионов, трансплантированных реципиентам, ставшим супоросными.

В рамках эксперимента N I 14 реципиентам трансплантировали только зиготы или только 2-клеточные эмбрионы. Результаты такой трансплантации приведены в таблице N 3. Всего было трансплантировано 135 зигот и 130 2-Алеточных эмбрионов. Все 7 реципиентов, которым трансплантировали зиготы, стали супоросными. Впоследствии у них родилось 58 поросят, включая мертворожденных, что составило 43* от общего числа трансплантированных эмбрионов. Только 4 из тех 7 реципиентов, которым трансплантировали 2-клеточные эмбрионы, стали супоросными. Их супоросность завершилась рождением 20 поросят, включая мертворожденных, что составило 15,4% от общего числа трансплантированных эмбрионов и 24,7% от числа эмбрионов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам.

В эксперименте N 2, результаты которого приведены в таблицах N I и N 2, был использован 345 эмбрион, 254 из которых находились на стадии зиготы, 85- на стадии 2-х бластомеров и б -ка стадии 3-х и более бластомеров. Травмируемости эмбрионов после центрифугирования нами обнаружено не было. У подавляющего числа 2-клеточных эмбрионов ( 92,9% ) и у значительной части зигот ( 71,3$ ) после центрифугирования был визуализирован ядерный материал. Травмируеыость после микроинъекции чужеродных ДКК в центрифугированные зиготы или 2-клеточные эмбрионы была одинаково низка и не превышала 2%.

После трансплантации 16 реципиентам 339-ти ранних эмбриона, супоросными оказалось только 7 из них ( 43,8% ). Супоросность

завершилась ровдвнкем 36 поросят, что составило 10,6% от общего

«

число трансплантированных эмбрионов и 23,1% от числа

вибрионов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам.

Таблица N 3

Результаты трансплантации реципиентам только зигот или только 2-клеточных эмбрионов, подвергнутых микроинъекции

I Эксперимент N 1 I Эксперимент N 2

1 1 1 1 зиготы (I) 1 1 2-клеточные 1 эмбрионы (К) 1 ЗИГОТЫ (2)

Использовано реципиентов 7 7 8

Стало супоросными 7 (1002) 4 (57, IX) 4 ( 502)

Трансплантировано эмбрионов 135 130 169

в т.ч.реципиентам, ставшим

супоросными 135 81 82

Рождено поросят 58 20 26.

Уровень рождаемости:

а) от общэго числа транспланти- 43Х11)

рованных эмбрионов 15.« 15,42

б) от числа эмбрионов, транс-

плантированных супоросным 432

реципиентам 24,72 31,72

х) р < 0,05 хх) р < 0,01

В рамках вксперимента в 2 восьми рецишентаы, также как и в вксперименте Н I, трансплантировали только зиготы. Результата такой трансплантации приведены в таблице N 3. Всего было трансплантировано 168 зигот, подвергнутых центрифугированию с последующей кикроинъекцией. Супоросными стало только 4 реципиента. В результате супоросности у них родилось 26 поросят, что составило 15,4% от обцего числа трансплантированных эмбрионов и 31,7% от числа вибрионов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам•

Анализ полученных данных показывает, что ни центрифугирование, ни кикроинъекция , ни их сочетание не вызывают существенного травмирования ранних вибрионов свиней, так как в обоих экспериментах уровень травмируемости зигот и 2-клеточных вибрионов был очень низок.

Более высокий уровень травмируемости зигот после кикроинъекции в эксперименте N I по сравнению с таковым в эксперименте н 2 ( р<0,01 ) мовет быть объяснен недостаточно квалифицированным овладением метода микроинъекции на первых этапах выполнения эксперимента N I. Кроме того не исключено, что некоторая часть I-клеточных вибрионов находилась укэ в состоянии цитокинеза. Ыикроинъекция в такие эмбрионы могла снизить общую выживаемость микроинъецированпых зигот.

