Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тестирование генных конструкций в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и трахеи эмбриона крупного рогатого скота (FBT)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Тестирование генных конструкций в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и трахеи эмбриона крупного рогатого скота (FBT)"



всероссийский научно-исследовательски'!"! институт

животноводства (вия)

¡¡а правах рукописи

Лйтбасз Нурлан Ергоноаич

ТЕСТИРОВАНИЕ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ПОЧКИ ЭНБРИОНЛ СВИНЬИ (СПЭВ) II ТРАХЕИ ЭМБРИОНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (КВТ)

03.00.13-Физиология человека и пизотнич

АВТОРЕФЕРАТ диссертации «а соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московской области 1994

Работа выполнена в отдало биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор И.Я.Шихов, кандидат биологических наук, И.П.Савченкова Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.П. Кононов , кандидат биологических наук, И.Л.Куликова Ведущее учреждение ■ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится февраля 1995 года

в 10 часов на заседании специализированного Совета Д.020.16.02. при Всероссийской научно-исследовательском институте нивотно-водства. •

Адрес института: 142012, Московская обл, Подольский р-н,

поселок Дубровици С диссертацией,момно ознакомиться в библиотеке ВИЖ Автореферат разослан "^У " Л-^^у^А^ 1991" г.

Ученый секретарь специализированного Совета,

доктор биологических наук П. <\. Науменко

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

йКТУЗЯЬВОСГЬ.теУИ. Актуальность работ по генетической трансформации соматических клеток с культуре связана с изучением и моделированием процессов функционирования чужеродных генов в организме хозяйка, а также с практическими задачами производства генио-инженерных белков(гормонов, ферментов, интерферонов, интерлейкиноч, различных антигенов) , синтез которых в прокариотных клетках и дрожжах остается часто незавершённым. Прокариотические системы имеют ряд недостатков. Это - отсутствие в них ферментативных систем, обеспечивающих посттрансляционкке модификации (гликозилирование, фосфорилирование, образование бисульфидных связей) в процессе синтеза белков.

Рекомбинантные белки, получаемые в микроорганизмах, чаще синтезируются в нерастворимом виде, как тела - включения в цитоплазму клетки- продуцента, что осложняет их выделение и очистку.

В последнее время предпринимается попытки ввести чунеродную информацию в организмы с целью получение нивотных с экзогенной генетической информацией (трансгенные вивотные). Ряд результатов , полученных на лабораторных нивотных (стимулирование роста, коррекция наследственных дефектов роста и иммунной системы, индукция стабильных .и нестабильных мутаций, синтез и секреция в кровь и в молоко физиологически активных белков), при воспроизведении на сельскохозяйственных нивотных могли бы стать основой для новых биотехнологий и генетико-селекционных методоЕ. Однако, попытки воспроизведения этих результатов на сельскохозяйственных животных натолкнулись на серьезные

трудности.

Для того,чтобы использовать трансгешшх животных в биотехнологии , необходимо изучить факторы, от которых зависит тканеспецифкчность экспрессии чукеродных генов .чтобы контролировать уровень выработки нужного продукта.Необходимы дальнейшие исследования , направленные на изучение проблем взаимодействия генома соматических клеток • с чужеродной генетической информацией.

Изучение свойств рекокбинантной ДНК и способности к экспрессии в культивируемых клетках открывает возможности для анализа чужеродных генов до введения их в организм животных.

Все эти причини требуют дальнейынх работ по отработке способов эффективного ппедения ДШС в клетки млекопитающих, в ток числе сельскохозяйственных животных, культивируемых In vitro, и созданию стабильных клонов клеток с генетически трансформированным фенотипом.

Црдь.и.задача..иссзедорзиий.-Целью настоящей работы являлось изучение возможности. тестирования рекомбинантных генных конструкции в качестве трансформирующих факторов в культуре клеток сельскохозяйственных ¡з:нвотных(СПЭВ и FBT). Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи; 1.Поиск и отработка оптимального метода введения чужеродной ДНК в геном клеток сельскохозяйственных животных культивируемых In vitro. _

2.Проведение сравнительного анализа эффективности разных методов трансфекции культур клеток при использовании репортерного гена lacZ E.coli, поставленного под контроль промоторов RSV и CMV.

