Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МИКРОИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МИКРОИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ"

всесоюзный ордена трудового красного знамени научно-исследовательский институт животноводства

(виж)

На пршх рукопнси

ВАСИЛЬЕВ Иван. Михайлович

удк 577.21

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МИКРОИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ

(ф6.02.о1 — разведение, селекция и воспроизводство сельскохозяйственных животных)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУБРОВИЦЫ — 1969

'А--';-' ^Диссертационная работа выполнен« в лаборатории генетической кк-"• жснерин с.-х. животных ВНИИЖ»-

Научные руководители:

доктор биологических наук И. Я. Шихов , доктор биологических наук Б. А. Кузин

Официальные оппоненты: доктор виол, наук Н. И. Сергеев" .

кандидат бнол. наук А. А. Языко»

" Ведущее учреждение: ВНИИ разведения и генетики с.-х. животных

г - Защита состоится <■ [йГ^УкУт 1

- на заседании Специализированного сомта Д. 020.16.01 при Всесо-юз ном научно-исследовательском институте: животноводства,

■.■. : Адрес: 142012, Московская" обл.;; Подольский р-н, пос- Дубро-вицы, ВНИИ животноводства. ; ,. ■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан ч $ . 1939

Ученый секретарь " ..;. * .

Специализированного

совета, доктор :. . ' , '"/ . .

сельскохозяйственных наук А. Й. Филатов

Актуальность темы. Знатательные усшзд. достигнутые в последнее десятилетне в области генетическойтрансформации соматических клеток животных, стала возможными благодаря развитии , генно-инженерной • технологии. Закономерный интерес: к генетической1 трансформации пшювш клеток маекслитащкх вызвав тек, что в случве успеха южш ожидать изменения фенотипа на уровне долото организма ■ ешшдовшя ' трансформированного признака . потомками." ■ Особенно заманчивой представляется генетическая трансформация половых клеток сельсхохозяйственных животных, Вэнспольэование делает возможным направленное изменение пасме ~ с целью создания пород животных, обладапщх новыми, ценными продуктивными признаками. или животных, продуцирующих технологически важные- белки, чего невозможно добиться традиционными методами оелекции. Правомочность такой постановки * вопроса вытекает из результатов работ, .

проводившихся о начала ■ 80-х годов советскими и эарубехтшн учеными во генетической трансформации лабораторных животных* в основном швей * ( Ра1жиех* н.1>., Вг1пМегН.Ь.,1966 ). ' Однако, к началу выполнения данной диссертационной работа в; печати. было опубликовано 'лишь три статьи вврубежных авторов ( вгва >г (а., 1985 ¡ нышиг в^ а1.,1985 19Эб ), в к0т0рн1 г сообщалось, ■ об успешных попытках получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Эти статьи не только не содержала . подробного описания хода выполнения работы, во в поставили целый ряд методических проблем, решение - которсх потребовало' дальнейшего расширения работ в этой области.

"' \ Цель и задачи исследования. * Цель исследоваяия состояла в изучении .влияния микроинъекциЭ, в сочетании с методами визуализации ядерного материала, ' на жизнеспособность

ЦЕИТРДЛЬЕЗДП НАУЧНАЯ ■:.. .Екгдзд,¿ид ■ ■' .....

шьешшашш*,! /¡адклз

V. В.1, 1а. 1в . >

ранних . эмбрионов свиней, а также получение тренсгеннш. свиней посредством микроинъекции чужеродной ДНК в ранние "вибрионы.

Для достижения намеченной цели необходимо било решить следующие задачи: ., V.

1) детально разработать и ' усоваршеноствовать технику' микроинъекции чужеродных генов в аиготы свиней; -

2) определить стадию развития ранних эмбрионов свиней, наиболее подходящую для проведения микроманипуляций;

3) изучить влияние процедур предварительной обработки и микродоьекций ранних зародышей свиней на их выживаемость и' жкзнеспособность; V ■. „ ■ Л;-:' ■

4) определить эффективность интеграции чужеродной ДИК в состав генома свиней и экспрессии интегрированного гена. > ■ Научная новизна подученных результатов: -у-^'/¿г':. , - показано, что метод микроинъекции чужеродных ДНК в ранние эмбрионы применим для получения трансгевшх свиней с- общей эффективностью - 4.&Х; -.. : .

- установлено, что микроивьекция, центрифугирование ш кх сочетание вызываитпаявлевиевидимыхнарушений целостности ранних эмбрионов свиней на незначительном уровне, не превышающем ?%. Сочетание иентри^гирования и микроинъекции резко снижает их жизнеспособность. - так как только . 10,6% от числа центрифугированных и микроинъэдарованных вибрионов развивались до рождения; ' . У'■

- показано! что дм проведения микроинъеций .чужеродных ДНК с целью получения трансгенных свиней целесообразно использовать эмбрионы не стадии зиготы, так как при достоверно более высокой жизнеспособности мшфоинъецироващщх зигот ' посравнвнл» с' микроинъецированными 2-клеточными эмбрионами общая эффективность

:.. ■ ■. ■;■ .■: - .. ■. V - 3

,(«''• • ' •' . . "'.V = 3 ' ' •' получения трансгенных кшотшис послв микроинъвкции в зиготы достигает 8,9* ндостовево превышает таковую4 в случае использования 2-клеточных амбришов; : '

— получены , трансгенные . свиньи с "подтвержденной радиокмыунологическим и иммутюферментным мптодами экспрессией генов ' соматотропина быка и поверхностного антигена1 вируса гепатита В человека. , Продукты экспрессии этих генов могут иметь медицинское и народнохозяйственное значение.'

