Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТЕСТИРОВАНИЕ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ПОЧКИ ЭМБРИОНА СВИНЬИ (СПЭВ) И ТРАХЕИ ЭМБРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (FBT)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ТЕСТИРОВАНИЕ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ПОЧКИ ЭМБРИОНА СВИНЬИ (СПЭВ) И ТРАХЕИ ЭМБРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (FBT)"

ЗН2>6

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЯ)

На правах рукописи

АЙтбаев Нуряаи Ергековкч :■ . ,

тестирование геннях ;онс1?укций В КУЛЬТУРЕ клеток почки эмбриона свнм (спэв) и трахеи эибгиона ' крупного роитого скота (гзт>

03.00.13-Физ1.э^огкй человека и якаотких

- .. автореферат ;■■. диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. /п. Дубровнцы Иосксегкой области -1994 ■'■;"■ '

Работа выполнена в отделе биотехноло.._ ^ . ь— ; |. ..

научно-исследовательского института животноводства.

*

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор И.Я.Онхов, кандидат биологических наук И.П.Савчвккова Официальные оппоненты: доктор биологических наук ■ профессор В.П. Кононов , кандидат биологических • • наук И.Л.Куликова

Ведущее учреждение - Всероссийский научно•исследовательский институт физиология биохикии и питания сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится "Й " февраля 1995 года в_10 часов на заседании специализировавшего Совета Д.020.16.02. при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства. '■'■■■■ ■.'■ '■■" V1 Г'.';."-'-..-..

Адрес института: Московская обл.. Подольский р-н, поселок ДуЭровнцы ■■■ • ' ' . ■

:С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИ1а -*■•" Автореферат разослав ■ '- 199* г'. '

' Ученый' секретарь' "■■::./■■.:■. "о/ -■■ ■

' специализированного Совета, -' - ■ - ..-■ доктор-биологических.наук ■■■■;■-..} П.А.Науыенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛБОТЦ АВТУЗЯЬЧОСТЬ.ТвчЮ* Актуальность работ по генетической трансформации соматических клеток в культуре связана с изучением и моделированием процессов функционирования чужеродных генов в оргаиизке хозяина, а танке с практическими задачами производства гекно*инженерных белков(гормонов, ферментов, интерферонов, ннтерлейкииов, различных антигенов) , синтез которых в срокариолшх клетках и дрожжах остается часто незаверенным, Мрокариоткческне системы имеит ряд недостатков. Это - отсутствие в них ферментативных систем, обеслечивалцих посттрансляционкие модификации (гликозилнрованке, фосфорилирование, образование бисульфндкых связей) в процессе синтеза белков.

Реконбинантные белки, получаемые в микроорганизмах, чаше синтезируется ч нерастворимом виде, как тела - включения в цитоалазку клетки* продуцента, что осложняет их выделение и очистку. , '

В последнее время предпринимается попытки ввести чужеродную информацию в организмы с целью получение животных с экзогенное генетлческой информацией (трансгешта животные), Ряд результатов , получении из лабораторных животных' (стимулирование роста, коррекция наследственных дефектов роста и иммунной 'системы, индукция стабильных и нестабильных мутаций, синтез и секреция в кровь и в молоко физиологически активных б&лков),-при воспроизведении нд сельскохозяйственных животных могли бы стать основой для новых биотехнологий и генетико-еелекционнше методов. Однако, попытки воспроизведения этих результатов на сельскохоэяйстненных животных натолкнулись на.( серьезные

^-^-^грал'ьная "тк

^ Ндучнля б: ьл; 10 ГЕКА ;

-'ОС«. . -чадении

трудности.

Для того,чтобы использовать трансгеяных иивотшх в биотехнологии , »«обходимо изучить, факторы, от которых зависит тканеспетдифичностъ экспрессии чужеродных генов ,чтобы . контролировать уровень выработки нужного продукта.Необходимы дальнейшие исследования , направленные на изучение проблем сгаимодеиствия генома соматических клеток с чужеродной генетической информацией.- •

Изучение свойств рекомбинанткоЙ ДНК к способности к экспрессии б культивируемых клетках открывает возможности для анализа чужеродных генов до сведения их в организм животных.

