Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ СВИНЬИ IN VITRO НА ВВЕДЕНИЕ ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ КЛЕТОК ПОЧКИ СВИНЬИ IN VITRO НА ВВЕДЕНИЕ ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА"

30589

BCEPOOCWRKMS НАУЧН>1ЮСУ1ЕД0ВАТВв1СЖИЙ . ИЕЗТИТУТ

животноводства

Hat правах рукописи уда бЭ6.4.082.12;573.б

шшикч Александр Владимирович *

морю-мзнодогнчваия реакция кшак подш свиньи » vitro на введшие чпвроиного пдагааюго материала

03. OCX 13. Фенология человека и животных

А В Т О РВвВР А I

диссертации на соискание учейой степени . кандидата биологически* наук .

Дубровины 1992

Работа выполнена в отделе биотехнологии Всероссийского ордена Трудового Красно, о Знамени научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: диктор биологических наук,

профессор О. К. Смирнов

кандидат биологических наук Н. С. Стрельченко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И, И. Соколовская

доктор биологичес:ои :наук В. Т. Какпаков

Ведущее учреждение - ■ Всероссийский научно-исследовательский

.институт разведения и генетики -■ ' ; - сельскохозяйственных животных

.' Зашита диссертации состоится " //О " 1992 г.

а -/¿х* часов на еаседании специализированного Совета ■ . при Всероссийском научно-исследовательском

'■■ ' институте животноводства.

Адрес института: Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровины ' * ':

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕИЖа Автореферат разослан

£ " ОииЛиЯж* г.

Ученый сек^>етарь . . *

специализированного Совета

■ ■ *

кандидат биолргическга тук - И. И. Шыгин

1. овдая характеристика работы

, Актуальность демы. Во 'всем мире интенсивно ведутся научные, исследования по получению трансгенньи животных. При решении' этой задачи исследователи сталкиваются'с проблемой использования тех иди иных методов переноса генетического ^материала в ре-ципиентную клетку. .Выбор метода генной трансформации зависит от природы и свойств клеток-реципиентов, их состояния в культуре, физиологической компетентности к восприятию экзогенной ДОК,' а также во многом определяется теми векторными системами, которые используются для внесения чужеродных генов в клеточный геном. ' ■.г. Эукариотическая клетка - .хорошая модель для встраивания генов. •Искусственная генетическая трансформация 'клеток открывает перспективы направленного изменения' свойств клеток, и организмов (трансгенные животные) с цель» получения.продуцентов фИ-.зиологически активных веществ (гормоиов, ферментов, иктерферо-нов, интерлейгашов, антигенов вирусов, бактерий и других микроорганизмов) и повышению устойчивости мгеотных к заболеваниям яда 'клеток "к определенным возбудителям при встраивании генов,, несущих антисмысловую РНК к определенному-вирусу.

Использование в ; этих целях .бактериальных-или дрожжевых культур невозможно до причине отсутствия ферментативных систем, .обеспечивающих.посттрансляционные модификации (гликозидирова-ние, фосфорилирование, образование^ дисудьфидных связей и др.), протекащие в процессе созревания полноденных белков. Б зтих клетках синтезируются белки, имеющие правильную полипептидную последовательность, но отличные от природных по своим антигенным и физиологическим свойствам. Поэтому целесообразным являет-

ся создание культур клеток с ельскахозяйсце«?РИЛЫ^аД н» 1 реп-

рессирующих целевые продукты.

пжт* штмят,

ТЛоск. сельскохоэ. академии им. К. А, Тимирязеву.

гвам

природным. ■ -

Актуальность данной работы вытекает из необходимости'испытания различных методов генетической трансформации, а такле генетических конструкций на модельных клеточных системах. Результат^

. ^ г. ■+ "

исследований- могут быта ценны при использовании трансформированных клеток в качестве продуцентов биологически активных вепрств и препаратов.

Цель и.аадачи исследования

Цель» нашей работы явился поиск и разработка оптимального метода генетической трансформации культуры«клеток домашних животных • с учетом" их ыорфо-физиологической реакции на введение чужеродных' нуклеиновых молекул..■ Попутно испытывали» различные генетические конструкции векторов,, содержащие .чужеродные последовательности. ДКК.- ' _

В соответствии с этим решались следующие задачи: ;

1.' Отработать различные методы генетической трансформации культуры соматических клеток., * '

2. Овладеть системой.' селекции,; • пригодной , для' работы с . культурой соматических свиных клеток. .