Практическая значимость результатов исследования. Полученные данные могут быть использованы для увеличения'выхода трансгенных сельскохозяйственных животных,, в частности свиней. ; Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на конференции молодых ■ ученых института вирусологии АМН СССР . им. Д.И. Ивановского в декабре 1987 года; на 41-ой научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВНИИЖа в мае. 1988 года!

Объем работы. Диссертация состоит из' введения, обзора литературы, материала, и методов исследования, 4 результатов и обсуждения, выводов и; списке литературы. Объем работа - "О страниц, ■■ включая 7 .' таблиц и Орисунков. Список литературы включает77работ, в том числе 69 на иностранны* языках.

Г I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. '

в качестве доноров эмбрионов. были использованы помесные ; ремонтные свиноматки { Крупная белая х Ландрас ) в возрасте 7-8 мес. живой массой 100-115" кг. Для. увеличения число овуляция часть'животных была подвергнута гормональной обработка

В качестве' реципиентов использовали неосемененных помесных

( КрупнаябелаяхЛаядрао ) ремонтных свинок возрасте 7-в ио. живой. мнооой 100-116 , кг, синхронны! по половому цяклус донорами. ' " ~

Эмбрионы свиней на ранаиг стадиях раавктия получаш через 48-БО чаоов. после введения ХГ ала через 24-26 часов после шкргггяхряксм посредством промни cum п яйцеводов, выделенных при. убое животных-доноров. В некоторых случаях извлечение вибрионов проводили хирургически по описанному A.A. Некрасовым и •ооавторемн ( 1988 ) методу. V .... Ч- ,

Качество 'вмврионов оценивали год голяриэацианно-интерфэренцианным микроскопом "Бнолар-Ш" ( ПНР ).; Эмбрионы на стадии 1-ой клетки считали оплодотворенными, если у них была видни- .2 направительных тельца и/или многочисленные сперматозоиды, прикрепленные к прозрачное оболочке *

- Дня микроиньекцнй в раннневмбрионы свиная использовали предоставленные Г.Н. йикололвым < лав. нуклеиновых кислот института молекудяфдой вио^гог^ > рекомбинаптпыа

линеалиэированные / ДНК, содержащие - res ъон - ила ген' ввз*я. Рекомбннантные конструкции помимо клонированной комплементарной ДНК. генов ЪОН, или HBSig, содержали промоторную овласть вылчаюцуоенхансер,' промотор ' и - часть Б*-концевой яетранслируемой области, мРНК ) гена UT-I мыши, донорный в акцепторный участки сплайсинга из ранней области вируса st 40 и участок поли^денелнроваши из етой , не области. Перед микроинъекцией маточный раствор инъецируемых рекомбинантных, ДНК разводили до концентрации I мкг/кл средой Внттенз ( whitten. 1ЭТ6 ). . ' ■..-.:'.. *' Ч: j "

■ В целях выполнения поставленных задач нами было проведено 2 эксперимента, в эксперименте х. I для визуализации ядерного

материала ранние вибрионы свиней исследовали методом шляризационно-нытарференционного контраста в однородном поле с помощью микроскопа "Вюлар-Ш". В эксперименте.к 2 емврионн перед визуализацией 'ядерного материала подвергали предварительному'' центрифугировании по методу, предложенному Хамюром и соавторами ( Наотогвгв1,, 1939

- При мнкроиньекцвяд использовали ывкроманипуляторы КЫ-2. В область одного на про нуклеусов ели каждого ядра шгьецировали 1-1,6 од раствора чужеродной. ДНК - в концентрации I мг/ил. Введение раствора ДНК обеспечивалось с. помощью пневматического ручного изьектора. ' ■ *

Микроинъецированныв< вибрионы после оценки их травмируемости трансплантировали свиньям-реципиентам. Критерием травмируемости служило появление видимых признаков нарукения целостности эмбрионов в течение 1-1,5 часов, непосредственно предшествующих трансплантата». Травмированные ембрионы реципиентам не •рансплантировали. - ■

■ Жизне способность цицимцщщидпдпгг л трансплантированных эмбрионов оценивали по результатам опороса реципиентов.; '' '.'','

ДНК- из тканей полученного" потомства выделяли по методу Блина и Стаффорда ( В11л, 8гаХГог<1, 1976 ).

Гидролиз ДНК рестрикцконными вндонуклеазами, препаративный электрофорез, перенос на нитроцехлплозннВ фкльтр и гибридизацию проводили го иашатису и соавторам ( 1984 ). "

. Экспрессию генов нВвЖк и ъон определяли то наличию соответствующих белков в сыворотке крови анализируемых животных.