Все этн причины требует * дальнейших работ по отработке способов .эффективного введения ДНК в клетки млекопитагдих, а том чнеле сельскохозяйственных животных, культивируемых In vitro, н создании стабильных клонов клеток с генетически трансформированным фенотипом.

. Целью настоящей работы являлось изучение возможности тестирования рекомбинантных генных конструкций в качества трансформирующих факторов в. культуре клеток сельскохозяйственных животиых(СПЭВ и FBT). Для достижения намеченной цели были поставлены следухчхе задачи: 1.Поиск н отработка оптимального метода "введения чужеродной ДНК я генск клеток сельскохозяйственных животных культивируемых in vitro. А'-

2.Проведение сравнительного анализа эффективности разных, методов трансфекцни культур клеток при использовании репортерного гена Ie.eZ E.coll, поставленного под контроль промоторов RSV и CMV*

3.Проведение трансфекцнн клеток сельскохозяйственных животных (CH3B,FBT) и изучение компетентности клеток к поглощении экзогенной ДНК в зависимости от длительности культизированйя .

4.Изучение экспрессии иаркерних генов в составе различных векторных систем в генетически трансформированных клонах кл£ток Ш к СПЭВ.

В целях испытания векторных конструкций в иодельных опытах на культурах- клеток бш впервые применен предложенный научным руководителем новый способ введения рекомОкнантной ДНК посредством' нанесения раствора препарата на иоаослой клеток с последующим давлением за счёт наложения покровного стекла по форме чашки Петри. Научная новизна подтверждена- соответствующей заявкой на изобретение "Способ введения экзогенных ДНК плазммд в культуру клеток клекопнтавдкх, культивируемых in vitro" заявка No93038111. пркорететот 26 июля 1993года.

В проведенных исследованиях впервые показана возможность усиления процесса интеграции чужеродной ДНК с последующей экспрессией введенной в животную клетку генной конструкции за счет встраивания в конструкцию фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека (рЛВВ}.-

ЗЬэвтическм.цееоость'.Апробированы методы кальций-фосфатной преципитации н ¿новый способ> введения экзогенной ДНК в клетки сельскохозяйственных животных(СПЭВ,FBT), которые могут быть использованы яри тестировании генных конструкций в культуре клеток. Разработаны "Методические рекомендации по введении экзогенной /ЩИ в культуру клетск сельскохозяйственных животных".

Утверждены ученым советом ВВДг. 25 ноября 1993г.

Рекомендуется использовать клетки почни эхбрйо.ча свинья (СПЭВ)н трахеи эмбриона крупного рогатого скота(ГВТ) для генноинженерчих работ ,как клетки компетентше к восприятию чужеродной генетической информации.

Материалы диссертации доложепы и обсуждены на Ученом совете ВИМ, ноябрь 1993г.; на 6-ой конференции Росссийской Федерации <Новые направления биотехнологии)24-26 мая 1994г,г.Пущиио; на лабораторном совещании в секторе клеточной инженерии отдела биотехнологии ВИИ,199<г;

Hyv-tlVtfBUVV.no теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

в.етручтурэ.лиссерт&иив.Диссертация изложена на страницах мапинописнэго текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы к практические предложенья. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 11 рисунками . Список литературы содержит/^/ источников (на русском и иностранных языках).

?. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований В работе в качестве объекта для трансфекшш использовала перевлвиемые л:1нии соматических клеток трахеи эмбрисиа коров (КВТ) предосгавчгннуе институтом вирусологии км Д.Н Иванов, ко го РАМН и почки эмбриона свиньи (СПЭР) любезно (тре^оспвлсннце прфесгором Л.П Д-яконсеым (^ЛЭВ),

В качестве векторього к;»гермача использовали-линсйнуп

гониую конструкцию сосланную на векторе рЦС 19 из

FVUII-BstHI 3'-концевого фрагмента вируса саркомы Рауса длиной 594 п.н.,знлючащую V3 и STH последовательности длинного концевого повтора: Bstlll-Pstl. Рестрикты гена lacZ длиной 3063 п.п.из . лактозкого оперока E.coli и Pstl-Kpul 3'-концевого участка гена горнена роста быка длиной 7В6 п.н., содержащего сигналы сплайсинга, полиадекелнрования и терминацин тралскрипцки, Для кикроиньекцин использовали Hind III-EcoRI 1,естрикт, длиной около 4,5 т.п-;н., лишенный прокариотической векторной части(рис 1).

