Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Особенности липидного обмена у трансгенных растущих свиней

ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Лияськин, Юрий Константинович, Ульяновск

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

УДК 577.125: 636.4 ЛИЯСЬКИН ЮРИЙ КОНСТАНТИНОВИЧ р>

ОСОБЕННОСТИ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА У ТРАНСГЕННЫХ РАСТУЩИХ СВИНЕЙ

Специальность 06.02.05-Физиология, биохимия и биотехнология сельскохозяйственных животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук

Лапшин С.А.

»

Ульяновск 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЬ

1.1. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА И ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА

1.1.1. Нейрогипофизарная система организма (анатомия)..........8

1.1.2. Принцип обратной связи в регуляции секреции гормонов.........................................................................................И

1.1.3. Взаимовлияние биорегуляторов на уровень гормона роста в организме..............................................................................12

1.1.4. Влияние гормона роста на обмен веществ в организме.....18

1.2. ВЗАИМОСВЯЗЬ ГОРМОНА РОСТА И ЛИПИДОВ В ОР-

ГАНИЗМЕ

1.2.1. Значение и классификация липидов организма...............20

1.2.2. Химический состав мембран..........................................22

1.2.3. Обмен липидов........................;'л^?,..,................25

1.3. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

1.3.1. Фенотипический эффект интеграции гена гормона роста........................................................................................30

1.3.2. Особенности фенотипа трансгенных свиней по гену (МТ-ШСШО...............................................................................34

2.0. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общая схема исследования...............................................38

2.2. Научнохозяйственный опыт.............................................38

2.3. Балансовые опыты...........................................................42

2.4. Биохимические исследования............................................45

2.5. Статистическая обработка данных..................................48

3.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Особенности роста трансгенных животных........................49

3.2. Особенности трансгенных животных в переваривании и использовании питательных веществ кормов........................53

3.3. Особенности липидного состава тканей и органов трансгенных свиней.................................................................58

3.3.1. Содержание в крови глюкозы, липидов и жирных кислот . 59

3.3.2. Липидный состав легких..........................................62

3.3.3. Липидный состав печени..........................................64

3.3.4. Липидный состав почек...........................................66

3.3.5. Липидный состав сердечной ткани..............................68

3.3.6. Липидный состав селезенки......................................70

3.3.7. Липидный состав стенок желудка, тонкого и толстого кишечника................................................................72

3.3.8. Липидный состав мышечной ткани..............................77

3.3.9. Липидный состав жировой ткани...............................79

4.0 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...............82

ВЫВОДЫ......................................................................94

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК....................................96

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и качество продукции во многом определяется уровнем их наследственного потенциала. До последних десятилетий совершенствование наследственности шло медленно и осуществлялось только традиционными методами. В течение длительного периода с их помощью были созданы многочисленные высокопродуктивные породы и стада разных видов животных, устойчиво передающие свои признаки потомству.

Возникновение и бурное развитие биотехнологии и ее основных ветвей клеточной и генной инженерии создает возможности более быстрого и радикального воздействия на организм животных, расширения и ускорения их селекции. Основной целью работ по генной инженерии в животноводстве является создание уникальных племенных животных с измененной и устойчивой наследственностью, используемых в больших популяциях для их совершенствования, повышения продуктивности и качества продукции. В настоящее время разработаны методы выделения отдельных генов и их конструирования, интегрирования в геном реципиента. Включение чужеродных последовательностей ДНК или трансгеннов в геном организма - реципиента с последующей устойчивой их наследуемостью в ряде поколений обеспечивает получение так называемых трансгенных животных (R.J. Wall, et. ей., 1992; Н.П. Блинов, 1995). При этом не существует никакого систематико-генеологического барьера этой интеграции. С помощью трансгенеза можно целенаправленно воздействовать на хозяйственно полезные признаки и получать животных с новыми ценными, ранее им не присущими наследственными признаками и свойствами.