• Наличие НВаА^ в сыворотке крови свиней определяли методом имнуноферментного анализа ( ИФА ) с помощью южунофврыентноЯ 'тест-системы , разработанной в институте вирусологии им. Д.И.

Ивдаицкого ацк тоСР на основе ЫКА к нВвжо ( Кущ и др., 1987 ).• . , / Наличие ьон в сыворотке крови свиней проводим по методу твердофазного ни на основе метода двойных ентител ( Исаченков я ДР.. 1931 ). Г,.. .-■.,,' ■■■>■. ■:■.■-. Г.^/"

Для статистической обработки полученных данных использовали критерий Стьвдента для долей.,. V, '.,.; ■. ■.■.-,.-..>

V. ' .- ^ 2. РЕЗУЛЬТАТ« И ОБСУЖДЕНИЕ. у V- '■,,'(

Л'. В ходе выполнения денного исследования было использовано 83 донора,'.'01 которых получили* 1138 эмбрионов (. 89,3* : от _числа овуляций ) на ранних .стадиях развития. 1061 вибрионов ( 93.2* ). бшш оценены как пригодные для дальнейших манипуляций. Остальные 8мЗраоны _ч< 6.8% . ), оказались . либо-де генерированными, либо нэошюдотворенными. г В : экспериментах шиш были : использованы эмбрионы 3-х групп: БЫ вмбряш на стадии эиготв; 446; эмбриона на 'стадия 2-х олвстомеров; 64 эмбриона на стадия; 3-х, и Солее • бластсмеров. Тек как последнюю;группу , вибрионов не подвергали никраиньекции.. чужеродных. ДНК.,.ее .да:> учитывали^ при .' анализе результатов опытов, направленных на получение^ трансгенвых "свиней. Вместе с тем эмбрионы втой.группы включаливобщее число трансплантированных свиньям-рещпшэнтам .эмбрионов, -..так > как в большинстве случаев их . трансплантировали в целях поддержания супоросаости. ..... ... ' ,

В ходе выполнения экспериментов ,48, .реципиентам трансялентиров^ли .1012 ранних _ эмбрионов свиней, 958 из которых-подвергали.. микроикьекцки чужеродных ДНК. В ,■ результате экспериментов у^ - 28 ; реципиентов^ . родилось 209 - поросят, ^ что составило 20,7К от общего числа .трансплантированных эмбрионов :и

31 »3* от " ч ,чисда эмбрионов, трансплантированных ставши супоросными реципиентам. Поросята ■: рождались фвнохипнчески* нормальными. Средник вес прирожданин ооставкл 1,3 кг. 1 '

; 2.1; влияние мккроинъекций и мэтодов визуализации ■ . ядерного материала на травмируемость и жизиесао-слособность ранних вибрионов свиней.

В эксперименте N I было использовано 706 ранних эмбрионов свиней» 2ЭТ из которых находились на стадии зиготы, sei - вз 2-клеточнаЙстаднин4в - на более поздних- стадиях развития. Результаты эксперимента приведены в таблицах N Ihn 2.

При изучении вибрионов методам: поляризационно-интерференционного контраста в однородном поле ядерный материал выл визуализирован yi.30.3S зигот и ЗЭ,1Х 2-клэточннх эмбрионов. Уровень визуализации ядерного материала у 2-хлеточных вибрионов достоверно превышал таковой у зигот ( р<0,05 ).

Михроютьекцая не оказывала существенного влияния, на травмируемость эмбрионов. Так 93,6Х*зигот и 96,1X эмбрионов не стадии 2-х бластомеров благополучно перенесла микроинъекцшо. Травмируемость зигот в эксперименте и I била достоверно вша ( <0,05 ) таковое у Z-клетоишх ембраонов. "

/ - Шсле ишфоаньекции . екэогеной ДНК бТЗранних эмбриона свиней, £25 - из : которых были подвергнуты микроинъекция. а находились-:: на стадии 1 . iзиготы . шш; 2-х бластомеров, трансплантировали ."32 ' реципиентам. Супоросными стало 23 реципиента У (• 71,85 ). В результате родилось 173- поросенка, включая мертворожденных.' Уровень рождаемости составил 26.7Х от общего числа трансплантированных анбрвонов и 36,0% от числа

' Шзуализааия ядерного штериала и травшруеюсть послэ швфонааипуляций

с ранними эмбрионами свиней, ,■ о' * ■',:

'■. .' I 'V Ранние эмбрионы свиней на стадии: »

1Д , ■ ■ —---------—----------———-----1• Всего.

