Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-физиологическая реакция клеток почки свиньи in vitro на введение чужеродного генетического материала

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-физиологическая реакция клеток почки свиньи in vitro на введение чужеродного генетического материала"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

На правах рукописи УДК 636.4.082.12;573.6

КАЯАРЕВКЧ Александр Владимирович

JiOPlО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕМЩШ КЛЕТОК ПОЧНИ ССШЕЬП III VITRO НА БЗЕДЗШЗ ЧУИЕРОДИОГО ГЕИЕТИЧ'ЕСЖСГО МАТЕРИАЛА

03. 00.13. Зизиодогйя человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учейой степени . кандидата биологических наук

Дубровицц 190?.

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского ордена Трудового Красно, о Знамени научно-исследовательского института животноводства

Научные руководители: дпктор биологических наук,

профессор 0. К Смирнов

кандидат биологических наук Е С. Стрельченко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор . И. И. Соколовская доктор бкологичеесих 'наук Е Т. Какпаков

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский

.институт разведения я генетики - сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится " " и Рг£ с> /иЛ^Щ г.

■ , п ■ ■ '

в /о часов на заседании олецизлкзйрсьанного Совета

при Всероссийском научно-исследовательском

институте животноводства.

Адрес института: Московская обл. , Подольский р-н, п. Дубро-

вицы

С диссертацией можно ознакомиться ъ библиотеке ЕИ2а Автореферат разослан " ¿:> " О (¿2/сР £ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного СоЕета кандидат биологических наук

И. И. Шмыгин

РОССИЙСКАЯ

госуд/»*'.".

оИ5)Ш0Т«ХЛ

1

1. ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность -гены. Во всем мире интенсивно ведутся научные следования по получению трансгенных животных. При решении1 'ой задачи исследователи сталкиваются с проблемой использов'а-я тех или иных методов переноса генетического"материала в ре-пиентную клетку. Выбор метода генной трансформации зависит от ироды и свойств клеток-реципиентов, их состояния в культуре, зиологической компетентности к восприятию экзогенной ДНК, а кие во многом определяется теми векторными системами, которые пользуются для внесения чужеродных генов в клеточный геном.

Эукариотическая клетка - хорошая модель для встраивания тов. Искусственная генетическая трансформация клеток открыва-перспективы направленного изменения свойств клеток и оргазмов Странсгенные животные) с целью получения продуцентов фи-здогически актиьных веществ (гормонов, ферментов, иктерферо-з, интерлейкииов, антигенов вирусов, бактерий и других микро-'анизмов) и повышению устойчивости гивотных к заболеваниям [ клеток 'к определенным возбудителям при встраивании генов, :ущих антисмысловую РНК к определенному вирусу.

Использование в этих целях бактериальных или дрояокевых Ьтур невозможно ло причине отсутствия ферментативных систем, спечивагацих посттрансляционные модификации (гликозилирова-, фосфорилирование, образование дисульфидных связей и др.), такающие в процессе созревания полноценных белков. В этих тках синтезируются белки, имеющие правильную полипептидную ледовательность, но отличные от природных по своим антиген-и физиологическим свойствам. Поэтов целесообразным являет-зоздание культур клеток сельскохозяйственных аивотных, згссп-зирующих целевые продукты, идентичные по своим свойствам

- г -

природным.

Актуальность данной работы вытекает из необходимости испытания различных методов генетической трансформации, а также генетических конструкций на модельных клеточных системах. Результаты

о

исследований могут быть ценны при использовании трансформированных клеток в качестве продуцентов биологически активных веществ и препаратов.

Цель и задачи исследований / -1 *

Целью нашей работы явился поиск и разработка оптимального метода генетической трансформации культуры^,клеток -домашних жи-.вотных с учетом' их ыорфо-физкологической реакции на введение чужеродных нуклеиновых молекул. Попутно испытывапксь различные генетические конструкции векторов, содержащие чужеродные последовательности ДНК. ■ '

В соответствии с этим решались следующие задачи:

1. Отработать различные методы генетической трансформации культуры соматических клеток.

2. Овладеть системой селекции, пригодной для работы с культурой соматических сеяных клеток.

3. Получить культуру, трансформированную маркерным геном.