& Шлучить культуру,' трансформированную маркерным геном.

4. ' Изучить экспрессию- маркерных генов в составе различных векторных систем в культуре - соматических клеток.

Научная|новизна. .Вопросы трансформации соматических клеток на сельскохозяйственных.животных не достаточно исследованы, ввидз того,,что традиционным объектом в подобных экспериментах выступа; юг клетки лабораторных животных.

Нами получены." трансформированные:, in Vitro соматические клетки свиньи, й кх тр^сгеннвсть-пвдтверздека данными, молекул ■

лярно-генетического анализа. Установлена • вирус-юстированная трансформация свиных клеток фрагментом генома вируса бычьей папилломы (ВРУ), специфичного для крупного рогатого скота.

Практическая значимость. Апробирована тест-система быстрого определения экспрессии гена пыточной фосфатаэы в клетках'по результатам цветной реакции. Даны методические рекомендации по использованию полибренового метода и метода гдектрошрации на культуре клеток почки эмбриона свиньи (СГОВ), и применению селективных маркеров при работе с соматическим.! клеткгм свиньи.

Реализация результатов исследований. Шлученные ■ результаты использована при составлении методики создания клеток-продуцен-. тов. ■ ' _

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и получили полояятельиую оцещ^:

- на 42-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых. . - Дубровицы. - БИЖ. -1989.

. на :43-Я научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых.- - ДуОровкцЫ. - ШЖ. - 1990.

- на Всесоюзном'совещании "Проблема развития биотехнологии в животноводстве". ЕМЖ. - август 1960. .

. . - на III Всесоюзном совещании. "Культивирование клеток животных и человека"» - Лущдао. - февраль. 1990.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 печатные работы.'

< Объем и структура диссертации. .„.-сертация изложена на'103 страницах машинописного ^екста, содержит 9 таблиц» 16 рисунков. Список литературы включает.170 названий, в том .числе 169 иностранных авторов. '

2. " материал и иетсдика исслед0ваш1 Научные-исследования проведены в 1983-1990 гг.- в лаборатории клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИЖэ. -

В качестве векторного' материала^ .использовали .генную: конструкцию pSV2 neo с геном резистентности к антибиотику генети-. цину (Q 418) любезно предоставленную нам к. б. н. Шрошниченго О. И, из лаборатории генной инженерия' института сельскохозяйственной биотехнологии ВАСЭДИЛ. - Данный. вектор (рис. 1-) имеет кольцевую форму и состоит из участка плаэыиды рВР322, последовательностей вируса SV 40 ( области ранних,и поздних генов, ра:лих и поздних вирусных промоторов, участка ' полиаденилкрования* и терминация транскрипции) ' и " бактериального гена - неомицинфосфотрансферазы (neo), являющегося .генетическим маркером трансформированных клеток. Клетки, включившие последовательности гена neo. приобретают способность расщеплять антибиотик генетицш (G 418), - подвергаясь селекции.

В котрансформации с pSV2 neo использована генная конструкция pBPV 13S (.рис. -2.). Она состоит.из участка плазыиды pBR 322¿' трансформирующей области ДНК вируса бычьей ' папилломы (69 Т) и бактериального гена щелочной фосфатазы. Эта конструкция имеет два маркерных уастка: ген щелочной фосфзтазы и область. охватывающую 69 X генош вируса бычьей папилломы, вызывающую морфологическую трансформацию клеток. -

Плазмида pSV2 neo считается инт^гратлвной, т.е. в линеаризованной форме врезается в геном клетки-реципиента, ' рВРУ13б - век-i тор эписомного типа, т.е. не встра:1ваясь в геном клетки, еущзст-вует ' в эветрахрошеоыном . состоянии, автономно,-* в' количестве нескольких десятков кошт на клетку, за исключением пермиссивнщ

Pst

4.0

Sgb. I

. Hind Ш 3 0 Bgl П .