Использовали гениу» конструкции pCWV-lacZ кольцевой формы также содержащую бактериальный ген lacZ".поставленный под контроль промотора цитомегаловируса. Размер конструкции составляет 8,7 т.п.п. (ряс 2). Выэеуказанные конструкции предоставлены институтом молекулярной биологии РАН.

Использовали генную конструкцию pSV2neo с геном резистентности к антибиотику генетицину (G418). Данный в;ктор имеет кольцевуп форму и состоит из участка плазмиды pBR322, последовательностей вируса SV40 (области ранних и поздних генов,ранних и поздних яирусиых промоторов,и участка полиаденнлнрования и терминации транскрипции) и бактериального гена неоницинтрансфе-разы пео, являющегося генетическим, маркером трансформированных клеток.Размер конструкций,составляет 5.6 т.п.н (рис 3).Генная конструкция предоставлена ВИКИ сельхозбиотехнологии.

. Использовали генную конструкцию pSV2neo-pABB, созданную в .лаборатории по изучению трансгенных животных к.б.н. а.в.Чичиловым. Была взята плазмида: psv2neo и фрагмент рибосомальной ДНК человека рД.8В (Образец ДНК-повтора был

ЕШШ

, ЕСО

и^-ч

Н'ооп.н

промоторная часть

С1а1

Есой1 ВёИ

-ь

ЕесЩ ВдП

5ас1 : РтоП Эша1

Хас2

Крп

» р11С 19

3/ро1у(А) в ЙН гена

Рис Л. Векторная конструкция рИЭТ-1ас2

, .ШШ

■ам!®""-'

ВгШ Аре/

Рис.2. Взктсрная конструкция сСУ1.'- 1ас2

Hind-ЛГ BfilH

Рис.3. Векторная конструкция pSV2-neo

Hind. Ш B£l П

Рис,4. Векторная конструкция pSV2neö-pABB

любезно предоставлен докторок биол.наук Л.II. Гиндклисои).С цель» пол,,ченкя препарата рекДМК била проведена трансформация атамма НВ101 н аз полученной биомассы выделена илазмида в количестве 3 мг. Рестрикция и лягирование фрагмента проводились поИаннатису Т. (рис 4) .

В качестве ДНК-носителя в экспериментах использовали ДНК спермы лосося("Serva").

Для культивирования клеток в качестве ростовой среды использовали жидкие среды ДНЕМ(Serva),«-МЕН (Signa) Игла (Flow). Для промывочных работ использовали раствор Хенкса, изготовлен* ный в Московском институте вирусных вакцин н препаратов. Также солевой раствор яа основе фосфатного буфера (PBS) рН-7,2-7,4.

8 экспериментах использовали эмбриональную телячую сыворотку (PCS), производства фирмы Serva и института вирусологии нм. Д. И'.Ивановского.

Для снятия клеточного монослоя н трипсннизации культур клеток использовали раствор трипсина (0.25Х) на растворе Хенкса без кальция я магния рН=»7,8 к раствор вереена 0,02%-ный (ЗДТА) рН-7,2.

Для замораживания клеточных линий в качестве крнопротектора использовали глицерин отечественного производства . и диметилсульфоксид фирмы Serva. Концентрации клеток определяли □о стандартным методикам .

Депонтаминацию культур клеток от микоплазм проводили по методу разработанному И.Л.Куликовой (1988), Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом ■ , а также с покочью (нового способа>, отмеченного cunte.

Селективный отбор клеток, трансформированных генными конструкциями р£>\Г2пео и рЗУ2пео-рАВВ осуществляли в среде с антибиотиком й418. Степень экспрессии определял» по частоте трансформации т.е отношением числа образованных трансформантов на числа использован¡шх клеток.

Для выявления продукта экспрессии гена 1ас2 мы использовали Х*£а1 в качестве субстрата к ц-галактозидазе. Наличие экспрессии интегрированного гена" 1ас2 определяли на 2-ой день по цветной реакции, обусловленной . присутствием нераствбрикых синих кристаллов хромофора • Степень экспрессии гена определялась анологично частоте трансформации - отношением числа образовавшихся трансформантов в процессе селекции к обяему количеству клеток взятых для траисфекции, но в отличие от последнего выражалась в процентах.