-з-

3.Проведение трансфекции клеток сельскохозяйственных нивогных (CI13B,FBT) и изучение компетентности клеток к поглощению экзогенной ДНК в зависимости от длительности культивирования .

4.Изучение экспрессии маркерных генов в составе различных векторных систем в генетически трансформированных ¡слонах клеток FBT и СПЭВ.

UayvU3.3.liOBB3B5x в целях испытания векторных конструкций в модельных опытах на культурах клеток был впервые применен предложенный научный руководителем новый способ введения рекомбинаитнон ДНК посредством нанесения раствора препарата на монослой клеток с последующим давлением за счёт наложения покровного стекла, по форме чашки Петрн. Научная новнзна подтверждена соответствующей заявкой на изобретение "Способ введения экзогенных ДНК плазиид с культуру клеток млекопитающих, культивируемых In vitro" заявка NO93038111, приорегет от 26 июля 1993года.

В проведенных исследованиях впервые показана возможность усиления _ процесса . интеграции чуаеродной ДНК с последующей экспрессией введенной в живогнуи клетку генной конструкции за счёт встраивания в конструкцию фрагмента рибосомалыюй 28S ДНК человека (рАВВ).

ВрзкТИЧес«8Я-Це8В0СТЬ:Апробированы методы кальций-фосфатной преципитации и сновый способ> введения экзогенной ДНК в клетки сельскохозяйственных hjibothux(CI13B,FBT) , которые могут быть использованы при тестировании генных конструкций в культуре клеток. Разработаны "Методические рекомендации по введению экзогенной ДНК в культуру клеток сельскохозяйственных нивотных".

Утверндены ученым советом ВИНа, 25 ноября.1993г.

Рекомендуется использовать клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ)и трахеи эмбриона крупного рогатого скота(ГЕТ) для генноинженерных работ - ,как клетки компетентные к восприятию чужеродной генетической информации.

¿иРООзция.раОотУ.Иатериалы диссертации доложены и обсуждены на Ученой совете ВИЙ, ноябрь 1993г.; на 6-ой конференции Росссийской Федерации «Новые направления биотехнологии>24-26 мая 1994г,г.Пущшго; на лабораторном совещании в секгрре ■ клеточной инженерии отдела биотехнологии ЕШ,1994г;

ПубвтеоишкПо теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

0б1>еи.и.структура.диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и практические предлояег:ш. • Работа иллюстрирована 7 таблицами и 11 рисунками . Список литературы соде раит 159 источников (на русском и иностранных языках).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследовании, В работе в качестве объекта для трансфекции использовали перевиваемые линии соматических клеток трахеи эмбриона чкоров (ГВТ) предоставл&шше институтом вирусологии ни Д.И Ивановского РАМН и почки' эмбриона свиньи (СПЭВ) любезно предоставленные прфессором Л .П Дьяконовым (ВИЭВ).

В качестве векторного материала использовали линейную

генную конструкцию рИБУ-Хасг, собранную на векторе рис 19 из

PVUII-BstHI 3'-концевого фрагмента вируса саркомы Рауса длиной 584 п.н..включающую V3 и STR последовательности длинного концевого повтора: BstIII-PstI. Рзстрикты гена lacZ длиной 3063 п.н.из лактозного оперона E.coli и Pstl-Kpul З'-концевого участка гена гормона роста быка длиной 786 п.п., содержащего сигналы сплайсинга, полиаденелировання и термшации транскрипции. Для микроинъекции использовали Hind III-EcoRI рестрикт, длине.; около 4,5 т.п.и., . лишенный прокариотической векторной части(рис 1).

Использовали .генную конструкцию pCMV-lacZ кольцевой формы также содержащую бактериальный ген lacZ .поставленный под контроль промотора цитомегалоаируса. Размер конструкции составляет 8,7 т.п.н. (рис 2). Выиеуказашше конструкции предоставлены институтом молекулярной биологии РАН.