. рис^.І t. _ Векторкаяконстрї.кция_. pSVíítieoj

ВашШ

Вїігпйі

Рис. 2. Векторная конструкция pBPVI36

- 6 -

для данного вируса клеток. *, . *

В качестве-объекта для трансгенеза использовали перевиваемую линию соматических клеток почки эмбриона свиныг(СШВ).* Указанная линия была любезно предоставлена нам профессором Дьяконовым ЛИ из Всероссийского!института экспериментальной . ветеринарии , им." Я. Р. Коваленко. Культивирование клеток СПЭВ. проходило в 1 среде ЛЬЕМ или , альфа-ЫБЫ' (Gtbco) с І0 X сыворотки плода теленка' (Gibco). Для снятия клеток с подложки при пересеве использовали '. * раствор 0,25 X трипсин + 0.02 Г ЭДГА(Ггг/а).

Внесение чужеродных генов в клетку осуществляли йолибреяовым методом, описанным на клетках; комара Aedes albopictus (Fallon, .1986),* модифивдрованным применительно к культуре сша

; Клетки СПЗВ высевали в количестве 5 х Ю^клеток на 60 км чашки (Cell-Cult) за сутки до генной трансформации. Клетки после прикрепления ко дну.чашки подвергались предварительной инкубации - с малой дозой польЬрбка в количестве 3 шг/мл. Через 12 часов инкубации старую среду, удаляли, и заменяли средой' для трансфекции, которая содержала следующее компоненты: Среда ДМЕМ или альфа-ЫБМ . - ■" 90 ЗЕ ■ сиворотка плода теленка ..— ' 10 X ч полиб-ен - - ■ 12 мкг/ыд

плазииды pSV2 neo и pBPY 136 • - I : 10 . . . Количество ДНИ определялось эмпирически по максимальному' ,числу-образования колоний на селективной среде. ■ ..

Процесс,трансфекции длится 5.5 - 6 ч^сов при 2-х' ■ минутном покачивании чашек через , каждый час инкубации. .По истечении.6. . часов среда-удаляется к клетки подвергаются'токовому' воздейст- ;

вию путем 4-х минутной экспозиции в среде с диметилсульфокси-.

V ь I . '

;дом. После этого"ыонослой клеток отмывают трияг! -любой бессывороточной средой if вате«'-добавляют на одни'сутки обычную росто-' вую среду для осуществления предселективной экспрессии.

Параллельно проводили зкспергалент по введению генных конс-' трукций методом электропорации. Злектропорация клеток СПЗВ выполнялась на. приборе для электрбслияния CFA - 400 ( Kruss ) в специальной геликамере. . г./ ■ ■

Клеточную суспензию в среде, смешивали с плазмидкой ДНК в присутствии электродного,буфера. Готовую смесь переносили в каые-

■ ру и вводили туда: электродный стержень.

концентрация клеток составляла 1- 1.6 шш/ мл суспензии при следующей концентраиии плазмидной ДНК- ^ " *■

- ■ pSY2 neo- 1 МКГ/МЛ pBPV 136 - 10 мкг/мл*

Собранную камеру подключали к электронному .блоку, откуда' поступали ' электрические импульсы с предварительно.установленными параметрами." • • '( ' ■ . '

Экспрессия гена nso в составе плазмиды pSV2 neo подтверзда-' лась'ростом клеток в 'среде с антибиотиком G , 418 и образованием трансгенных колоний.

: Экспрессия,последовательности 'АР вектора pBPV 136 определялась по результатам цветной реакции^связывания субстрата с генным продуктом - щелочной фосфатазой. ■ - *- ' ■ '

■ " Экспрессию 69 , I трансформирующей области* вируса бычьей папилломы Еектора pBPV 136 определяли пи наличию вкусов морфологической трансформации npjt посеве ка полутвердую агавовую среду- .

Наличие чужеродных последовательностей ДНЛ,в клетках определяли путем блот-гибридизации по Сауэ'ерну в лаборатории шлекудяр-

СХЕМА . ЭКСПЕРИМЕНТА

Рис * 3.

вой генетика ЕИЖа.

Принципиальная схема эксперимента представлена на рис. 3.

Результаты экспериментов документированы микрофотографиями.

