Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль трансформирующего фактора роста-бета в регуляции пролиферации культивируемых клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль трансформирующего фактора роста-бета в регуляции пролиферации культивируемых клеток"

украинский научно-исследовательский институт физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

СУШЕЛЬНИЦКИЙ

Сергей Иларьевич

РОЛЬ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА -Р В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Львов — 1992

Работа выполнена в Львовском отделении Института биохимии им. А. В. Палладина АН Украины в отделе биохимии клеточной диффереици-ровки.

Научный руководитель: — кандидат биологических наук СТОЙКА Р. С.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, В. В. СНИТЫН-СКИЙ, доктор биологических наук, М. Д. ЛУЦИК.

Ведущая организация — Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины (г. Киев). 22{ ^

Защита состоится « ^ / > ¿'^Л' 1992 г. в « .» ча-

сов на заседании спецализированного совет? Д. 020. 14.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Украинском научно-исследовательском Институте физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных АН Украины (290034, г. Львов—34, ул. В. Стуса, 38).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Украинского НИИ физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных.

Автореферат разослан «

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

'В. Е. РОБАК

Актуальность пробдошл Трансформирующий фактор роста ß -типа ( TEP-ß) - это лодипептид, который регулирует пролиферацию, дисЭДкреншфовку, а также метаболические процессы у многих типов клеток. Шказако, что в присутствии зпидер-мального фактора роста ок стимулирует субстратнезависимую пролиферацию клеток, полученных из нормальных тканей меаен-химного происхождения, и ингибирует пролиферацию клеток из •эпителиальных тканей, в том числе из опухолей / Roberts А. В. et al. 1983, Moses H. et al. 1987, Sporn M. В. et al. 1987. /. Шханизмы, которые обеспечивают такое стимулирующее или кнгибирутаее. влияние ТФР-ß на клеточную пролифэрацию пока не изучены. Mçxay тем. исследование этих механизмов весьма актуально в связи с предложениями о практическом использовании ТФР-ß в медицине для угнетения роста злокачественных клеток, стимуляции заживления рак и для лечения ряда патологий у животных и человека /Allen J. В. et al. ■ 1990, Joyce M.E. et al. 1983, Nöda M.. et al. 1989, Roberts A. B., Sporn M. B. 1985 /.

Влияние ТФР-ß на клетки ~ мигени связано с функционированием сложной системы регуляторных связей в клетках. Изучение згой системы необходимо ке только для обоснования целесообразности и безопасности применения ТФР-ß в медицине, но и для познания молекулярных механизмэв регуляции пролиферации и диффе еншгровки клеток животных и человека.

Имеется основания считать, что центральную роль в молекулярных механизмах регуляторного действия'полипептидных факторов роста на клетки играит специфичные рецепторы на по. верхности клеток. Регуляшш Функционирования рецепторов ТФР.-З пока недостаточно изучена t Vakefleid L. 1987 /. Недостаточно исследованы и внутриклеточные регуляторные механизмы, определявшие направленность действия ТФР-й на клеточную пролиферацию.

Дель и задачи работы: Исходя из выше наложенного, в диссертационной работе была поставлена цель - изучить осо-. бенности влияния ТФР-8 на пролифэрашю разных типов • клеток

и исследовать некоторые этапы в молекулярных механизмах действия этого фактора.

Для достижения поставленной цеди решали следующие аадачи:

1. Получить высокоочищенный препарат ТФР-8.

2. Изучить влияние Т2Р-П и его комбинаций с ЭФР и инсулином на пролиферацию в- монослое клеток разных литий, полученных из нормальных тканей и опухолей.

3. йсследовать влияние ТФР-й и его комбинаций с ЭФР и инсули"ом на интенсивность субстратнезависимой пролиферации в среде с полужидким агаром у разных типов клеток, полученных из нормальных тканей и опухолей.

4. Изучить регуляцию специфичного связывания Т®-8 под влиянием Э1Р и /или/ инсулина, а также понижающую регуляцию и .^оперативность рецепторов данного ({актора роста.

Б. Изучить влияние ТФР-0 и его комбинаций с ЭФР и иасули-«ом на содержание сАМР и сЗМР в культивируемых ¡слетках исследуемых линий.

Научная новизна: Впервые проведено комплексное изучение действия ТФР-В в комбинациях с ЭФР и инсулином на пролиферацию в монослое клеток, полученных из нормальных тканей и из опухолей, в зависимости от продолжительности инкубации, концентрации сыворотки в кудьтуральной среде и плотности клеток на единицу плоиади в культуре. Обнаружено,- ио коло-ниеобразование у псевдонормальных клеток, культивируемых в среде с полужидким агаром регулируется ТФР-Й и существенно аависит от одновременного действия на клетки ЭФР и инсулина. Характер влияния самого ТФР-В на пролиферацию опухолевых клеток существенно зависит от типа опухоли, из которой были подучены клетки. '

Впервые обнаружена отрицательная неоперативность рецепторов ТФР-0 у клеток линии МЙК-49Р. Изучена трансмодуляция рецепторов ТФР-8 под действием ЭФР и инсулина.

Впервые показано, что ТФР-0 и его комбинации с ЭФР и инсулином влияют на содержание сАМР и сБМР в культивируемых клетках. Обнаружено, что ТФР-й увеличивает в большинстве случаев отношение [сАМРДЛ сШРЗ в клетках.

Научно - практическая значимость работы: Усовершенствован

метод получения высокоочишенного ТФР-Я из тромбоцитов крови животных. С его помоиыо достигнут рнход препарата ТФР-Я, равный около 10 мет из 1 г сырой тромОошггарной массы, что приблизительно в 10 роз выше, чем при использовании ранее предложенных методов / Assoian R. К. et al. 1985 /.

Результаты анализа действия ТФР-fl на пролиферацию клеток разного происхождения указывают на целесообразность исполь-вования ТФР-Й в комбинации с другими полипептидными факторами роста при разработке фармацевтических форм и терапевтических схем, пригодных для клинических целей.

Апробация результатов исследования:. 1.!атериалы диссертации доломаны « обсуждены HaV Украинском биохимическом съезде {Ивано-Франковск. 1987}, Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза" { Харьков, 1987 >, II Всесоюзном совещании по изучению роли морфогенэтически активных факторов в различных процессах { Путано, 1988 >, конференциях молодых ученых Института биохимии им. А. В. Палладн-на АН Украины и Львовского отделения Института биохимии АН Украины 1 Киев, Львов, 1987 - 1988 >, семинарах в Центральном институте молекулярной биологии { Берлин, ФРГ,1990 >,и в Институте молекулярной биологии и физиологии Свободного университета г. Берлина < Берлин, ФРГ,199?. >.

Публикация результатов исследования: to'теме диссертационной работы опубликовано 6 статей и 8 тезисов сообщений.

