Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Простаноиды и опиоиды в регуляции функций клеточных систем

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Сергеева, Марина Глебовна, Москва

У/ • ff ... / * _ У

7/ ' / оС$Г

московский государственный университет

им. м.в.ломоносова

На правах рукописи

сергеева марина глебовна

простаноиды и опиоиды в регуляции функций клеточных систем

03.00.04 - биохимия

диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений.............................................................................................. 6

Введение....................................................................................................................8

Глава 1. Методы и методики исследования..........................................................12

1.1. Использованные методики..............................................................................13

1.1.1. Реактивы и препараты...........................................................................13

1.1.2. Среды и растворы....................................................................................13

1.1.3. Буферы для выделения PGH-синтазы и определение активности фермента..................................................................................................15

1.1.4. Радиорецепгорный анализ......................................................................16

1.1.5. Клеточные культуры...............................................................................16

1.1.6. Насыщение перитонеальных макрофагов меченой арахидоновой кислотой..................................................................................................18

1.1.7. Метод гомогенного сцинтилляционного счета.....................................19

1.1.8. Подсчет клеток и оценка их жизнеспособности..................................19

1.1.9. Выделение препарата микросом из перитонеальных макрофагов.....19

1.1.10. Полярографическое определение PGH-синтазной активности........20

1.1.11. Спектрофотометрическое определение PGH-синтазной активности.............................................................................................20

1.1.12. Определение белка в анализируемых пробах.....................................21

1.1.13. Определение простаноидов, синтезируемых клетками......................21

1.1.14. Биосинтез простагландинов препаратами микросом.........................22

1.1.15. Оценка пролиферативной активности клеток....................................22

1.2. Метод оценки общей активности иммунной системы in vitro по реакции митоген-стимулированной пролиферации.....................................................22

1.2.1. Пролиферация лимфоцитов в ходе иммунного ответа........................23

1.2.2. Оптимизация метода митоген-стимулированной пролиферации

лимфоцитов...........................................................................................26

1.2.3. Определение уровня пролиферативной активности лимфоидных

клеток в модельной системе................................................................29

1.3. Развитие метода ВЭЖХ анализа простаноидов.............................................36

1.3.1. Методы определения простаноидов в биологических объектах...........36

1.3.2.Подготовка проб для хроматографического анализа..............................38

1.3.3. Выбор хроматографических условий.......................................................39

1.3.4 Получение флуоресцентных производных простаноидов......................41

1.4. Определение опиоидной активности радиорецепторным методом

анализа...............................................................................................................51

1.4.1. Общие принципы радиорецепгорного метода анализа с использованием препаратов мембран, содержащих рецепторы...........51

1.4.2. Использование радиорецепгорного метода анализа для детекции общей опиоидной активности.............................................................................52

Глава 2. Участие нервной и иммунной систем в установлении новых

гомеостатических состояний при наркотической зависимости....................56

2.1. Основные понятия проблемы возникновения пристрастия к химическим

веществам.........................................................................................................56

2.2. Основные структуры центральной нервной системы, вовлеченные в установление новых гомеостатических состояний при наркотической зависимости.......................................................................................................57

2.3. Опиоидные вещества и их рецепторы............................................................62

2.3.1. История открытия опиоидных рецепторов и их эндогенных лигандов.....................................................................................................62

2.3.2. Гетерогенность опиоидных рецепторов..................................................65

2.3.3. Регуляция процессов, участвующих в проведении сигналов опиоидных рецепторов.................................................................................................70

2.4. Бимодальные эффекты действия опиоидов при различных концентрациях...................................................................................................74

2.5. Изменение концентрации опиоидных веществ при введении в организм животных...........................................................................................................79

2.6. Анализ возможности участия иммунной системы в возникновении наркотической зависимости.............................................................................82

2.6.1. Изменения в иммунной системе при длительном введении

наркотических веществ in vivo................................................................84

2.6.2. Модуляция иммунной системы приводит к изменениям реакции нервной системы на наркотические вещества.....................................85

2.6.3. На иммунокомпетентных клетках существуют специфические рецепторы к наркотическим веществам................................................86

2.6.4. Возможные механизмы модуляции функций иммунной системы наркотическими веществами..................................................................89

Глава 3. Влияние оииоидных веществ на функции клеток иммунной

системы.......................................................................................................94

3.1. Кинетика пролиферации лимфоидных клеток человека под действием опиоидных веществ...........................................................................................94

3.1.1. Влияние морфина, (З-эндорфина и налоксона на кинетику митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов, полученных от различных доноров...................................................................................96

3.1.2. Механизм модулирующего влияния морфина на ФГА-стимулированную пролиферацию лимфоцитов...................................104

3.1.3. Сравнение влияния опиоидных веществ на динамику пролиферации первичных лимфоцитов и трансформированных лимфоидных клеток человека...................................................................................................109

3.2. Влияние опиатов и опиоидных пептидов на синтез простаноидов

макрофагами.................................................................................................113

