Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ПРОДУКТИВНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНУ РЕЛИЗИНГ-ФАКТОРА ГОРМОНА РОСТА, 3-ГО И 9-ГО ПОКОЛЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ПРОДУКТИВНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНУ РЕЛИЗИНГ-ФАКТОРА ГОРМОНА РОСТА, 3-ГО И 9-ГО ПОКОЛЕНИЙ"



На правах рукописи

ПАРХОМЕНКО Елена Григорьевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ПРОДУКТИВНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ СВИНЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНУ РЕЛИЗИНГ-ФАКТОРА ГОРМОНА РОСТА, 3-ГО И 9-ГО ПОКОЛЕНИЙ

03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2007 і .

Диссертационная работа выполнена в центре биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства.

Научный руководитель - академик РАСХН

JUC. Эрнст

- доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН

H.A. Зиновьева

Официальные оппоненты: - - д.б.н,, профессор

Л.П. Дьяконов

- д.б.н., профессор Ю Д. Клинский

Ведущее учреждение - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Защита состоится «17» июля 2007 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д.006.013.02 во Всероссийского государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ВИЖ. Факс: 8(4967) 651101

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа Автореферат разослан «■/£)> июня 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного coßeraj Кандидат биологически:

Губанова

1,Общая \араепх*р исти ка работы

1.1. Актуальность работы. Прикладное использование трансгенных животных с измененными биологическими и хозяйственно-полезными признаками предусматривает создание линий трансгенных животных, стабильно передающих ло наследству чужеродный ген и обусловленные интеграцией и экспрессией трансгена признаки (Эрнст Л.К., 2005). Несмотря на то, что во всем мире сегодня подучено большое число трансгенных животных с интеграцией и экспрессией чужеродных генов (Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., 2006), вопросам стабильного сохранения рекомбннанггных генов и влияния таких генов и продуктов их экспрессии на организм животных в ряде поколений не уделяется должного внимания. Результаты многолетних исследований, проводимых во Всероссийском НИИ животноводства, показали, что в процессе разведения трансгенных свиней с интеграцией генной конструкции mMTl-hGRF (ген релизинг-ф актора гормона роста под контролем промотора металлог ионелна мыши), происходит нивелирование действия трансгена на ряд биологических и хозяйственно-полезных

. признаков (Эрнсг JT.K,, Шатайло В.Н., 2001, Эрнст JIJK., Чабан И.М., 2001, Эрнст Л.К., Полтавцева P.A., 2001, Эрнст Ji.fC. и др., 2004). Однако, в связи с тем, что исследования трансгенных животных разных поколений проводились с существенным временным разрывом (более 10 лет), не ясно, является ли такое нивелирование действия трансгена на организм следствием саморегуляции организма или обусловлено влиянием изменившихся условий внешней среды. С целью более объективной оценки действия трансгена на организм свиней разных поколений в 2004 году методом внутритрубного осеменения глубоко замороженным семенем, хранившимся в криобанке более 10 лет, было получено 2-ое поколение трансгенных свиней (Багиров В.А., 2005), которое послужило основой для воссоздания последующих поколений свиней (3-, 4-го и тд,).

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение физиолого-биохнмическнх процессов и продуктивных качеств свиней, трансгенных по генной конструкции mMTl-hGRF, 3-го и 9-го поколений.

Для достижения указанной цели, были поставлены следующие задачи:

1. Выполнить сравнительное исследование уровня соматотропнна в крови трансгенных и контрольных свиней.

2. Изучить особенности роста и развития экспериментальных групп свиней, в том числе под воздействием вакцинации.

3. Изучить клиническую картину крови и особенности иммунного ответа опытных групп свиней на раздражение возбудителям» острых кишечных заболеваний.

4. Выявить особенности биохимических процессов, протекающих в организме трансгенных свиней, в сравнении с животными-аналогами.

5. Определить показатели мясной и-опюрмечирй- индуктивности трансгенных свиней и их аналогов. * г! АУ-МСХА

им?нн К.А, Тимиряа^ iJHfi имени Н.И. Жел*.^ Фонд научный литерату

6. Изучить весовые характеристики, гистологичесне и цитоморфологические особенности органов и тканей трансгенных свиней.

7. Изучить систему морфологических корреляций в организме трансгенных и контрольных свиней.

1.3. Научная новизна пяботы. Впервые выполнена оценка действия интеграции трансгена на организм свиней, трансгснных по тМТ1-ЬОЯК, разных поколений. В одинаковых условиях внешней среды (кормление, содержание и т.п.) изучены особенности физиолого-биохимнческих процессов, мясная и откормочная продуктивность, пито морфологические показатели органов и тканей, иммунный ответ при вакцинации бактериальной вакциной у трансгснных свиней 3-го восстановленного и 9-го поколений в сравнении с животными-аналогами.