Использовали генную конструкцию pSV2neo с геном резистентности к антибиотику генетицину (G41B). Данный вектор имеет кольцевую форму и состоит из участка плазмиды pBR322, последовательностей вируса SV40 (области ранних и поздних генов,ранних и поздних вирусных промоторов,и участка полиаденилирования и терминации транскрипции) и бактериального гена неомицинтрансфе-разы neo, являющегося генетическим маркером трансформированных клеток.Размер конструкций составляет 5.6 т.п.н (рис 3).Генная конструкция предоставлена ВНИИ сельхозбиотехнологии.

Использовали генную конструкцию pSV2neo-pABB, созданную в лаборатории по изучению трансгешшх животных к.б.н.

А .В.Чичиловым. Была взята плазмида psvzrico и фрагмент рибосомальной ДНК человека рАВВ (Образец ДНК-повтора был

Н1псШ1

С1а1

Бас! РуиП

ЕсоЯ!

вел ЕсоКЕ ВБИ Бша1

1 1 1-1|

Крп

1 рис 19

Н юоп.н

промоторная часть

1асг

3>ро1у(Л) в йН гена

Рис.1. Векторная конструкция рК8У-1асг

.БяШ Кра!

Рас./.. Векторная конструкция рСМУ-1асг

S.ö ■ Eeoïï 1

Pst утр 1

Leo Ш

4 A ^

Fvu np¡J-

5phl Hind Ш П

Рис.3. Векторная конструкция pSV2-neo

. ' Tit I-Жшр

Ii у

■ - '5.6 Ecop 1

5,Sr 1 Xy.......з

Ma a

_ sdïi 1

Fvu II -

Hiad Ш Ъ&1 II

Рис.4. Векторная конструкция pSV2neo-pÀ33

любезно предоставлен доктором блол.наук JI.H. Гиндилисом) .С целью получения препарата рекДНК била проведена трансформация пгамг'.а НВ101 и из полученной биомассы выделена плазмида в количестве 3 мг. Рестрикция и лигирование фрагмента проводились по Маниатису Г. (рис 4) .

В качестве ДНК-носителя в экспериментах использовали ДНК сперны лосося("Бегуа").

Для культивнроваиия клеток в качестве ростовой среды использовали яидкие среды AMEfí(Serva) ,а-МЕМ (Sigma) Игла (Flow). Для промывочных работ использовали раствор Хенкса, изготовленный в Московском институте вирусных вакцин и препаратов. Также солевой раствор па основе фосфатного буфера (PBS) рН=7,2-7,4.

В экспериментах использовали ■ эмбриональную телячую сыворотку (FCS), производства фиряы Serva и института вирусологии 'им.Д.И.Ивановского.

Для снятия клеточного монослоя: и трипсинизацги культур клеток использовали раствор трипсина (0,25У.) на растворе Хенкса без кальция и магния рИ=7,8 и раствор версена 0,02%-ный (ЭДТА) рН=7,2. -

Для замораиивания клеточных линий в качестве криопротектора использовали глицерин отечественного производства и

диметилсульфоксид фирмы Serva. Концентрации клеток определяли по стандартным методикам . . \

' Декоиташшац'ип культур клеток от микоплазн проводили по методу разработанному.И.Л.Куликовой (1988).

Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом , а также с помощью <нового способа>, отмеченного выше.

-д.

Селективный отбор клеток, трансформированных генными конструкциями рЗУ2пео и рЗУ2пео-рАВВ осуществляли в, среде с антибиотиком С418. Степень экспрессии определяли по частоте трансформации т.е отношением числа образованных грансформантов на число использованных клеток.

Для выявления продукта экспрессии гена 1асИ мы использовали в качестве субстрата к £-галактозидазе. Наличке экспрессии интегрированного гена 1асг определяли на 2-ой день по цветной реакции, обусловленной присутствием нерастворимых синих кристаллов хромофора . Степень экспрессии гена определялась .анологично : частоте трансформации - отноаениен числа образовавшие« трансформантов в процессе селекции к общему количеству клеток взятых для трансфекции, но,в отличие от последнего~вь1ракадась в процентах.

Анализ ДНК выполняли с помощью дот-гибридизации в

лаборатории по изучению тракегенных животных ВИЙа. Суммарную

ДНК зыделяли из клеток согласно известной прописи . ДНК

денатурировали щелочью и наносили точки на капроновый фильтр

("Хийу Калур").фиксировали пр<г 80°С в течение 2 ч в вакууме и

ч?