4. Изучить экспрессию маркерных генов в составе различных векторных систем в культуре соматически:* клеток.

Научная новизна. Вопросы трансформации соматических клеток на сельскохозяйственных животных не достаточно исследованы, ввид; того, что традиционным объектом в подобных экспериментах выступает клетки лабораторных .тавотных.

Нами получены трансформированы«. in vitro соматические клетки свиньи, a »fx трансгеннвсть подтверждена данными ыолеку-

лярно-генетического анализа. Установлена вирус-индадированная трансформация свиных клеток фрагментом генома вируса бычьей папилломы (ВРУ), специфичного для крупного рогатого скота.

Практическая значимость. Апробирована тест-система быстрого определения экспрессии гена палочной фосфатазы з клетках'по результатам цветной реакции. Данч методические рекомендации по использованию полибренового метода и метода злектропорации на культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭЗ), и применению селективных маркеров при работе с соматическими клеткгчи свиньи.

Реализация результатов исследований. Полученные результаты ислоль.-ованьГ при составлении методики создания меток-продуцентов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку:

- на 42-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых'. - Дубровицы. - ВНЕ. - 1989.

- на 43-й научно-методической конференции аспирантов к молодых ученых. - Дубровицы. - ВИЙ. - 1990.

- на Всесоюзном 'совещании "Проблема развития биотехнологии в животноводстве". - ВЙЖ. - август 1990.

- на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток тавотных и человека". - Лугано. - февраль-.1990.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работа

Объем и структура диссертации. ,. .:сертация изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 16 рисунков. Список литературы включает. 170 названий, в том числе 169 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛ Й МЕТОДИКА, ШЭДОВШЯ

Научные исследования проведены в 1988-1990 гг. в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИВа.

В качестве векторного материала использовали .генную конструкцию pSV2 neo с геном резистентности к антибиотику генети-цину (G 418) любезно предоставленную нам к. б. н. Мирошниченко О. П. из лаборатории генной инженерии института сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ. Данный вектор (рис. 1.) имеет кольцевую Форму и состоит из участка плазмиды рВП322, последовательностей вируса SV 40 ( области ранних, и поздних генов, ра..них и поздних вирусных промоторов, участка лолиаденилкчования' и терминации транскрипции) ' и бактериального гена < неомицинфосфотрансферазы (neo), являющегося генетическим маркером трансформированных клеток. Клетки, включившее последовательности гена neo, приобретают способность расщеплять антибиотик генетицин (G 418), подвергаясь селекции.

В ^трансформации с pSV2 neo использована генная конструкция pBPV 136 ( рис. 2.). Она состоит из участка плазмиды pBR 322, трансформирующей области ДНК вируса бычьей папилломы (69 Т) и бактериального гена щелочной фосфатазы. Эта конструкция имеет два маркерных уастка: ген щелочной фосфатазы и область, охватывающую 69 % генома вируса бычьей папилломы, вызывающую морфологическую трансформацию клеток.

Плазмзда pSV2 neo считается интеграгквной, т. е. в линеаризованной форме врезается в геном клетки-реципиента. pBPVISS - век. тор эписомного типа, т.е. не встраиваясь в геном клетки, существует в экстрахромосомном состоянии, автономно, ' в' количестве нескольких десятков копии ка клетку, за исключением пермиссивных

5.5 Ее "RI

Fat

4.0 ^'í

V Psv-Ш L p¡jp40 E г

/ '*«£ / ■ ^

Pwïï

Hind Ш Bglïï Рис._1._ ^Векгорная конструкция j.il^nc-o

8116 El

ВатШ

Amp !рВЕ322

jp\ 4°" 69 Т

V

Ш1Й1

Рис. 2. Векторная конструкция pBPVT3ô

beíicihi

- б -

для данного вируса клеток.

В качестве объекта для трансгенеза'использовали перевиваемую линию соматических клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Указанная линия была любезно предоставлена нам профессором Дьяконовым Л. IL из Всероссийского института экспериментальной ветеринарии . им. Я. Р. Коваленко. Культивирование клеток CI3S3 проходило в среде ДМЕМ или адьфа-ЫЕМ (Gibco) с 10 % сыворотки плода теленка (Gibco). Для снятия клеток с подложки при пересеве использовали раствор 0.25 X трипсин + 0.02 % ЗДТА (ferva).