1.4. Практическая значимость работы. По результатам исследований трансгснных свиней 3- и 9-го поколений и их аналогов определены биологические особенности развития трансгенных свиней разных поколений; изучены особенности гематологических показателей и иммунологического ответа организма трансгенных скиней на раздражение возбудителями острых кишечных заболеваний; определены показатели мясной и откормочной продуктивности при убое в 120-130 кг живой массы; изучены цито морфологические особенности органов и тканей трансгенных свиней; выявлена корреляционная зависимость уровня соматотропина в крови с другими физиологическими и хозяйственно-полезными признаками.

1.5. Основные положения, выносимы« на защиту.

• Повышенный уровень соматотропина в крови трансгенных свиней 3-го и 9-го поколений как результат интеграции и экспрессии гена релизинг-фактора гормона роста.

• Изменения в динамике роста трансгенных свиней ло сравнению с аналогами.

• Лучшая иммунологическая реактивность трансгенных свиней 3- и 9-го поколений по результатам вакцинации к возбудителям острых кишечных заболеваний.

• Изменение морфометрических показателей внутренних органов (щитовидной железы, поджелудочной железы, печени) у трансгениых свиней 3- и 9-го поколений как реакция организма на интеграцию трансгена.

• Изменение некоторых морфологических корреляций в организме трансгенных свиней.

• 1.6. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на научных конференции центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ в 2005, 2006 гг., на 5-й международной школе-конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2005.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 - в журналах «Свиноводство» и «Зоотехния», рекомендованных ВАК РФ.

1.7. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы.

Диссертация изложена на 124 страницах, включает 26 таблиц, 35 рисунков. Список литературы включает 150 источников, в том числе 77 на иностранных языках.

2. Материал и методы исследований.

Исследования проводили на откармливаемых трансгенных свиньях 3-го (восстановленного) и 9-го поколений м их аналогах — помесных свиньях пород ландрас и крупная белая в условиях физиологического двора ВИЖ, согласно схеме исследований, представленной на рисунке i.

Свиньи были получены методом искусственного осеменения нстрансгенных маток семенем трансгснных хряков № 231-г, № Збб-г, Ks 398-г в экспериментальном хозяйстве ВИЖ «Кленово-Чегодаево» (отв. исполнитель - вл.с., к.с.-х.н. Данч С.С.). Интеграцию чужеродного гена определяли с помощью ПЦР в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики животных ПИЖ (отв. исполнитель — с.н.с., к.б.н. Коновалова E.H.). В течение научно-хозяйственного опыта от животных отбирали кровь для гематологических исследований. Биохимический анализ крови проводили в лаборатории биохимии животных (отв. исполнитель Гусев И.В-)-Иммуиологическис исследования крови проводили на кафедре клинической диагностики и болезней молодняка МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

По окончании опыта и при достижении свиньями живой массы 120 — 130 кг, был произведен контрольный убой по методике ВИЖ с детальным изучением развития внутренних органов, анаггомо-морфологического состава туш и гистологической картиной некоторых органов и тканей организма. Результаты обрабатывали биометрическими методами по малой выборке по Е. К. Меркурьевой с помощью компьютера. За минимальный порог достоверности разницы между показателями принимали Р <0,05.

3. Результаты собственных исследований

3.1. Изучение уровня соматотропнна в крови трансгенных и контрольных свиней.

Содержание в крови трансгенных свиней соматотропнна — важнейший показатель, определяющий изменение фенотипа. Как показано в таблице 1, в среднем уровень соматотропнна в крови трансгенных особей, как 3-го, так и 9-го поколений был существенно выше по сравнению с контролем. Так, у свиней опытных групп 3- и 9-го поколений этот показатель составил, соответственно, 1,8 и 0,85 нг/мл, что было, соответственно, в 4,5 и 2,1 раза выше, чем в контроле. Сопоставляя средние значения уровня соматотропнна в крови трансгенных животных изучаемых поколений, следует отметить, что уровень гормона в крови трансгенных свиней 3-го поколения был выше в 2,1 раза по сравнению с трансгенными свиньями 9-го поколения.

Рисунок 1. Общая схема исследований.

Изучение концентрации соматотрошша в крови свиней в динамике, выявило значительные колебания этого показателя на протяжении всего откорма. Следует отметить, что трансгенные свиньи характеризовались большей индивидуальной изменчивостью этого показателя.

Таблица 1

Содержание гормона роста в кровн трансгенных свиней и их аналогов. __

№ животного Уровень соматотропнна в крови (нг/мл)

1 взятие 2 взятие 3 взятие 4 взятие 5 взятие в среднем

135 да. 170 дн. 190 дн. 205 дн. 220 дн.