Цифровой материал обрабатывали биометрическим методом.

%

3. іезультапі шершй'

3.1. Характеристика клеточной линии

Исеяедозанга проводились на перевиваемой .линии клеток * почки

эмбриона свиньи (СШВ). Данные клетки отличаются легкостью веде-, аса в культуре, отзывчивостью на изменение состава среды и, таким, образом, Ередставлясг удобную модель для экспериментов такого ро-дз- ' .

. Клетки EIBB в нормальном состоянии в культуре существуют в {орме шнослоя и клеточныг наялас-овпкЛ. Мэдзлышй класс *. хромосом составляет й>-40. Дна замораживания клеток используется среда ДХЕК. «где в качестве риопротектора выступает глицерин в . коядетрасЕя' 10 X от об ее го объема смеси. Жизнеспособность клеток* поел? огтаинания'составляет 76-60 Z. ,

2.2. Подбор селективных условия.

В работе проводилась селекция клеток по устойчивости к авти-йдаткку 6 418. Это потребовало проведения цатотокпического теста культуры на различЕШ дозы airrcf котика. Руководствуясь минимальной токсической. ДОЗОЙ ГеаеТЕЦИЕЗ для клеток СПЗВ мы установиш его рабочую концентрация для селективных сред - 400 мкг/мд.

- ■ * •. ■ ... - 10 - . *; : -3.3. - Генетическая трансформация клеток.

3. а 1. • шлибреновый метод Шлибреновый метод трансакции состоит иэ двух этапов: инкубации с адгезивным агентом полибреном и кратковременной экспозиции в диметилсульфокеиде, которы" повышает физиологическую компетентность клеток к восприятию чужеродной ДНК.

После инкубирования а средей с поликатионом полибреном клетки приобретают адгезивные свойства.и адсорбирую? на себе нуклеиновые молекулы. Обработка диметчлсульфоксидом повышает проницаемость клеточной мембраны вызывая клеточный пзк. и способствует дальнейшему проникновения ДНК внутрь клетки. В связи с этим необходимо 'было подобрать., такую концентрацию диметил-сульфоксида в среде,* которая увеличивала бы проницаемость клеточной мембраны (т.е. плеточный иж), оказывая при этом минимальный токсический эффект на клетки.* В опытах установлено, что наиболее оптимальной является'20-2-ная концентрация ДОСО в среде, при .которой происходит успешное встраивание геков без существенного ущерба "для клеток. ^ ■" '■

Выл . проведен ряд экспериментов гга' трансакции клеток с ■ различными концентрациями ДНК. Результаты этих -экспериментов представлен1* в таблице 1. . ' • . .

Наивысшая частота трансформации отмечена в опыте с 2000 иг ДНК.' Увеличечие количества ДШ сверх этой .величины неэффективна, так как частота трансформации ке возрастает, а при величине овцгв 300С нг/мл этот показатель даже снижается.

- .Таблица l.

Влияние различных концентраций • ДНК на частоту трансформации.

Кол-во. Кол-во , Кол-во ■■ Частота-трансформации'

ДНК, клеток- . пео-р^зист....----—-----—--—------■—

ш7ил ' для опыта, ' колония, шт. абс. впадение - I

тыс.' г> - 4 ' , - .' ■

:-. 12.5 500 '

25.'.. "у.; - - у ~ ' '■

50 - . . 8 t 0.7 ; 1.60 х 10~* 0.0016

100 -*•- 44 ± 1.8 0.90 X 10** С.ССС2

200 -**- . 54 ± 2.5 1.10 x10"* 0.0110

400 ■; -"-У 56 ± 1.8 У 1.12 х 10** 0.0112

800 >**- 73 t 1.8 .1.46 X 10й . а 0146

1000 . " . . 76 + 2.5 ' v 1.52 X 10м- а0152

1500' ■ • * 93 + 2.5 : .1.86 x 10*' а0186

2000 ' 101 + 1.6 2.00 X 10" 0.0200

:зоо У-* ■ • 95 ± i.9 : 1.90 х а0190

3000 ' 97 ±2.7 . 1.94x10*' .. a 0194

4000 • /87+3.6 ; 1.74 х ю*' о.0174

5000 . 81 ± 1.6 . . 1.62 X 10~* 0.0162

контроль

- Í2 -

, 3.3.2. 'Нэтод' электропорации.'.