Исследования в области трансгении сельскохозяйственных животных ведутся в следующих направлениях:

- пересадка генов и генных конструкций, связанных с механизмами регулирования обмена веществ в организме, роста, лактации, воспроизводства, яйценоскости;

- воздействие на качество продукции животных;

- улучшение переваримости питательных веществ кормов и их использования для формирования продукции;

- получение необходимых для организма человека биологически активных веществ в продуктах животноводства;

- создание животных устойчивых к заболеваниям и стрессам;

- изучение фенотипа с точки зрения физиологических, биохимических и морфологических особенностей трансгенных животных.

В результате проведенных работ были получены отдельные индивиды трансгенных свиней, в геном которых включены генные конструкции соматотропина (гормона роста) и соматолиберина (регулирующего уровень гормона соматотропина). Предварительные наблюдения показали, что у отдельных особей экспрессия интегрированного в геном гена способствует повышению интенсивности роста животных (V.G. Pursei et al, 1987; P.D. Vize et al, 1988; G. Brem et al, 1989; V.G. Pursei et al, 1990; G. Brem, 1991; И.Л. Гольдмая и др., 1992; Л.К. Эрнст и др., 1993; G. Brem, 1993).

Но, несмотря на первые обнадеживающие результаты, связанные с успешной интеграцией генов, возникли некоторые трудности связанные с бесконтрольностью экспрессии гормона роста, которая вызывает патологические изменения в организме животных, такие как акромегалия, сахарный диабет, бесплодие, летальный исход и т.д. (V.G. Pursei et al, 1987; V.G. Pursei et al, 1989; G. Brem, 1993). При попытке поставить экспрессию гормона роста под контроль путем интеграции моди-

фицированных генов, кодирующих релизинг-фактор гормона роста, но эти манипуляции к желаемому эффекту не привели. Животные нормально развивались, но чаще всего интенсивнее не росли (V.G. Pursel et al.f 1989; Л. К. Эрнст и др., 1993). Попытки найти подходящий промотор для лучшего контроля экспрессии гормонов на данном этапе исследовательской работы не увенчались успехом (M.Szabo etal, 1995).

Проведенные исследования показывают, что генная конструкция по релизинг-фактору гормона роста в большей мере затрагивает ли-пидный обмен, особенно в онтогенезе (R.G. Vernon, 1988; Л. К. Эрнст, 1995). В связи с этим возникает необходимость изучения происходящих изменений на уровне организма, обменных процессов, состава тканей и органов, происходящих под воздействием чужеродного гена, а также наследуемости их потомством разных поколений.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось выявление особенностей липидного обмена у трансгенных растущих свиней. При этом были поставлены следующие задачи;

1) получить трансгенных по MT-1/hGRF свиней второго поколения;

2) изучить влияние трансгенности на интенсивность роста свиней;

3) установить изменения в переваримости липидов, жирных кислот и других питательных веществ, использовании азота кормов у трансгенных животных;

4) выявить особенности липидного и жирнокислотного состава тканей и органов у трансгенных подсвинков.

Научная новизна работы. Впервые выявлены особенности в переваривании липидов и жирных кислот, их содержании в тканях и органах у трансгенных по MT-1/hGRF подсвинков второго поколения. Установлено влияние трансгенности на рост тела и внутренних органов, на соотношение в тканях ненасыщенных и насыщенных жирных кислот.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований дают возможность объективно судить о влиянии интегрирования генной конструкции МТ-ШОШ7 в геном свиней на липидный состав тканей и органов, усвоение липидов кормов в пищеварительном тракте, о наследовании полученных в результате трансгенеза изменений липидного обмена у животных второго поколения. Это позволит избежать возникновения патологических изменений в организме при дальнейшей работе по совершенствованию генома методом генной инженерии.