Анализ ДНК выполняли с помощью дот-гибридизации в лаборатории г;о изучению трансгенных животных В1Ша, Суммарную ДНК выделяли из клеток согласно известной прописи ДНК

денатурировали щелочью и наносили точки на капроновый фильтр {"Хийу Калур").фиксировали при ВО°С в течение 2 ч в вакууме к гибрид ¡повали с фрагментами плазмиди, мечеными 32 Р с помощью реакции ннк-трансляции.

Принципиальная схема эксперимента представлена иа рис.5.

Результаты экспериментов документированы микрофотографиями.

Цифровой материал обрабатывали биометрическим методом.

СХБМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Генетическая трансформация клеток:

СПЭВ

РВТ

Векторный конструкции:

Метод генетической трансформации.

Рис.5.

■ "• у'V ■•'■■ц *'■ ■'■■ : X '■■'■■

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4;

3.1. Характеристика клеточных линий Исследования проводили на перевиваемой линии клеток трахеи эмбриона коров(ЖГ). Эти клетки морфологически представлен» элителноподобньши и полигональными структурами. Они имеют округлые ядра .ядрышки крупные ,от одного до нескольких в ядре.Встречается клетки и ядра больного размера . Цитоплазма зернистая. Модальный класс хромосом составляет 50 (рис 6).

Жизнеспособность клеток после оттаивания 84%.

46 47 48 49 50 51 52 53 Рис 6. Модальный класс хромосом клеток ,РВТ по оси Х-число хромосом (кариотип) ' \ по оси У-колнчество клеток.

Вторая линия это перевиваемая линия почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Они такие представлены элителкоподобнымн структурами. Имеют крупное ядро(до 60% размера клетки), по ллощади превыиащее размер цитоплазмы.Ядра клеток содержа!, от 2 до 4 ядрышек.В цитоплазме иногда можно встретить включения в виде липидных гранул.Края клеток относительно гладкие.Модальный класс хромосом составляет 40 (рис 7). Жизнеспособность после оттаивания 76•80Я.

•1270

60

50

40

30

20

10

о

35 36 37 39 39 40 41 42 Рис 7. »опальный класс хромосом клеток СПЭВ по оси Х-чксло хромосом (кариотнп) по осн У-количество клеток. 3.2.Введение гена LacZ Е.соН в культуру клеток 3.2,1.Опыты по разработке нового метода /раксфеяции Для . проведения опытов были использовали культуры клеток трахеи эмбриона крупного рогатого скота (FBT) и почки эмбрина свиньи (СПЭВ) . Трансакцию осуществляли с помощь» кальций-фосфатной методики , где использовали рекомбинантную ДНК плг.змиды pCMVlacZ.

Временная экспрессия гена lacZ связанная с выявлением р-галактозидазной активногтн в трансформированных клетках, была обнаружена на 2-й день после проведения трансфекции по образованию синих бляшек в присутствии субстрата Х-£а1:

Оптимальное время инкубирования культивируйmux клеток в

растворв экзогенной ДНК, при котором наблюдалось экспрессия трансгена составил 40-60 мяяут(таблнца !)•

Были проведены ряд экспериментов по трансфекции клеток с различными концентрациями ДНК; результаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Оптимальная концентрация ДНК при которой достигнут наивысший эффект был на уровне 20 мкг/мл , гце pGMV-lacZ занимает 2 мкг/мл, ДНК -носитель - 18мкг/мл(сперма лосося).

Нави многочисленные исследования привели к выводу, что в большинстве используемых методов трансфекции лежит один и тот же принцип: для того чтобы чужеродная ДНК проникла в клетку необходимо частичное нарушение клеточном мембраны. Исходя из этих наблюдений, предложен простой доступный и легко воспроизводимый способ введения экэогешо? ДНК-плазмид в культуру клеток.

Поставленная цель достигается тем,что предложен способ ("Новый способ"), согласно которому клетки млекопитающих, культивируемые In vitro, придавливают покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя в PBS буфере, содержащем экзогенную ДНК в концентрации 10-40 мкг/мл .стекло убирают , а клетки ннкуСируют (в б>фере с донорской ДНК) в течение 40-60 мин при 37°С.