В экспериментах по электропорации клеток возникла необходимость испытания основных характеристик электрического импульса на клетках „ Параметрами, которые обусловливают изменение проницаемости мембраны, -являются напряжение импульса переменного тока и число электрических импульсов'в'данном режиме. Проведена серия экспериментов по определению' выживаемости клеток через сутки после воздействия различными величинами напряжения (рис.4 ).

Данные графика убеждают в том, -чт? напряжение 80 В является критическим, так как в клетках возникают необратимые изменения, охватывающие около половины всего- массива клеток С47 X), о 'чем можно было судить по заполненйю'мертвых клетоЛ трипановым синим.

Далее была определена степень:* влияния напряжения и количества импульсов на эффективность"трансформации -с целью оптимизации . параметров, . ' .

Как показывает таблица Z, максимальная частота трансформации била достигнута в эксперименте с напряжением 60 В при воздействии 5 импульсами переменного тока. При напряжении.80_В аналогичный результат получили после 4-х кратного воздействия ,электрическим импульсом, тогда как при 40 В ■ была ' отмечена низкая, частота -трансформзпи. сделан вывод о том, что для успешных опытов по электропорации на клетках СГОВ напряжение 60 В является достаточным при числе импульсов от 4 до ?.

3.4. Экспрессия чуяеродных' генов в клетках СЕБЕ.

' 3.4. J. Экспрессия вектора p£V2 neo.

Выявление экспрессии гена neo плазмиды р5У2лпео основано на использовании доминантной системы селекции. Период селекции

80

60

40

20

_л t

*

• * •

-L ■'--.....» 1 1 - .... ^»-ч.

M і

20

40

60

во 100

120

140

Рис, 4.' ВїИШКв Кбпряіешія электрически* иипульсов .US {ГІИВ.ЗКОСїЬ клеток

по оси X - ыапряг-жие электрического имп,льса, О по ос» У - соотношениа жишх клеток, %

■ .."'у . , '. , r ; . Таблица 2. '

; /■,.' Влияние напряжения и количества электрических импульсов на частоту трансформации при электропорации.

Кол-во Напряжение • ; 1 ч.

ИМПУЛЬ- , ■■ ■■ . ;

сов i . —............——„......———-----...., _

. U - 20 Ь :'■ и - 40 В и - 60 В и - 80 в

1 . - - : • - . 3(7.5 х 1*0

2 ; - 4(1 х 10*) 3(7.6 х 10*)

3 >. - . 18(4.6x10') 22(5.5x100

4 •'6(1.6 х 10 ) 27(6.7x100 29(7.25 x 100 б -.. ' ' - .• 6(1. Б х Ю'О secs. О х iff) 26(6.26 X 100

6 • • • - г. І1С2.75 я IffO 30(7.Б X ÎCÎ^J 27(6.75 X ІОО

7 . . S(1.S5 X Юр ' 10(2.6 X 10*0 30(7.6 X Iff1) 6(1.6 х 10*0

8 . 7(1.76 x id'■),: 12(3,0 X 100 27(6,7 X 100

9 " 7(1.76 X ltfO 16(3.75 X lOO- 20(6.0 X 100 - .

.. примечалиег а)-цифра перед скобкоі.'означает число обраэс- . еавшихся колоний после трансформации в данном опыте, л, скобках - величина эффективности трансформации;'

б)- во всех опытах для трансформации Сраш по 400 тыс. клеток. .

обычно длился 21 день. Начало образования колоний отмечали на і 4-13 дни культивирования. Ш 21-й день, как правово,- во флаконе оставались только те клетки, юторге инкорпорировали чуке-родку» ДНК. ' Шяно было наблюдать плотные полонии трансгенных клеток, имеицие неровные, резкие, иногда обрываицвеся »фаз. Клетки очень плотно прижаты друг к другу. В центре такие колонии имеют скопления многослойного роста '- • трансформированные

клетям .обладает высокой митотической активность п.,

■ ' * ■ і

' Таблица 3.

Экспрессия гена neo плазмиды p3V2 neo в клетках СЛЭВ. .'

