Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение пролиферативной активности глиальных клеток под влиянием опиоидных пептидов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение пролиферативной активности глиальных клеток под влиянием опиоидных пептидов"

российская академия наук институт цитологии

Не» гтравах рукописи УДК 616-006.57.014..-547.466.96

СЛЕПКО Наталья Георгиевна

изменение пролиферативнои активности гениальных клеток под влиянием опиоидных пептидов

03-00-25 — клеточная биология

автореферат

диссертации на ооискани© ученой степени к а ндидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992 Г-

Работа выполнена в Отделе клеточной биологии НИИ экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

кандидат биологических наук Козлова Н.В.

кандидат биологических наук Баркан P.C.;

доктор медицинских наук, профессор Коновалов Г.В.

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

13

.иох

/3

Защита состоится " .Т.""'. . " . .г У.'У.'."...... 199 2 года в.'.~. . . .ч.

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064 С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

/ /уА, '/-'/ /V Автореферат разослан ".'Т.. . ". . У..(...'. ТТ. . 1 992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Л.Н.Писарева

@ Институт цитологии РАН

Изучение факторов, регулирующих пролиферацию клеток, является "одной' [из фундаментальных проблем клеточной неярооиологии. В настоящее время интенсивно исследуется влияние известных факторов роста (эпидермального, фактора роста фивробластов, фактора роста из тромбоцитов) на пролиферацию клеток нервной ткани (Gensburger et al., 1987; Yong et al., 1988; Huff et al., 1990; Drago et al., 1991; Suits et al., 1991 ). Интересным явилось открытие митогенных свойств у регуляторных нейропептидов: вазопрессина, бомбезина, нейромедина, вещества П, вещества К, синтезируемых нейральными и нейроэндокринными клетками (Hanley, 1985; Zachary et al., 1987). В последние годы способность изменять пролиферацию клеток обнаружена у опиоидных пептидов - группы нейропептидов, принимающих участие в регуляции разнообразных функций организма (Vertes et al., 1982; Zagon, McLaughlin, 1988);

В ' настоящее время установлено, что эндогенные опиоиды ингибируют пролиферации неяробластов и клеток нейробластомы крысы (Zagon, McLaughlin, 1988; 1989с). Существуют некоторые литературные данные и о возможном влиянии опиоидов на пролиферацию глиальных клеток. Так, блокада опиоидных рецепторов вызывает увеличение числа глиальных клеток в некоторых отделах мозга крысы (Zagon, McLauglin, 1983b; Schmanl et al., 1989). Эндогенные опиоидные пептиды и синтетический аналог лей-энкефалина даларгин увеличивают число клеток периферической глии в зоне роста эксплантатов симпатических и спинальных ганглиев крысы (Ilyinsky et al., 1987), что может быть связано с изменением скорости миграции и/или пролиферации глиальных клеток. Однако полученные данные явно недостаточны и не позволяют сделать окончательный вывод о влиянии опиоидных пептидов на пролиферацию глии, этого важнейшего компонента нервной ткани.

Исследование регуляции пролиферации глии может иметь большое значение для понимания процессов эмбриогенеза нервной системы. Кроме того, известно, что некоторые патологические состояния (инсульты, травмы, рассеянный склероз, неоплазии и др.) характеризуются возникновением глиозов (Latov et al., 1979; Salzer, Bunge, 1980; Simpson et al., 1982; Ludwin, 1984). Поэтому агенты, способные стимулировать или ингибировать пролиферацию глиальных клеток могут найти применение в медицинской практике. Особенно актуальным является изучение действия нового лекарственного пептидного препарата даларгина в связи с

- г -

предложениями о практическом использовании этого синтетического опиоидного пептида при лечении бокового амиотрофического склероза и рассеянного склероза (Kozlova et al., 1990).

Цель и задачи работы. Целью работы явилось исследование особенностей влияния опиоидных пептидов лей-энкефалина и даларгина на пролиферацию глиальных клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику пролиферативного ответа нормальных клеток первичной культуры глии мозга крысы на действие лей-энкефалина и даларгина.

2. Изучить динамику пролиферативного ответа клеток глиомы С6 на действие лей-энкефалина и даларгина.

3. Охарактеризовать возможный механизм действия опиоидных пептидов на пролиферацию глиальных клеток .

Научная новизна. В опытах in vitro впервые установлено, что опиоидные пептиды являются факторами, изменяющими пролиферацию глиальных клеток. Показано , что лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин ингибируют пролиферацию нормальных глиальных клеток и оказывают модулирующее влияние на пролиферацию опухолевых глиальных клеток в зависимости от условий культивирования . Впервые описана сложная динамика клеточного ответа на, действие опиоидных пептидов и изучены факторы, определяющие направленность пролиферативного ответа опухолевых глиальных клеток. Выявлен бифазный характер пролиферативного ответа клеток. Установлена возможность разнонаправленного действия опиоидов на базальную и гормон-стимулированную аденилатциклазную активность клеток глиального происхождения. На клетках глиомы С6 обнаружено, что в регуляции пролиферативного ответа клеток на опиоиды может принимать участие аденилатциклазная система.