За день перед трансфекцией клетки рассевали в чашки Петри с диаметром 3,5 см в концентрации 10'/смги инкубировали при 37°С в течение ночи Непосредственно перед трансфекцией клетки промывали буфером PBS ph=7,2 2-3 раза. Переосаждали двух-нратно в 70® этаноле при 5 тис .оборотов в течение 15 мин донорскую ДНК

и растворяли в 6уфере( ОДмМ ЭДХА. 1иК трнс-НС1.рН=8,0),а затем добавляли к клеткам , находящимся в PBS до конечной концентрации ДНК 10-40 мкг/мл. Клетки в растворе с донорской ДНК накрывал« стерильным покровным стеклом и придавливали перпендикулярно поверхности монослоя равномерными , круговыми движениями. Затем покровное стекло удаляли, а клетки инкубировали пра 37°С с 5ХС0г в этом ке растворе в течение 40-60мин, После этого клетки тщательно промывали буфером PBS 3 раза и среду меняли на нормальную ростовую среду.

Установлено, что оптимальное время инкубирования культивируемых клеток в растворе экзогенной ДНК, при котором наблюдается экспрессия трансгена, составило от 40 до*60 минут { табл 1). Ниже этого значения экспрессия трансгеиа не наблюдалась, при более длительной инкубации клеток в растворе с ДНК наблюдалась гибель клеток. ,

Таблица 1

Зависимость эффективности временной экспрессии гена lacZ в клетках СПЭВ, FBT , культивируемых in vitro, от времени инкубации в ратворе с экзогенной ДНК

Количество клеток продуцирующих /з-галак.(Х)

Способы BpeMd инкубации

мин час!

¿0

40

60

У Li

16

24 ,

ft nLпик ({офатный iknui Liionati

o,e

34

3

53

1

17

Результаты опытов показали также, что оптимальный уровень концентрации экзогенной (донорской) ДНК в буфере PBS составил 10-40 мкг/мл (табл 2). При величине этого показателя ниже и вьше отмеченного уровня экспрессия траисгена не была установлена.

Таблица 2

Эффективность временной экспрессии гена lacZ в клетках СПЭВ , FBT, культивируемых In vitro, от конечной

концентрации экзогенной ДНК в растворе

Способы Количество клеток продуцирующих р-галак.{%)

Концентрация ДНК (мкг/мл)

5 10 20 30 40 60

Кальций-фофатный - . 1 3 2 0.8 -

Предложенный

Новый способ - 21 50 34 15 -

3.2.2. Сравнительный анализ временной экспрессии гена lacZ поставленного под контроль разных промоторов при использовании разных методов трансфекции в культуре клеток селькохозяйственных животных Для проведения опытов по введению трансгена в культуру клеток использовали кольцевые формы ДНК плазмид:

pCMVlacZf со£1фжащую ген 1гс2 Е.СсИ под контролем промотора цнтомегаловируса , pESV 1 acZ, где этот ген поставлен под контроль промотора дл, j;:ioro концевого повтора вируса саркомы .Рауса и ДНК сперми лэсося/Sigiia/. Б оште использовали клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ)и клетки трахеи эмбриона kopob(FBT),

Трансфекций осуществляли двумя мвтодамн: кальций-фосфатным и предложенным нами Нови« методом.

Определение 0-галактоэидазц служит хорошим контролем за компетентностью клеток. В наших экспериментах клетки СПЭВ н ГЗТ показали достаточно хорооую чувствительность к поглощению и экспрессии экзогенной ДНК плаэмид. Когда клетки трансфецировали кальций-фосфатным способом было выявлено 0,8 - 3 X клеток продуцирующих р-галактоэидазу от общего количества клеток, используемых в опыте. При использовании предложенного нами способа количество клеток, экспрессирущнх ген 1ас2, повышалось до 38-53Х.

Таблица 3

Сравнительный анализ временной экспрессии гена 1ас-2 потавленного под контроль разньц£ промоторов при использовании разных методов тра1'Сфекции в культуре клеток С."X животных

Культура клеток Кальций-фосфатный метод НоьыЙ способ

Количество клеток продуцирующих р-галактозидазу (%)

pCMVlac-Z pRSVlac-2 pCMVlac-Z pRSVlae-Z

СПЭВ FBT 2 0,3 ЗБ 40 13 53 27

Сравнительный анализ временной экспрессии продуктов гена lacZ В,coll в клеточных линиях, трансфецируемых разными методами , показал,что Новый способ является не только простым, но к более эффективным. Новый способ превосходит кальций - фосфатный по количеству клеток, поглощающих экзогенную ДНК и экспрессирущнх

чужеродный белок в среднем по всем типам исследуем»« клеток в 50 раз.