Трансгенные свиньи (3 поколение)

Кя 719 1,4 0,5 4 1,3 1,7

№736 3 3,5 U 4 0 2,3

№720 1,4 0,5 1,2 3 1,3 1,5

В среднем (М) 1,9 1,5 1,2 3,7 0,9 1,8

Трансгенные свиньи (9 поколение)

№753 0 0,8 0,6 0,5 1,3 0,6

№761 1,4 0,8 2,8 0,5 0 1,1

В среднем (М) 07 0,8 | 1,7 0,5 0,65 0,85

Контроль

№716 0 0,5 0,5 0,25 0 0,3

№72) 0 0,25 0,8 0 0 0,2

№732 0 0 0,8 0 1,3 0,4

№ 765 1,4 0,5 0,25 0 0 0,4

№715 1,4 0,25 0,1 0 0 0,4

№750 1,4 0 0,25 0 1,3 0,6

В среднем (М) 0,7 0,3 0,5 0 0,4 0,4

3.2. Особенности роста трансгенных свнней.

По данным ряда исследований, проведенных на лабораторных животных, известно, что повышенный уровень соматотропнна в кровн приводил к ускорению темпов роста. Поскольку изучаемые нами свиньи, трансгенные по гену релизинг-фактора гормона роста, также характеризовались повышенным уровнем гормона роста в крови, следовало ожидать заметных изменений в темпах роста транс генных свиней по сравнению с аналогами,

В результате изучения темпов роста трансгенных и контрольных животных было установлено, что за весь период опыта трансгениые животные 3-го поколения по среднесуточному приросту массы превосходили контрольных свиней на 36 грамм, в то время как трансгенные свиньи 9-го поколения — па 81 грамм.

Если в начале откорма свиньи 9-го поколения по среднесуточным привесам уступали контрольным животным и животным 3-го поколения, соответственно, на 9,2 и 21,0%, то во второй половине откорма среднесуточные привесы данной группы оказались выше, чем в других группах. Наиболее ярко это проявлялось, начиная с 215 дня: максимальная разшша по отношению к контрольной группе -16,2 % (225 день), к группе 3-го поколения —53,7% (215 день). Свиньи 3-го поколения, наоборот, в первую

половину откорма по среднесуточным привесам превышали животных других групп, однако после 215 дня их привесы значительно снизились.

Совершенно неизученным является вопрос о влиянии на обмен веществ и процессы роста вакцинация животных против различных заболеваний, которая, несомненно, вызывает существенные изменения обмена веществ и, как следствие, изменения в темпах роста* В нашем опыте проводилась двукратная вакцинация трансгенных и контрольных свиней вакциной ОКЗ на 175 и 190 дни откорма.

Как показано на рисунке 2, вакцинация в обоих случаях приводила к заметному снижению темпов роста свиней, однако степень снижения в разных группах подопытных животных варьировала.

Рисунок 2

Влияние вакцинации на привесы трансгенных и контрольных свиней в период откорма (дни вакцинации указаны стрелками)

12Б 135 145 165 169 175 185 195 205 215 225 235

Как показано на рисунке 2, снижение среднесуточных привесов в ответ на первую вакцинацию в большей степени наблюдалось у трансгенных свиней: на 13,2% у свиней 3-го поколения и на 6,9% - у животных 9-го поколения, в то время как у контрольных - на 3,7%. При повторной вакцинации существенных различий в изменениях темпов роста между трансгенными и контрольными свиньями не наблюдалось.

В целом следует отметить, что интеграция в геном свиней генов, связанных с экспрессией факторов роста, приводит к некоторым изменениям в характере роста и развития животных, однако однозначной тенденции в направлении таких изменений у свиней 3- и 9-го поколений не выявлено.

3.3. Иммунологический статус трансгенных свннеП.

Генетические исследования ряда лабораторий мира показали дестабилизирующее действие чужеродных генов на состояние хромосомного аппарата и появление, связанных с этим генных мутаций. Возможно, что экзогенная конструкция в результате синтеза чужеродного продукта и мутагенного взаимодействия прямо или опосредованно влияет на состояние иммунной системы трансгенных животных. Для характеристики иммунного статуса трансгенных свиней были исследованы особенности гуморального иммунитета в норме и при повышенной иммунной нагрузке. В качестве показателя, отражающего резистентность организма, был использован титр антител к бактериальным антигенам в сыворотке крови до и после вакцинации.

Были проведены исследования по изучению динамики образования специфических антител к Протею, Клебснелле, Сальмонелле, Эшерихии при вакцинации животных вакциной ОКЗ (вакцина ассоциированная и «активированная против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллсза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей), серия .№21, контроль №21. В нашем опыте проводилась двукратная вакцинация с интервалом 14 дней.

Как показано в таблице 2, у всех животных до вакцинации отмечалось наличие антител ко всем антигенам, входящим в вакцину ОКЗ. Это свидетельствует о соответствующем антигенном раздражении исследуемых свинсй на протяжении жизни, предшествующей вакцинации. Это могло происходить естественным путем: от матери с колостральными антителами, алиментарным и другими. За период до вакцинации уровень антител против клебсиеллы был выше у контрольных животных. Однако титр антител против других антигенов был выше у трансгенных свиней.