-' . ' -** ... "v.

Шказатели . Шиибреяовый - . Электропориция

.метод;.;". ■ ;

П - 16 • п - 12 .

Число.к£етока. опыте,, тыс /■.■■ . 5ÓÜ :.. * 400 ■

Еод-во neo-резистентных- , _

колоний ■ ' ■ ' 95*1.3 31+1.46

Эффективность трансформации; ■ .;:.-■■■■'

абсолга£нс* значение 1.92 зе 1СГ* 7.75 2 10"**

г .■■■.„.■■;. ■ \ 0-0Í92 "аоота

Наибольиая эффективность экспрессии гена-neo в состав«: .век* тора psV2 neo была достигнута при полибреновом методе трансакция (табд.3. ), где на ю-тыс. клеток прихолитсзг2 трансгенные-колонии, это почти в 2.5 раза превосходит результат4 .элекгропо-pacsL . ' '

а 4.2. Эхпрессия вектора pSPV 136 При трансформации пдазмпдой рБРУ-135 в клетках СЕЗЗ Есщгчена экспрессия 2-х последовательностей: гена щелочной фосфатазы (АР) и онкогена из области 69Т BPV.

Этот вектор вводился вместе с pTV2 neo, и ставилась цель определить какой процент клеток с устойчивостью к антк5кзт:ику

■ экспрессирует эшсомную шшмиду pBPV-136. Наличие в конструкции

о. ,

гена АР существенно облегчило эту задачу. - Лоеле соответствушэй i > обработки опытных клеток субстратом X-phos набжшаля еине-зелевэе

окрашивание, которое указывало на присутствие в клетюх плзздаш

pBPV-136. '

Излученная. величина степени котрансформации (42- 55 х '.)

характеризует довольно вьсокую эффективность экспрессии ддазмгтды

pBPV-135 (табл. 4.'). . * ....

Тагам образом, в процессе данного эксперимента была апробл-

ровава подходящая тест-система, позволяпззя оперативно выявлять ^

траисгенность в Культуре клеток то эющрэссии маркерного гева ÁP.

Таблица 4-

гкспрессия плазмвды рШ^У-136 ПО 1«ну АР.

Показатели ШлиОреновыЗ. -Электропорация

метод ■'

I. ,

Взято клеток для' опыта, тыс ' • 500 400

Образовано АР колоний ' ~ 41 ' / ,17'

"Степень экспрессии по АР ге::у, X 0.0082 0.00425

Степень Репрессии по гену neo, X 0.0192 0.00775

Степень котрансфоршцш, X >42.7 55.0

Как известно, плазмиды, в состав которых входит трансферы»- ■ рута&я область вируса или полный геном, находясь в. эписомной форме вызывают оквогенную трансформацию только в перыиссиввых клетках. Для вируса бычьей папилломы такими нершссивнымн клетками является клетки крупного, рогатого.скота», клетки мышей линии НІН эта и С 127. ''

Наличке экспрессии гена АР в составе вектора BFV-136 на ,' свиных клетках навело нас на мысль о возможности шрфологичее-. кой трансформации этих клеток послздоваггельвостью 69 T'.BPY. Для проверки экспрессия трансформирующей области ДНК. ЕИГ пео-резис- ' тентнш клетки высевали ' на полужидкую агаровую среду. - На 7-е

сутки культивирования на поверхности агара были обнаружены ,фо- : 1 ' • *' . 1 -кусы иди скопления ~ .клеток опухолевого происхождения.,. 2ІЛЄТКИ'.'

имеют злокачественную морфологи» плотно расположены^'наползают друг, на друга, образуя очаги многослойїгаго роста, коморі» . пронизывают всю толщу агара, 'проникая-до;самого дна чашки

В таблице 6 представлены данные* по частоте образования:. фокусов малигнизации 'при посеве клеток в трехкратно .убываадах разведениях. . ■

• Частота фондообразования клеток СЮВ де высока и составляет ..в среднец.(Х01:1, т.е. из 10 тыс. петок одна клетка, образует ' очаг морфологической, трансформации. Еаизыгшая частота фокуссобра-л зстания Ътмечена при концентрации 167 тыс. .клеток на 100 мм чажу.';