Глава 4. Базальный синтез простаноидов в регуляции функций клеточных

систем...............................................................................................................122

4.1. Простаноиды - регуляторы физиологических функций организма............122

4.2. Базальный синтез простаноидов перитонеальными макрофагами

мыши...............................................................................................................124

4.3. Влияние РОЕ2 на пролиферацию лимфоцитов............................................128

Глава 5. Простагландин Н синтаза перитонеальных макрофагов мыши..........132

5.1. Биохимический механизм метаболизма простаноидов...............................132

5.1.2. Простагландин Н синтаза - ключевой фермент биферментной системы синтеза простаноидов.............................................................................134

5.1.2. Вторые ферменты биферментной системы синтеза простаноидов -

РСН-конвертазы.................................................................................... 138

5.2. Получение и характеристика простагландин Н синтазы перитонеальных

макрофагов мыши...........................................................................................142

5.3. Внутриклеточные механизмы регуляции синтеза простаноидов...............147

5.4. Роль арахидоновой кислоты в регуляции биосинтеза простаноидов макрофагами.....................................................................................................157

Глава 6. Регуляция нестероидными противовоспалительными препаратами

базального синтеза простаноидов макрофагами............................................174

6.1. Исследования регуляции базального синтеза простаноидов в макрофагах нестероидными противовоспалительными препаратами.............................178

6.2. Влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на пролиферацию спленоцитов...........................................................................189

6.3. Влияние бруфена на заживление линейных ран крыс................................191

Заключение..............................................................................................................202

Выводы....................................................................................................................205

Список литературы.................................................................................................208

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - арахидоновая кислота

[3Н]АК - меченая тритием арахидоновая кислота

[3Н]тимидин- меченый тритием тимидин

Кон.А - конканавалин А (митоген)

ЛПС - липополисахарид (митоген)

ФГА - фитогемааглютинин (митоген)

МФ - митоген фитолакки

РО - простагландин

Тх - тромбоксан

ЬТ - лейкотриен

НЕТЕ - гидроксиэйкозатетраеновая кислота

ННТ -гидроксигептадекатриеновая кислота

ЕЕТ - эпоксиэйкозатриеновая кислота

МБА - малоновый диальдегид

РЬ - фосфолипаза

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВгММС - 4-бромометил-7-метоксикумарин

взн - восстановленный глютатион

В8А - бычий сывороточный альбумин

ЕСБ - телячья эмбриональная сыворотка

РВ8 - фосфатно-солевой буфер

НПП - нестероидные противовоспалительные препараты

с-АМР - аденозин-3 \5' -цикломонофосфат

АТР - аденозинтрифосфат

ЬАТ - лизофосфолипид-арахидонил СоА-трансфераза

СоА - кофермент А

СоА-1Т - СоА-независимая трансацилаза

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

РС - фосфатидилхолин

РЕ - фосфатидилэтаноламин

PI - фосфатидилинозит

PS - фосфатидилсерин

P LA? - фосфолипаза A2

PLC - фосфолипаза С

DADLE - Tyr-D-Ala-Gly-D-Leu - селективный агонист опиоидных

рецепторов 5 типа DAGO - Tyr-D-Ala-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol - селективный агонист

опиоидных рецепторов ¡i типа DPDPE - [D-Pen2, D-Pen5] - энкефалин - селективный агонист

опиоидных рецепторов 8 типа ICI174864 - N,N - diallyl-Tyr- Aib-Aib-Phe-Leu- обращенный

агонист опиоидных рецепторов, где Aib=d-aminobutyric acid

ВВЕДЕНИЕ

С середины 80-х годов начались интенсивные исследования взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной клеточных систем на молекулярном уровне. Взаимосвязи этих систем наиболее ярко проявляются при установлении новых гомеостатических состояний, связанных со старением, длительным воздействием стрессирующих условий, употреблением наркотических веществ, хроническими заболеваниями, а также при изменениях, вызванных введением эндотоксинов и провоспалигельных веществ. Для всех названных процессов характерны такие общие явления, как изменение концентраций простаноидов и опиоидов.

Класс опиоидов включает в себя растительные алколоиды (морфин и другие компоненты опиума) и эндогенные опиоидные пептиды (энкефалины, эндорфины и другие). К настоящему времени достаточно хорошо сформировано представление о том, что опиоиды определяют устойчивость организма к различным дестабилизирующим факторам и ключевым этапом их воздействия на клетки является взаимодействие с рецепторами, однако молекулярные механизмы активации клеток опиоидами и клеточной адаптации к длительному воздействию этих веществ оставались неясными.