На защиту выносятся результаты исследований особенностей роста тела и внутренних органов, липидного и жирнокислотного состава тканей и органов, соотношения в них ненасыщенных и насыщенных жирных кислот, переваримости липидов, жирных кислот и других питательных веществ кормов, использования азота.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА И ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ГОРМОНА РОСТА В ОРГАНИЗМЕ

В организме животных все системы тесно взаимодействуют между собой, поэтому любые изменения в одной из них вызывают отклонения в деятельности многих других, даже, на первый взгляд, не взаимосвязанных систем. Все процессы, происходящие внутри организма и их внешние проявления всегда можно объяснить с точки зрения молекулярной биологии и биохимии. Объяснение изменений, происходящих под воздействием интеграции в геном гена гормона роста, затрудняется ввиду отсутствия достаточного экспериментального материала и открытий. В последние годы установлено, что трансгенез гена гормона роста в ряде случаев способствует повышению интенсивности роста животных, активизации некоторых обменных процессов. Одновременно с этим иногда проявляются нежелательные изменения в организме (Л.К. Эрнст и др., 1993; G. Brem, 1993).

Многие проявления в фенотипе трансгенных животных по гену гормона роста или его релизинг-фактору можно объяснить, исходя из анатомических, физиологических, биохимических и молекулярных особенностей эндокринной системы организма животных.

1.1.1. Нейрогипофизарная система организма

В связи с тем, что действие гена гормона роста проявляется через гормон соматотропин и его регулятор соматолиберин, которые синтезируется в гипофизе и гипоталамусе, возникает необходимость дать краткую характеристику этих эндокринных желез.

Гипофиз (от греческого слова «растущий внизу») или нижний мозговой придаток, является эндокринной железой, функции которой регулируются гипоталомическими гормонами. Обширные нервные и сосудистые связи существуют между гипоталамусом и гипофизом, бла-

годаря которым осуществляется интегрирование нервной и гормональной регуляции функций многих органов. Вследствие этого гипоталамус и гипофиз часто объединяют в единую гипоталамо-гипофизарную систему (В.И. Георгиевский, 1990; А.Д. Ноздрачев и др., 1991). Следовательно, это важный регуляторный центр, который объединяет нервный и эндокринный компоненты координирующей системы организма.

Общеизвестно, что передняя доля гипофиза, или аденогипофиз продуцирует соматотропный гормон или гормон роста (П.А. Глаголев, В.И.Ипполитова,1969; А.Н. Голиков, Г.В. Паршутина, 1980; А.Н. Голиков и др., 1991).

Гистологически она состоит из плотных тяжей железистых клеток, окруженных соединительной тканью. Окраска гистологических срезов позволяет различить в ее паренхиме три типа эпителиальных клеток: 1)главные клетки, хромофобные, протоплазма которых очень плохо красится как кислыми, так и основными красителями, 2)оксифильные, или эозинофильные клетки, протоплазма которых прокрашивается эозином, и 3)базофильные, протоплазма которых красится основными красителями (П.А. Глаголев, В. И. Итолитова, 1969; Г.И. Косицкий, 1985; А.И. Кононскгт, 1992).

Иннервация передней доли гипофиза осуществляется за счет волокон симпатического сплетения. Большое значение в регуляции функций этой доли имеют особенности ее кровоснабжения, а именно то, что кровь, оттекающая от капилляров гипоталамической области, поступает в так называемые портальные сосуды гипофиза и омывает его клетки. В гипоталамической области вокруг капилляров существует нервная сеть, формирующая на капиллярах своеобразные нейро-капиллярные синапсы. Посредством этих образований продукты ней-росекреций клеток гипоталамуса (кортикотропинвысвобождающий,

тиротропинвысвобождающий, фоликулостимулинвысвобождающий, лютеинвысвобождающий, соматотропинвысвобождающий пептидные гормоны и моноаминовые - дофамин, норадреналин и серотонин) поступают в кровь и с ее током переносятся к клеткам аденогипофиза, изменяя их функции (ЮЛ. Ноздрачев и др., 1991).

Так нейронам гипоталамуса, продуцирующим гормоны, присущи функции одновременно секреторных и нервных клеток. Гипоталамус является той областью ЦНС, которая посредством нейротрансмитеров, гипоталамических гормонов, а также симпатической и парасимпатической частей вегетативной нервной системы интегративно регулируют функциональную активность гипофиза и периферических эндокринных желез, поддерживая тем самым гомеостаз и регуляторную активность всего организма в целом (В.А. Ткачук, 1983; ЮЛ. Ноздрачев и др., 1991).