Центрифугирование существенно увеличивает уровень визуализации ядерного материала. Из таблицы N I видно, что в эксперименте N 2 уровень визуализации ядерного материала как у зигот, так и у 2-клеточных эмбрионов достоверно ( р<0,001 ) превышает таковой в вксперименте N I. Вместе с тем, необходимо отметить, что на более низкий уровень визуализации пронуклеусов у зигот в эксперименте N I могли оказать влияние следующие

факторы: во-первых, отсутствие на первых порах навыков визуализации ядерного материала; во-вторых, ко времени проведения микроинъекцш некоторые эмбрионы могли ухе пройти стадию сформированных пронуклеусов.

Сравнение результатов трансплантации вибрионов после микроманипуляций показало снизение уровней сугороспости и рдздаености в эксперименте N 2 по сравнении с экспериментом N I. Как видно из таблицы N 2 , уровень супоросности в эксперименте и I достоверно ( Р<0,05 ) превышал таковой в эксперименте н 2 и составил 71,8$ против 43,8S. Такая se закономерность прослеживается и в отношении уровней рождаемости, вычисляемых или относительно общего числа трансплантированных эмбрионов, или относительно числа эмбрионов, трансплантированных ставпим супоросными реципиентам. В эксперименте N I они составили 25,75 и 36,03 соответственно и достоверно превышали ( р<0,01 ) уровни рождаемости в эксперименте N 2, составившие 10,635 и 23,IX соответственно. По-видимому, существенное негативное влияние на уровни супоросности и рождаемости оказывает сочетание центрифугирования и кикроинъекцяи. Основанием для такого предполокения являются следующие факты: I) по данным Спрпнгмана и Брэма ( Springman, Вгея, 1906 ) и Брэма и соавторов ( Brem et al., 1985, 1986 ) только 12-18% центрифугированных и шкроинъедарованных эмбрионов развиваются в условиях In vivo до стадии морулы или бластоцисты; 2) достоверно ( р<0,01 ) более высокий уровень роздаемости после трансплантации только микроинъецированных зигот в эксперименте N I, чем в эксперименте N 2 ( таблица N 3 )

Как указывалось выше, в эксперименте и I 14- реципиентам трансплантировали только зиготы или только 2-клэточные эмбрионы.

- M -

Результаты этого опыта также приведены в таблице N 3. Оказалось, что уровень супоросности у реципиентов, которым трансплантировали только 2-клеточные эмбрионы ( 67,I* ), был заметно ниже чем у реципиентов, которым трансплантировали только зиготы ( 100* ). Кроме того, уровень рождаемости у таких реципиентов был достоверно ( р<0,05 ) ниже чем у реципиентов, которым трансплантировали только зиготы. Расхождение полученных нами результатов с данными Перселла и соавторов ( Pureel at al., 1987 ) не может быть- объяснено увеличением травмируеммости 2-клеточных эмбрионов после микроинъекции, так как в целом у зигот она была достоверно ( р<0,05 ) выше.

2.2. Интеграция я экспрессия чужеродных генов.

В ходе выполнения экспериментов 48 реципиентам трансплантировали 1012 ранних эмбрионов свиней, 958 из которых подвергали микроиньекции чужеродных ДНК. В результате экспериментов у 28 реципиентов родилось 209 поросят, что составило 20,7% от общего числа трансплантированных эмбрионов и 31,3% от числа эмбрионов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам.

Образцы тканей или органов 198 животных и образцы сыворотки крови 139 животных подвергали анализу на интеграцию и/ели экспрессию чужеродных генов. Анализ полученных данных выявил неожиданный результат. Несмотря на то, что в эксперименте N 2 в более чем 702 случаев микроинъекции чужеродных генов проводили непосредственно в пронуклеусы или ядра, в этом эксперименте не было роадено ни одного поросенка, содержащего чужеродный ген в эписомной или интегрированной форме или экспрессирущего его.

Эти данные ставят год сомнение необходимость использования центрифугирования в работах го микроинъекции чугародных генов в ранние эмбрионы свиней.