Теоретическое и практическое значение. Результаты работы вносят существенный вклад в понимание роли эндогенной опиоидной системы в нейроонтогенезе, - расширяют представление об ингибирующем действии опиоидных пептидов на пролиферацию клеток нервной ткани. Полученные данные о сложной динамике пролиферативного ответа клеток позволяют определить стратегию дальнейших исследований влияния эндогенных опиоидных пептидов на процессы развития и регенерации нервной ткани. Данные о том, что новый лекарственный пептидный препарат даларгин изменяет

пролиферативную активность клеток нервной ткани, открывают перспективу создания экспериментальной вазы лля проводимых в настояыее время клинических исследований при лечении даларгином неврологических заболеваний - Сокового амиотрофического склероза и рассеянного склероза.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и доложены на 2 Всесоюзной конференции по нейронаукам (Киев, 1988г.). на Международном симпозиуме "Функции нейроглии" (Тбилиси, 198 9г.), на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клинической биологии" (Ленинград, 1989г.), на 2 Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пуиино, 1990 г.), на симпозиуме "Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов" (Горький, 1990г.), на Международном симпозиуме "Сигнальные молекулы и механизмы поведения" (Пуиино, 1990 г.). Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (Москва, 1991) и на межлабораторном семинаре Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы" и "Список литературы". Овьем работы ¿U. . стр. машинописного текста, она содержит . .

/ /г/.

рисунков и ...... таблиц, список литературы включает /.'.V.

наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выделение и культивирование клеток первичной культуры глии. Для получения глиальной монокультуры использовали общепринятую методику (McCarthy, de Vellis, 1980). Большие полушария головного мозга новорожденных крыс (1-2 дня) выделяли стерильно, снимали оболочки и суспензировали механически (пипетированием). После фильтрования суспензии через фильтры 230 и 140 мкм клетки высаживали во флаконы площадью 7 5 см2 фирмы "Falcon", покрытые полилизином ("Sigma"), с плотностью 2 X 10 5 клеток/см2. Среда культивирования имела следуюыия состав: DMЕМ, лоыадиная сыворотка 20», глютамин 2мМ, пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл (все реактивы фирмы"Flow"). Через 7-9 суток клетки пересевали в 24-луночные планыеты ("Costar") с плотностью 1 х 105клеток/лунку. При пересеве использовали ростовую среду иного состава: DMEM:F-10

в соотношении 1:1, эмбриональная вычья сыворотка 10*, глютамин 2 мМ, пенициллин/стрептомицин (все реактивы фирмы "Flow"). Одновременно с посадкой и при каждой смене среды (через каждые 2 суток) производили добавление опиоидов. В том случае, если первичная культура содержала смесь астроцитов и олигодендроцитов, олигодендроциты перед пересевом удаляли с помощью тряски в течение нескольких часов. Таким образом для экспериментов использовали первичную культуру астроцитов с небольшим (около 10*) содержанием олигодендроцитов и фибробластов.

Для авторадиографических исследований клетки мозга пересевали на покровные стекла, покрытые полилизином и помешенные в культуральные чашки диаметром 3 5 мм ("Costar"). Смену ростовой среды и добавление опиоидов проводили по вышеописанной схеме.

Культивирование опухолевых клеток глиомы С6■ Перевиваемая клеточная линия глиомы С6 - клонированная линия, полученная из глиальных клеток ЦНС крысы в результате ракового перерождения под действием метилнитрозомочевины (Benda et al., 1968). Клетки глиомы были получены из Коллекции клеточных культур .(Институт цитологии РАН , Санкт-Петербург). Исследования проводились на •клетках 65-7 5 пассажей.

Клетки глиомы С6 культивировали в среде следующего состава (среда А) : F-10 (На») ("Flow"), 15* лошадиной сыворотки ("Flow"), 2% эмбриональной бычей сыворотки ("Flow ") (Zimmer, Van Eldlk, 1988). Через 2-3 пассажа часть клеток помещали в среду Б, имеющую следующий состав: среда 199 ("Flow ") с добавлением 10* эмбриональной бычей сыворотки ("Flow") (Jenkins et al., 1988).

После первого этапа культивирования (во флаконах) в различных средах клетки пересевали на 24-луночные пластиковые планшеты "Costar" с плотностью посадки 1.0 - 3.0 х ю4 клеток на лунку. При этом пересеве и/или при смене среды (на третьи сутки и через сутки) в среду культивирования добавляли тестируемые вещества: лей-энкефалин (Туг-G1y-Gly-Phe-Leu) фирмы "Serva"; даларгин (Туг-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg), полученный в лаборатории синтеза пептидов НИИ экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН; налоксон ("Endo Lab."). При анализе сочетанного влияния опиоидных пептидов и налоксона пептиды добавляли в среду роста через 2 0 мин. после добавления налоксона. Контролем служили клетки в ростовой среде без этих агентов.

Кривые роста■ Для построения кривых роста клетки снимали с лунок 24-луночного планиета обработкой 0,05* трипсина с edta ("Flow") и подсчитывали в камере Горяева с оценкой выживаемости клеток по окраске трипановым синим ("Flow"). Построение кривых роста проводили в течение 8-15 сут. после пересева на планшет. На каждый срок брали по 3-6 лунок; подсчет клеток проводили для каждой лунки отдельно.