Структура и обьем диссертации: Диссертационная работа из-.ложена на 147 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", б глав собственных •исследований, обсуждения результатов,. выводов и списка ци-. тированной литературы, содержащего 207 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. Работа илюстрирована 24 рисунками и 6 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

В работе использованы клетки линий MIH-3T3 и. Swiss-ST3 из •эмбрионов мыши, NRK-49F - из нормальной почки крысы, А-549 -из аденокарциномы легких человека. CCL-64 - из карциномы

легких норки, ЯТ-1080 - из Шиброеаркош человека, Ш-103 /клоны Зсб и 384/5 / - ив саскош, индуцированной ишланта-шей полихлорвиниловой пластинки шшам лиюш СВА, СЫО-719С/3 - из яичника китайского хомячка. Клетки линий ГО-103 и А-549 получены из коллекции клеточных культур Института канцерогенееа Всесоюяного онкологического научного центра АМН СССР / г. Шсква /. Клэтки других перечисленных линий получены из коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР / г. Санкт-Петербург /. Клетки линий ШНтЗГЗ, Sviss-ЗТЗ, NRK-4SF. А-549, CCL-64, НТ-1080, СНО-710С/3 культивировал« в среде Игла в модификации Даль-бэкко / ДМЕМ, Flow Lab. „ Великобритания / с. добавлением 10Д или 3% / для клеток линии СНО-719с/3 / сыворотки крови плодов круглого рогатого скота / ДиаЛек, г. Шнек /, а клетки линии ПС-ЮЗ - в среде Игла / ЫЕИ, Flow Lab., Великобритания / т 10Z сыворотки кро.ви крупного рогатого скота /Московский мясокомбинат /. . •

ТФР-6 получали из свежешдедэнньм с помощью дифференциального центрифугирования тромбоцитов крови свиньи. На первом этапе очистки проводили кислого - этанольную экстракцию тромбоцитов / Asoian R. К. et al. 1985 /. Последующие этапы включали разделение полученного экстракта на колонке /8.5х ЮБем /, наполненной Акрилексом Р-30 / Reanal, Венгри. • используя 1U СН^СООН в качестве элюэнта и разделение фракции, содержащей ТФР-fl , на колонке / 1. 3x120 см / , наполненной Акрилексом Р-60, с использованием в' качестве элюэнта 7М мочевины в 1М СЕ^СООН. Биологическую активность ТФР-Û определяли по влиянию на оуботратзависиыую / манослойная культура / и субстратнеаависимую / культивирование в среде с полужидким агаром / пролиферацию клеток линий NRK-49F, N1H-3T3, A-54-d, CCL-64,

Влияние ТФР-3 и его комбинаций с ЭФР и инсулином на пролиферации клеток разных линий в монослое изучали, культивируя клетки в пластиковых 24- или 96-луночных, планшетах /Lnibro, Nunk, США*/ согласно общепринятым методам культивирования. Добавление в культуральную среду факторов роста, сыворотки крови, время инкубации с ними клеток1, инкубация

с радиоактивными предшественниками нуклеотида / -Н-тимидин или^С-тимияин / осуществляли в соответствии с протоколом каждого из опытов. По окончании инкубации определяли интенсивность включения радиоактивной метки в нерастворимую в трихлоруксусной кислоте фракцию клеток / Femamlea-Pol J. А. et al. 198F>, Hamel E. et al 1988 /, используя сциктиляшюн-hbift счетчик MARK III/ Tracor Europa, : Нидерланды /. Poe опыты повторяли не менее 3-х раз с 3 - 4 карательными экспериментами в каждом опыте. В отдельных контрольных опн-тах пролиферативную активность клеток определяли по изменению их количества методом подсчета в камере Горяева.

Лля изучения влияния ТФР-Й в комбинациях с ЭФР и инсулином на проявление трансйхзрмировинного фенотипа использовали тест на клонирование клеток в среде о полужидким агаром, как наиболее адекпатно отображающий степень трансформированное™ клеток / van Zoelen Е. J. et al. 1988 /. В 40-мм чашки 1 ПО "Полим- >", г. Санкт-Петербург / валивали 1 мл среды культивиров дия, содержащей 0.5% агара /Di Fco. США/. Затем вносили 1 ш суспензии теток в среде (сульивкроьания, содержащей 0. 37. агара с добавленными тестируемыми факторами. Чашки инкубировали 10 - 14 суток в (XI, инкубаторе /ГПИ-1. г. Санкт-Петербург / в присутствии 57. С0Ргтри 1002 влажности. lb окончании инкубации в каждой чашке подсчитывали количество колоний диаметром не менее 52 мкм. Каждый опыт повторяли не менее 3-х раз с 3-мя паралельными экспериментами.

'^Г-ТФР-А получали по методу Paint и Рншвшо / Raff Е. . Riszino А. 19(35 / с использованием хлорамина Т. Удельная

I

активность препарата I-T-XP-ll составляла 70-1Б0 мкКл^мкг. Идентификацию .специфичных рецепторов ТФР-fl проводили на

4 ПГ

клетках линии NRK-49F. I-TSP-A ковадентно "сошЕали" со

специфическими рецепторами дисугашнимипилсубератом в лрисутстсии н в отсутствие SCO - кратного избытка немеченого лиганда с после душим разделением белков электрофорезом в градиенте, концентрации лолишериламида / 5 - 10 £ / с добавлением додеиилсульфпта натрия в буферной системе Лэм.ли и

авторадиографией.

Понижающую регуляцию / down regulation / рецепторов ТФР-В

определяли по изменению уровня специфичного связывания 12S

I-ТФР-В после предварительной инкубации клеток в течение ?,-*. часов с немеченым ТФР-В.

[количество специфичных рецензоров ТФР-fl и их сродство к лигаыду определяли с использованием клеток линий А-549 и NRK-49F согласно рекомендациям Вейкфшща и сотр. /Wakefield L. at al. 19В? /. Клетки высевали в 24- или S6-луночные планшеты в среде культивирования. После прикрепления ¡слетки отмывали от сыворотки и добавляли в среду инку-

1

башщ разные количества 1-ТФР-З / концентрации, от 1 до ISO пЫ /. В зависимости от варианта опыта добавляли ,.такке Э.iJ / 5 мкг/мл; Serva / и Сиди] инсулин /1 мкг/мл; Serva/. Для определения уровня неспецифического связывания в отдельные пробы, содержащие 10, 60, 100 пЫ 12Б1-?ФР-Й, добавляли 500 - кратный избыток немеченого ТФР-П. После инкубации клеток в течение 2 часов определяли содержание радиоактивной метки в среде и метки, специфически связанной с рецепторами ГФР-й на клетках, с использованием счетчика

"Сотри-Gama" / LKB, Швеция /. Расчет кинетических парамет-1 p^i

ров связывания I-ТФР-В осуществляли по методу Скзтчарда / Scatohard G. 1949 /.