Изучение рожденных в эксперименте н I животных показало наличие в составе генома пяти из них чугеродной ДНК. Рзстрикционный анализ ДНК, выделенной из органов а тканей этих животных, позволяет сделать заключение о содержании трансгена в количествах менее I копии ( 0,3-0,5 ) на диплоидный геном, йце у двух поросят в 4-х повторах также были обнаружены положительные сигналы на присутствие трансгенов в ДНК, выделенной из образцов кожи этих животных. Генные конструкции у этих гзвотных, возможно, претерпели частичные перестройки и присутствовали как эписомы в количествах менее I копии на диплоидный геном.

Исследование сыворотки крови животных показало наличие в ней у 25 животных продуктов экспрессии чужеродных генов в количествах, достаточных для их достоверного определения. Два из этих животных содержали в составе генома чужеродную ДНК.

Таким образом, в ходе экспериментов было получено 30 трансгенных животных, что составило 3,156 от общего числа микроинъецированных в обоих экспериментах. эмбрионов и 4,835 от числа эмбрионов микроинъецированных в эксперименте н I.

Результаты анализа интеграции и экспресии чугеродных генов у животных, родившихся после трансплантации только зигот или только 2-клеточных эмбрионов в эксперименте н I, приведены в таблице N 4 Сравнение полученных данных показало, что общая частота получения трансгенных животных в случав трансплантации микроинъецированных зигот достоверно выше чем в случав трансплантации микроинъецированных 2-клеточных эмбрионов ( 8,92 против 2,ЗЖ ). Полученные нами данные не согласуются с данными

Перселла и соавторов ( Ригве1 е! а1., 1987 ), в соответствии с которыми частота получения трансгенных свиней из микроинъецированных эмбрионов бала примерно в 2 раза выше, чем из микроинъецированных зигот.

Таблица Н 4.

Результаты анализа интеграции и экспрессии чужеродных генов у животных, родившихся после трансплантации только зигот или только 2-клеточных эмбрионов в эксперименте N I.

Г зиготы (%) I 2-клеточные

I I эмбрионы (X)

Трансплантировано микроинъецированных эмбрионов Рождено поросят, включая мертворожденных Из них трансгенных в том числе

а) по интеграции

б) та экспрессии

135

130

68 20 12 ( 8.9Ж )х' 3 ( 2.3Ж )

3 '

10 3

X) р < 0,05

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о мозаичности практически всех полученных в настоящем исследовании трансгенных животных, несмотря на то, что как минимум 12 из них родилось после трансплантации только микроинъецированных зигот.

Генетический мозаицизм животных является, на наш взгляд, следствием по крайней мере двух причин. Во-первых, интеграция трансгенов вероятно происходит лишь непосредственно перед или во время репликативного цикла ДНК ( 1Шк1е et а1., 1986 ). И хотя у 30,3% микроинъецированных в эксперименте N I зигот были визуализированы пронуклеусы, ко времени проведения микроиньекции решшкативный цикл в них был, весьма вероятно, уже завершен. Во-вторых, у 69,7% зигот в эксперименте N I пронуклеусы не были визуализированы. Микроинъекцию проводили в область

предполагаемого расположения пронуклеусов. Поэтому такая микроинъекция, скорее, всего носила цитоплазматический характер. В таких условиях интеграция, возможно, происходила на более поздних стадиях развития и имела место не во всех клетках раннего эмбриона. Все это и могло привести к рождению мозаичных трансгенных животных.

Результаты- микроинъекции гена нввА& в эксперименте N I приведены.в таблице N 5.

Двенадцати реципиентам трансплантировали 239 ранних эмбрионов свиней, 219 из которых подвергали микроинъекции гена НВвАв. Одному реципиенту трансплантировали только зиготы и 4 реципиентам трансплантировали только 2-клеточные эмбрионы. Остальным 7 реципиентам трансплантировали зиготы, 2-клеточные эмбрионы и 3- и более клеточные эмбрионв в смеси. В результате трансплантации у 10 реципиентов ( 83,3% ) родилось 64 поросенка, включая мертворожденных. Пять из 64 поросят ( 2,3% от чиола микроинъецированых эмбрионов ) содержали последовательности введенной ДНК. У 16 животных. НВвАв-белок синтезиррвался в количествах, достаточных для его достоверного обнаружения в сыворотке крови. Общая эффективность получения свиней, трансгенных по гену нввАв, составляет 8,7%.