Внесение чужеродных генов в клетку осуществлял! полибреновш методом, описанным на клетках комара Aedes albopictus (Fallon, 1385), шдкфицйрованным применительно к культуре СГОЕ

Клетки С1БВ высевали В' количестве 5 х 10Гклеток на 60 ым чашки (Cell-Cult) за сутки до генной трансформация. Клетки после прикрепления ко дну. чаши подвергались предварительной инкубации с малой дозой полпбрёна в количестве 3 ккг/мл. Через 12 часов инкубации старую среду удаляли и заменяли средой для трансфакции, которая содержала следущке компоненты: Среда ДШ1 или альфа-ЫЕМ - 90 %

сыворотка плода теленка - 10 %

гюлиб-ен - 12 мкг/мл

плазшды pSV2 пео и pBPV 136 1 : 10

Количество ДНК определялось эмпирически по максимальному числу образования колоний на селективной среде.

Процесс трансфакции длится 5.5 - 6 ч^сов при 2-х минутном покачивании чаиек через каадый час инкубации. По истечении 6 часов среда удаляется и клетки подвергается шоковому воздейст-

- ? -

вшо путем 4-х минутной экспозиции в среде с диметилсульфокси-дом. После этого монослой клеток отмывают триип любой бессывороточной средой и затем-добавляют на одни'сутки обычную росто-' вую среду для осуществления предселективной экспрессии.

Параллельно проводили эксперимент по введению генных конструкций методом электропорации. Электропорация клеток CIBB выполнялась на приборе для электрослияния CFA - 400 ( Kruss ) в специальной геликамере.

Клеточную суспензию в среде смешивали с плазмидной ДНК в присутствии электродного буфера. Готовую смесь переносили в камеру и вводили туда электродный стержень.

.концентрация клеток составляла 1 - 1.5 млн/ мл суспензии при следующей концентрации плазмидной ДНЕ-

pSV2 neo- 1 мкг/мл pBPV 136-10 мкг/мл Собранную камеру подключат} к электронному .блоку, откуда" поступали электрические импульсы с предварительно установленными параметра»,ш. ■

Экспрессия гена neo в составе ялазмиды pSV2 neo подтверждалась ростом клеток в среде с антибиотиком G 418 и образованием трансгенных колоний.

. Экспрессия последовательности АР вектора рВРУ 136 определялась по результатам цветной реакции связывания субстрата с генным продуктом - щелочной фосфатазой. . '

Экспрессию 69 Т трансформирующей области вируса бычьей папилломы вектора pBPV 136 определяли по наличию фокусов морфологической трансформации njyi посеве на полутвердую агаровук среду.

Наличие чужеродных-последовательностей ДНК в клетках определяли путем блот-гибридизации по Саузерну в лаборатории молекуляр-

СХЕМА ЭКСПЕРШЗША

Генетическая трансформация клеток СПЗВ

Ьекторные конструкции

Рис.

ной генетики ШВз.

Принципиальная схема эксперимента представлена на рис. 3. Результаты экспериментов документированы микрофотографиями. . Цифровой материал обрабатывали биометрическим методом.

а результаты чсстрзжт

3.1. Характеристика клеточной линии Исследования проводились на перевиваемой.линии клеток почки З!с3ркснэ свиньи (CIBB). Данные клетки отличаются легкостью ведения а культуре, отзывчивостью на изменение состава среды и, тагам образам, представляют удобную модель для экспериментов такого ро-

Клетки СПЗЗ в нормальном состоянии в культуре существуют з форма мозослоа и клеточных наллге-овпкг. Уэдзлышй кгасс хромосом составляет 2rt=40. Для заморажвания клеток используется среда ДНЕМ, где в качестве кркопротегегора выступает глицерин в . концетрации 10 Z от ебцего объема смеси, Жизнеспособность клеток после оттаивания составляет 75-80 %.

2. 2. Подбор селэгаигяих условий. ,

3 работе проводилась сга-легакя клеток по устойчивости к анти-. биотип в 41S. Это потребовало проведения одта т с кс s 14 е с ко г о теста культуры за различны? дэгы антиЗшгкха. руководствуясь минимальной токсической дезей генеткжна для клетсх СШВ мы установили его рабочу» концентрация для еелеетиь-:..^ срез - 400 мкг/мл.