I зиготы (X) I 2-х бластомеров (X) ., I V'--'

V ■ Эксперименты'." ■ .■.•"■„■..'. ■

■ Визуализация 90/237 (30.31) ■ Н1/361 ¿1/658

Трашфуемость ^ : : ■ 19/297 ( 6,41) ^ 14/361 ( 3,0Х) . ; 33/658 "

Трансплантировано эмбрионов 278 "*'.:■ 'г 347 • 625

Центрифугировано : 254 85 " ■ 339

Визуализация' < ¡V . 181/254 (71,3*) ^ 79/85 ( 02,9Х) 260/339

Травмируемостъ ' ■.„"■;;■ 5/254 1/85 ■ : 6/339 •

Трансплантировано эмбрионов 249 84 " 333-

I

00 I

х) р <. 0,05; XX) р < 0,01; заве) р < 0,001

4 у ■''■.:' ' ^ - '""■ Таблицам 2

Трансплантация ишфоинъецированных эмбрионов

* \ ; Эксперимент К 1 - I Эксперимент N 2

Использовало реципиентов £ ■ ■.

'-■Стало супоросными :

: Трансплантировано эыбрюнов *: .

в т. ч. ставший супоросными реципиентам ' . 481 Рождено поросят, включая мертворожденных

Уровень рождаемости: .V. , а) от общего числа трансшиятиро- . <' ванных эмбрионов . . ; . -'У б) от числа эмбрюяов','травсшав-■. ' тированных супоросным решшя-; 1 ентаи .'' ■ ; :• ..■ ■ :

зг

23 (71,81) 673 '

173 ,25,71

X)

36,01

хх)

• 7 (43,8Х) д .339 , \ • : 156 .

36 .

10,61 23,IX

м <0

х) Р < 0,05 хх) р < 0,01

вибрионов, трансплантированных реципиентам, ставшим супоросными.

В ранках акспервментв H I 14 реципиентам транспланпфовапи только аиготы ала только 2-кле точные эмбрионы. Результаты таков трансплантации араведевн в таблице к 3. Всего било трансплантировано 135 зигот И 130 2-йлеточвых эмбрионов. Вса 7 реципиентов, " которш трансплантировали аиготы, стали супоросными. Впоследствии у них родилось 58 поросят, включая мертворсщденных, ■ что ■ составило 431 от - общего часла трансплантированных эмбрионов. Только 4 - из. тех 7 реципиентов, которым трансплантировали 2-клоточные - вибрионы, стали супоросными . Их сугоросность завершилась рождением 20 поросят У вклгчая мертворожденных,что составило 15,4Х от общего числа трансплантированных эмбрионов s 24,7% от числа вмбриовов, трансплантированных ставшим супоросными реципиентам. ' \

В эксперименте N 2, - результата :которого приведены в таблицах к 1нн2, был ^использован 345 эмбрион, ' 254 иэ которых находились на стадии зиготы, 85-" на стадии 2-х Оластомеров и 6 -на стадии 3-х и более оластомеров. Травмируемостн эмбрионов после центрифугирования нами обнаружено нв оыло1У подавляидего числа 2-клеточных эмбрионов { 92,9» ) и у значительной части ■зггот ( 71, ЗХ - ) тосле : центрифугирования бил визуализирован ядерный материал. Травмируемость после кшфоиньекции чужеродных ДНК в центрифугированные зиготы -или 2-клеточньга эмбрионы была :. одинаково низка .и не превышала 2%. ч v ■"■■■';'

: < ' После трансплантации 16 реципиентам 339-ти ранних эмбриона, супоросными оказалось только 7 из г них (, 43,85 ) Супоросность завершилась рождением-36 поросят, .что составило ю,6* от общего числа трансплантированных эмбрионов и 23,IX ' от числа

амбриогов, травсшгантировашшх ставшим супоросными реципиентам.-

■ \>'.г /Ч;-' • . •' Таблица К 3

Результаты .трансплантации реципиентам ушью зигот ши только 2-клеточвых эмбрионов, подвергнутых микроинъекцнн - 'Л- "У ' .■

I ■ .i асспвримэнт N Г ; f

Эксперимент H 2 ;

| „„„„„„.„,

( зиготы (1)Г2-каеточныз 1 . t эмбрионы (X) Г"

еиготы (X) .v,-.;

Использовано реципиентов /7 : ССтало супоросшая . ' 7 (100Z) '

Трансплантировано эмбрионов ■ 135 " в т. ч. реципиентам, ставшим супоросными. Ï .. 135

Роднено поросят 'Л '58 -, Уровень рождаемости: ."* V -; '

: а) от обяего числа траясшштн-■ 7 рованных эмбрионов /■' 432

б) от числа емОрионов, траве- • ' • шантированныг супоросным ■ V. -реципиентам. "г . 43Х

хх)

7 . • 4 ÎS7.1X)

1эо 8i

" 20 . /-г-

■15,41 ' . V 24,71

8 -.4 ( 601) 169

82 гв.

15.41

31.7Х

X) р < 0,05 XX) р С 0,01 ' 'Î v''У

-Л '

г

: : ' В ранках эксперимента V 2 восьми реципиентам, тага» как и в аксгорпмаате Я I, трансплантировали только витоты. Результаты такой трансплантация прагаеденывтаблнце N а. Всего * Шло трансплантировано 168 вигот, подвершутых центрифугированию с госледупцей; микроиньекциеЯ. Сушросшшн стало только 4 реципиента, В результате супоросностя у них родилось.26 поросят, что ооставидэ 18,4Х от общего числа - трансплантированных жбрисвов ' и 31,7* от числа эмбрионов»' трансплантированиях ставшим супоросными реципиентам. Л * '-.