Для выявления кооперативное!« рецепторов ТФР-С испольво-вали метод, основанный на определении кинетики диссоциации меченого лигаяда в присутствии и'в отсутствие немеченого лиганда / Corln R. Е. et al. 1982 /.

Определение содержания сAMP и cGMP в клетках линий NRK-49F, NIH3T3 и А-549 проводили с использованием стандартного набора фирмы "Amersham Inc. " / Великобритания /. Метод основан на конкуренции немеченых циклических иуклео-тидов в пробе о фиксированным количеством меченых тритиеи молекул с AMP и oGhP за связывание со специфической антисы-ьороткой /' для оСКР / или с высокоспецифичееким евяэывавдим полком / для сАМР /. Концентрации циклических нуклеотидов определяли, используя стандартные калибровочные кривые сог-1 «?но рекомендациям фирмы "Amersham Inc. Для всех линий ic.v-грк каждый вариант опыта повторяли не менее 3-х pas.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Очистка трансформирующего фактора роста Я - типа Получение высокоочикенных препаратов ТФР-А со сих пор яв ляется сложной проблемой, для решения которой необходимо привлечение значительных средств и времени. Принимал по внимание недостаточную эффективность используемых методов, нами усовершенствован один из них для получения ТФР-И из тромбоцитов свиньи. При этом выход препарата был приблизи тельно в 10 раз выше,.чем в других работах по очистке ТФР-й из тромбоцитов / АЗБО^ал й. К. еЬ а1. 1983, А>;.зо 1 ап ЯК. е1 а1. 1985 Такой результат был достигнут благодаря использованию более щадящих режимов обработки препарата ТФР-0 в процессе очистки и благодаря оптимизации условий гельфиль • трашш препарата ТФР-0 на. колонках с биогелями Р-типа.

Тромбоциты свиньи подвергали кислото - этанольиой экстракции и полученный экстракт фракционировали на колонке, заполненной Акрилексом Р-30. В этих условиях ТФР-В элю-ируется с колонки 1 М СНдСООН в зоне элшии белков с молекулярной массой 10 - 14 кДа Такая задержка вызвана его сорбцией частицами Акрилетеа. Фракции с активностью ТФР-8 мы концентрировали частичной лиофилигацией и наносили на колонку с Акрилексом Р-60, используя в качестве элюента 7 М мочевину в 1 М ОЯдСООЯ В этих условиях сорбция ГФР-П на частицах геля устраняется. Препарат ТФР-Р, полученный таким образом, по данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия имеет чистоту более 95 X.

Полученный нами препарат теряет свою активность после воздействия протеинаэ {трипсина или пепсина), литйотреиго-

о

ля. мало чустрителен к прогреванию при БбС 30 мин или 100СС 3 мин, а также не конкурирует с ЭФР аа связывание последнего со специфическими рецепторами ЭФР на клетках линии А-431. Препарат ТФР-й блокирует также цитотоксическое действие фактора некроза опухолей на клетки линии ^929.

табл. 1

Очистка ТФР-В из тромбоцитов свиньи

этапы очистки белок Е%0 + обшая ++ степень выход

<мг> 1нг/мл> активность очистки m

тромбоциты 1. ОхЮ5 - - -

киелото-

этанольный экстр, на 5. 0x103 1.0x103 5-ОхЮ6 •1.0 100

тромбоцитов

Биогель Р-30

■ft М СНдСООН} 2. ОхШ2 45.0 4. 4X106 25.0 88.9

Еиогрль Р-30

<1 М СН^СООН, 7 М мочевина} 1.0 0.5 . 2. ОхЮ6 5. ОхЮ3 40. 0

ь - ЕД^дравна концентрации ТФР-В при которой достигается его

пол/максимальный эффект в ЭФР - аависимой стимуляции коло-ниеобраэования в полужидком агаре клеток линии NJH-3T3 '1 - Условные единицы, определяли как отношение белок {ury/ES^Qlnr/мл}

ЕДцд этого препарата а опытах по стимуляции колониеобра-

&оввния клеток линий NRK-49F, NIH-3T3, Swiss-ЗТЗ составляет 0.6 нг/мл. 0.5 нг/мл и l.'O нг/мл соответственно. ТФР-П ин-гиоирует колониеоОразование клеток линии А-М9 / - 0.1

кг/мл / и пролиферацию я монослое клеток линий А-649 / ЕЛ50 • 0. Б нг/мл / и CCL-64 / ЕДд0 - 0.1 нг/мл /. Это соот-

[■'■Т'-'Тну от полумакоимальным эффективным концентрациям препаратов TIP-1?, полученных другими исследова - елями.

2. Влияние ТЕР-0 и его комбинаций с ЭФР и инсулином на субстратаависимую пролиферацию клеток

При изучении регуляции субстратэависимой пролиферации клеток нами покавано, что направленность и выраженность действия ТФР-В в большей мере зависит от условий культиви-• рования клеток, чем от их типа Установленно, что действие ТФР-В зависит от концентрации сыворотки крови, времени инкубации клеток в присутствии факторов роста, плотности клеточного монослоя, присутствия ЭФР и инсулина.

Так, ь среде с 10 %.СКП'ТФР-8 в концентрации 50 нг/мл ингибирует включение %-т ими дина в ДНК клеток линии NRK-49F в монослое, причем в присутствии ЭФР или инсулина ингибирую-шее действие ТФР-В проявляется при более низких концентрациях, равных 0. б и О. 05 нг/мл соответственно. При более низком содержании сыворотки в среде '{ 0.1 X } ТФР-0 дозоза-висимо стимулирует биосинтез ДНК в этих клетках, инкубируемых в течение 24 часс-. но при увеличении времени инкубации до 86 часов этот эффект практически не проявляется /Рис. 1а/.

При продолжительной инкубации /0G лсоь/ ТФР-0 в концентрации О. Б - 5. О нг/мл в присутствии инсулина снижает уровень биосинтеза ДНК в клетках линии " NRK-49F. Вместе с тем, при еовм*. тном действии ТФР-8 с ЭФР и инсулином в течение 48 или 86 часов проявляется дозовависимое увеличение интенсивности биосинтеза ДНК.