Основное назначение гипоталамо-переднегипофизарной системы -осуществление связей между гипоталамусом и гипофизом. В мелких нейросекреторных клетках гипоталамуса, располагающихся в так называемой гипофизотропной зоне, происходит выработка пептидных гормонов, которые регулируют функцию железистых клеток аденогипофиза. Гормоны, стимулирующие синтез и высвобождение гормонов гипофиза, называют рилизинг-гормонами или либеринами, а тормозящие эти процессы - ингибирующими гормонами или статинами {В.А. Ткачук, 1983; Ф. Фелиг и др., 1985; А.И. Голиков и др., 1991).

Гормоны из гипофизотропной зоны поступают в аденогипофиз через воротные вены гипофиза. Воротная система кровообращения начинается ветвями верхней гипофизарной артерии, которые распадаются на мелкие капилляры. Возвратные ветви этих сосудов сливаются, образуя воротные вены, которые несут кровь к капиллярному сплетению аденогипофиза. Аксоны нейросекреторных клеток гипофизотроп-

ной зоны оканчиваются на стенках этих сосудистых петель. Из капилляров гипофизотропные гормоны попадают к своим мишеням - клеткам аденогипофиза, вырабатывающим гормоны. Функция железистых клеток гипофиза находится под регулирующим влиянием шести рели-зинг гормонов и трех ингибирующих гормонов гипоталаму са (Я У. Ба-занова и др., 1980; Ю.П. Ноздрачев и др., 1991).

Из вышесказанного можно сделать заключение, что организм анатомически хорошо адаптирован для тонкой регуляции гуморальной системы.

1.1,2. Принцип обратной связи в регуляции секреции гормона

Принцип обратной связи в регуляции секреции гормонов довольно полно описан во многих работах (СМ Афонский, 1970; К.А. Вгшккаж еГа!., 1987; В.А. Ткачук,1983).

М.М. Завадский (1930), изучая закономерности в регуляции эндокринных желез, сформулировал принцип «плюс - минус взаимодействия», получивший в дальнейшем название «принцип обратной связи».

Различают положительную обратную связь, когда повышение уровня одного биологического вещества стимулирует высвобождение другого вещества, и отрицательную обратную связь, когда повышенный уровень одного вещества угнетает секрецию и высвобождение другого. Гипоталамо-гипофизарная регуляция осуществляется механизмами, функционирующими по принципу обратной связи. Под "длинной " обратной связью подразумевается взаимодействие периферической эндокринной железы с гипофизарными и гипоталомически-ми центрами. Под «короткой» цепью обратной связи понимают такое взаимодействие, когда повышение гипофизарного гормона модулиру-

ют секрецию и высвобождение гипоталамического гормона. «Ультракороткая» цепь обратной связи - вид взаимодействия в пределах гипоталамуса, когда высвобождение одного гипоталамического гормона влияет на процессы секреции другого гипоталамического гормона (L. Geländer et al, 1989).

«Длинная» и «короткая» цепи обратной связи функционируют как системы «закрытого» типа, являясь тем самым саморегулирующимися системами. Однако они отвечают и за другие внутренние и внешние сигналы, изменяя на короткое время принцип саморегуляции. Примером тому служит изменение уровня гормона роста на суточный ритм смены дня и ночи (ММ Балаболкин, 1989; M. Szabo et. al, 1995).

1,1.3. Взаимовлияние внутренних биорегуляторов на уровень

гормона роста

По выражению К.Бернара (1887), «неизменность внутренней среды организма есть основное условие полной независимости жизни». Неизменность внутренней среды, или гомеостаза, поддерживается за счет постоянного притока в клетку веществ и энергии (П.Хочачка, Дж. Сомеро, 1977; Э.Ньюсхолм, К.Старт, 1977; В. А. Ткачук, 1983). Потоки питательных веществ и энергии могут изменяться: в одном случае резко превышать потребности клетки, а в другом не удовлетворять их. В соответствии с этим изменяется и соотношение скоростей катаболизма и анаболизма. В определенных случаях может происходить потреб