Анализ полученных ' данных' V показывает^ ' что , ви центрифугирование, ни микроинъвкция , ни нх сочетание^ вв вызывает' существенного: травмирования ранних" вибрионов свиней, так"|сак<в.'обоих вкгаюриментах уровень травмнруемоохи / зигот и г-клеточных ембриовов Сил оченьнизок. " ; ...■;■

Более высокий : ; уровень травмируемости зигот после микроинъекцим в вксдорнменте К I по сравнениюо, таковым - в експвриментенг ( :р<0,01) мошет. быть объяснен недостаточно квалифицированным, овладением метода микрошгъекции на первых этапах выполнения аксперимента в I. кроме того не исключено, что некоторая часть 1-клеточных эмбрионов находилась уже в состоянии цитокинеза. Кикрсшньекши в такие вмбрионы могла снизить" общую выживаемость микрииньецированннх > вигот. '

. центрифугирование существенно ::11 увеличивает <*-' уровень визуализации ядерного материала .Из таблицы я I видно, .что в эксперименте N 2 уровень ' визуализации ядерного материала как у зигот, так и у Е-клеточных ембриоаов достоверао <. р<о,оо1 ) превышает таковой в ексшримвнте И1. Вместе о тем, необходимо отметить, что на более низкий уровень визуализации пронуклеусов у зигот в Эксперименте и 'I могли,.оказать влияние■ следующие

факторы: ^.во-отрвнх,. отсутствие на .„овртшх,: порах навыков i визуализации i:ядерного " материала; в&-вторых, ко времени . проведения мнкраинъекцин некоторые вмбрианы могли уже пройти стадии сформированных пранукяеусов.. , Г-

Сравнение.„, результатов..... трансплантации шбрювш . после мгороыашшуляцвЯ показадо снижанне уровней % супоросности \ .ррждаемости вэкшернмеате щ 2 по сравнению с экспериментом н I. Как видно, из твблицы М 2 . уровень сутгоросности в эксперименте я I, достоверно ( р<0.05 ) превышал такоасЛ в эксперименте н 2 и .составил 71,8*, против 43,85. Такая же .закономерность прослеживается и в отношении уровней рождаемости. вычисляемых или относительно общего числа трансддннтироввнних эмбрионов, или относительно^ .числа ' эмбрионов, трансшзнтированшд ставшим супоросными реципиентам, В эксперименте N I они составили 25,7Х и 36,0» соответственно я достоверно превываля ( р<0,01 ) уровни рождаемости в эксперименте !» 2, составившие ; 10,6» ..и 23,1* соответственно. По-видимому, существенное негативное влияние на уровни супоросяости ^рождаемости оказывает сочетание центрифугирования я . микроинъекция, Основанием . для . . такого предположения.являотсяслвлуятое факты:1) по данным Саршгмана и Брама ( Springman, Brem, 1986 ) и Браме я соавторов ( Brem et al., ,1985, 1986 ) только^ I2-I8X, , центрифугированных я микроингеиироватшх эмбрионов развиваются в условиях 1л vivo до стадии морулы или бластоцисты; 2) достоверно ( р<0,01 ) более высокий уровень рождаемости после ; трансплантации . только микроинъешрованшх зигот в эксперименте N I, ъчем в эксперименте N 2 ( твблица N 3 ) .л-.;'/,". "V! /

Как укезыввлось^ выше, в эксперименте N ; i t 14' реципиентам. трансплантировали только зиготы или только 2-клеточныа эмбриона.

Результаты этого опыта также приведены в таблица к 3. Оказалось, : что / уровень сушросноств у:' ■ реципиентов, которым трансшвдтировали толдо 2-вд 57,1* :), бил'

заметно ниже чек у реципиентов, которым трансплантировали только аиготы ( 100* ). Кроме того, уровень рождаемости- у тагах реципиентов* Сил достоверно ( р<0,05 ) ниже чем у реципиентов, которым трансплантировали только знготн^'Ввсховданве'шжученншс. вами результатов о данными Пврселла и соавторов ( Purwel at al., 1987, ) не может - вить- объяснено увеличением травмнруеиюсти 2-*леточша вмбрионов посл0 |1Шкроиаьекции,' так как в целом у вигот ава Оыла достовершо ( р<0,05 )

2.2. Интеграция и, экспрессия чужеродных генов, '■.■.'-;: ' Г l

' В Юде ^ выполнения экспериментов 43 реципиентам Трансплантировали 1012 раавнх амбрнавов овивай,: Эбв из которых подвергали микроинъекции чухвродацх ДНК. в ' результате аксоеримевтов у 28 реципиентов родилось 209 поросят, что составило20,7S от общего числа трансплантированных ембрионов и 31,3» от числа эмбрионов, ; трансплантированных ставшим ■ супоросными реципиентам." ■'ч" "', '' ? 1 ; ■ ' ;

■; Образцы тканей клн органов*19в животных н образцы сыворотки крови 139 животных подвергали анализу на интеграцию и/или экспрессию чужеродных генов. ' Анализ полученных данных , выявил неожиданный результат; Несмотря на то, что в эксгорменте к 2 в более чем 7ОХ случаев микроиньёкциа чужеродных генов5проводили непосредственно в пронуклеусы или ядра.в атом вксперяменте на : <Яию роздано ни одного шросенка. содврЕащего чужеродный ген в еписомной или интегрированной форме кли акспрессирущего ' его.