Таблица 2

Значения титров антител к клебсиелле, прлтею, сальмонелле, эшерихии в различные сроки вакцинации свиней_

Период клебсиедла протей

контроль 3 поколение 9 поколение контроль 3 поколение 9 поколение

1 40,0 33,3 30,0 48 53,3 60,0

2 56,0 33,3 100,0 320 186,7 100.0

3 144,0 240,0 200,0 1808 960,0 240,0

4 112,0 160,0 120.0 1024 533,3 400,0

ч а I 1—1 Ч сальмонелла эшерихия

контроль 3 поколение 9 поколение контроль 3 поколение 9 поколение

1 40,0 93,3 80,0 72,0 133,3 120,0

2 168,0 266,7 160,0 128.0 266,7 320,0

3 320,0 533,3 320,0 224,0 266,7 480,0

4 320,0 746,7 320,0 288,0 426,7 400,0

І - до вакцинации;

2-довакцинации:

3 - через две педели после первой вакцинации; 4 - через две недели после второй вакцинации

В периоды после вакцинации титры антител к каждому антигену возрастали, но динамика изменения уровней в группах была различной. Резкие изменения уровня антител к клебсиелле после первой вакцинации отмечены в іруппе свиней 3 поколения - в 7,2 раза. Однако после второй вакцинации титр антител к клебсиелле во всех группах снизился. Уровень антител к протею наиболее стабильно увеличивался в группе свиней 9-го поколения; в 2,4 раза после первой вакцинации и в 1,7 раза - после второй. В других группах после первой вакцинации титр антител резко увеличивался, а после второй снижался в 1,8 раза. Стабильное увеличение титра антител к сальмонелле показали свиньи 3-ю поколения: в 2 раза после первой, и в 1,4 раза - после второй вакцннаїшн, В группах контрольных свиней и трансгснных свиней 9-го поколения титр антител после первой вакцинации увеличился, соответственно, в 1,9 и 2 раза. После второй вакцинации титры антител у этих групп остались на том же уровне. Титры антител к эшерихии после первой и второй вакцинаций увеличились у контрольных животных, соответственно, в 1,7 и 1,3 раза. В группе 3-го поколения титры антител увеличились только после второй вакцинации - в 1,6 раза. Животные 9-го поколения показали увеличение титра антител в 1,5 раза после первой вакцинации, однако после второй вакцинации произошло снижение • в 1,2 раза.

Таким образом, результаты исследований по установлению специфического иммунитета к антигенам: протею, сальмонелле, клебсиелле и эшерихии в результате вакцинации животных вакциной ОКЗ показали, что трансгенные животные характеризуются не только высокой степенью специфического иммунного ответа к бактериальным возбудителям, но и подтвердили ранее полученные данные о готовности таких животных к специфической защите при встрече с любым инфекционным агентом на ранней стации вакцинации.

3.4. Биохимические особенности обмена веществ трансгенных свиней и аналогов.

Исследования обмена веществ трансгенных и не трансгенных свиней показали некоторые отличия в интенсивности протекания процессов метаболизма. Так, уровень глюкозы в группе свиней 9-го поколения был выше, чем в контрольной группе в группе свиней 3-го поколения, соответственно, на 38,2 и 24,6%. Азотистый обмен характеризовался увеличением общего белка в крови свиней 9-го поколения по сравнению с контрольной группой и группой свиней 3-го поколения, соответственно, на 13,9 и 10,6%. Было отмечено снижение уровня альбуминов в крови у свиней 3-го поколения на 4,9% по сравнению с другими группами. По концентрации

глобулинов животные 9-го поколения превосходили контрольную группу и группу 3-го поколения, соответственно, на 31,4 и 31,0%. Отмечая некоторые различия в биохимических показателях крови трансгенных и контрольных свиней, следует отметить, что во всех группах свиней биохимические показатели находились в пределах физиологической нормы.

3.5. Мясная продуктивность.

Изучение состава туш опытных свиней показало, что при практически равном весе полутуш у трансгснных животных 9-го поколения отмечается тенденция к увеличению мяса в туше по сравнению с группой 3 поколения и контрольной группой, соответственно, на 5,5 и 2,8%, Отмечено снижение веса сала в группе 9-го поколения по сравнению группой 3 поколения и контрольной группой, соответственно, на 10,0 и б,1%- Вес костей в группе 3 поколения снизился на 2,3% по сравнению с контролем, в то время как в группе 9-го поколения, наоборот, увеличился на 7,3%.

Таблица 3

Состав тут трансгенных свиней и 9-го поколений и их аналогов.

Показатель Группы свиней

Контр. 3 поколение 9 поколение

кг кг К контролю кг К контролю К 3 поксл.