Экспрессия бактериального гена в клетках млекопитающих может служить тестом ка активность грохоторов в эукариогическнх векторах. Приведенные в таблице даньие свидетельствуют о том, что существенной разницы между уровней белкового синтеза в зависимости от характера нпользованных нами промоторов, контролирующих соответствующий ген не существует .

3.3. КОКПЕТШЙОПЬ МЕТОК СПЭВ И FST К ПОГЛОЩЕНИЮ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В ЭАВИСИИОСТИ ОТ ДЯИШЬР0Ст" КУЛЬТИВИРОВАНИЯ 1« VITRO

Для проведения эксперимента били использованы две перевиваемые клеточные линии: клетки почки эмбриона свиньи /СПЭВ/ и клетки трахеи эмбрио<.а коров/КВТ/.Для трансфенции использовали клетки на разных этапах субкультивирсвання:2-3, 5-7, 15 и 20-22 пассажах. В опыте использовали рекомбинантнув ДНК плаэмнды pCHV-LacZ. кодирующую g-галактозидазу E.coll. Трансакцию осуществляли с помощью кальций-фосфатной методики. Продукцию бактериального гена д-галактозидазы выявляли в клетках на следующий день погле проЕеден!'л трансфекцин.

Наиболее высокую степень поглощения экзогенной ДНК показали клетки,которуе перед трансфекцией находились на 3*7 пассаже последовательного су0.чультивирования(таблица 4).Эта закономерность иабльдалась для обоих клеточных линий. Так количество клеток СПЭВ пелотившнх к экспресскрующих д-галактоэидазу на 3-7 пассаже достигало до 3% ,а клеток FBÎ до 5%. С увеличением длительности культивирования клеток этот

показатель значительно снижался до 0,5-1% .

* Таблнца4

Количество клеток логлотнших и экспресскрущнх д-галактозидазу ,в зависимости от длительности культивирования клеток in vitro

Культура клеток Номера пассаней

3 5 7 9 15 20

СПЭВ FBT 4x10 ^ 2х10"5 4х10'5 10*5 10*6 10*6 9х10'5 9х10"5 5х10*5 2x102х10'6 Kf6

j__I

3.4.ЭШ1ШЦИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ Получены клоки генетически трансформированных клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и клеток трахеи эмбриона коров (РБТ) в которых обнаружен продукт ' экспрессии гена 1ас-2, ¡зталактозидаза.

Для котрансфекции использовали рексмбинантнке ДНК плазмид р5У2-пео, р<ЗШас-2 и ДНК спермы лосося. Трапсфекция клеток лроводили кальций-фосфатным методом, селекцию трансформантов осуществляли в селективной среде .содержащей генетнции(0-418).Для выявления наличия в клетках продуктов экспрессии гена 1ас-2 Е.соН использовали в качестве

субстрата к р-галактозидазе. ■ . ; '

Результаты цитохимического анализа показали ,что' не все к дону исследуемых, клеток с пео+ фенотипом экспресснроаали -р-галактозидазу. Так из 28 клонов клеток СПЭВ с фенотипом г.ео+ в 3 клонах была выявлена экпресЬия р-галактозидазы. Из 36 клонов

ксетон Л)Т с фенотипом гес^ только в 5-ти была обнаружена продукция экспрессии, гена 1ас-2. Экспрессия 0-галакюзндази ь пео-резястйнтных клонах клеток КВТ достигала клеток С1)ЗВ

соответственно 23Х.

Наблюдали изменение экспрессии р-галактозидаэм ь исследуемых клвтках клонов-трансформаитов с г.ео* фепотииои при цепрсрылзюм культивировании в течение 5-ти пассажей до 3-5Х клеток (рис 8). ■• '.......... .,

Рлс.й. Д1гч^и:гка р.хирессн Гс;?"л 1?,с2 в нео^езистккткык клопах ■клеток. X -¡-змер^. ггассп у- зкспресс1:ру!::ци:', клеток Клзгяк: сер::.! 1 -СЮВ, сер:?я 2 -?£?.