Тест на включение 3Н-тимидина. Определение уровня синтеза ДНК по включению 3Н-тимидина в ТХУ-нерастворимую фракцию клеток производили по модифицированной методике Като с соавторами (Kato et al.,1982).

Для определения уровня синтеза ДНК клеток глиомы 3Н-тимидин (Чехословакия, удельная активность 960 ГБк/моль) добавляли в ростовую среду на 1 ч. ¡ конечная концентрация составляла 2 мкКи/мл. Для клеток глии 3Н-тимидин добавляли на 2 4 часа с конечной концентрацией 4 мкКи/мл. На каждый испытываемый вариант брали 3-6 лунок. Подсчет радиоактивности осуществляли на сцинтилляционном счетчике (1215 Rackbeta 2, Финляндия).

Авторадиография. Через 2 4 часа после добавления 3Н-тимидина в концентрации 0,2 мкКи/мл покровные стекла с клетками отмывали раствором Хенкса и фиксировали жидкостью Карнуа. Препарат покрывали фотоэмульсией типа "М", экспонировали 7 суток при +4°С. Ядра докрашивали гематоксилином. Для определения индекса мечения на каждую точку считали не менее 5000 клеток на трех покровных стеклах, взятых из разных культуральных чашек. Допустимым считали фон в пределах 1-2 зерна серебра на клетку. Меченой считали клетку, над ядром которой было не менее 7 зерен серебра.

Измерение_активности_аденилатциклазы. Активность

аденилатциклазы клеток глиомы С6 определяли в клеточных гомогенатах с использованием в качестве субстрата Л-(32Ф)-АТФ ("Amersham" и В/О "Изотоп", с удельной активностью 10-50 Ки/ммоль) по методике Саломона с соавторами (Salomon et al., 1975) в модификации Панченко с соавторами (Panchenko et al., 1 985) .

Стимуляцию АЦ проводили: гормоном 1-изопротеренолом ("Sigma"), 0,1 мМ; Gpp(NH)p ("Serva"), 0,1 мМ - стимулирующим G-белки; даларгином 10~7 - 10 М; лей-энкефалином 10~7 - 10"12 М; 1-изопротеренолом и даларгином; 1-изопротеренолом и лей-энкефалином, Gрр(NH) р и лей-энкефалином.

Реакцию по определению активности АЦ начинали добавлением 152 5 мкг белка клеточного гомогената, проеы инкубировали 15 мин. при 37° С. Все анализы выполняли в триплетах. Останавливали реакцию добавлением 250 мкл 0,5 Н HCl, кипятили пробы 6 мин. в водяной бане и нейтрализовали 200 мкл 1,5 М имидазола. ЦАМФ очищали хроматографией на колонках с окисью алюминия методом Байта (White, 1974). Выход образующегося цАМФ был не менее 90* по определению с использованием (3Н)-цАМФ.

Активность проб просчитывали по Черенковскому излучению в ß ~ счетчике "Delta - 300" (Франция). Общий белок в гомогенатах определяли по модифицированной методике Петерсона (Peterson, 1977) .

Обработка данных. Каждый опыт повторяли не менее 3-х раз с 3-6 параллельными экспериментами в каждом опыте. Каждая точка кривых роста и ордината гистограммы соответствует среднему значению 3-6 измерений в одном из нескольких однотипных опытов. Сравнение двух варьирующих величин проводили на основе t-критерия Стьюдента (Урбах, 1964). Для обработки результатов использовали микро-ЭВМ Labtam 3015 PS (Австралия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изменение пролиферации клеток первичной культуры глии под влиянием леи-энкефалина и даларгина. При подсчете числа клеток было обнаружено, что лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин ингивируют пролиферацию нормальных глиальных клеток в культуре . Изменение пролиферации клеток глии под влиянием пептидов было зарегистрировано на 7-е сутки культивирования в присутствии тестируемых веществ.

Таблица 1. Первичная культура глиальных клеток. Ингибируюцее действие опиоидных пептидов на пролиферацию клеток (7-е сутки культивирования в присутствии пептидов) ■_

Число клеток/лунку : Включение 3 : ( имп. Н-тимидина /мин.)

контроль 408000 + 8000 36919 + 2243

лей-энкефалин (10"10М) 256000 t 16000* 21 033 t 454***

даларгин (10~10М) 240187 1 17902* 26843 1 1181**

» - Р < 0.05; ** - Р<0.01; *»* - Р<0.001.

Число клеток под влиянием лей-энкефалина и даларгина было ниже, чем в контрольных культурах в среднем на 3 7% (табл. 1). К седьмым суткам культивирования происходило первое удэоение числа

глиальных клеток, затем наступал экспоненциальный рост а период логарифмической и предстационарноя фаз кривой роста ( 7 - 12 сутки ' культивирования), где статистически достоверных отличий опыта от контроля нами не обнаружено.