. Трансформация.клеток СПЗВ онкогеном вектора полибреновсм методе. ;

N а/а .- ГЬсеяко клеток Кол-во ' ^Ьстота фояусообразования

: на чажку. тыс - фокусов

.траясф-ции : абс. значение . ' 'V

/л -5

1 seo 45 i 5.5 • - 0.9 х 10"* ■ а 009

2 166.6 ' . 23 ± 4.7 ' . 1.38 х Ш* 0.0133

3 ' 55.5 ' .;.' 6 ± 2.0 " 1.03 к 10*' . 0.0108

4 18.5 • '': . 1 ±0.5 0. 54 х 10** ! 0.0СН4

■ •5 \¿i. i . - ■ . ■ :

6 ■.- 2.0 ■ ■ -. ..• - ■ ' •

7 ;> а 667 ; • V

. ¿5/ . имекулярно - генетический анализ'интеграции чузке-;

- родной ДНК. . ■ '

, -^Зыделенная из образцов трансформированн ых клеток тотальная '

i ДНК:была ■ расщеплена '. рестриктазаш EcoRI a EeoRI - Bañil Г. '

В качестве- зонда для гибридизации использовали ДНК плазмиды pSV2 neo. Результаты ЧШахиз а показали, что после обработки рестриктазами ДЩК опытны* клеток" гибридизовалось с радиоактивным

■ - - : . С - .

ДНК-зондом образуя соответствующие, полг-^ы.' В данном случае имела место гибридизация с участгзми влазкида. рШ322,.коТорыз присутствуют в обоих векторах С pSV2 г«о и pBFV-136 ), а также с' ¿оследокзтельностяш гена neo. Получены^© результаты свидетель-

Таблица 5. pBPV-136 при

; - із - ' ї .

ствуюг о тзндемном встраивании нескольких копий плазмидвой ДНК . а геном клетка; .... ': ' ' •

Цри расщэшгении ВалШ/EcoRI Bt-епляется фрагмент величиной .700 п.н., соответствующая BáirHI/BcoRI-фрагменту плаэмиды pSVSnea

■ , ЗАКДОШШ

Испытание полийрееовой . методики на клетках СГОВ гало неплог хие результаты; показав простоту выполнения и воспроизводимость ■ она ка порядок прейосходит (2* х,-) иыекгиеся данзіие'по трансформации полибреновым' методом мышиных. - кроветворных- клеток -(Chlsholm, Syraonds, 1988 ); Вероятно этому способствовало использование ДШО-тока.

. ¡Эффективность трансформации при использовании метода элект- . ролорации у разных, иссдедовагелей-заметно варьирует в зависимости от типа клеток.; Например; самая низкая эффективность (1оТ 10"* ) описана на озотфиксируюших' бактериях ;и - на мышиных ■ 3 клетках , . (Doetscftman, toeda, 1988) ,.* а самая высока* (10*1) на шейных ГИб-ридомах (Shlnichiro.et al.', 1987).

В нака экспериментах.злектропоращш дала'худшие резудыату . по сравнении с полибрёном-по экспрессии , гена г.эо,. но в то ле .время степень ¡«трансформации гена'АР пл лмиды рБРУ 136'па отновенюо к neo «аркеру приэлектропорации - выше (табхб). f

Апробирована подходящая тест-система,. позволяйся оперативно выявлять трансгенность в культуре клеток по экспрессии маркерного . .' гена иглэчно'й фосфатазы (АР).

Полученные результаты, ' позволяет, предполагать о наличии ви, рус-кндуцирозанной - трансформации,- и . опи тем боже ютерескы в • случае, где ДНК вирусам специфического для крупного рогатого'сто-

■ • ' - 20 - : ; та трансформировала клетки другого биологического вида - свинья.

'Доказана наличие в трансформированных клетках чужеродных последовательностей ДНК.

Таблица 6.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ тВЯЮРМЫЩ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫМИ ЬЕЕТОДШИ. ■. '

■ ПОКАЗАТЕЛИ'

, гюлибреювш ; ; электрогор/тйя

,■ , МЕТОД .■■■•■ • •.

' Плазиида- р5У2пео 200 нг/мл

Посеяно клеток 500 тыс.