- 10 -

3.3. ■ Генетическая трансформация клеток.

3.3.1.' Шлибреновый метод Полибреновый метод трансфекции состоит из двух этапов: инкубации с адгезивным агентом полибреном и кратковременной экс-

• о

позиции в диметилсульфокеидё, которы" повышает физиологическую ■ компетентность клеток ^ восприятию чужеродной ДНК.

После инкубирования в средей с поликатионом полибреном клетки приобретают адгезивные свойства и адсорбируют на себе нуклеиновые молекулы. Обработка диметчлсульфоксидом повышает проницаемость клеточной мембраны Еызывая клеточный пзк и способствует дальнейшему проникновению ДНК внутрь клетки. В связи с этим необходимо было подобрать такую • концентрацию диметил-сульфоксида в среде,* которая увеличивала бы проницаемость клеточной мембраны (т.е. клеточный шок), оказывая при этом минимальный токсический эффект на клетки. • В опытах установлено, что наиболее оптимальной является'20 %-ная концентрация ДМСО ь среде, при которой происходит успешное встраивание генов без существенного ущерба для клеток.

Был проведен ряд экспериментов по трансфекции клеток с 'различными концентрациями ДНК. Результаты этих экспериментов представлен" в таблице 1. '

Наивысшая частота трансформации отмечена в опыте с 2000 ф ДНК Увеличение количества ДЯК сверх этой величины неэффективна так как частота трансформации не возрастает, а при величине свыгг 3000 нг/т этот показатель да.чэ снижается.

Таблица 1.

Влияние различных концентраций-ДНК на частоту трансформации.

Кол-во ДНК,

Кол-во клеток

Кол-во пео- резист.

Частота трансформации'

нг/мл для опыта, тыс. колоний, шт. п « а абс. значение %

12.5 500 - - -

25 - - -

50 ■ 8 ± 0.7 . 1.60 X 10"^ 0.0С16

100 44 + 1.8 0 90 X 10"' Г, "i/V. <J. Uww

200 54 + 2. 5 1.10 X 10"* о. оно

400 56 ± 1. 8 12 X Iff* 0. 0112

800 73 ± 1. 8 • 1.46 X 10"' . 0.0146

1000 76 ± 2. 5 1.52 X 10-* 0.0152

1500' 93 + 2.5 1.86 х 10'* 0.0186

2000 ■ 101 ±1.6 2.00 X 10" 0. 0200

:зоо 95 ± 1. 9 . 1.90 X 10-* 0. 0190

3000 97 + 2. 7 1.94 X 10н 0. 0194

4000 87 ч 3. 6 1.74 X 10"' 0. 0174

5000 81 ± 1.6 , 1.62 х 10'4 0. 0162

контроль - - -

- 12 -

' 3. 3.2. Метод злектропорации.

Б экспериментах по электропорации клеток возникла необходимость испытания основных характеристик электрического импульса на клетках . Параметрами, которые обусловливает изменение проницаемости мембраны, являются напряжение импульса переменного тока и число электрических импульсов в данном, режиме. Проведена серия экспериментов по определению выживаемости клеток через сутки после воздействия различными величинами напряжения (рис. 4 ).

Дачные графика убе?зда:от в том, чт~ напряжение 80 В является критическим, так как в клетках возникают необратимые изменения, охватывающие около половины всего массива клеток ('47 X), о чем можно было судить по 'заполнению мертвых клеток трипановым сини;,!.

Далее была определена степень влияния напряжения и количества импульсов на эффективность трансформации с целью оптимизации параметров.

Гак показывает таблиц* 2, максимальная частота трансформации била достигнута в эксперименте с напряжением 60 В при воздействии 5 импульсами переменного тока. При напряжении 80 В аналогичный результат получили после 4-х кратного воздействия электрическим импульсом, тогда как при 40 В была отмечена низкая частота трансформации. Сделан вывод о том, что для успешных опытов по электропорации на клетках СЮВ напряжение 60 В является достаточным при числе импульсов от 4 до 7.

3. 4. Экспрессия чужеродных генов в клетках СПЗЕ.

3.4.1. Экспрессия вектора рБЧ2 пео.