гибридизовали с фрагментами плазмиды,. мечеными Р с помощью реакции ник-трансляции.

Принципиальная схема эксперимента представлена на рис.5.

Результаты экспериментов документированы микрофотографиями.

Цифровой материал обрабатывая^ биометрическим методом.

-ю-

СХЕНЛ ■ЭКСПЕРИМЕНТА Генетическая трансформация клеток:

СПЭВ

РВТ

Векторные конструкции:

Метод генетической трансформации.

Кальций-фосфатная преципитация

Предложенный* новый способ введения чужеродной ДНК

Отбор трансформированных клеток с геном пео на селективной среде 4

Молекулярно-генетический анализ трансформированных клеток

Рис.5.

- 11 -

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3,1. Характеристика клеточных линий Исследования проводили на перевиваемой линии клет-ок трахеи эмбриона коров(ИЗТ). Эти клетки морфологически представлены эпителиоподобными и полигональными структурами. Они имеют округлые ядра ,ядрыски крупные ,от одного до нескольких в ядре.Встречаются клетки и ядра больиого размера . Цитоплазма зернистая. Модальный класс хромосом составляет 50 (рис 6);

Низнеспособность клеток после оттаивания 84%.

3(1

20

10

46 47 48 49 50 51 52 53 Рис 6. Модальный класс хромосом клеток Б*ВТ по оси Х-число хромосом (кариотип) по оси У-количество клеток. Вторая линия это перевиваемая линия почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Они также представлены эг.ителиоподобкими структурами. Имеют крупное ядро (до 60% размера клетки), по площади превышающее размер цитоплазмы.Ядра клеток содержат от 2 до 4 ядрышек.В цитоплазме иногда мо/йно встретить включения в виде липидных гранул.Края клеток относительно гладкие.Модалмчм класс хромссом составляет 40 _(ри? 7). Жизнеспособность пос.г.> оттаивания 76-80%.

и_L

-1270

60

SO

40

30

20

10

О

35 .36 3? 38 39 40 41 42 Рис 7. Модальный класс хромосом клогок СПЗВ по оси Х-число хромосом (кариотип) по оси У-количество клеток. 3.2.Введение гена LacZ E.coli в культуру клеток 3:2.1.Опыты по разработке нового метода трансфекции Для проведения опытов были использовали культуры клеток трахеи эмбриона крупного рогатого скота (FBT) и почки эмбрина свиньи (СПЗВ) , Трансфекцию осуществляли с помоцью кальций-фосфатной кетодики , где использовали ' рекомбинантную ДНК плаз пидп pCMVlacZ. _

Временная экспрессия гена lacZ связанная с выявление!! 0-галактозидазиой активности в трансформированных клетках, била обнаруяена на 2-й день после проведения трансфекции по образованию синих бляшек в присутствии субстрата X-gal.

Оптимальное время инкубирования культивируемых клеток в

растворе экзогенной ДНК, при котором наблюдалось экспрессия трансгена составил 40-60 шшут(таблица 1).

Были проведены ряд экспериментов по трансакции клеток с различными концентрациями ДНК; результаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Оптимальная концентрация ДНК rip:: которой достигнут наивысший эффект был на уровне 20 мкг/мл , где pCMV-lacZ занимает 2 икг/ил, ДНК -носитель - 1Снкг/мл(сперма лосося).

ilasm многочисленные исследования присели к выгоду, что в болызинстЕе используемых методов трансфекции леьшт один и тот Ее принцип: для 'того чтобы чужеродная ДНК проникла б клетку необходимо частичное нарушение клеточной мембраны. Исходя нз этих наблюдений, предлокен простой доступный л легко воспроизводимый способ введения экзогенной ДНК-плазкид в культуру; клеток.

Поставленная цель достигается тем,что предложен способ ("Нопый способ"), согласно которому клетки млекопитающих, культивируемые in vitro, придавливают покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя u PBS буфере, содержа:, -ул экзогенную ДНК в концентрации 10-40 мкг/мл .стекло убирают , а клетки инкубируют (в буфере с донорской ДНК) в течение 40-60 шш при 37°С.