Эти данные ставят под сомнение необходимость использования центрифугирования в работах по микрсянъекцин чужеродных генов в ранние амбрионы свиней. ;■■„.','

* Изучение рождевныхв тосш|я»1енте к '1жиБОТНИ1'110казаж» наличие в составе генома пяти из них чужеродной ДНЯ. р^стрикциоиный анализ ДНК, выделенной из органов и тканей етих животных, позволяет сделать заключение о содержании трансгена в количествах менее I копии ( 0,3-0,5 ) на дншкнщшЯ геном. Еще у двух поросят в: 4-х повторах такта били обнаружены положительные сигналы на присутствие трансгегов в ДНК, выделенной из образцов, кожи етих - животных. Генные конструкции у етнх животных, возможно, претерпели частичные перестрой)« к присутствовали как еписомы в количествах менее I копни па диплоидный геном.

Исследование сыворотки крови животных'.паковало" наличие в ней у 25 животных продуктов »кспрессии чужеродных генов в количествах, достаточных для их достоверного определения. Два из етих животных содержали в составе генома чужеродную ДНК. '■ '

Таким .образам,-в хода экспериментов было получено 30 трансгенных животннх,.что составило 3.1% от обюего числа иикроинъецироЕВннш: в обоих екстортментах - емСряонов и 4.8% от числа эмбрионов микроингецяровашшх в эксперименте . Н I.

; Результата анализа интеграции и -экспресии чужеродных генов у животных, родившихся посла трансплантации только зигот или тольхо 2-клеточаых' ембрионов в вкспврименте я ?1, приведены. в таблице Н 4; ' Сравнение полученных данных показало, что общая частота получения трансгенных животных в случае трансплантации микрошъедарованных зигот . достоверно ' выше ¡чем. в случае трансплантации микроинъецированных 2-клеточных эмбрионов ( 8.9% против 2,3» ). Полученные вами данные не согласуются о данными

Персеша а соавторов ( Turrol et ol., 1987 )» в которыми ; частота ' ■ получения - трансгенных ' свиней ' . из кгароинъе дарованных вмбрионов была примерю в 2раза, визге ,чем is мшфоиньецированных зигот- - г - - ■■:'■* .

.. Таблица н 4.,- Результата анализа интеграцга и экспрессии чужеродных генов у животных, родившихся после трансплантации „ только зигот нли только Z-клеточных эмбрионов в эксперименте N I.,

- .. '■■■.■■, г зиготы (*)-* I 2-клеточные ^ ; ■

■■'*..-." ■ I 1 -'■■■■■ I , эмбрионы (*) .

Трансплантировано михроинъв—

цированных ембриожш J35 ,.. 130 ^ •

Рождено поросят, вмятая

мертворожденных 68 _» • . 20 -

Изних трансгенных 12 < 8,9* Г' 3 < 2,3* ) .

в том числе--. .■<■■■ -¡>. ■-. ,, f.. --j i '-.■■" ---

а) со интеграции v, '■' ". *".■ ■■" 3 -

б) ш экспрессии • . 10 ■ , ■■ . ■ , 3 V v

х) р < о,05 -

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о мозаичности практически всех полученных в настоящем исследовании трансгенных животных," несмотря - на то, что как минимум 12 из них ' родилось после трансплантации только мнкроинъецированных аигот.; - Генетический - мозаицизм животных является, на^наввагляд, следствием по крайней мере двух причин. Во-первых, ' интеграция трансгенов вероятно происходит лишь непосредственно перед иди во время репликативного цикла ДНК ( Wilkie еЪ 1906 ). И хотя у 30,3* щщроинъещфованных в ' эксперименте К ■ I аигот были

• визуализированы провуклеусы, ко времени проведения микроинъекции реолихативный шпсл .в . них* был, весьма вероятно, уже завершен. Во-вторых, у 69,7* зигот в експерименте к I пронуклеусы не были визуализированы. ^Ыикроинъекцию проводили -в область

предполагаемого расположения '; пронуклэусов. ; Поэтоку - . такая микрошгьекция, скорее,' всего косила цитопяазматическнй характер. В таких условиях интеграция, возможно, происходила на более позднкт стадиях развития н амела место не во всех. клетках раннего эмОриона. Все eró и могло привести к рождению мозаичных трансгешшх животных. .;.'.

Результаты' микроиньокцин гепа HBeAg в :бкспериментен I приведена. в таблице я 5.