Измерение включения меченого тимидина в ДНК клеток первичной культуры глии показало, что опиоидные пептиды ингибируют уровень синтеза ДНК в среднем на 3 5* (табл. 1). Сходный результат получен и при определении процента меченых клеток методами авторадиографии (рис. 4 ). Так, если индекс мечения глиальных клеток в контрольных культурах составлял 10-20*, то под влиянием лей-энкефалина и даларгина он был снижен до 6-14* (рис. 4). Следует отметить, что индекс мечения клеток глии в контрольных культурах совпадал с данными других авторов, полученными для астроцитов in vivo (Резников, 1981).

Таким образом впервые установлено, что опиоидные пептиды ингибируют пролиферацию нормальных клеток первичной культуры глии. Обнаруженное другими авторами увеличение числа глиальных клеток развивающегося мозга крысы под влиянием блокатора опиоидных рецепторов налтрексона (Schmahl et al., 1983; Zagon, McLaughlin, 1983b) позволяет предположить, что и в условиях In vivo эндогенные опиоидные пептиды могут ингибировать пролиферацию ' нормальных глиальных клеток.

Изменение пролиферации клеток глиомы С6 под влиянием лей-энкефалина и даларгина. В проведенных экспериментах были использованы две среды культивирования (среда А и среда Б), имеющих в своем составе различные типы синтетических сред, различный набор и концентрацию сывороток (раздел "Материалы и методы"). В среде А клетки глиомы С6 обладали эпителиоидной формой и высоким базальным уровнем . пролиферации ( удвоение клеточной популяции происходило в среднем за 2 4 ч.). На рисунке 1 изображены кривые роста клеток глиомы, культивируемые в среде А. Опиоидные пептиды, добавляемые при посадке, на третьи сутки и через сутки при каждой смене среды, достоверно ингибировали размножение клеток в начале логарифмической и в предстационарной фазах роста в среднем на 28*. Вслед за первым уменьмением числа клеток наступал период, где достоверное различие между опытом и контролем отсутствовало (4-6 сутки культивирования, середина логарифмической фазы роста).

Рисунок 1. Антипролиферативное действие лей-энкефалина (10~10М) и даларгина (10 М) на клетки глиомы Сб. Среда А ( среда Р-ю с добавлением 15* лошадиной сыворотки и 2% бычьей эмбриональной сыворотки). Смена среды и добавление пептидов обозначены стрелками. Верхний рисунок - кривые роста, нижний рисунок включение меченого тимидина в ДНК.

Измерение уровня синтеза ДНК в клетках С6 в среде А (рис. 1 ) продемонстрировало сложную динамику ответа клеток на опиоиды. Действие лей-энкефалина и даларгина на синтез ДНК носило бифазный характер: вслед за первой реакцией ингибирования (2-3 сутки) наступало кратковременное активирогание (4-е сутки) включения меченого тимидина в ДНК. После многократных добавлений пептидов вновь было обнаружено ингибирование уровня синтеза ДНК (6-8 сутки), при этом бифазность реакции отсутствовала (рис.1).

Таким образом, лей-энкефалин и даларгин ингибировали пролиферацию опухолевых глиальных клеток, культивируемых в среде

А. Характерной особенностью пролиферативного ответа этих клеток являлась бифазность.

Клетки глиомы С6, растущие в среде Б, имели преимущественно астроцитарную форму, а при увеличении плотности культуры биполярную форму, что сопровождалось упорядоченным расположением биполярных клеток. По литературным данным такая форма клеток глиомы СБ соответствует их более дифференцированному состоянию (Parker et al., 1980; Llm et al., 1987; Ortiz-Caro et al.. 1988; Sueino et al., 1988; Hargreaves et al., 1989; Mangoura et al., 1989; Amano et al., 1990). Клетки глиомы C6 в среде Б имели сниженный базальный уровень пролиферации по сравнению с клетками, культивируемыми в среде А (удвоение клеточной популяции происходило в среднем за 4 8 ч.).

Рисунок 2. Пролиферативное действие лея-энкефалина (ю~10 М) и даларгина (10 М) на клетки глиомы Сб. Среда Б { среда 199 с добавлением ю« бычьей эмбриональной сыворотки). Верхний рисунок-кривые роста, нижний рисунок - включение меченого тимидина в ДНК.

При использовании среды Б лей-энкефалин и даларгин стимулировали пролиферацию клеток глиомы Сб. На рис. 2 представлены кривые роста клеток в среде Б. Хотя направленность пролиферативного ответа изменилась по сравнению с клетками, культивируемыми в среде А, но динамика оказалась сходной достоверное стимулирование пролиферации в начале логарифмической и в предстационарной фазе роста ( в среднем на 3 5*), отсутствие достоверных различий между опытом и контролем в середине логарифмической фазы кривой роста (5-9 сутки культивирования). При измерении включения меченого тимидина выло обнаружено увеличение уровня синтеза ДНК под влиянием опиоидных пептидов в начале логарифмической и в предстационарной фазах кривой роста (рис. 2). Как и в среде А выявлен бифазныи пролиферативный ответ клеток в логарифмической фазе роста.

Таким образом, пролиферативный ответ клеток глиомы Сб на действие опиоидных пептидов имел сходную динамику, но различную направленность при культивировании клеток в средах А и Б.