кг % кг % кг %

Вес полутуши 41,6 44,8 +3,2 +7,7 46,0 +4,37 +10,5 +1,2 +2,6

Вес мяса 22,5 23,7 +и +5,1 25,6 +3,06 +13,6 +1,9 +8,1

% мяса 54,1 52,7 -1,4 -2,5 56,0 +1,52 +2,8 +2,9 +5,5

Вес сала 15,1 17,0 +1,9 +12,4 15,7 +0,58 +3,8 -1,3 -7,6

%сала 36,4 37,9 +1,6 +4,4 34,1 -2,21 -6,1 -3,8 -10,0 +12,8

Вес костей 3,98 4,19 +0,2 +5,2 4,7 +0,75 +18,7 +0,5

% костей 9,6 9,4 -0.2 -2,3 10,3 +0,7 +7,3 +0,9 +9,8

Показательными и более объективными критериями оценки полномясности туш являются «индекс мясности» - соотношение мясо/кость и

«индекс постности» - соотношение мышечная/жировая ткань (тит. 4).

Таблица 4

_Показатели качества отдельных частей туш свиней._

Группа Индекс «мясности» Индекс «постности»

животных Части туши Части туши

Передняя Задняя Средняя Передняя Задняя Средняя

Контроль 5,42 5,81 5,32 4,77 2,64 1,23

3 поколение 5,07 5,72 6,64 3,83 2,34 1,03

9 поколение 4,99 5,77 5,72 3,9, 2,30 1,27

Как видно из таблицы 4, значения индексов мясности и постности для туш изучаемых групп свиней очень близки. Так, по индексу мясности передние, задние и средние часта туши контрольных и трансгенных животных оказались практически идентичными, значение этого индекса

колебалось в пределах 5,0-5,8. Лишь у евшей 3-го поколения индекс мясности средней части туши был значительно выше — б,б. По среднему индексу постности все соответствующие части туш свиней 3- и 9-го поколений трансгенных свиней так же очень близки. У контрольных животных индекс постности передней и задней частей выше, чем у опытных. Однако вследствие значительного разброса данных, особенно в контрольной группе, разница не достоверна. По средним значениям индекс мясности свиней 3- и 9-го поколений составил, соответственно, 5,7 и 5,4, контрольных свиней - 5,5, индекс постности, соответственно, - 2,0, 2,2 и 2,4.

Выход жира-сырца у всех экспериментальных свиней был невысокий: от 1 до 1,6% от массы туши. Если в группах аналогов и транс гешых свиней 3-го поколения выход жира-сырца составил 1,6%, то у свиней 9-го поколения этот показатель был существенно ниже и составил 1,0% (табл. 5),

Таблица 5.

Выюд основных субпродуктов I категории.

Номер животного жир-сырец почки печень сердце

кг | % кг I % КГ 1 % кг і %

Контрольная грэ ,ппа

1 0,84 1,25 0,29 0,43 139 2,07 0,31 0,46

2 1,63 2,16 ОДб 0,34 139 1,84 038 0,50

3 1,50 1,97 0,28 0,37 1,24 1,63 0,37 0,48

4 0,78 1,03 1 0,31 0,41 1,45 1,92 0,38 0,50

М 1,19 1,60 0,29 0,39 1,37 1,87 0,36 0,49

Опытная группа 3-е поколение

5 0,986 1,19 0,31 0,38 1,57 1,90 0,39 0,47

6 1,57 2,01 0,23 0,29 1,57 2,01 0,37 0,47

7 1,44 1,64 0,28 032 1,59 1,80 0,42 0,48

М 1,33 1,61 0,27 озз 1,58 1,90 039 0,47

Опытная группа 9-е поколение

8 0,92 1,14 I 0,40 0,49 1,56 1,93 0,35 0,43

9 0,80 0,87 ! 035 0,43 1,78 3,46 0,47 0,51

М 0.86 1,01 0,38 0,46 1,67 2,70 0,41 0,47

Заметные различия были установлены по выходу почек и печени (табл. 5). Более высоким выходом этих субпродуктов характеризовались животные 9-го поколения: соответственно, 0,46 и 2,7%. В двух других группах выход почек и печени был существенно меньше и составил, соответственно, 0,39 и 1,87% у контрольных свиней и 0,33 и 1,9% у трансгенных свиней 3-го поколения. По выходу сердца животные разных групп практически не различались. Следует отметить, что если разброс данных по соответствующим показателям между индивидуальными животными контрольной и опытной (3-е поколение) групп был незначительный, то трансгенные свиньи 9-го поколения характеризовались высокой

индивидуальной изменчивостью по выходу основных субпродуктов, в частности печени (1,91-3,46%) и сердца (0,43-0,51%).

Анализ химического состава длиннейшей мышцы спины показал, что содержание основных составных компонентов: влага, белка и жира во всех группах было характерным для этой мышцы. Содержание влаги колебалось в среднем от 71,7% в группе трансгенных свиней 9-го поколения до 74,0% в контрольной группе, жнра - от 2,1% в контрольной группе до 4,4% в опытной группе 9-го поколения, белка - от 22,9% в контрольной группе до 23,3% в опытной группе 3-го поколения. Различия в показателях между группами были недостоверны.