Двенадцати реципиентам трансплантировали 239 , раангх вибрионов свиней, 219 из которое подвергали мнкроинъекции гена HBaig. Одному реципиенту трансплантировали только зиготы и 4 реципиентам транешюнгиррвали ; только 2-хдеточше амбрионн. Остальным 7 реципиентам трансплантировала зиготы. ; 2-клеточнне амбрионы и 3-й более клеточные эмбрионв в смеси. В результате трансплантации у10 реципиентов ( 83,31 ) родилось 64 поросенка, включая мертворожденных. Пять из 64 поросят ( 2,3V.ot чнола ьшкрошгьецированых эмбрионов ) содержали t последовательности ввелэнноВ ДНК., Í IG овотвнх: HBaie-белок синтезировался в количествах,' достаточных дяя его достоверного обнаружения в сыворотке крова. ООпая эффективность получения .'свиней, трансгенных. по ; гену HBsAg, составляет 8,7*.

; Шдробиый анализ ДНК, - выделенной из органов и тканей одного из животных-( поросенок и 8 )¿ показал наличие 0,3-0,Б копий трансгена на диплоидный геном в мозге, печени, почках, селезенка и лимфоузлах ( рис. N I >. ; ^

Кодкруххцая и регуляторная части рехомбинаятной конструкции, видимо, не претерпели значительных изменений, • так как гибридизационный анализ выявляет характеристические фрагменты из-этой. области. .Вместе с тем отмочена перестройка З'-области

■: ■ Лг...;. : " ^ ■

Таблица Н Б :

.- Результаты анаша интеграции и экспрессии гена ШгА? ( эксперимент N 1 ) у •

•• I • только

• i ' зиготы

< " Г ' ."г

!

-толы® '• ! аиготы * 2-кле- I '2-клеточнш .Г/. точные эмбрионы! 'зыбрионы . 1 + 3-. и более кяе-!

Г; точные эмбрионы I -

- .л - ■ V | Всего (X) }

'% \

• Трансплантировано 12 Игафошгьещровано -12 ,. Использовано реци- . ■ ■■ '••• яиентов :'' ¿у ■ 1 ■ Стало супоросными '■ ■-: Роадено поросят :""■*.':7; <; В том числе транс-,■ ■ ■ генных: ■ 'у :/• 1

а) по интеграции . * ; V I ' С) по экспрессии ' ■ 3

84

•• 84 ": ""

■■ .3 >

•16 у-'/* 2 ;; -V 2

; 143 V 123

239 я 219

.'б 5 -' < / ю (вз.ад, ,.

•41; ч'-.?-.-- 64 (26,82)

14 ■ 4 И

; 19 (8,7»

■ 5 у

16 ' 7;

со

* М ""

. - : ■■ -19'-1 7 3 4 5 6 7

■ глг- •.. . о - •

.г у .' Г* j»

л»»- т-л

Рис. к I. Блот-гибриддэацкя ДНК, - выделенной из ; печени поросенка Н 8 ■( дорожки мн 3 - 7 ) после гидролиза различными рестрпктазами.1 -^конструкция-свваАв.послв гидролиза' Pet в ^" : ; количестве,- соответствующем содерхаки» I'копии на геном; 2 конструкция с .EBeAg.B количестве,. соответствушэм содержанию '"*: 1/3 копии на геном. 3 - Hind III; 4 - Pet; 5 - Hind III + KooV-: . Uli 6 - Pet + Ban HI; 7 - Всю HI + Baa HI. / ' ;r/''*; ■

нетранслируемоЯ части - рекомбшантноя конструкции." Анализ " ■исходной, необработанной 'рестриктазами, ДНК трансгешшдг. особей , 'показал,;что положение сигнала совпадает о положением клеточной ДНК, и это дает-основание полагать,' что генетический материал * интегрировался в хромосомы евшей. : - ■..■.■■.' ' ;■■'.

: ' Содержание нвод оценивала с помощью 1ИА. В образцах'-крови " '16-ти из 51-го проанализированного животного выявляй нввАв- У'* . ■;':' .равных животных его концентрация колебалась'в щироккх пределах -■ от 25 до 125 нгЛиг.' В экстрактах и лизатах органов поросевка N 8 ■

• ■ ■.. ■■ i' : г ' i- * " ■■

с помощью. , тыуноферыэнтноЯ . тест-системы выявлено присутствие HBeig, однако его содержание в разных органах Шло неодинаковым. Высокое содержание SBaig ( 100 - 200 вг/мл ) бшго обнаружено в почках;'мышцах и сердце. В клетках сердечной мышцы этот антиген был, по-видимому, прочно ассоциирован' с клеточными органеллами, поскольку аффективное освобождение HBaAg было достигнуто лишь при лизисе клеток. В , легочной ткани выявлено незначительное количество'HBsig.