Выявление экспрессии гена пео плазмиды рБУ2'пео основано на использовании доминантной системы селекции. Период селекции

Таблица 2.

Влияние напряжения и количества электрических импульсов на частоту трансформации при электропорации.

Кол-во Напряжение импульсов --------1-----------------'-----------

и - 20 В и - 40 В и - 60 В 0 - во В

1 - - - , 3(7.5X10"'} м

2 - - 4(1 х 10" ) 3(7.5 х 1СГ') л

3 - - • 18(4.5 х 10"*) 22(5.6 х КТО •

4 •- 6(1.5x10) 27(6.7x10"') 29(7.25 х 10*)

5 - . . 6(1.5 X 10"*) 32(8.0 X 1СЯ") 26(6.25 X 10"*)

6 - 11(2.75 X 1СГ) 30(7.5 X 10"*) 'Д6.75 X Ю'О

7 5(1.25 X Ю'Г) 10(2.5 X 10~) 30(7.5 х 10*) 6(1.5 х 10 )

8 7(1.76 X 1 б*) 12(3.0 X 10"*) 27(6.7 х 10"*)

9 7(1.75 X 1СГг) 15(3.75 X 1СГ5) 20(5.0 х 10"5)

примечание: а)- цифра перед скоОко!'. означает число'образовавшихся колоний после трансформации в данном опыте, л. скоб(сах - величина эффективности трансформации;

б)- во всех опытах дли трансформации орали по 400 тыс. клеток.

- - 15" -

обычно длился 21 день. Начало образования колоний отмечали на i4-13 дни культивирования. На 21-й день, как правило, во флаконе оставались только те клетки, которые инкорпорировали чуяе-родкуга ДНК. ЬЬано было наблюдать плотные колонии трансгенных клеток , имеющие неровные, резкие, иногда обрывающиеся края. Клетки очень плотно призаты друг к другу. В центре такие коло-зим имеют скопления многослойного роста - трансформированные клетки обладают высокой митотическоЗ активностью.

Таблица 3.

Экспрессия гена neo ллазмиды pSV2 neo з клетках СПЗВ.

Показатели Полибреновый Электропорицня

метод

п = 16 ■ п = 12

400

31+Í. 46

7.75 х 10* 0.С073

Наибольшая эффективность экспрессии гена neo б состава вектора pSV2 'neo была достигнута при яодибрековои методе тргнсфек-ции (табл.3.), где на 10-тыс. галеток приходится-2 траксгекине колонии, это почти в 2.5 раза превосходит результат здгкгропо-

Число клеток в опыте, тыс 5CÜ Кол-во пео-реэистеятных

колоний S6íl.3 Эффективность трансформации:

абсолютное значение 1.92 х 10*

% > 0.0192

- 15 -

3.4.2. Экспрессия вектора pBPV 135 При травс-формадии плазмидой pBPV-136 в клетках С1БВ получена экспрессия 2-х последовательностей: гена шэлочной фосфатазы (АР) и онкогена из' области 69Т BPV.

Этот вектор вводился вместе с рГУ2 neo, и ставилась цель определить какой процент клеток с устойчивостью к антибиотику

экспресеирует эписомную пдазниду pBPV-136. Наличие в конструкции

о

гена АР существенно облегчило эту задачу. ^Ьсле соответствующей обработки опытных клеток субстратом X-phos наблюдали сине-зеленое окрашивание, которое указывало на присутствие в клетках плазшды pBPV-136.

Полученная величина степени котрансфорыацик ( 42 - 55 z ) характеризует довольно высокую эффективность экспрессии плазм;<.ды pBPV-136 (табл. 4.).

Таким образом, в процессе данного эксперимента была апробирована подходящая тест-система, позволялся оперативно выявлять трансгенность в культуре клеток по экспрессии шркэрного гена АР.

Таблица 4.

Экспрессия шгазмиды pBPV-133 по г«ну АР.

Показатели

Болибрековый . Электропорация метод

Взято клеток для опыта, тыс 500

Образовано АР колоний 41

Степень экспрессии по АР ге::у, z 0.0032

Степень c-.гспрессии по гену neo, % 0.0192

Степень котраксформацик, 7, 42.7

400 17 0.00425 0. 00775 55.0

Как известно, плазмиды, в состав которых входит трансформирующая область вируса или полный геном, находясь в эписошой форме вызывают онкогенную трансформацию только в пермиссивных клетках. Для вируса бычьей папилломы такими пермиссивными клетками являются клетки крупного рогатого скота, клетки мышей лшии ШН ЗТЗ и С 127.