Ван Поелен и сотр. /van Zoelen Е. J. et al. 1988/ также отмечали стимуляцию включения меченого тимидина в ДНК клеток линии NRK-49F при' действии ТФР-8, ЭФР и инсулина, но наши данные свидетельствуя о том, что выралвнность этого эффекта. как и аффекта от действия самого ТФР-8 зависит от продолжительности инкубации ¡щеток в его присутствии и концентрации ТФР-й. По-видимому, такая зависимость характерна для ТФР-8. поскольку инсулин или ЭФР, хотя и в разной степени. в большинстве случаев стимулируют пролиферацию клеток

4000

2000

f^

/ " Ж

50.0

Рис.1. Влияние ТФР-^ на включение %-тшидина в • ДНК культивируемых в ыоно-слов клеток: А - линии HRK-49F f 24 ч инкубации в присутствии 0.1% СКП /I, 2/ или I05S СКП /3,4/. 1,3 -

, 2,4 - ГфР-^ + ая> / 5 нг/ыл /; Б - линия

О 0.05 0.5 5.0 Ш-/ нг/мл

клвтох з«1а8-ЗТЗ , 24 ч инкубации в присутствии 0,1% СКП при плотности высева 5 тыс.клет. /сы2 /1,2/ иди тыс.клет. /см2 /3,4/, 1,3 - Ш-/> + ЭФР, 2,4 - Ш-^ + инсулин / I ыкг/ыл /; В - линия клеток А-549, 24 ч инкубации в присутствии 10% СКП. I - Тйу, 2 - Ш-^ Э4Р, 3 - ТФРу + инсулин, 4 - + ЭОР + инсулин,'

Б

- п -

линии МНК-49Г, независимо от времени инкубацин.

Известно, чтс плотность высева кле-")к в монослое в определенной мере страдает степень непосредственных контактов («жду клетками. А это, в свою очередь, может влиять на чуствительность клеток к тем или иным биорегуляторам / Никольский Е Н 1984/. Ыы обнаружили, что при редком высеве { Б тыс. клеток/см 2 > сам ТФР-Й не влияет на интенсивность биосинтеза ДНК. в ' в присутствии ЭФР ингибирует его. При тестировании клеток этой линии, находящихся в плотном монослое < БО тыс. клеток/см2 >. сам ТФР-Я также не влияет на биосинге"■ДНИ, однако отмечается стимуляция пролиферации под действием ТФР-15 в концентрации 0.5 - 5.0 нг/мл совмест-• но с ЭФР /Рис. 16/. Такой синергизм в действии ТФР-А и ЭФР имеет место только при высокой плотности высева клеток линии Зизэ-ЗТЗ. что мокет быть свяэанс} с блокированием ТФР-П контактного нкгибирования и, соответственно, проявлением стимулирупиэго действия ЭФР.

При одновременном действии ТФР-В, ЭФР и инсулина биосинтез ДНК в клетках лин : Э»азз-ЗТЗ ингибируется независимо от плотности высева' клеток, хотя в редкой культуре это ин-гибирование происходит при концентрации Тф^-О О. ОБ нг/мл, а в плотном монослое - при 5.0 кг/мх Ростингибирувдее действие этих трех факторов роста сохраняется и после сни-ления концентраии СКП до б. 5 X. В таких условиях наблюдается стимуляция включения ^Н-тимидина в ЛНК клеток под действием ТФР-й и инсулина и ингибирование включения радиоактивной метки в ДНК под действием ТФР-Я и ЭФР.

Таким образом, полученные нами рееультаты могут объяснить; почему разные авторы обнаруживали разные биологические эффекты ТФР-В - ингибирование, отсутствие эффекта или стимуляцию пролиферации клеток под действием этого фактора. По - видимому, источником этих расхождений является недостаточный охват возможных вариантов опытов в тест-системах с использованием ТФР-9.

Обнаружено, что ТФР-Й не влияет на интенсивность биосинтеза ДНК в клетках линии N14-313, культивируемых в присутствии 10 % или 6 X СКП в течение 24 часов. После уве-

личения времени инкубации этих клеток до 48 часов в присутствии 6 X СКП отмечено ингибирование этого процесса под действием ТФР-13 в присутствии ЗФР .или инсулина и его стимуляция - в присутствии обоих факторов - ЭФР и инсулина. При инкубации клеток в течение 72 часов ростингибирующий эффект ТФР-G в присутствии инсулина, а тага® стимуляция роста клеток под действием ТФР-П в присутствии ЭФР и инсулина менее выражены. Кроме того, наблюдается ингибирование включения Зн-тимидина ' в, ЛНК клеток линии NIH-3T3 в присутствии TCP-В и ЭФР. ХЬсле снижения концентрации сыворотки крови в среде до 0.1 X стимуляция 'пролиферации клеток имеет место только при одновременном действии на них ТФР-G, ЭФР и инсулина.

Лной характер действия ТФР-й на пролиферацию обнаружен нами при исследовании клеток линии А-549, подученных из •\ценокарцикомы легких человека /Рис. 1в/. Тфр-В .ингибирует биосинтев ДНК в этих клетках при их инкубации в течение 24 часов в присутствии 10 % СКП. Аналогичные результаты получены и другими авторами /Fernandez-Pol J. A. et al. 1986/ . По-видимому, этот ингибируюиий эффект является следствием взаимодействия ТФР-0 с факторами роста, имеющимися в сыворотке крови. Эти факторы роста должны быть в определенных соотношениях, поскольку нами обнаружено, что доба., яение ЭФР снижает ингибируюшее влияние ТФР-8 на биосинтез ДНК, а инсулин полностью устраняет его /Рис. 1в/.

После снижения концентрации СКП в среде до 7.6 % ингибирование включения метки в ДНК клеток линии А-Б49 под действием ТФР-Й наблюдается только в присутствии ЭФР. При концентрации СКП в культуральной среде 0.*1 X наблюдается уже стимуляция биосинтеза'ДНК в клетках под действием ТФР-В /0.5 нг/мл / и ЭФР, а также ТФР-В, ЭФЕ и инсулина.

.3. Слияние ТФР-Й и его комбинаций с ЭФР и инсулином на

субстратнезависимую пролиферацию клеток ТФР-й был впервые выявлен как фактор, стимулирующий еубётрнтнеаывиеимую пролиферацию клеток, полученных иэ нормальных тканей /Roberts А. В. et al. 1983/. Такая пролифера-

- 13 - .

шя'является характерным фгнотипическим сривнаком трансформированных и опухолевых клеток. В дальнейших работах было показано, что действие ТФР-П может быть не только стимулирующим, но и ингибируюшим /Lee К. et al. 1987, Laiho М. at al. 1987/. Однако, неизвестно; от каких факторов зависит характер дейсвтия ТФР-íi на фенотипическую трансформацию клеток.