Подробный анализ ДНК, выделенной из органов и тканей одного из юшотных ( поросенок N 8 ), показал наличие 0,3-0,5 копий трансгена на диплоидный геном в мозге, печени, почках, селезенке и лимфоузлах ( рис. N I ).

Кодирующая и регуляторная части рекомбинантной конструкции, видимо, не претерпели значительных изменений, так как гибридизационный анализ выявляет характеристические фрагменты из этой области. Вместе с тем отмечена перестройка 3'-области

Таблица N 5

Результаты анализа интеграции и экспрессии гена ИБгАе ( эксперимент N 1 )

■только зиготы

только I 2-клеточные I эмбрионы I

зиготы + 2-кле- I точные эмбрионы I + 3- и более кле-! точные эмбрионы !

Всего (X)

Трансплантировано 12 Микроинъецировано 12 Использовано реципиентов 1 Стало супоросными 1 Рождено поросят 7 В том числе трансгенных: 3

а) по интеграции 1

б) по экспрессии 3

84 84

4 3 16

2

2

143 123

7 6 41

14 4 11

239 219

12

10 (83.32) 64 (26,8%)

19 (8.7Х) 5 16

X)

со I

12 3 4 5

лЧ

tft'A

f^? V 1

•а»

2.02-

0.8v

Рис. N I. Блот-гпбридкзация ДНК, выделанной из печена поросенка N 8 ( дорожки Ш 3 - 7 ) посла гидролиза различными рвстриктазаш. I - конструкция с НВзА^ после гидролиза Pst в количестве, соответствующем содержанию I копии на геном; 2 -конструкция с HBeAg в количестве, соотвэтствувдем содержанию 1/3 копии на гоном. 3 - Hind III; 4 - Put; 5 - Hind III + Soo RI; 6 - Pet + Ban HI; 7 - Eoo RI + Bam HI.

нетранслируемой части рекомбинантной конструкции. Анализ исходной, необработанной "рестриктазаг.и, ДНК трансгенных особей показал, что положение сигнала совпадает с пологениом клеточной ДНК, и это дает основание полагать, что генетический материал интегрировался в хромосомы свиней.

Содержание HBsAg оценивали с петжэщыо ИФА. В образцах ¡сровя 16-ти пз 51-го проанализированного гивотного выявлен HBaAg. У разных животных его концентрация колебалась в широких пределах -зт 25 до 125 нг/мл. В экстрактах л лязатах органов поросенка N 8

с помощью иммуноферментной тест-системы выявлено присутствие HBeAg, однако его содержание в разных органах было неодинаковым. Высокое содержание HBelg ( 100 - 200 нг/мл ) было обнаружено в почках, мышцах и сердце. В клетках сердечной мышцы этот антиген был, по-видимому, прочно ассоциирован' с клеточными органеллами, поскольку эффективное освобождение HBeAg было достигнуто лишь при лизисе клеток. В легочной ткани выявлено незначительное количество HBeAg.

У двух животных ( поросята N 8 и N 10 ) подтверждением экспрессии HBeAg в клетках печени и лимфатических узлов послужили результаты иммунофлюоресцентного анализа.

. Результаты микроинъекции гена ъон в эксперименте N I также приведены в таблице N 6.

Двадцати реципиентам трансплантировали 434 ранних эмбриона свиней, 406 из которых подвергали микроинъекции гена bGH. Шести реципиентам трансплантировали только зиготы и 3 реципиентам трансплантировали только 2-клеточные эмбрионы. Остальным животным трансплантировали зиготы, 2-клеточные и 3- и более клеточные эмбрионы в смеси. В результате трансплантации у 13 реципиентов ( 65% ) родилось 109 поросят, что составило 25,1% от общего числа трансплантированных эмбрионов.