Противоположный характер влияния опиоидных пептидов нельзя объяснить их взаимодействием с различным набором сывороточных факторов в двух данных средах. Об этом свидетельствуют эксперименты по однократному добавлению пептидов одновременно со сменой среды с использованием различных сывороток (и с изменением их концентрации). Так, опиоидные пептиды ингибировали пролиферацию клеток глиомы в среде А и стимулировали в среде Б с идентичным набором сывороточных факторов (10* эмбриональной бычьей сыворотки ); пептиды ингибировали пролиферацию клеток глиомы и в среде А с 2% эмбриональной бычьей сыворотки и 15* лошадиной сыворотки, а также стимулировали пролиферацию в среде Б с 1* эмбриональной бычьей сыворотки . По-видимому, перевод клеток из одной среды в другую через несколько пассажей изменяет состояние регуляторных систем, участвующих в пролиферативном ответе клеток на опиоиды.

Можно предположить, что и в условиях ln vivo опиоидные пептиды оказывают модулирующее влияние на размножение клеток в зависимости от состояния их регуляторных систем. Так, Роскетти с соавторами (Roscettl et al., 1988) обнаружили, что мет-энкефалин активирует пролиферацию моноядерных клеток кроаи у одних доноров и ингибирует у других доноров.

Полученные нами результаты оа ингибировании опиоидными

пептидами пролиферации нормальных глиальных клеток, находящихся на ранних стадиях дифференцировки, и клеток глиомы С6, культивируемых в среде А, подтверждают литературные данные о существовании сходства между этими типами клеток (Уегпа<1ак1з, Ш(1езз, 1976; Мапеоига ег а1., 1989). Известно, что некоторые агенты, например дибутирил-цАМФ, вызывают сходную морфологическую и биохимическую дифференцирорку глиальных клеток развивающегося мозга крыс и клеток глиомы Сб (Уегпадак1з, N1(1699, 1976). Интересно, что фактор созревания глии вызывает появление астроцитарной формы у глиальных клеток мозга новорожденных крыс в культуре и биполярной формы у клеток глиомы С6 (Ни а1. ,

1987). Таким образом, клетки глиомы С6, культивируемые в среде А являются удобной моделью для изучения свойств глиальных клеток развивающегося мозга.

Однократное и многократное воздействие опиоидных пептидов. В сложной динамике пролиферативного ответа клеток глиомы С6 на действие опиоидов особый интерес вызывает бифазность реакции, наблюдаемая в логарифмической фазе роста. В следующей серии экспериментов первое предъявление пептидов производили на 3-й сутки культивирования, чтобы исключить возможное влияние опиоидов на адгезивные свойства клеток при посадке (рис.3).

3

М х

м

дни культивирования

Рисунок з. Зависимость пролиферативного,.ответа клеток глиомы С6 от количества воздействий даларгина (10~|и М). Среда Б. Смена среды и добавление пептида обозначены стрелками.

Оказалось, что воздействие пептиде на уже прикрепившиеся клетки также приводило к бифазному пролиферативному ответу. Так, при культивировании в среде Б обнаружено стимулирование размножения клеток под влиянием даларгина через 21 ч. после добавления (4-е сутки культивирования) и ингибирование через 4 8 ч. (5-е сутки культивирования) (рис.3). Обнаруженная бифазность

пролиферативного ответа- клеток Глиомы, т.е. смена реакции на противоположную, проявлялась без дополнительного добавления пептида. Следует отметить, что бифазный пролиферативный ответ был также обнаружен после однократного (первого) воздействия пептида на клетки, находящиеся в различных фазах кривой роста. После многократного воздействия даларгина бифазность реакции отсутствовала (рис.3, 9-11 сутки культивирования, предстационарная фаза кривой роста).

В исследованиях других авторов (Vértes et al., 1982; Zagon, McLaughlin, 1987), выполненных in vivo , обнаружен бифазный пролиферативный ответ клеток мозга на блокаторы опиоидных рецепторов : активирование синтеза ДНК сменялось ингибированием. Учитывая, что опиоидные пептиды синтезируются клетками нервной ткани, авторы объясняют бифазность повышением уровня эндогенных опиоидных пептидов и увеличением числа опиоидных рецепторов под влиянием блокатора.

Известно, что глиальные клетки, чкак нормальные, так и опухолевые, продуцируют энкефалины или их предшественники (Yoshikawa. Sabol. 1986; Noronha-Blob et al., 1986; Batter et a 1., 1991). He исключено, что добавление экзогенных энкефалинов в наших экспериментах изменяет уровень синтеза эндогенных энкефалинов, что приводит к аутокринной регуляции пролиферации, выражающейся в бифазности пролиферативного ответа.

По литературным данным воздействие экзогенного опиоида может изменять плотность опиоидных рецепторов, соотношение различных типов опиоидных рецепторов, а также содержание эндогенных опиоидных пептидов в межклеточной среде (Gilbert, Rlchelson, 1985; Suzuki . et al., 1991). Первое добавление пептида и его связывание с одним из нескольких типов опиоидных рецепторов в некоторых случаях приводит к "демаскировке" других типов опиоидных рецепторов (Glntzler, Hyde. 1984). В таком случае связывание эндогенных опиоидов с другим типом рецептора может вызвать противоположный пролиферативный ответ.