Изучая влияние ТФР-fl на проявление трансформированного фенотипа, мы исследовали колониеобразование в полужидком агаре разных линий клеток, полученных из нормальных тканей •ÍNRK-49F, N1H-3T3, Swiss-ЗТЗ)-, из опухолей меэёнхимального •ÍHT-1080, IT" 103 клоны 384/6 и Зсб> и из опухоли .эпителиального происхоядения {А-549), а такие клеток,'трансформированных in vitro {CHD-719a/3K

Обнаружено, что сам TCP-8 не влияет на уровень колониеоб-разования клеток, подученных из нормальных тканей, но в присутствии ЭФР /5 нг/мл/ он дозозввисимо стимулирует про-'лиферацию в полужидком агаре. Полумаксимальная эффективная концентрация ТФР-В составляет О. Б нг/мл для клеток линий NRK-49F и NIH-3T3, 1.0 нг/мл - для клеток линии Swi33-3T3. Показано, что при совместном действии ТФР-й в больших концентрациях /БО нг/мл/ и ЭФР колониеобразование клеток линии NIH-3T3 меньше, чем при действии ТФР-8 в меньших концентрациях. Присутствие инсулина / 1 мкг/мл / не влияет на действие ТФР-8 на колониеобразование 1слеток линий NRK-49F и Swiss-ЗТЗ. При совместном действии ТФР-В с ЭФР и инсулином на клетки линии NRn-49F результат такой, т, как и - в присутствии самого ЭФР. У клеток линии Swiss-ЗТЗ инсулин усиливает действие ТФР-й с ЭФР по стимуляции колониеобраэо-вания, а у клеток линии NIH-3T3 он значительно уменьшает стимулирующий эффект совместного действия ТФР-В и ЭФР . /Рис. 2а/. „ •

Результаты наших исследований свидетельствуют о тс что стимуляция колониеобразования у клеток, полученных из нормальных тканей, происходит при действии ТФР-0 в присутствии

200

/

100

/

1Ш о^ &.о ьо.о

ТЗР-/! нг/мл

0.-05 0.5 Ш-р

5.0 50.0' нг/мл

400

>>300

1200 <я

1юо

и

о «

Рио.2. Влияние и его

комбинаций с ЭФР / 5 нг/ил / и инсулином / I к Уыл / на колонизобразование в полувеком агаре клеток линий нш-зтз /А/, А-549 /Б/, НТ-1060 /В/. I - Ш-р ; 2 - Ш-р + Э$Р; 3 - Ш-р + инсулин; 4 -+ инсулин.

50.0

0 0.05 0.5 5.0 Ш-р нг/мл ЭФР. В то же время, у трансформированных т vil.ro клеток линии ОНО-719с/3 такая- стимуляция наиболее выражена иг -совместном действии ТФР-В и инсулина. А добавление ЭФР ве-д*у к снижению уровня колониеобравования. индуцированного ТФР-П.

О том. что ТФР-й играет валнуш роль в процессах развития

опухолей, свидетельствуют результаты тестирования клеток, полученных из новообразований. Так, у клеток линни А-649, полученных ив аденокарциномы легких человека, сам T2P-I5 вызывает почти 90 Z ингибирование колониеобразования. Этот ингибируквдий эффект ТФР-fl частично устраняется ЭФР и инсулином /Рис. 26/. В то же время нами показано, что ЭФР it инсулин существенно уменьшают стимулирующий эффект ТФР-fl на пролиферацию клеток, полученных из опухоли другого типа -фибросаркомы человека <линия НТ-1080> /Рис. 2в/. Таким образом, направленность рострегулирующего действия ТФР-Й зависит и от типа опухолей, из которых получены клетки-мииени.

Полученные паки данные позволяют предположлть, ' о направленность действия ТФР-íi на субстратнезависимую пролиферацию клеток, полученных из опухолей в значительной мере определяется не только происхождением опухоли, но и характеристиками клонирования клеток в полужидких средах. Так, обнаружено, что ТФР-В ингибирует колониеобразование клеток • линии НТ-1080, но при этом коэффициент спонтанного клонирования этих клеток был выше, чем в наших опытах /Laiho М. et al. 1987/. Такая же зависимость направленности действия TCP-Я от уровня спонтанного колониеобразования обнаружена нами для клеток линии ПС-103 /клон 384/5/, полученных из мышиной саркомы. В тех случаях, когда использовали клетки с низким уровнем 'спонтанного колониеобразования, действие ТФР-Й оказывается стимулирующим. При тестировании клеток с высоким уровнем спонтанного колониеобразования ТФР-8 .вызывает его дозозависиь г ингибирование. В то же время, у клеток другого клона /Зсб/ зной же линии ПС-103, характеризующегося высоким■уровнем спонтанного колониеобразования, наблюдается стимуляция пролиферации под действием ТФР-Й в присутствии ЭФР и инсулина.

Таким образом, ТФР-Й стимулирует в присутствии ЭФР колониеобразование у псевдонормальных клеток или не влгчет на него. В то ке время у клеток, полученных- иэ опухолей, картина не столь однозначна. Можно 'предположить, что направленность действия ТФР-13 на колоииёобраэование опухол( их клеток в большей мере зависит от особенностей клонирования

. - 16 -этих клеток в полужидкой среде , чем от типа опухоли. При этом аффект ТФР-Я сильно зависит от присутствия других факторов роста

4. Характеристика специфичного связывания ТФР-В клетками

Одним т первых этапов в механизмах действия ТФР-В , ,а котчнюм может осушествлятся регуляция его действия, является рецепция ТФР-0 клетками-мишенями /Like В. et al. 198£>., Massaque J. et al. 1985/. Поэтому нами проведено изучение лиганд-свизывамдих характеристик специфичных рецепторов ТФР-В, включая их понижающую регуляцию /down regulation/, кооперативность и трансмодуляцию.

Используя полученный нами -^j-ТФР-В , мы провели иденти-фш«шию специфичных рецепторов ТФР-Я на клетках линии NRK-49F, используя ковалентную сшивку яиганда с рецептором Йисукшнимиди. .."убератом с последующим электрофоретическим разделением белков в полкакриламидном геле и авТорадиограФией. Показано, что основная часть специфично связанного 12^1-ТФР-Я обнаруживается в зоне миграции белков с Мг 260 -280 кЛа. Наблюдается также слабо»? опепифичь е связывание 125ЫФР-Л белками с относительными молекулярными массами РО и 90 кЛа. Полученные нами результаты соответствуют данным, известным из других работ о молекулярной массе специфичных рецепторов TCP-0 /Frolik С. et al. 1984, Segarini P. et al. 1988/.

Нами показано, что у клеток линии NRK-49F после их преин-кубаши с немеченым лигандом имеет место п< 'ижаюиия р»?гуляния рецепторов ТФР-В , которая еа 2 часа достигает 47 X оу оби»?го "уровня специфичного связывания 12^1-ТФР-(3 клетками. Олелует подчеркнуть. что величине понйлсшцей регуляции близка к таковой, полученной исследователями для других линий клеток: • А-549 - SO.?, AKR-2B - 64-76? /Tucker R. F. et al. 1984/. Можно предположить, что покижагавя регулящи, рецепторов ТФР-П в диапазоне от ЗОХ до "ОХ характерна для ме-хпнм,|*.Гупяторного влияния ТФР-R и ненсч-ч^дстБемно. не зависит от ншцктлиннмти л^йотуин этого Фактора на- проли-

ферацию клеток.

Интересно, что связывание ^^ клетками линии

NRK-49F снижается также под действием холерного токсине» /Юнг/мл/ и аК/макроглобулина /Змкг/мл/. Если эф(ект ¡^/мак-рог лобулина может быть обьяснен образованием клиренсиых комплексов ТФР-13 с ятим белком /Hu.mg 3.3. et al. 1981V, то действие холерного токсина , по-видимому, связано с его влиянием на функциональную активность G-белков, а через них и на специфичное связывание ТФР-9 клетками /Murthv U. 3. et al. 1988/.