За день перед трансфекцием клетки рассовали в чайки Петр;;,с диаметром 3,5 см в концентрации 104/смги инкубировал;; прк 37°С в течение ночи . Непосредственно перед трансфекцией клетки промывали буфером PBS рН=7,2 2-3 раза. Переосаждалп двух-крлтнэ в 70° этаноле при 5 тыс .оборотов в течение 15 мин донорскую ДНК

it растворяли в буфере( 0,1к!1 ЭДТЛ, 1иМ трис-1!С1 ,рН~-8,0),а затем добавляли к клеткам , находящемся в P3S до конечной концентрации ДНК 10-40 мкг/мл. Клетки в растворе с донорской ДНК накрывали стерильным покровным стеклом и придавливали перпендикулярно поверхности моиослол рашюмернган , кругоеими двиаеш'яии. Затем пскрсзкое стекло удаляли, т клетки иккуСнровагл при 37°С с 5%С0г 1 этсч рас:г:орс я ч'йчскге 40-бСипн. После этого клетки тпат^льзо прс:глэгли бу!-?ром PBS 3 раза л среду пеняли па ".орн^Лгнуг. ростов\п среду.

Утзаэя.-тнз, что оптимальное время инкубирования яудмааируекяч ;<г.-}?ск з растасрэ экзогенной ДНК, при котором аабдэдао? сл жспрессч.ч трапегенп, составило от '10 до 60 минут { гг.5л U. И*--:-) этого значения экспрессия трансгена не 1.зо."сда.г::'.сь, при более длительной инкубации клеток в растворе с ДНИ наблюдалась гибель клеток.

Таблица 1

Зчзпсаг'петь :>,ь;ектионосги временной экспрессии гена lacZ з им'тннх СГЮ8, FBI' , культив'лруомых In vitro, от

чреиенк инкубации я ратвора с экзогенной ДНК

Скосов- Количество клеток продуцирующих р-галак.(%)

Вр»кч ипкубаш'И tnr" час

30 ] 40 _ i 60 90 16 1 24 i

К - 0, В 3 1 Иоьый способ • 34 53 17

Результатьг' опыюа показали тгл-ке, что оптимальный уровень концентрации экзогенной (донорской) ДНК в буфере PES составил 10-40 ккг/кл (табл 2). При величине этого показателя нике и выае отмеченного уровня экспрессия трансгена не была установлена.

Таблица 2

Эффективность временной-экспрассмк гена lacZ в платках СПЭВ , FBT, культивируемых In vitro, от конечной концентрации экзогенной ДНК в растворе

Способы Количество клеток продуцирующих р-галак.(К)

Концентрация ДНК (мкг/нл)

5 10 . 20 30 40 60

Кальций-фофатный - 1 3 2' 0,8 -Предложенный Новый способ - 21 50 34 ' 15

3.2.2. Сравнительный анализ временной экспрессии гена lacZ поставленного под контроль разных промоторов при использовании разных.методов трансфекцни в культуре клеток селькохозяйствекных ¡«квотных Для проведения опнтор по введению трансгена в культуру клеток использовали кольцевав форш ДНК плазмяд:

pCMVlac" содеряащуз ген lacZ E.Coll под контролем промотора цитомегаловируса , pRSVlacZ, где этот гза ген поставлен под контроль промотора длинного концевого гмптора вируса сар;:окы Рауса к ДНК спс'риы ласося/Sigr.a/. В спыта использовали клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ)и клетки трахеи эмбриона коров(РВГ),

Трансфекцию осуществляли двумя методами: кальций-фосфатным и предлозенным нами Новый методом.

Определение р-галактозидази слузит хорошим контролем за компетаптностьо клеток. В назих экспериментах клетки СПЭВ я РВТ показала достаточно хоропую чувствительность к поглощению и зиспросскн экзогенной ДНК плазнид. Когда клетки трансфецировали клльций-фосфатным способом било выявлено 0,8 - 3 У. клеток яродуцирувзих р-галактозидазу от общего количества клеток, пспользуекых з опыте. При использовании предложенного нами способа количество клеток, экспрессируюцих ген 1ас2, повидалось ло 38-53".