Анализируя химический состав мякотной части туши в целом (табл. 6), следует отметить несколько большее содержание белка в группах трансгенных свиней: 17,4% у свиней 3-го поколения и 17,6% у свиней 9-го поколения по сравнению С контрольными свиньями (17,1%), Минимальным средним содержанием жнра в мясе характеризовались свиньи 9-го поколения (17,2%), однако вследствие высокой индивидуальной изменчивости этого показателя в группе, разница была недостоверной (табл. 6).

Таблица 6

Химический состав свинины (мякотной части туши _экспериментальных групп свиней) _

Номер животного | Влага, % | Жир, % | Белок, %

Контрольная группа

I 63,3 18,5 17,4

2 59,6 22,9 16,6

3 61,6 19,8 16.2

4 65,80 15 18,1

М 62,6 19,1 17,1

Опытная группа 3-е поколение

5 62,8 18.2 18,1

6 58,9 23,4 16,5

7 63,6 18 17,7

М 61,8 19,9 17,4

Опытная группа 9-е поколение

8 68,4 12.4 18,6

9 62,8 19,2 16,5

М 64,7 17,2 17,6

Таким образом, в целом ло общему химическому составу мяса не установлено существенных и достоверных различий между опытными животными и контрольными аналогами.

3.6. Исследование гастоетруктуры внутренних органов.

Анализ весовых характеристик внутренних органов показал увеличение массы некоторых внутренних орі-анов у свиней 9-го поколения

по сравнению с контрольными животными и животными 3-го поколения. Так у свиней 9-го поколения масса печени была больше на 6,4%, чем у свиней 3-го поколения и на 17,7 %, чем у аналогов; масса селезенки была больше на 29,6%, чем у контрольных животных; масса сердца была больше на 13,9%, чем у контрольных животных и на 5,1%, чем у животных 3-го поколения.

Гистологическое исследование внутренних органов свиней показало заметную реакцию животных в ответ на интеграцию трансгена в геном. По-видимому, регуляторные механизмы, отражением которых служит картина развития щитовидной железы, печени и островков Лангерганса, участвуют в компенсаторных процессах межуточного обмена. На ранних генерациях исследуемого типа животных (3-е поколение) происходит активное изменение в структуре и функции фолликулярного аппарата щитовидной железы, фолликулы увеличиваются (средний диаметр равен 223,6 мкм против 188,2 мкм в контроле), а на поздних генерациях (9-е поколение), этот фактор компенсируется и не проявляет столь значительного влияния (средний диаметр равен 193,4 мкм) (табл. 7).

Таблица 7.

Морфомстрические показатели фолликулов щитовидной железы

опытных свиней

Показатели 721 К И 14 К Ы Л- 719 III 720 Ш 736 III а {С X У-. <~- щ №

Диаметр, мкм 316,8 159,5 1188 Д 183,9 262,7 224,3 223,6, 2133 173,4 193Д

сг.откіі. 97,9 36,0 • 66,9 61,8 96,0 182,3 113,39 109,0 71,6 •90,3

±т [4,0 5,1 9,6 ■■■ 8,8 13,7 26,0 : 16,20] 15,6 10,2

СУ 45 23 33,8 34 37 81,3 50,49 51 41 --46Д.Г]

Аге*., мкм'1 38130 І8І35 28282- 25648 53328 56213 450«. 3732^ 22826 30077

ст.откл. 40298 8832 24565 20297 43370 115028 5956* 627231 27468 45096

5757 1262 3509: 2900 6196 16433 8509 8960*1 3924 6442 \

СУ 106 48 Г 76 *- 79 81 205 -122 168 120

В поджелудочной железе наблюдается заметное снижение плотности размещения клеток в островках Лангерганса: 24 и 27 клеток на 100 мкм2 площади у трансгенных животных 3- и 9-го поколений, соответственно, против 32 клеток на 100 мкм1 в контроле. Это, по-видимому, связано с укрупнением клеток, повышением их функциональной активности.

Пищеварительные процессы, в которых значительный удельный вес принадлежит печени, у трансгенных свиней так же активизированы, о чем свидетельствует увеличение толщины печеночных балок у трансгенных животных (25,4 и 24,9 мкм у свиней 3-го и 9-го поколений, соответственно, против 20,7 мкм в контроле), что является нормальной реакцией иа интеграцию гена релизинг-фактора гормона роста, однако уровень пищеварительных процессов сбалансирован и не вызывает особых отклонений от физиологической нормы.

В скелетной мускулатуре, на образцах длиннейшей мышцы спины, прослеживается некоторая дифференцировка, выразившаяся в снижении диаметра мышечных волокон у трансгенных свиней (табл. 8). Эти явления наблюдались и раньше при исследовании трансгенных животных. По-видимому, указанные процессы связаны с дополнительными сигналами со стороны генетического аппарата и являются ответом на стимуляцию анаболизма, обусловленную модификацией организма за счет внедрения рекомбинантной конструкции.