Из полученных нами данных следует, что диссоциация 121>1-тфр-а и-! его связи с клеточными рецепторами зависит- от степени их насыщения лигандом. При насыщении более 20%. от общего числа рецепторов ТФР-ß их сродство к лиганду изменяется тик, что общий уровень специфичного связывания снижается на 15Х. Эти данные предполагает наличие отрицательной кооперагивности рецепторов ТФР-Й.

Понижающая регуляция и отрицательная («оперативность рецепторов ТФР-ß у клеток линии NRK-49F приводят к тому, что общий уровень специфичного связывания ТФР-ß у клеток этой линии при действии лиганда в больших концентрациях будет более, чем на 50Х ниже, чем при действии ТФР-ß в концентрациях 1-10 нг/мл. Поскольку действие ТФР-ß на пролиферацию клеток проявляется при его концентрациях менее 10 нг/мл, то очевидно, что понижающая регуляция и отрицательная коопера-тивность приводят к защите клето.к от образования избыточного количества лиганд-^.ецепгорных комплексов.

Большой интерес при изучении механизмов действия ТФР-ß надставляет влияние других полинентидиыч факторов роста на специфичное связывание ТФР-ß, то есть трансмодуляция рецепторов ТФР-Я /Sporn М. В. et al. 1988/. Нами изучено влияние ЭФР и инсулина на количество рецепторов ТФР-ß и их Kd у клеток линий MRK-49F и А-549. Клетки этих двух линий ,ыбра-ны в связи с разным характером действия ТФР-ß на их Пролиферации. Как уже упоминалось, клетки линии NRK-49F стимулируются этим фактором в присутствии ЭФР, а клетки лиь..й А-649 - ингибируются самим ТФР-Я.

Данные, приведенные в табл.2 , рассчитаны на основании {чгаультатов радиорецепторного анализа но методу Скэтчарда. Видно, что количество рецепторов ТФР-й у клеток линии уменьшается под действием ЭФР и инсулина, хотя в присутствии самого ЭФР оно достоверно не изменяется, а в ¡¡риеутстпик самого инсулина - увеличивается. рецепторов ТФР-В в названных вариантах опыта достоверно не изменяется. При изучении клеток линии А-Б49 обнаружено, что ЭФР вызывает увеличение количества рецепторов ТФР-В. а инсулин и его смесь с ЭФР достоверно не влияют на него. В этом случае Н,? рецепторов ТФР-В также достоверно не изменяется. Вероятно, первым этапом в изменении характеристик связывания ТФР-8 клетками, изменяющими свой статус, является изменение количества центров связывания, но не сродства к лиганду.

табл. 2

Влияни» ЭФР и инсулина на специфическое связывание 1251-7® О (слетками линий ШК-49Г и А-¡549.

внрипнты

ЧЕ1Ы14-С.

без ШГ

ТФР-П +ЭФР

ТФР-А • ин-.-ул.

ТФР-«

+эфр ^

инсул.

ШК-49Г

к-но рецепт.

на клетку

ла-тт^кх)

40900+6000

^кооиооо

К.1

/ИМ/'

::г. а±з. о

?л. з+ь. о

7+ II. О

о+о. о

А-Б49

к-во рецепт, на клетку

3700+700

?Л 600+9 "О

!:г"00<с00

14400+11П0

(V)

/пм/

27. 0±б. О

32. 7tB. О

о.':, о <6. о

27. Г'". О

Сопоставлен»*» р-^у.оьгчт.->й ц-_>уч^ния транск»>ду.пниионных из-м-•Н'м-яЛ специфичного евяйыраний ТФР-0 и данных о ►то влиянии ><;> я|ч">ли*1» >[к|11(1н> к.'^ток |'|-иле,г»",л1»(>,гг,уоТ о том. что оти-

мудируг^-.- действие в нриоугетши ЭФ? н* оуГччр-чтн«-

зависимую пролиферацию клеток линии №К-49Р сопровождается снижением количества рецепторов ТФР-В , а частичное блокирование ингибирующзго действия ТФР-Й на пролиферацию клеток линии А-Б49 иод влиянием ЭФР сопровождается повышением количества рецепторов ТФР-0.

В целом, полученные нами результаты изучения понижающей регуляции, кооперативное™ и трансмодуляции рецепторов ТФР-В предполагают, что уже на этапе рецепции ТФР-Й клетками действуют механизмы, которые могут определять характер его влияния на эти клетки-мишени.

5. Влияние ТФР-Я и его комбинаций с ЭФР и инсулином иа содержание оАМР и сбМР в клетках Одной из клеточных регуляторных систем, которые могут быть задействованы в действий гормонов и полипептидных факторов роста На клетки-мишени, являются оАМР- и ' сбМР-эависимые процессы /Северин 0. Е. и др. 1979/. Исходя из этого, мы научали изменение содержания оАМР и сбМР в клетках и определяли отношение внутриклеточных концентраций этих нуклеотидов под действием ТФР-Й , а также инсулина и ЭФР. Для сравнения использовали клетки линий .Г№К-49К и М1Н-ЗТЗ, полученные иа нормальных тканей, и клетки линии А-Б49, полученные иа опухоли.

Обнаружено, что при инкубации клеток линии А-Б49 в бессывороточной среде ТФР-8 снижает внутриклеточное содержание сАМР,'причем, это действие не блокируется циклогексимидом. ТФР-13 также снижает стимулирующее влияние ЭФР на содержание сАМР в клетках: В присутствии инсулина содержание сАМР снижется, а после добавления еще и ТФР-й оно повышается в 1.3 раза по сравнению с таковым у клеток, инкубируемых в бессывороточной среде. Совместное действие ТФР-Й, ЭФР и инсулина индуцирует уменьшение содержания сАМР в клетках. л определении содержания овМ3 в клетках линии А-549 обнаружено, что ТФР-0 во всех вариантах опыта вырывает его уменьшение. При использовании клеток линии N114-ЗТЗ также обнарук.но

- ЕО -

снижение внутриклеточного . содержания с<3№ иод действием ИР• С, независимо ит присутствия или инсулина. ТФР-й сым или н присутствии ЭФР снижает содержание сЛМР в этих клетках. После добавления инсулина, который вызывает уменьшение содержании сАМР. эф{*чст ТФР-П не обнаруживается. Цик-логексимид не блокирует влияния ТФР-П ня содержание сАМР в клеткнк линии М1Н-ЗТЗ в присутствии УХР. Представляет инте-!'-•(.• тот >|»1кт. что ТФР-п. независимо от нрисутетния ЭФР и лису «инн. вызывает ув'-.^ии.пи»' гепичины ы ноиеии.» и-ЛМ-Ч.ЧЧЧМ5] /табл. 3/. Такой ;ч|«(ект мп**т свидетельство-