Таблица 3

Сравнительный анализ эремепной экспрессии гена 1ас-г потавлснного под контроль разных промоторов при использовании разных методов трансфекции в культуре клеток с.-х яивотиых

Культург Кальций-фосфатный метод Новый способ

клеток

Количество клеток продуцирующих fj-галактозидазу (%)

~CMVlae~Z P'iSV] ac-Z рСМV1 ac-Z | pRS'/lrfc-Z

С'ПЭВ 2 0,8 38 40

г ВТ 1 п 53 27

Срайнитслышй '.кализ временной экспрессии продукте«; гена lacZ F.coli з клеточных линиях, трансфецяруемих разними методами яскэз.'м.чтг» Нет:й способ ярляе/сл не только простым, но и более . Иг/,шй способ првросхсдит кальций - фосфатный по колз'к-стяу глеток, поглощающих экзогенную ДНК к экс.прессирующих

чукеродний белок в средкаи~"по всем типам исследуемых клетск в 50 раз.

Экспрессия бактериального 'гена в клетках млекопктаюцк;; мояет слуаить гестом на активность промоторов в эукариотических векторах. Приведенное в таблице данные свидетельствуют о ток. что существенной разниц« кекду уровнем бслкозого синтеза е зависимости от характера ипользованных нами про:.;отороЕ, контролирующих соответствующий ген не существует .

3.3. КОМПЕТЕНТНОСТЬ КЛЕТОК СПЗВ И FBT К. ПОГЛОЩЕНИЮ

ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ . КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IM VITRO

Для проведения эксперимента били использована две перевиваемые клеточные линии: клетки почки эмбриона свиньи /СПЭВ/ и клетки трахеи эмбриона коров/FBT/.Для трансфекции использовали клетки-на разных этьпах субкультивироЕання:2-3, 5-7, 15 и 20-22 пассажах. В опыте использовали рекомбинантную ДНК плазкида pCMV-LacZ, кодирующую р-галактозидазу E.coll. Трансфекцюо осуществляли с помощью кальций-фосфатной методики. Продукцию бактериального гена /з-галактозидазы выявляли в клетках на следующий день писле-проведения трансфекции.

Наиболее ьысокую степень поглощения экзогенной ДНК показали клетки.которые перед трансакцией находились на 3-7 пассаже последовательного еуЁкультнвираванияСтаблица 4).Эта закономерность наблюдалась для обоих клеточных линий. Так количество клеток СПЗВ поглотивших и :л.1'.нр<:с".:ируквдх ¡3 - галактозидазу на 3-7 па ссаке достигало до 3X ,а клеток ?ВГ до 5%. С увеличением длительности культивирования клеток этот

показатель значительно снизался до 0,5-1% .

Таблица4

Количестзо клеток поглотивших и экспресснрующих /з-галактозндазу з зависимости от длительности культивирования клеток In vitro

Культура клеток Номера пассажей

3 J 5 j . 7 1 9 ■ 1 1 1 15 20

СПЭВ ?зт 4х10"5 IxlO"5 10'5 ^ 10'5 10"6 ЭхЮ"5 9х10"5 5x10 2х10"5 2x10® 10'6

3. 4..ЭЛИМИНАЦИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ Получены клони генетически трансформированных клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) и клеток трахеи эмбриона коров (FBT) в

ч

которых обнаружен продукт экспрессии гена lac-Z, fi- галактозидаза.

Для котрансфекции использовали рекомбинантные-ДНК плазмид pSV2-neo, pCMVlac-Z и ДНК спермы лосося. Трансфекцию клеток проводили кальций-фосфатным методом, селекцию трансформантов осуществляли в селективной среде .содержащей

генетицин(С-418).Для выявления наличия в клетках продуктов экспрессии гена lac-Z E.coll использовали в качестве

.✓субстрата к (з-галактозипазе-.

Результаты ыитохииическогс анализа показали , что не все клоуы исследуемых клеток с пео^ фенотипом зкспрессировали ¡2 - галактозидазу. • Так из 2о клоноз клеток СПЭВ с фенотипом пео+ в 3 клонах была выярлена экпрессия <г-^алактозидазы. Из 36 клонов

клэток ИЗТ с фенотипом пео+ только с 5 - ™п была обиаруяена продукция экспрессии гена 1ас-2. Экспрессия р-галактозидазы с пео-резистентных клонах клеток РБТ достигала 30;.',а ¡слегск СПЭБ соответственно 23Й.