- 13 - .

При обсуждении возможных причин, обуславливающих бифазный пролиферативныя ответ клеток глиомы необходимо отметить, что опиоидные пептиды после добавления в культуру быстро разрушаются с образованием ди- и три-пептидов (Weinberger, Martines 1988; Schultels et al. 1989). He исключена возможность влияния этих продуктов на пролиферацию клеток глиомы.

Реальные причины, вызывающие бифазный пролиферативныя ответ клеток глиомы на опиоиды, не известны, и этот вопрос требует дополнительных исследований. Есть основания предполагать, что бифазность - распространенное свойство клеточного ответа на ОПИОИДЫ (Буглак и др. 1991; Sharma et , al. . 1975; Williams, Clouet, 1982; Craln 1988; Suzuku et al.,1991).

В середине логарифмической фазы роста после повторного добавления пептида не обнаружено достоверных различий между числом клеток в опыте и контроле (рис. 3, 6-8 сутки культивирования). Следует отметить, что авторы, изучающие разнообразные функции опиоидов указывают на существование периода толерантности, наступающего вслед за однократным (острым) применением агентов (Мартынова, Медведев, 1986,- craln et al., 1979). По-видимому, отсутствие реакции в середине логарифмической фазы кривой роста, зарегистрированное нами, аналогично развитию толерантности.

Таким образом, пролиферативныя ответ клеток глиомы С6 в проведенных нами экспериментах зависел от состава среды культивирования, времени, прошедшего после добавления и количества добавлений опиоидных пептидов. Первое воздействие опиоидов влияло на характер последующих воздействий. Возможность разнонаправленного клеточного ответа в различных условиях культивирования, а также бифазность, свидетельствуют о существовании динамичной регуляторной системы, участвующей в пролиферативном ответе клеток глиомы на опиоиды.

Действие различных концентраций опиоидов. В проведенных нами экспериментах лей-энкефалин и даларгин оказывали влияние на размножение глиальных клеток в широком диапазоне концентраций (Ю-7 - 10-12 м) . Часть этих концентраций совпадает с физиологически активными (10-10 - 10~12 М) (Roscettl et al., 1J88). Эти низкие концентрации обусловлены, вероятно) зеиепторным механизмом действия пептидов в нашей экспериментальной модели.

При исследовании действия различных концентраций опиоидов выло обнаружено, что при первом добавлении эффективными являются низкие концентрации пептида (ю'10 М) (табл.2, 3-й сутки культивирования), а при повторных (6-е сутки культивирования)

наиболее высокие (10

-7

М) .

Таблица 2. Влияние, различных концентраций лей-энкефалина и налоксона на включение Н-тимидина в клетки глиомы Сб. Среда А.

вещества

имп./мин.

* к контролю

контроль лей-энкефалин

налоксон

контроль лей-энкефалин

налоксон

третьи сутки культивирования

5515 + 328

10~1 М)

10. °М 1п 1'м1

4475 3793 3677 387 1

268 85 1 58 204

-7

-9 М

Юм 10 1 'м

34 12 ± 160 2796 ± 69 3064 + 301

шестые сутки культивирования

860 ± 26

I10 я м)

ю 2м ¡ю"12м)

по-_1 м) 10 9 м

577 662 671 752

40 9 53 51

786 ± 33 735 ± 23

1 00 81

69«*

67* 70*

62** 51 **

56*

100

67** 77**

78* 37

91 85*

1С -

10 -

5 -

1-контротп 4—налоксон

2-даллргш! 5-налоксон-Ьдаларгин

3-лвй-энхефешнн в-налоксон+лвй-эккефалин

**

*

12 3 4 5 6 7-в сутки культивирования

Рисунок 4. Первичная культура.слиальных клеток. Инсибирующее ютвие опиоидных пептидов 110" и М) , налоксона (10""' М) и их

ДНК. 7-е сутки культивирования.

действие суммы на

уровень синтеза

Этот сдвиг в сторону более высоких концентраций, вызванный повторным воздействием опиоида указывает на существование подвижной системы рецепции, участвующей в пролиферативном ответе клеток глиомы на опиоиды.

Действие блокатора опиоидных рецепторов налоксона на пролиферативный клеточный ответ. При использовании блокатора мю-, дельта- и каппа-типов опиоидных рецепторов налоксона было обнаружено, что налоксон ингибирует пролиферацию нормальных глиальных клеток (рис. 4 ) и оказывает модулируюиее влияние на пролиферацию клеток глиомы С6 в различных средах роста. Так, в среде Б налоксон как стимулировал (рис.5, 3-й сутки культивирования), так и ингибировал (8-е сутки культивирования) размножение клеток глиомы. В некоторых случаях было обнаружено разнонаправленное действие пептида и блокатора (11-е сутки культивирования). Налоксон проявлял активность в широком диапазоне концентраций (10~6 - 10"11 М) . После повторных добавлений блокатора (тавл. 2) отсутствовал сдвиг в сторону более высоких концентраций.

600

КО -400 300

зоэ -о 50 -

0

дш! культивирования

Рисунок 5. Влияние даларгина (10~10 М) , налоксона (Ю-7 М) и их суммк на пролиферацию клеток глиомы Сб. Среда Б.