. ■ Лу/двух животных: ( поросята и 8 л в 10 ) подтверждением экспрессия HBeig ;в клетках печени и лимфатических узлов послужили результаты нммунофлхюресцентного анализа. ;

.Результаты кикроинъекции генаъсн в экспериментом I также щяведены в таблице н 6. ■ ;:■ V : • ''■■■■

•■ Двадцати реципиентам трансплантировали 434 ранних эмбриона свиней, 406 из которых подвергали микроинъекции гена ьоа. Шести реципиентам трансплантировали . только аиготы = и 3 реципиентам трансплантировали только'■ 2-клеточные эмбрионы. Остальным животным трансплантировали зиготы, 2-клеточные и 3- и более клеточные ембртош в смеси. В результате трансплантации у. 13, реципиентов ( GS* > родилось 109 поросят, что.составило 25,1* от общего числа трансплантированных ембрионов. ¡ - ^ ' 'У 2-х животных в ДИК, выделеной. из образцов кожи, обнаружены ' микроинъецврованнаа последовательности ДНК. В образцах . сыворотки крови 9 животных был обнаружен ыш в количествах,7 Достаточных дляего достоверного определения. Общая эффективность получения свиней, трансгенных по ьсн, - составила около 2,7*. . ■'■>'.1 ¿ : ' ■ '- . "-i "''■"." " ■ v .••'

Подробный анализ ДНК, выделенных из обрззцов кожи '2-х животных ( поросята N эт и Л ; 105 ), проведенный - с целью

Результаты анатаа интеграции в экспрессии гева ЬСН ( эюсперимевт Н 1 )

Тавлида Н 6

I только < яшвд I зиготы + 2-клеточ-Ч - Г

• I зиготы I 2-клеточные I вш змОрионы +.3-1 Всего (X) (

г \ I . эмбрионы ; I и более клеточные I ^ I

Л'1'"'- ' г-'. *• .I ?1Срионы ■ ■ V/.; 1 . " ■■ К', I.

. Трансплантировано - . "123

Иикрошгъецироваво • 123

Использовано реда- ■. 1 :

пиентов ; б

Огаю супоросными . б

Рохлено поросят . ■ 51 ' В том числе транс-"; ■

' генных: ■ ■ - - Л; .. 9

а) по интеграции . - 2

б) по экспрессии ' :7

46

.46:

3 1

4

' ■ 1 1

265

.237 -11

1

434 406

к

20 .... . , 13 (65, ОХ) 109(25,11)

11 (2,7Х) 2"

I

й

■I"

выяснения Форш существования введенного гена - интегрированного в хромосому - или в виде кольцевой минкхромосомы, показал следу шее. Во-первых^ положение сигнала ~ не совпадает с положением клеточной,, необработанной рестриктазаыи. - ДНК. что дает - ,: основание предполагать - существование ' введеного генетического материала в ашсомаой, а не штегрированнок форме. Во-вторых генные конструкции,возможно, перестроены и содержатся в количестве менее I копии на диплоидный геном.'<

'-Содержание ъсв в сыворотках' крови . полученных животных оценивали, с помощью РИА. В образцах сывороток крови 9 из 87 животных. был выявлен ъон в количествах, достаточных для его достоверного определения. У разных животных концентрация ьсн колебалась в - широких пределах > от 5 до более чем 20 нг/ыл. : . Сравнение результатов анализа интеграции и экспрессии генов НВвАв и - ЬШ : показывает, .что - общая. эффективность получения трансгенных свиней с использованием НВвАв достоверно ( р<0,01 ) выше.'чем с использованием гена ъсн. По-видимому, это может быть обусловлено свойствами используемых конструкций. .

' % . 3. выводы. ,

1. Метод микроинъекции , чужеродных ДНИ в ранние ембриовы применим для получения трансгенных свиней"с общей эффективности) -'4^8*. ^ г/. '.■; уч.-;у/у/;',-К'' /у \у7у': ■■■ .-„-^ ''

2. Кюфоиаъекция. центрифугирование или их сочетание вызывают ■ появление - видимых " /нарушений; целостности ранних эмбрионов свиней на незначительной уровне, не превышаддем 21. Сочетание центрифугирования в микрошгьвкции резко снижает их жизнеспособность, так как ; только ..10,6* от числа

центрифугированных я микроинъецированвых эмбрионов развивались , ДО рождения. ; >■' ■■' . -ч.'л, I,-

3. Для проведения мшсроииьецяй чужеродных ДНК; о целью получения трансгенных свиней целесообразно использовать эмбрионы настадии /зиготы, так как» при .достоверно более высокой :1 жизнеспособностимикроинъецированных зигот по сравнению' о микроинъецировзнными 2-клеточнымн вибрионами, общая •. эффективность получения трансгенных животных после микрояньекции в зиготы достигает 8,ЭХ и достовено превышает таковую в случае использования 2-клеточных эмбрионов. ' ■ * ' ■ > "

. 4»' Получены трансгенные свиньи с подтвержденной радиоимнунологичееким и аш«уноферментным методами внспрессией чужеродных генов. Продукты експрессии этих генов могут, иметь * медицинское и народнохозяйственное значение...

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. " . . '

I. Кузин Б.А., Васильев H.U., Слезингер , U.C. и др. ' „ Ышфоманипуляции с ранними эмбрионами .свиней.. // Доклада ВАСХНИЛ. - 1908. - Н7 10. - С. 2Э-31. \ ;

2. Некрасов А.А.. Семеняченко В.П., Васильев; И.Ы. и др. ' " Пересадка однодневных инъецированных зигот в животноводстве.' // ■ Зоотехния. - 1980. - N. 8. - С. 45-47.. ' " - : ' ■ ;