. Образовано пео-резис-. V,- > --тевтшш КОЛОНИЙ ;

Эффективность ' трансформации '„.' / Котравсформэдия ; (ретгпео + рвру 136) : ■ Оэсеяно клеток ' ^Йразовано колоний с экспрессией гена АР 4 Эффективность ■ ^, ■трансформации '■'; <Степень котрансформ-и,ии . 42. 7 X

96 ■

1.92 х Ю-*

2 мкг/мл ■ ' БОО тыс/

41' ■'

а 82 х 10~*

1 ыгсг/ш

дао Т ЫС.

7,75 X «Г

; 10 мкг/мл 400 тыс

.17 ■■■;*

4.25 X 10

—г

ВЫВОДЯ

На основании результатов проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. В экспериментах на культуре клеток почки свиньи (СПЗВ) установлено, ,что введение векторной плазмиды pSY2-neo обуелов-

' ливает образование в селективной среде резистентных кг тюний с частотой от 0.75 до 2,0 х юЧ .

2. Внесение гена палочной фосфатазыв составе конструкции pEPV-136 сопровождалось цветной реакцией- клеток CIÍjB после связывания с фермент-специфический, субстратом с - частотой 0.42 -ааг X 10"í д

, 3. Наличие клеточных 'фокусов опухолевой морфологии на полутвердом "агаре 'после введения плазмиды на основе ДНК вируса

- бычьей папилломы (pBPY-136) позволяет сделать.вывод о. межвидо-, вой в прус-индуцированноя трансформации свиных клеток. ;

- -4. *Испыгание двух методов трансфекции показало, что полиб-реновый метод характеризуется более высокой.эффективность» и воспроизводимостью по сразнеаию элекгропоращгей. -

5. Наибольшая эффективность '.котрансф'рмадаи плазмиды

■ ■ ■ - . ■■ ■ ■

pBPV-136 410 отношению к ллаэмиде pSV2 '."reo (55 X) была достигнута в экспериментах до электропорации. '

- 6. Шлекулярко-генетическим анализом ДНК установлено вали-■ ' чие в клетках векторных последовательностей pSV2-néo в количестве Э-х, копий ка.клетку, а также последовательностей вектора . PBPV136. . ■ "; . . ' ' "V,

- 22 -

Практические предлолкния .

л

.1. Отзывчивость клеток СГОВона:введение чужеродного генетического материала» а также легкость ведения в культуре дает возможность использовать эту линии в плучении шюток-продуцентов физиологически агегиЕншс в^пеств.

2, Конструкция i*SV2-mo с геном устойчивости к антибиотику

■

может быть использована в качестве гекетичг с.-ого маркера при получении эмбрионального трансгенного материала.

■ 3.' Установлено, что* ДНЯ вируса бычьей папилломы экспресси-рует свой опухолевый фенотип в свиных клетках. Если в такой вектор встроить последовательности любого интересуюц, го гена, - при этом удалив - фрагменты, вызывающие злокачественность., то его мохнэ использовать при получении трансгенных свиней.

-'_■•;,■ До теме диссертации опубликованы следующие работы: .

II . кЕакаревич А. В., Стрельченко ЕС., Смирнов О. К, Сравнительная характеристика. различных ■ методик генетической трансформации

■ культур .клеток сельскохозяйственных животных// Тезисы докладов-

III Вгесрюэного совещания "Культивирование ыгток животных- и человека11, Яуияно 1990 г. , ■ , . -

2. ■ Иакаревич A.B.., Ларина Т.IL. Стрельченко.ЕС. появление ; трансформированного фенотипа в культуре клеток СПЗВ //Тезисы

докладов III Всесошного^еовеглния "Культивирование клеток животных и человека**, Цщино 1S90 г. ' ■ '

3. Смирнов О.К,1£каревич А.Е Эффективный метод трансфекции .соматических клеток сельскохозяйственных животных -7/ Тезисы докладов Всесоюзного научно-технического совевсшия "Проблемы, развития биотехнологии в животноводстве*',, Дубровицы, 1880 г.

Зак&э ft 85¿ от 6,<XS*9¿ Г. Тврак ІОО Ротапринт ИВУ Вктебскоблагропрохи