Сочетанное добавление налоксона и опиоидного пептида показало, что налоксон не блокирует действие пептидов, а в ряде случаев

усиливает его (рис. 5, 8-е сутки культивирования). Отсутствие блокады было зарегистрировано как на клетках нормальной глии (рис. 4), так и на клетках глиомы С6 (рис. 6).

Т.о. наши результаты свидетельствуют о том, что в действии опиоидных пептидов на пролиферацию глиальных клеток участвуют, вероятно, и рецепторы, отличные от мю -, дельта- и каппа -типов.

Изменение аденилатциклазной активности клеток глиомы С6 под влиянием опиоидных пептидов. Одной из клеточных регуляторных систем, принимающих участие в действии пептидов на пролиферацию) может являться цАМФ-зависимая система (Rozengurt, Collins, 1983).

Опиоидные пептиды, по литературным данным, могут как ингибировать так и стимулировать базальную аденилатциклазную (АЦ) активность клеток мозга, а также ингибировать гормон-стимулированную АЦ активность (Olleman et al., 1979; Reggiani et al. 198 7 ). На гибридных клетках нейробластомы x глиомы и нейронах мозга показано, что в регуляции действия опиоидных пептидов на аденилатциклазную систему могут принимать участие ГТФ-связываюцие белки (Noronha-Blob et al, 1986).

В наших экспериментах даларгин и лей - энкефалин ингибировали гормон - стимулированную актйвность АЦ клеток глиомы Сб. Так,, 1-изопротеренол повышал активность АЦ опухолевых клеток в 2-6 раз, а опиоидные пептиды ингибировали 1-изопротеренол-стимулированную активность АЦ в среднем на 2 5* (табл.3). При этом сами пептиды стимулировали базальную АЦ активность в 1,8-3,4 раза. Стабильный аналог ГТФ - гуанил-Б-ил-имидодифосфат (Gpp(NH)p) стимулировал действие опиоидных пептидов на АЦ клеток глиомы в 2-2,5 раза [табл. 3), что позволяет предполагать участие ГТФ - связывающих белков (Childers, 1991).

Сопоставление измения базальной АЦ активности и уровня синтеза ДНК клеток глиомы С6 в логарифмической фазе роста под действием даларгина приведено на рисунке 6. Опиоидные пептиды как ингибировали, так и стимулировали базальную АЦ активность глиомных клеток в различные сроки культивирования. ¡Снетки, ' увеличившие уровень синтеза ДНК имели сниженный уровень базальной АЦ активности (3-й сутки культивирования, верхний рисунок) и наоборот ( 5-е сутки культивирования, нижний рисунок).

Таблица 3. Изменение аденилатциклазной активности глиомы С6 под влиянием тестируемых веиеств. Среда Б.

тестируемые веиества

активность аденилатциклазы (пмоль цАМФ/мг белка в мин.)

контроль даларгин (10

10

М)

1-изопротеренол (10 1-изопротеренол. 11 0 + даларгин (Ю"|и МА лея-энкефалин.(1 0" 1 ° вррГШПр (10 1 м)

0рр(МН)р (Ю~4 И) + лей-энкефалин (1 0

М)

1 о

М>

3,81 + 1,15

10,86 ± 0,87*»

18,70 ± 1,35*»

14,17 £ 0,89/

12,91 * 2,19

50,75 + 8,41*

32,69 ± 0,75«

* - р<0 , 05; ** - р<0.01 по сравнению с контролем; ' - р<0.05 по сравнению с 1-изопротеренолом; п - р<0.05 по сравнению с лей-энкефалином.

спаонтроль езщаларгин

I—ггптггрг-лт.

Г7-71ТГП ГТ!Чр1Ч< Ц

-•12

-0

-Ч

багальный уровень

уровень АЦ сшггеса ДНК

Изменение базального уровня АЦ активности слепа) и уровня синтеза,ДНК (рисунок справа) клеток глиомы С6 под влиянием опиоидов (10 ,и М). Вверху - 3-й сутки культивирования, гнизу - 5-е сутки культивирования. Среда Б.

Рисунок 6.

(рисунок ~~ под

Разнонаправленное действие опиоидных пептидов на вазальную АЦ активность (рис.6), а также противоположное действие на вазальную и гормон-стимулированную АЦ активность (табл.3) можно объяснить влиянием опиоидов как через ингиОирующие, так и через активирующие АЦ рецепторы.

Проведенные нами эксперименты продемонстрировали

противоположнонаправленное влияние опиоидов на уровень синтеза ДНК и АЦ активность клеток' глиомы. Данные других авторов подтверждают наши результаты. Так, на клетках глиомы С6 обнаружено, что форсколин, агент, повышающий уровень цАМФ, и дибутирил-цАМФ ингибируют уровень синтеза ДНК (Ortiz-Caro et al., 1 988; Amano et al., 1990). Вероятно, АЦ система принимает участие в регуляции пролиферативного ответа клеток глиомы С6 на опиоиды.