Наличке экспрессии гена АР в составе вектора ЕРУ-136 на . единых клетках навело нас на мысль о возможности морфологической трансформации этих клеток последоватедьностьо 69 Т ВРУ. Для проверки этепрессии трансформирующей области ДНК Б»"У пео-резж-тенткые клетки высевали на полужидкую агаровую среду. На 7-е сутки культивирования на поверхности агара были обнаружены .фокусы ;-!ли скопления . клеток опухолевого происхождения.. Илеткя имегет злокачественную морфологию: плотно расположяы, наползает друг на друга, образуя очаги многослойного роста, которые пронизывает всю толщу агара, проникая до.самого дна чашки

В таблице 5 представлены данные'по частоте образования, фокусов малигнпзации 'при посеве клеток в трехкратно убызавщхх разведениях.

Частота фокусообразования клеток СПЭВ.незысокз и составляет э среднего; 01 %, т.е. из 10 тыс. г леток одна клетка образует очаг морфологической трансформации. Паизксшая частота фокусссбра-спания отмечена при концентрация 167 тыс. клеток на 100 мм часку.

Таблица 5.

Трансформация клеток СНЭВ онкогеном вектора pBPV-135 при полибреновйг! методе.

N п/в . Посеяно клеток Кол-во Частота фокусообразования

ка чашку, тыс фокусов --------------------------

трансф-цки абс. значение Z

П « 5

1 500 . 45 + 5. 5 0. 9 х 10 0.009

2 166. 6 23 + 4.7 1.38 X 10"' 0.0138

з 55.5 6 ± 2.0 1.08 х 10*f 0. 0108

4 18,5 1+0.5 0. 54 х 10"* 0.0054

5 • 6.1 < - . - '

6 2.0 - - ' -

7 . 0.657 - ■ - -

3. 5. Мэлекулярно - генетический анализ интеграции чу же-,

родной ДНК -

-выделенная из образцов трансформированных клеток тотальная ДНК 'была расщеплена . рестриктазами EcoRÍ и EcoRI - BamHÍ.

В качестве зонда для гибридизации использовали ДНК плазмиды pSV2 neo. Результаты анализа показали, что после обработки рестркктаза'ж ДНК опытнда клеток гкбридизовалось с радиоактивным ДНК-зондом образуя соответствующие полг-^ы. В данном случае имела место гибридизация с участками плазмидл p8R322, которые присутствуют в обоих векторах С PSV2 neo и pBPV-136 ), а также с последовательностями гена neo. Полученные результаты свидетель-

ствутот о тандемном встраивании нескольких копий плазмидной ДНК в геном клетки.

При расщеплении BamHI/EcoRI вцепляется фрагмент величиной 700 п. н., соответствующий ВатН Г/EcoRI-фрагменту плазмиды pSV2neo.

4. ЗАКЖГЕНКЕ

Испытание полибреновой методики на клетках СПЗВ гало неплохие результаты; показав простоту выполнения и воспроизводимость она на порядок превосходит £2' х. 10"*) имеющиеся данные по трансформации яолибреновым методом мышиных кроветворных клеток (Chisholm, Synonds, 1S88 ). Вероятно этому способствовало использование ДМСО-шока.

Эффективность трансформации при использовании метода элект-ропорации у разных, исследователей зачетно варьирует в зависимости от типа клеток. Например, самая низкая эффективность (10{ 10"á; ) описана на азетфиксирующих' бактериях ,и на мкшных 3 клетках (Doetsehmn, Maeda, 1988), а самая высокая ( 10"*) на мызиных гиб-ридомах (Shi ni Chi го et al., 1987).

В нб£нх экспериментах злегегропорация дала худпгне результату по сравнению с по'либреяом по экспрессии гена г:эо, но в то яэ время степеш> котраксфзрмации гена АР пд имды pBPV 136 по отнасенгао к neo маркеру при электропорации - выше (табл.6).