Наблэдаля изменение экспрессии р-галактозидазы в исследуемых клетках клонов-трансформаитов с пео+ фенотипом при непрерывной культивировании в течение 5-ти пассаией до 3-5% ккеток(рис 8).

— Series 1 *— Series Z ~ . .

' ■ - - V '

Рис.6. Динамика экспресс« гона lacZ в неорезистектных клонах, клеток. К -иемгра 'пгссаней, y- % экспрессируюцих клеток Клетки: серия 1 -СПЗВ, серия 2 -FBT.

-203.5. Тестирование генных конструкций pSV2neo и pSV2neo-pABB на способность к экспрессии в культуре клеток сельскохозяйственных кшвотнах 3.5.1. Подбор селективных условий В экспериментах по трансформации клеток чужеродными генами сходит этап отбора или селекции из сбг,ей клеточной популяции тех клеток, которые кнлпчилч чужеродную ДНК. Это потребовало проведения цитогокснческсго теста культуры на различные дозы антибиотика.

Гибель клеток начиналась па- 5-10 сутки культивирования з ергле содйрпацен G418. Ко кере увеличения концентрации антибиотика, начиная со 100 нкг/мл клетки реагировали на его присутствие. и ут-:е при концентрации 600 мкг/мл почти все клетки з чашке погибали.

Таблица 5

Устойчивость клеток FBT к различным концентрациям геиетицина

Кс.чц-я клеток на с.,2 Титр 0418(мкг/мл)

100 200 300 400 500 600 700 800 900

103 ^ + 3x103 -1-5х103 + 104 +

Руководствуясь минимальной токсической дозой генетицина для клеток 1БТ, ми установили его рабочую концентрацию для селективных сред -600 мкг/мл (таблица 5)., а для клеток СПЗВ 500 мкг/мл таблица 6

+ + + +

+ 4- + +

+ -i- . + +

+ + + 4 4-

Таблица 6

Устойчивость клеток СПЭВ к различным концентрациям геиеткцика

Концентрация клеток на СИ2 Титр G418(ь;кг/мл)

100 2.00 300 400 500 600 700 800

103 + -i- .+ + .... ЗхЮ3 +■ + + ' + - - - -SxlO3 + + ■(- + + ю'5 + + + + tí""

+ - наблюдается пролиферация клеток - - гибель всех клеток

i - частичная гибель клеток

3.5.2.Экспрессия генных конструкции pSV2neo и pSV2neo-pABB в культуре клеток , Выявление экспрессии гена neo плазмид pSV2neo и роУ2пзо-рАВБ основано на использовании доминантной системы селекции .Она заключается в ток , что в селективной среде-выживают и образуют колонии только клетки трансформированные чужеродным геном . Гея neo при его экспрессии кодирует фосфорибознлтрансферазу, который ингибирует действие антибиотика G418 . Клетки, не поглотившие этот ген, погибают в условиях культивирования в селективной среде.

Начало образования колоний отмечали на 14-16 деш культивирования . На 21-и день, как правило, во флакон? оставались только те клетки , которые инкорпорировали чужеродну1 ДНК. Можно было наблюдать плотные колонии трансгениых клеток

имеюцие неровные , резкие .иногда обрывающиеся края. Клетки очень плотно прияаты друг к другу.В центре такие колоний имеют скопление многослойного роста . Трансформированные клетки обладают вис око Г; митотической активностью.

Выла проведена серия экспериментов по трансфекции клеток с использованием плазмид р372пео и р372пео-рАВВ.В результате частота трансформации плазмиди рБТ^пео с фрагментом рибосомаль-пой ДНК (рАБВ) было в 2 раза вале, чем в контроле ( табл 7).