Возможность разнонаправленного влияния опиоидов на АЦ, различия в характере действия налоксона и опиоидных пептидов на пролиферацию клеток глиомы С6 косвенно свидетельствуют о действии опиоидных пептидов на глиальные клетки через различные типы рецепторов. Системы рецепции опиоидов и регуляции ( внутриклеточного содержания цАМФ могут играть роль s определении направленности влияния опиоидных пептидов на пролиферацию клеток.

Результаты проведенных экспериментов показали, что лея-энкефалин и даларгин являются факторами, влияющими на размножение нормальных и опухолевых глиальных клеток в культуре. Можно предположить, что эндогенные опиоидные пептиды принимают участие в пролиферации глиальных клеток как в процессе эмбриогенеза так и при различных патологических состояниях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что опиоидный пептид лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин являются факторами, изменяющими пролиферацию нормальных и опухолевых глиальных клеток.

2. Лей-энкефалин и даларгин ингибировали пролиферацию клеток первичной культуры глии и оказывали ингибируюшее или стимулирующее влияние на пролиферативную активность клеток глиомы С6 в зависимости от среды культивирования.

3. Однократное воздействие опиоидных пептидов на клетки глиомы СБ вызывало бифазный пролиферативный ответ: изменение направленности реакции без дополнительного добавления пептида. После многократного воздействия пептидов бифазность пролиферативного ответа отсутствовала.

4. Налоксон, блокатор мю, лельта и каппа - опиоидных рецепторов, не блокировал действие лей-энкефалина и даларгина на пролиферацию клеток глиального происхождения. Влияние исследованных пептидов, вероятно, опосредовано несколькими типами рецепторов, в том числе, отличными от мга-,дельта- и каппа-типов.

5. Лей-энкефалин и даларгин оказывали модулирующее влияние на базальную АЦ активность и понижали гормон-стимулированную активность АЦ клеток глиомы Сб. Впервые обнаружено противоположнонаправленное влияние опиоидов на уровень синтеза ДНК и АЦ активность клеток глиального происхождения. Указанная обратная зависимость свидетельствует об участии АЦ системы в регуляции пролиферативного ответа клеток на опиоиды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Слепко Н.Г., Козлова М.В. Действие нейропептидов на пролиферативную активность клеток в культуре // II Всесоюзная конференция по нейронаукам ( Киев, декабрь 1988г.): Тез.докл.-Киев, 1988 - С.147-148.

2. Козлова М.В., Слепко Н.Г., Красникова Т.Л. Изменение активности аденилатциклазы и пролиферации клеток глиомы С6 под влиянием пептидов //II Всесоюзная конференция по нейронаукам (Киев, декабрь 1988г.) : Тез. докл.- Киев, 1988 - с.39-40.

3. Козлова М.В., Глушенко Т.С., Слепко Н.Г., Таранова Н.П., Анджан A.C., Лучакова О.С. Дифференцировка глиальных клеток в культуре // Функции нейроглии : Тез.докл. Международного симпозиума (Тбилиси, 15-18 ноября 1989г.) - Тбилиси: Мецниереба, 1989 - с.43 . . '

4. Красникова Т.Л., Слепко Н.Г., Козлова М.В. Действие ингибитора Ма+ , к"*"-АТФазы на ß -адренорецепторзависимую аденилатциклазную систему клеток глиомы СБ // Актуальные вопросы клинической биологии: Тез.докл. Всесоюзного совещания (17-19 ноября 1989г., Ленинград)- Цитология, 1989 - т.31 - N 3 - с.1109-1110.

5. Слеп1.о Н.Г., Красникова Т. Л., Козлова М.В. Влияние опиоидных пептидов и вещества П на глиальные клетки и клетки глиомы СБ в культуре // Возбудимые клетки в культуре ткани : Те-;.докл. II Всесоюзного симпозиума (18-20 мая 1989г., Пущино) -Пуиино, 1990 - с.139-141.

6. Козлова М.В., Анджан A.C., Слепко Н.Г. Действие синтетического аналога лей-энкефалина даларгина и вещества П на

культуры спинного мозга и спинальных ганглиев крыс // Возбудимые клетки в культуре ткани: Тез.докл.II Всесоюзного симпозиума (182 0 мая 1989г., Пуиино). - Пуиино, 1990 - с.104-106.

7. Слепко Н.Г., Козлова М.В., Каленчук В.У., Анджан A.C. Участие опиоидных пептидов и вещества П в процессах созревания и пролиферации глиальных клеток в культуре // Физиологическое и клиническое значение регуляторных-пептидов : Тез.докл. симпозиума (27-29 ноября 1990г., Горький) - Пуиино, 1990 - с.167.

8. Слепко Н.Г., Козлова М.В. Исследование влияния синтетического аналога лей-энкефалина даларгина на пролиферативную активность клеток глиомы С6 и интенсивность синтеза в них ДНК // Цитология, 1992 - т.34 - N 1 - с.66-73.

9. Kozlova M.V., Andjan A.S., Slepko N.G. Opioid peptides and substance P as growth factors for nervous tissue // Signal molecules and behaviour / Eds. W.Wanlow, O.S. Vinogradova, D.A. Sacharov. Manchester Univ. Press. - Manchester. N.-Y.. 1991 -p.255-258.