Апробирована подходящая тест-система, позволяющая оперативно выявлять траксгенность з культуре клеток по экспрессии .маркерного гена щелочной фосфзтазы (АР).

Полученные результаты, позволяют, предполагать о наличии вирус- индуцированной трансформации, и они тем боль-е интересны в случае, где ДНК вируса, специфического для крупного рогатого ско-

та трансформировала клетки другого биологического вида - свиньи.

Доказано наличие в трансформированных клетках чужеродных последовательностей ДНК.

Таблица 6.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСФОРМАЦИЙ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМ

ПОКАЗАТЕЛИ

ГОЖЕРЕНОВШ МЕТОД_

ЭЛЕКТРОГОРА "Ж

Плазыида рБУ2пео Посеяно клеток Образовано пео-резистентных колоний ' Эффективность трансформации Котрансфорыация (р§У2пео + рЗРУ 136) Шсеяно клеток Йразовано колоний с экспрессией гена АР Эффективность трансформации

200 кг/мл 500 тыс.

96

1. 92 X 10

2 ыкг/мл 500 тыс.

4Г

-1

0.82 X 10

-4

1 !,ПСГ/МЛ

400 тыс.

*•■■■ 31

-¿г

7. 75 X 10

10 мкг/кл 400 тыс

17 ' '

Степень котрансформ_и,ии 42.7 %

4.25 х 10

55 % о

вывода

На основании результатов проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. В экспериментах на культуре клеток почки свиньи (СПЭВ) установлено, что введение векторной плазмиды pSV2-neo обусловливает образование в селективной среде резистентных кгтоний с частотой от 0. 75 до 2.0 х Ю-''.

2. Внесение гена щелочной фоефатаз'ы в составе конструкции рВРУ-135 сопровождалось цветной реакцией клеток CIíjB после связывания с фермент-специфическим- субстратом с частотой 0.42 -0.82 х 10"?

3. Наличие клеточных фокусов опухолевой морфологии на полутвердом агаре ' после введения плазмиды на основе ДНК вируса бычьей папилломы (pBPV-135) позволяет сделать вывод о межвидовой вирус-индуцированной трансформации свиных клеток.

4. 'Испытание двух методов трансфекции показало, что поллб-реновый метод характеризуется более высокой, эффективностью и воспроизводимостью по сравнения злектропорацлей.

-5- Наибольшая эффективность .котрансф рмации плазмиды pBPV-136 -по отношению к плазмиде pSV2 leo (55 %) была достигнута в экспериментах по злектропорации.

6. Молекулярко-генетическим анализом ДНК установлено наличие в клетках иекторных последовательностей pSV2-neo в количестве 3-х копий ка.клетку, а таюге последовательностей вектора pEFVl?6.

Практические предложения

1. Отзызчивость клеток СИЭВона введение чужеродного генетического материала, а также легкость ведения в культуре дает возможность использовать эту линию в голучении клеток-продуцентов физиологически активных веществ.

2. Конструкция ^542-пео с геном устойчивости к антибиотику

о

может быть использована в качестве гекетичгс.ого маркера при получении эмбрионального грансгенного материала.

3. Установлено, что' ДНК. вируса бычьей папилломы эксяресск-рует свой опухолевый фенотип в свиных клетках. Если в такой вектор встроить последовательности любого интересуют :о гека, при этом удалив фрагменты, вызывающие злокачественность, то его южно использовать при получении трансгенных свиней.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: 1'. Ыакаревкч А. В., Стрельченко К С. , Смирнов 0. К Сравнительная характеристика различных методик генетической трансформации культур клеток сельскохозяйственных ййюгных// Тезисы докладов* III Всесрьзного совещания "Культивирование 1-лэток животных и человека", Пущкно 1990 г.

2. Макаревич А. В., Ларина Г. Е , Стрельчешсо Е С. Проявление трансформированного фенотипа, в культуре кле~ок СПЗВ //Тезисы докладов III Всесоюзного евбегания "Культивирование клеток животных и человека", Еущко 1990 г.

3. Смирнов О. К., Иакароьич А. К Эффективный метод трансфекции еоматич&еких клеток сельсног -¡зяйегвенных «квотных .// Тезисы докладов Всесоюзного, научно-технического совещания "Проблемы. развития биотехнологии в животноводстве", Дубровицы, 1990 г.