Таблица 8.

Морфометрическне показатели волокон длиннейшей мышцы спины опытных свиней

Показатели И к ГА К К £ К м> ■ : а. ь о 111 Ш і; 60,2 У г- 5ЇД •а /г о. ?£<г

Диаметр, мкм «6,7 73,2 79,7 58,9 09,6 62,1 73,0 70,6 68.6

СГГОТКЛ. 11.7 14.8 16.8 11.6 13,7 9.9 13.6 14,3 12,6 10,4 6,9 8,6-

±т 1,7 2,1 2,4 1,7 2,0.; 1,4 1,9 2,0 1,8 1.5 1,0 1,2

О 17,6 20,3 21,1 19,7 19,6 15,9 18,6 20,2 18,2 17,2 13,5 15;3

X сеч., мкм' 512(1 62*2 7799 ■ШІ 5822 3X57 6021 5413 аш 3952 2724 3338

ст.откл. 1464 2378 3316 1370 2132 10% 1916 2071 1694 ■242 1222 673 947

±т 209 340 474 196 304 157 274 296 175 96 135

С\ 29 3« 43 34 ,45' 28 32 38 32 31 25 -27

3.7. Корреляционные зависимости в организме свиней.

Анализ корреляционных зависимостей показал, что развитие органов и тканей в организме свиней происходит скоординировано, по некоторым из

них отмечаются достоверные связи (табл. 9),

Таблица 9.

_Корреляционные зависимости в организме опытных животных

показатели Вес тушн голова сердце печень селезенка ночки легкие

Голова контроль 0,42 0,26 -0,36 -0.26 0,03 0,3

трансгсн -0,73 -0,53 -0,34 -0,36 -0,41 -0,21

Сердце контроль 0,95 0,26 0,11 0.65 0,13 0,07

трансген 0,92 -0,53 0,9 0,79 0.02 0,33

Печень коїггроль 0,13 -0,36 0,11 0.52 0,87 0,56

трансіїн 0,79 -034 0,9 0,55 0,25 0,66

Селезенка контроль 0,62 -0,26 0.65 0,52 0,51 -0,05

трансген 0,82 -0,36 0,79 0,55 -0,18 -0,05

Почки контроль 0,27 0.03 0.13 0,87 0,51 0,57

трансген 0,27 -0,41 0,02 0,25 -0,18 0,83

Легкие коїггроль 0,07 03 0,07 0,56 -0,05 0,57

тршісіен 0,38 -0,21 0,33 0,66 -0,05 0,83

1) мышечных волокон контроль -1,0 -0,36 0,97 -оде 0,68 -0,27 -0,91

трансген -0.31 -0,23 -0,43 -0,74 -0,18 -0,39 -0,8_ _

Так, по диаметру мышечных волокон в длиннейшей мышце спины и общему весу туши отмечается высокая отрицательная связь. Размер фолликулов щитовидной железы положительно связан с диаметром мышечных волокон, следовательно, накопление тироксина в фолликулах может быть связано с некоторой задержкой его выброса и соответственным понижением активности процессов расщепления н умножения мышечных волокон в изучаемом мускуле. Наиболее высокая положительная связь устанавливается между развитием сердца и массой туши. Масса туши слабо коррелирует с массой головы, но каждая из этих масс весьма высоко связана обратной связью с показателем диаметра мышечных волокон.

Всё это указывает на разносторонний характер взаимозависимостей между органами в их развитии. Указанные корреляции помогают в расшифровке особенностей развития органов и тканей трансгенных свинсй.

4. ВЫВОДЫ.

1. Синтез сомагготропииа в крови трансгснных свиней 3- и 9-го поколений в среднем составил 1,8 и 0,85 нг/мл, что, соответственно, в 4,5 и 2,1 раза выше по сравнению с контрольными свиньями.

2. Установлено, что трансгенные свиньи 9-го поколения характеризовались более высокими темпами роста на поздних стадиях развития (начиная с 215-го дня). Максимальная разница по отношению к контрольной группе составила 16,2% (225-ый день), к группе 3-го поколения - 53,7% (215-ый день).

3. По результатам вакцинации свиней к возбудителям острых кишечных заболеваний показано, что трансгенные животные характеризуются не только высокой степенью специфического иммунного ответа к бактериальным возбудителям, но и лучшей по сравнению с контролем готовностью к специфической защите при встрече с любым инфекционным агентом на ранней стадии вакцинации.

4. Биохимический анализ крови экспериментальных групп свиней показал соответствие вссх биохимических показателей крови, за исключением'глюкозы (во всех группах), физиологической норме. Концентрация глюкозы в крови трансгенных свиней 9-го поколения составила 7,б±3,2 ммол/л, что было, соответственно, на 38,2 и 24,6% выше, чем в контрольной группе и в группе свиней 3-го поколения. Активность ACT и AJ1T в группе 9-го поколения составила, соответственно, 87,4±23,6 и 63,3*2,5 МЕ/л, что было на 63,1 и 23,4% выше по сравнению с группой свинсй 3-го поколения и на 24,3 и 11,8% выше по сравнению с контрольной группой. Содержание общего белка и глобулинов в крови свиней 9-го поколения составило, соответственно, 84,2±0,1 и 43,1 ±1,9 г/л, что было выше на 13,9 и 31,4% по сравнению с контролем и на 10,6 и 31,0% - по сравнению с группой 3-го поколения.