-203,5. Тестирование гекиих конструкций pSV2neo и pSV2neo-pAEB на способность к экспрессия в культуре клеток сельскохозяйственных 5ив0тйых 3.5.1. Подбор селективных условий Б экспериментах по трансформации клеток чужеродными генак±1 входит этап отбора илк селекцхн из общей клеточкой популяция тех клеток, которые включили чужеродную ДНК. Это потребовало проведения цнтотокснчеекого теста культуры на различные до.'к антибиотика.

Гибель клеток начиналась на 5-10 сутки культивирования в среде содержащем G4Î8. По мере увеличения концентрации антибиотика, начиная со 100 мкг/мл клетки реагировали на его присутствие н уже при концентрации 600 мкг/мл почти все клетки в чашке погибали.

Таблица 5

Устойчивость клеток FBT к различии» концентрациям геиетицииа.

Конц-я клеток на см®

'.нтр С418(мкг/мл)

.1 .1 .1 ™ .1 J .!

100 j 200 I 300 I 400 j 500 j 600 j 700 j 600 j 900 j'

103 + + + +■ +

3xl03 + + + + +

5xl03 + + + + +

lO4 + + + + +

Руководствуясь минимальной токсической дозой генетнцнна для клеток FBT, мы установили его рабочую концентрацию для селективных сред -600 мкг/мл (таблица 5), а для клеток СПЭБ 500 мкг/мл таблица 6

Таблица 6

Утойчнзость клеток СПЗВ'К различным концентрациям генетицнна

Концентрация клеток на см* |

Титр С418<икг/мл)

100 | 200 | 300 | 400 | 500 600 700 800

Ю3 "+■■+■'+ ■+

3*10° + ► ■ + * : •

5хю3 + ++......* + +

ю^ + + + * +

+• наблюдается пролиферация клеток

• - гиболь всех клеток Т ' частичная гибель клеток

3.5.2.Экспрессия генных конструкций рЗУ*>пес к рЗУ2п:ю-рАВВ в культуре клеток

Выявление экспрессии гена пео плазмид р£У2пео и . рЗУ2пео-рАйВ основано на использовании диминантной системы селекции .Он« заключается в тон , что в селективней среде выживсвт и образуют колонии только клетки трансформировали«'' чужеродным генсм . Ген-лоо лрк его экспрессии кодирует фосфориСозилтрансферазу, который инп;6ирует деистаи« антибиотика СЛ18 . Клетки, не поглотиеоис этот ген, ноглблит в условиях культивирования ¡: селективной среде.

Начало сбраэорання колоний отмечали на день

культивирования . На 21-й де^ь, как правило, во флаконе оставались только те клетки , которые инкорпорировали чужеродную ДНК. Можно было наблюдать.плотны« кслонии трансгенных клеток ,

нмешив неровные , резине .иногда обривающиеся края. Клетки очень плотно прижаты друг к другу.В центре танке колоний имеет скопление многослойного роста , Трансформированные клетки обладают высокой кнтоткческой активность».

Была проведена серия экспериментов по трансакции клеток с использованием плазмлд р£У2пео я рЗГС2пео-рА|В.В результате частота трансформации плгзмиды рЭТ2пео с Фрагментом рнбосоыаль-ной ДНК (рАВВ) било в 2 раза выше, чем в,контроле ( табл 7).

■ Таблица 7

Получение генетически трансформированных клеток СПЗВ и КВТ с

использование« плазмнд pSV2-neo и рЗУ2псю-РАВВ

Получено клопов клеток.устойчивых к G-4Í8

pSV2neo pSV2neo-pAB8

Всего Частота Всего Частота

трансформации трансф&рманнн

СПЭВ 15 зхю;® 29 6x10i

FET 21 5x10 , , 44 9x10 l¡

3,5.3.Колекуларно- генетический анализ трансформированных

клеток СПЭВ я ШГ С целью тестирования на наличие гена neo была .проведена Дот-гибридизация ДНК*' из учаемых клоцов, В качестве зонда

• "К?