Таблица 7

Получение генетически трансформированных клеток СПЭВ и НЗТ с

использованием плазчид p5V2-neo и pSV2neo-PABB

Получено клонов клеток,устойчивых к G-4I8

pSV2neo pSV2neo-pABB

Всего Частота Всего Частота

трансформации трансформации

СЛОВ 15 29 бхю;^

F3T 21 5x10 44 9x10

3.5.3.1'олекулярно-теистический анализ трансформированных клеток СПЭВ и FBT

С целью тестирования на наличие гена пео била проведена

Дот-ги б ридкз а ция ДНК из у чае них кленов. В качестве зонда

32

использовали плазмндную ДНК, меченую Р . На радиоавтографе уровень интеграции в образце ' со вставкой (р2К2пео-рлвв) бил примерно в 2 раза выше, чем в контроле, что соответствовало табличным данным по частоте, трансформации. Это указывало па усиливающий эффект вставки при переносе чужеродной ДНК ь

культуре клеток СПЭй и' F3T. Таким образом, следует полагать, что повторяющиеся последовательности рДНК человека имеют определенную гомологию в случае с экспериментальными культурами клеток. Введение конструкций, содеркацих умеренные повтори,

способствовало повышению уровня встраивания чужеродных генов.

Таким образом, изученные нами экспериментальное клеточные системы являются удобной моделью для иллюстрации феномена экспрессии чужароднмх гонов в клетках млекопитающих.

вшоди

1. В р езулмате проведенных ка культурах клеток сельскохозяйственшшх кнвотных СПВБ ,и РВТ испытаний трансформирующих конструкций' с включением последовательностей neo и lacZ получены клетки, обнаруживающие эффект поглощения чунеродной ДНК и экспрессию кодируемого продукта.

2.Разработанный способ непосредственного нанесения экзогенной ДНК на слой клеток, культивируемых in vitro, позволяет"до 50 раз повысить уровень экслресин генного продукта по сравнению с кальции;фосфат!Ш;.: методом трансакция.

3. В опытах по трансфакцкн . на' культурах клеток С ГШ и FBT иегшташше промоторы в составе плазмид pRSV"lacZ и jiCMV-lacZ не проявили сколько-нибудь существенных различий по уровню экспрессии гена lacZ.

4. Анализ компетентности клеток в зависимости от длительности культивирования к поглощению и экспрессии чужеродных генов показал, что наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в линиях клеток.FBT и СПЭВ на 3-5 пассажах последовательного их

-24-

субкультивирования - ЗхЮ"5!! 9xl0~s.

5. С помощью кальций - фосфатной методики трансфекции протестированы две плазшда pSV2neo и pSV2neo со вставкой рибосошшх повторов -рАВВ. Установлено, что примерно в 2 раза более эффективной для получения генетически трансформированных клонов клеток является ллазмида со вставкой рЛБВ (pSV2neo-pABB).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1.Предложен для использования з лабораторных работах по изучению трансформации культур клеток новый способ трансфекции за счйт непосредственного нанесения раствора чужеродной ДНК на монослой клеток с последующим наложением покровного стекла по форма чашки.

Изданы "Методические рекомендации по введению экзогенной ДНК плазнид в культуру клеток сельскохозяйственных животных" -ВИИ, 1994 г.

2.Рекомендуется использовать линии клеток СПЭВ и FBT в качестве тест - объектов при отборе генных конструкций, предназначенных для создании трансгенлых янвотных.

3. Провести расиирелное испытание молекулярной вставки рнбосо.чального повтора рЛВВ в качестве усилителя процесса интеграции генной конструкции в составе генома реципиентнон клетки.

-25-

список опубликованных РАБОТ

1. И.П.Савчешсова, Н.И.Сергеев, И.Я.Шихоп и Н.Е.Айтбаев

- «Методические рекомендации по введению экзогенной ДНК плазмид в культуру клеток с.-х. нивотиых> - ВИН, 1993 г.

2.Н.Е.Айтбаев. Компетентность клеток СПЭВ и FBT к поглощению экзогенной ДНК ь зависимости от длительности культивирования. Сб. науч. тр. ВИЯ!, 1994 г,с.3-4.

3. И.П.Савченк о ва, Н.Н.Сергеев, И.Я.Иихов, Н.Е.Айтбаев Экспрессия гена LacZ E.coll в культурах клеток с.-х. животных. Тезисы докл."Новые направления биотехнологии".- Пущцио, 1994 г,с.144.

4.Савченкова И.П., Сергеев Н.И., Айтбаев Н.Е. Сравнительный анализ развития предимплантациошшх эмбрионов кролика In vitro на различных монослоях соматических клеток,- Цитология, 1994г. В печати.