5. Выявлена тенденция к увеличению содержания мяса и снижения содержания сала в тушах трансгснных свиней 9-го поколения по сравнению с контролем (соответственно, на 2,8 и 6,1%) и группой трансгенных свиней 3-го поколения (соответственно, на 5,5 и 10,0%). Анализ показателей мясной продуктивности выявил снижение веса сала у трансгенных животных 9-го поколения по сравнению с контролем и группой 3-го поколения, соответственно, на 6,1% и 10,0%. Выявлена тенденция повышенного содержания белка в мясе трансгенных свиней: 17,4% у свиней 3-го поколения и 17,6% у свиней 9-го поколения по сравнению с 17,1% у контрольных свиней.

6. Установлено изменение морфометрических показателей некоторых внутренних органов у трансгенных свиней 3- и 9-го поколений. Средний диаметр фолликулов щитовидной железы у трансгенных свиней 3- и 9-го поколений был выше и составил, соответственно, 223,6 и 193,4 мкм против 188,2 мкм в контроле. Плотность размещения клеток в островках Лангерганса в поджелудочной железе трансгенных животных 3- и 9-го поколений снизилась н составила, соответственно, 24 и 27 клеток на 100 мкм2 площади против 32 клеток на 100 мкм2 в контроле. Выявлено увеличение толшины печеночных балок у трансгенных животных по сравнению с контрольными: 25,4 и 24,9 мкм в группах свиней 3-го и 9-го поколений против 20,7 мкм в контроле.

7. Показано изменение некоторых морфологических корреляций в организме трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ.

Лабораториям, занимающимся вопросами трансгенеза в животноводстве, рекомендуем учитывать полученные нами данные, при создании И разведении стабильных линий трансгенных сельскохозяйственных животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Эрнст, Л.К. Влияние интеграции гена релизинг-фактора гормона роста на некоторые хозяйственно-ценные признаки свиней/ Л.К, Эрнст, Н.А, Зиновьева, H.A. Волкова, Е.Г. Пархоменко, И.А. Ралков, Г. Брем Г П Зоотехния, 2007, №5. - с.2-5.

2) Волкова, H.A. Динамика роста трансгенных свиней в эмбриональный и постпатальный периоды развития / H.A. Волкова, Е.Г. Пархоменко, Л.А, Волкова, H.A. Зиновьева // Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки.- Чебоксары, изд. ЧГСХА, март 2006 г., - стр. 179-180. — Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых

3) Пархоменко, Е.Г. Особенности иммунного статуса трансгенных свиней / Е.Г. Пархоменко, H.A. Волкова, НА. Зиновьева, Л.А. Волкова // Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки. • Чебоксары, Изд. ЧГСХА, март 2006. - стр. 217-218. - Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов).

4) Эрнст, JI.K. Мясные и откормочные качества трансгенных свиней / JI.K. Эрнсг, Е.Г. Пархоменко, Н,А. Зиновьева, В-А. Багиров, И.А. Ралков // Свиноводство, 2007, №3. - с.2-5.

5) Пархоменко, Е.Г. Проблемы получения трансгенных кроликов / Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Вып. 9. -РАМЖ - Быково. -2003.

6) Грезина, Н.М. Получение трансгенных кроликов методом микроииъекиии в пронуклеус зигот / Н.М. Грезина, Е.Г. Пархоменко // Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных, Дубровицы, 2003. — (Сб. материалов школы-практикума, под ред. профессора, доктора биологических наук Зиновьевой H.A.).

7) Пархоменко, ЕР. Эффективность получения трансгенных кроликов методом микроинъекции в пронуклеус зигот / Е.Г. Пархоменко, Н.М. Грезина // Материалы 4-й Международной научной конференции «Новые методы генодиагностики и гемотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных» ВИЖ 21 декабря, Дубровикы, 2004.

8) Пархоменко, ЕР. Сравнительный анализ некоторых показателей оценки качества туш и массы внутренних органов трансгенных свиней 3-го, 9-го поколений и животных аналогов / Материалы 5-й Международной научной конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных» ВИЖ 2i декабря, Дубровицы, 2005, стр. 125-127.

Издательство РУЦ ЭЕТЖ 142132, Московская обл.. Подольский р-н, п. Дубровицы Тел. (8 - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано а набор 14.06.2007. Подписано в печать 15,06.2007 Заказ № 12. Печ. л. 1,0 Тираж 100 экз.

Отпечатало в типографии РУЭЦ