использовали плаэмидную ДНК, меченую Р. На радиоавтографе

уровень интеграции в образце со вставкой {psvzneo-рлвв) был

примерно в 2 раза выше, чем з контроле, что соответствовало*

табличным данным по частоте трансформации. Это указывало

на усиливающий эффект вставки при ие^носе чужеродней _ ДКК в

культуре клеток CIÎ3B я FBT. Таких образом, следует полагать, что повторяющиеся последовательности рДНК человека имеют определенную гомологию в случае с экспериментальными культурами клеток. Введение конструкций, содержащих умеренные повторы,

способствовало повышению уровня встраивания чужероднях генов.

Таким образом, изученные вами экспериментальное клеточные скстены являются удобной моделью для иллюстрации феномена экслрессии чужеродных геков~в клетках млекопитающих.

• • взводы '

1. В р езультате проведенных на культурах клеток сгяъскохозя&ствеиииих животных СПЗВ - t. FBT испытаний трансформирующих конструкций с включением последовательностей neoHlacS получены клетки, обнаруживающие эффект поглощения чужеродной ДНК ш экспрессию кодируемого продукта.

2-Разработанный способ непосредственного нанесения экзогенной ДНК ма слой 1Слеток, культивируемых in vitro, позволяет до 50 ра? noïHCHTb уровень экспресия генного продукта по сравнению с кальций-фосфатвш! методом трансфекцкн.

3. В опытах по трднефекцхи на культурах клеток СПЗВ и R9T испытанные: промоторы в составе плазмил pHSV-lacZ и pOW-XacZ не проявил* сколько-нибудь существенных различий по уровне экспрессии rena'lacZ.

Д. Анализ компетентности клеток в зависимости от длительности культивирования к поглощению м экспрессии чужеродных генов показал, что наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в линиях клеток ?2Т и СПЭБ на 3-5 пассажах последовательного их

субкудьтивирояангш - Зх1СГ5к 9k1G"s. -'■.-■

5. С покощьо кальций - фосфатной' методики трансфекцси протестировав дза плазмй&и j.iSV2neo и pSV2nao со вставкой рибосомкшс повторов ** рАВВ. Устакозлепо, что примерно в 2 раза более эффективной для получения генетически трансформированных клоков клеток является плазнвда со вставной рАЕВ (pSV2neo-pABB).

пршическкг предложения

1.Предложен для использования в лабораторшк работок по изучении трансформации культур клеток новый способ трансакции за счот непосредственного нанасенпя раствора чуяеродной ДНК ил иочосдой клеток с последуем ^ наложением покровного стекла ко форме чаши.

Изданы "Католические ^рекохе^едацик во введение экзогс;шой ДНК ялаэмнд а культуру клеток сельскохозяйственных жзвотних1* 1994 г,

2.Реком««дуется использовать лив sí и клеток СКЗЗ к НОТ в качество 'тест - обье::т0э яря отборе генных г инструкций, предназначенных для создания траксгенншс шаотних.

3. Провести раеиареайое' испит акав ■ до лекуляркой встаЕкк рнбосомального повтора х,рЛВВ и качестве усилителя процесса интеграции генной конструкции. с cocíase гецоиа реципнеит;<о>£ клетки. ■ , . ' -

: СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Й.П.Савченкова, Н,Й.Сергеев,И.Я.Янхови Н.Е.Айтбаев -\„<Яетоднческие рекомендации по введению экзогенной ЛИК плазнид в культуру клеток с.-■■'*. вивотвых» - ВИЯ, 1993 г.

2.Н.Е.Айтбаев. Компетентность клеток СЛЭВ и FBT к поглощения экзогенной ДНК в зависимости от длительности культивирования.

' * . i ' s

Сб.науч.тр.ВИ1,1994 г,с.3*4.

3. И.П.Савчзнко аа, Н.И.Сергеев, И.Я.Вихов, Н.Е.АЙтбаев Экспрессия гена LacZ E.coll в культурах к леток с.-х. ашаотннх. Тезисы докл."Новые направления биотехнологии".- Пущино, 1994 г,с.144. ■ . ; j . \ / '

4-Савченкова И.П., Сергеев :Н.И. , АЙтбаев Н.Б. Сравнительный анализ развития предимплантацнцнншс эмбрионов кролика In vitro на различных монослоях соматических клеток.- Цитология, 1994г. ЙГшйити, : ..-'':.*