У 2-х животных в ДНК, выде леной из образцов кожи, обнаружены микроинъецированные последовательности ДНК. В образцах сыворотки крови 9 животных был обнаружен bGH в количествах, достаточных для его достоверного определения. Общая эффективность получения свиней, трансгенных по bGH, составила около 2,7%.

Подробный анализ ДНК, выделенных из образцов кожи 2-х животных ( поросята N 97 и N 105 ), проведенный с целью

Результаты анализа интеграции и экспрессии гена ЬШ ( эксперимент N 1 )

ТаЗ-етца N В

только зиготы

только 2-шеточнш эмбрионы

зиготы + 2-клеточ-' I ныэ эыбрионы + 3- I и более клеточные I эмбрионы I

I

Всего (2) I I

Трансплантировано КЬсфо инъецировано Использовано реципиентов

Стало супоросными Роддено поросят В том числе трансгенных:

а) по интеграции

б) по экспрессии

123 123

6 6 51

9 2 7

46 46

3 1

4

1 1

265 237

11 6 54

1

1

434 406

20

13 (65,ОХ) 109 (25,IX)

11 2 9

(2,72)

I

«о

выяснения формы существования введенного гена - интегрированного в хромосому или в виде кольцевой минихромосомы, показал следующее. Во-первых, положение сигнала не совпадает с положением клеточной, необработанной рестриктазами, ДНК, что дает основание предполагать существование введеного генетического материала в эписомной, а не интегрированной форме. Во-вторых генные конструкции,возможно, перестроены и содержатся в количестве менее I копии на диплоидный геном.

Содержание ъсн в сыворотках крови полученных животных оценивали с помощью Р/А. В образцах сывороток крови 9 из 87 животных был выявлен ЪСН в количествах, достаточных для его достоверного определения. У разных животных концентрация ьсн колебалась в широких пределах - от 5 до более чем 20 нг/мл.

Сравнение результатов анализа интеграции и экспрессии генов НВ&А& и ьсн показывает, что общая эффективность получения трансгенных свиней с использованием нввАв достоверно ( р<0,01 ) выше, чем с использованием гена ъсн. По-видимому, это может быть обусловлено свойствами используемых конструкций.

3. ВЫВОДЫ.

1. Метод микроинъекции чужеродных ДНК в ранние эмбрионы применим для получения трансгенных свиней с общей эффективностью - 4.8Ж.

2. Микроикъекция, центрифугирование или их сочетание вызывают появление видимых нарушений целостности ранних эмбрионов свиней на незначительном уровне, не превышающем 2%. Сочетание центрифугирования и микроинъекции резко снижает их жизнеспособность, так как только 10,6% от числа

центрифугированных и микроштьецировэнных эмбрионов развивались до рождения.

3. Для проведения микроиньеций чужеродных ДНК с целью получения трансгенных свиней целесообразно использовать эмбрионы на стадии зиготы, так как, при достоверно более высокой жизнеспособности микроинъецированных зигот по сравнению с минроинъецированными 2-клеточными эмбрионами, общая эффективность получения трансгенных животных после микроинъекции в зиготы достигает 8,956 и достовено превышает таковую в случае использования 2-клеточных эмбрионов.

4. Получены трансгешше свиньи с подтвержденной радаоиммунологическим и иммуноферментным методами экспрессией чужеродных генов. Продукты экспрессии этих генов могут иметь медицинское и народнохозяйственное значение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

I. Кузин Б.А., Васильев U.M., Слезингер М.С. и др. Микроманипуляции с ранними эмбрионами свиней. // Доклады ВАСХНИЛ. - 1988. - N7 10. - С. 29-31.

2. Некрасов A.A., Семеняченко В.П., Васильев И.М. и др. Пересадка однодневных инъецированных зигот в животноводстве. // Зоотехния. - 1988. - N. 8. - С. 45-47.