табл. 3

Кчтшио 'ГФР-Л I/ его комбинаций с ЭФР и инсулином н I «"личину отношении содержания и еСМР в клетк.-\ч линий

лиии.1 КЛ-.-11 ОС "АМР1 Л оОМР]

а оч- о. -4 я б :•'. 1 Г. 4 . 0. г ' 1. Л I. ('■ 1.0 0. 4

n иг зтз ::?. о 81. с 5з С) г:,-"', о 35. 5 37. 4 33. п 46. 0 1.0

ккк-49г ю;<. v 160. 0 «.'со, 0 43. Г 83. 3 6.7 0. 3 21.6

«цк ■

< x •.•-'[ ь".?. 1 vi . 4 11г - - - 103. 3 - '

т' м!.-.!11

т'т г- »1 ♦ » 4-

мг 1 * -

+ * +

гс* оки

р.-|гс о т' м. чту дей'тви- ТФГ-" т систему ¡м-умши содер-н (Нин ную'еотиК'.ч1 г.ц'.«ч•еяу^Т'.'И мехлни.">чми. не-

(•,-. . иц, . !(,. *■'■' ЧЧНИ. Л^ЙСП'НЯ

Г-ТГ >' о> 'у 1

- 21 -

У 'метоп линии ШК-49Г характер изменений содержания циклических нуклеотидов под влиянием факторов роста отличается от тчконого, наблюдаемого у клеток линий А-С49 и М1Н-ЗТЗ. Так, сам ТФР-Я вызывает снижение внутриклеточной концентрации оАМР и сбМР, но под действием ЭФР она повытается. ТФР-П в присутствии инсулина увеличивает содержание сАМР и снижа-содержание с(ЗМР. При действии ТФР-й совместно с ЭФР к инсулином содержание сАМР в клетках линии ШК-49Р резко снижается. В клетках этой линии ТФР-13 вызывает увеличение отношения [еАМРЗ/СсШР] сам или при совместном действии с инсулином, а в присутствии ЭФР ТФР-П вызывает резкое свидание величии этого соотношения.

Показано, что ТФР-8 снимает отношение внутриклеточных концентраций С сАМР]/[ свМР! в клетках линии МЙК-49Р,' культивируемых в присутствии холерного токсина. Необходимо отметить, что дада повышение содержания сАМР в клетках данной линии под действием холерного токсина не ликвидирует снижения содержании циклического нукяеотвда, обнаруживаемого после действия ТФР-Й в комбинациях с ЭФР и инсулином.

Та]сим образом, можно заключить, что влияние ТФР-В, ЭФР и инсулина на содержание циклических нуклеотидов зависит от типа используемых клеток. Тот факт, что ТФР-В практически в большинстве вариантов опытов вызывает увеличение отношения ГоАМР.) ЛсНЗМР] может свидетельствовать об активации этим фактором универсального механизма изменения содержания циклических ■нуклеотидов в клетках разных типов. Из результатов наших -исследований видно, что отношение I аАМРО/[ свМР] увеличивается в ряду клеток линий А-549 Н1Н-ЗТЗ ШК-49К. Такой характер изменения отношения внутриклеточных концентраций сАМР и сСМР может определятся типом клеток. Как уже отмечалось, клетки линии А-549 получены из опухоли, клетки .линии /ЛН-ЗТЗ - из эмбриона, а клетки линии те«-49Г - из нормальной ткани сформированного органа взрослого. № отного.

При сопоставлении результатов влияния ТФР-0, а также его комбинаций с ЭФР и инсулином, на содержание циклических нуклеотидов в. клетках и его действия на интенсивность субстратзавйсимой и субстратнеаависимой пролиферации клеток

выявлено, что чем выве, пролиферативная активность клеток линий А-Б49 и МИК-Ддр в полужидкой среде, тем меньше величина отношения toAi.Pl/tcGMP]. В то же время у клеток линии

«

МН-ЗТЗ мы наблюдаем обратную картину, а именно при увеличении колониеобраэования клеток увеличивается и величина отношения (сАКР]/СоОМР]. Что капается субстратэависимой пролиферации клеток, то не било обнаружено прямой г: мости между «вменением внутриклеточного содержания этих циклических нуклеотидов под действием ТФР-0 и его комбинаций с ЭФР и инсулином и интенсивностью пролиферации клеток. Исходи 'из приведенных результатов, можно предположить, что важную роль в определении характера действия ТФР-Й на проявление трансформированного фенотипа играх» не столько абсолютные концентрации циклических нуклеотидов , сколько величина их отношения - С оАМР1 ДсШР].

Таким образом, выявленные нами изменения в функционировании систем [х .¿пции ТФР-Й клетками и. регуляции внутриклеточного содержания сАМР и сбМ?, позволяют считать, что определение характера действия ТФР-11 на пролиферацию клеток может осуществлятся на уровне этих двух регуляторных систем клеток.

. щводы

1. Усовершенствован метод выделения и очистки ТФР-л иа т|ч'м'«»(ИЧ чь Г.|«1|41 сниньи, • 'Т^1т»"иь гомогенности полученного пр^мнр.тм щ^енышчет 95Х.

ижлнчно, что влияние ТФР-0 на проли4«^рншт клеток, кул1<тигнруемых в монослон ¡»амсит не тол' чо от типа кле-гок-миик'н^й, но и от наличия р (.'¡>'де ЭФР или инсулина, времени инкубации клеток, плотности их вы<;ена на единицу площади гугклтрата и от коннентршши сыворо'ио. крови в среде. Действие ТФР-0 на проли4>ерпци*> в зависимости от мик(>оокру-жьчшя клеток МОЖРТ. быть стимулирующим или шгибирующям.

3. ТФР-1Ч дооозависимо стимулирует'проявление трансформированного ^потипа у клеток, полученных из нормальных тканей /линии ККК-ЛРР, Н1Н-ЗТЗ, ГЗ/ только в присутствии

ЯРР. (Упмрукнно, что инсулин усиливает /клетки линии

Swiss-ЗТЗ/ или ингибирует /клетки линии NIH-ЗТЗ/ это стимулирующее действие ТФР-В и ЭФР.

•1 ТФР-В оказывает транеформируюшзе действие на клетки линии СНО-719с/3 в присутствии инсулина, но не ЭФР.

5. ЭФР и инсулин угнетали1 действие ТФР-Й на пролиферацию п полужидких средах клеток, полученных из разных опухолей че-' ловека. Эги факторы уменьшает выраженность роотетимулирую-п,чго действия ТФР-В на клетки линии HT-1030 из фибросаркомы н ростингибирумщее действие ТФР-В на клетки линии А-Б<19 из аде нокарци номы.

6. Действие ТФР-й на проявление трансформированного фенотипа у клет' t мышиной саркомы линии ПС-103 {¡слон 384, 5> зависит от уровня их спонтанного нолониеобразования: при низком уровне наблюдается стимуляция, а при высоком -. ингиби-рование пролиферации.

7. Идентифицированы специфичные рецепторы ТФР-В у клеток линии NRK-49F. Показано, что инсулин увеличивает, а ЭФР не 'изменяет их количества на поверхности этих клеток. При совместном действии ЭФР и инсулин уменьшают количество рецепторов ТФР-й. У клеток линии А-549 ЭФР вызывает повышение уровня этих рецепторов. Во всех случаях изменения в связывании ТФР-fl происходят без существенного изменения Kd его рецепторов.

8. Для клеток линии NRK-49F выявлена понижающая регуляция ■(down regulation специфичного связывания ТФР-Й и отрицательная кооперативность рецепторов ТФР-В при связывании специфичного лиганда.

9. ТФР-Й индуцирует снимание содержания сАМР и cGMP в клетках линий А-Б49, NIH-ЗТЗ и NRK-49F. Обнаружено, что отношение внутриклеточного содержания СсАМРЗ/СcGMPJ в большинстве случаев увеличивается, несмотря на то, что исходные концентрации этих циклических нуклеотидов в данных клетках существенно различаются. Влияние ТФР-fl на содержание циклических нуклеотидов в клетках зависит от присутствия ЭФР и инсулина в культурал'ьной среде.

10. Анализ полученных данных показывает, что понимаю. ..и* регуляция, отрицательная кооперативность и трансмодуляция

рецепции ТФР-ß клетками ивуеняют чуствительность клеток к действию ТФР-0. Системы рецепции ТФР-ß регуляции внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов >.югут играть роль в определении направленности влияния ТФР-0 на пролиферация клеток.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕЫЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сушелышцький С. I., Стойка P.C. , Гарасько С. Й. Часткова очистка та деяк1 властивост! ß-типу трансформуючого фактора росту тромбоцитов евин! // Укра1нський 6ioxiM. зiад: TeF ^п. / 1вано-франк. , вересень 1987р. /. - Ки1в, Наукова думка, 1987 - 4.2. - с. 249.

2. Стойка P.C., Федишин Я Я. , Сушельницький С. I. Шл^пеп-тидн! факторы росту в ранны»у eMöpioreHeai та при злояк1сн1й трансфэрмлШ 1 кл1тин // Укра1нський 6ioxiM. з1зд: Тез. доп. / I вано-фринк. , вересень 1907р. /. - Ки1в, Шукова думка, .1987 -4.1. - с. 149-150..

3. -Стойка Р. С. , Федишин Я Я. , Сушельншдький С. 1. , Гарасько С. И. , Микитнк Р. Г. Полилелтидные факторы роста в раннем эмбриогенезе животных // Всесоюгзний симп! "Молекулярные и функциональна:' механизмы онтогенеза", 27-29 ковтня 1987г. , XapKiB. -Вид. Хлрк. дерл. унi в. , 1987 - с. 172-173.

4. Sloiko R. 3. , Suche lriiUky S. К , Kusen S. I. The influence of transforming growth factor - ft , epidermal growth factor and insulin on cell proliferation in the media with semisolid agar // Abst r. ■ of 4th Int*rnftional Congress of cell biology, Montreal, 1988. - p. 108.

Г.. Стойка P. 0. , Cytüf лькйнки'й С. Я., Кусень С. И. Влияние; трансформирующего фактора роста - Я , энидер-'-лльного фактора pouva и инсулина на пролифе-рнцию клеток в среде о полужидким агаром //Биополимеры и клетка., 1989 - т. Б - N1 - с. 96-99.

6. Сушельницкий С. И. , Стойка P.C., Г>'"чч«ько С. Я , Щзфранская Г. И. , Кусень С. И. Влияние трансформирующего фактора роста ß-типа и его комбинаций е эпидермаяьньм iv-к ->ром роста и инсулином на субстратнеэавиеимую пролиферацию нормальных и с /холеных клеток // Цитология. , 1989 - т. 31 - N7 - с. 767-774.

7. Стойка Р. С. , Сушельницкий С-. И. , Кусень С. Я Регуляторное влияние трансформирующего фактора роста ß на пролиферацию кле-

ток в зависимости от условий тестирования его активности//Всесоюзное совещание «Актуальные вопросы клеточной биологии»: Тез. докл. (Ленинград, 17—19 окт. 1989 г.). —Цитология, 1989 —т. 31 —№ 9 —с. 1127—1128.

8. Сушельницкий С. И., Стойка Р. С. Изучение влияния эпндермалыюго фактора роста и инсулина на специфическое связывание трансформирующего фактора роста р нормальными и опухолевыми клетками // Всесоюзн. сов. «Актуальные вопросы клеточной биологии»: Тез. докл. (Ленинград, 17—19 окт. 1989 г.). — Цитология, 1989 —т. 31 — № 9 —с. 1129.

9. Стойка Р. С., Сушельницкий С. И., Кусень С. И. Влияние трансформирующего фактора роста р на интенсивность синтеза ДНК клеток в зависимости от их типа и условий культивирования//Цитология, 1990 — т. 32 — № 2 —с. 132—139.

10. Стойка Р. С., Сушельницкий С. И., Кусень С. И. Особенности регулятор-ного действия трансформирующего фактора роста — Р // В сборн. «Морфо-гепетически активные вещества»: под. ред. Шейман И. М. — Пущино: Изд. науч. центра бнол. исследов. 1990 — с. 107—113.

11. Stoika R. S., Sushelnitsky S. I., Kusen S. I. The regulation of proliferation of human lung carcinoma cells of A-549 line by autocrine factors // Abstr. of 20 th FEBS Meeting, Budapest, 23 11 1990,— p. 300.

12. Sushelnistky S. I., Stoika R. S., Kusen S. I. The regulation of specific binding of transforming growth factor |3 by NRK-49 cells//Abstr. oí 20 th F3BS Meeting, Budapest, 23 11 1990, — p. 303.

13. Сушельницкий С. И., Стойка Р. С., Кусень С. И. Влияние эпидермаль-ного фактора роста и инсулина на специфическое связывание трансформирующего фактора роста (3 клетками линий NRK-49F и А-549 // Цитология, 1991—т. 33 —№ 3-е. 80—88.

14. Сушельницкий С. И., Стойка Р. С. Определение кинетических параметров специфического связывания трансформирующего фактора роста р клетками линии NRK-49F из нормальной почки крысы//Биологические мембраны, 1991—т. 8 —№ 6 —с. 628-632.

Подписано к печ. 17.01.92. Формат 60х84Д6. Печать офсет. Бумага офсет. Усл. п. л. 1,4. Усл. кр.-отт. 1,64. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Бесплатно. Зак. 2065.

Областная книжная типография, 2ЭОООО, Л^вов, ул. Стефанцка, 11.