Класс простаноидов (простагландины, тромбоксаны, простациклины) - это производные полиненасыщенных жирных кислот, важнейшей из которых является арахидоновая. Простаноиды относятся к физиологически активным соединениям с широким спектром биологической активности. Они принципиально важны в системе крови, в репродуктивной системе, в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, воспалительных и иммунных ответах организма. Кроме того, к важнейшей защитной реакции организма относят развитие воспаления как ответной реакции на изменение гомеостаза. Интенсификация развития воспаления вызывается провоспалигельными веществами, из которых основными считаются простаноиды. Важным источником простаноидов в организме являются

макрофаги. Эти клетки принимают активное участие в регуляции процессов воспаления, развитии иммунного ответа. Синтезируемые макрофагами простаноиды оказывают влияние на пролиферацию клеток, секрецию интерлейкинов, антителообразование и т.д. Простаноиды имеют короткое время полупревращения, поэтому количественные характеристики ферментов их синтеза определяют во многих случаях физиологическую активность простаноидов. Ключевым ферментом биосинтеза простаноидов является простагландин Н синтаза (РОН-синтаза). В последние пять лет, после открытия новой изоформы РОН-синтазы, индуцируемой при активации клеток провоспалигельными агентами, количество работ в этой области резко возросло. Широко используемые в фармакологической практике нестероидные противовоспалительные препараты являются ингибиторами РОН-синтазы, и, следовательно, всего биосинтеза простаноидов. Тем не менее, к моменту постановки настоящей работы сведения о механизме образования простаноидов клетками, и их роли в регуляции функций клеточных систем были весьма ограничены.

Возможность существования взаимосвязи опиоидной и простаноидной систем обсуждали еще в 70-х годах, однако эта взаимосвязь на уровне клеток была не изучена, что связано, в первую очередь, с многопараметровостью исследуемых систем. Необходимо было выбрать объект для исследований, который бы позволял исследовать функции и опиоидов, и простаноидов.

Представления о гомеостазе на уровне организма получили широкое развитие в работах физиологов. С другой стороны, в настоящее время значительно продвинулись работы по молекулярным и биохимическим исследованиям внутриклеточных механизмов передачи сигналов гормонов и других физиологически активных веществ на уровне отдельных ферментов и ферментных систем. В то же время существует разрыв между этими двумя уровнями. Необходимо развитие комплексных биохимических и физико-химических исследований регуляции жизнедеятельности организма на уровне клеток и взаимодействующих клеточных систем, включающие в себя все этапы регуляции по схеме: внеклеточный стимул-субстрат-фермент-

продукт-клеточный эффект. Такого рода исследования и проводятся в данной работе.

Настоящее исследование посвящено изучению взаимосвязи действия опиоидов и простаноидов на клетки иммунной системы, биохимических стадий синтеза простаноидов макрофагами с целью понимания основных закономерностей действия этих веществ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд фундаментальных и практических задач. Предстояло:

- выявить особенности действия опиоидов на клетки иммунной и нервной

систем',

- проанализировать участие нервной системы в установлении новых гомеостатических состояний при наркотической зависимости и возможность участия иммунной системы в формировании при этом неспецифических защитных реакций организма',

- выявить основные закономерности регуляции синтеза простаноидов клетками;

- осуществить поиск взаимосвязи простаноидов и опиоидов на уровне клеток.

Для выявления такого рода взаимосвязи выбраны клетки иммунной системы, т.к. они позволяют (1) моделировать in vitro ответы иммунной системы; (2) выделять компоненты этой системы и исследовать влияние изучаемых веществ на отдельные типы клеток; (3) иметь значительные количества биоматериала для биохимических исследований. Важно также, что клетки иммунной системы имеют рецепторы к исследуемым классам веществ и отвечают на активацию этих рецепторов изменением клеточных функций. Клетки иммунной системы удобны для изучения взаимодействия различных клеток при прямом действии опиоидов, и опиоидные рецепторы головного мозга - для исследований динамики регуляции функций нервной системы при длительном введении опиоидов животным.

Объектом наших исследований выбраны макрофаги, т.к. синтезируемые ими простаноиды влияют на пролиферацию клеток, секрецию интерлейкинов, антителообразование и т.д., что проявляется в

активном участии макрофагов в регуляции процессов воспаления, развитии иммунного ответа. Решение поставленной задачи было связано с необходимостью:

- выделить и охарактеризовать РСН-синтазу из макрофагов;

- сравнить кинетические закономерности синтеза простаноидов целыми

клетками и микросомами;

- сравнить динамику синтеза простаноидов клетками из арахидоновой

кислоты, вводимой извне или высвобождаемой из внутриклеточных

источников;

- выявить физиологическое значение процесса синтеза простаноидов

макрофагами и возможность его регуляции.

Установление механизмов регуляции функций различных клеточных систем опиоидами и простаноидами даст возможность понять фундаментальную проблему поддержания гомеостаза организма и сформулировать принципы коррекции различных патологических процессов.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выполнение поставленной цели было возможным с привлечением общепринятых в биохимии и клеточной биологии методик с использованием стандартного биохимического оборудования, которые приведены без детального описания в разделе 1.1. Методики, развитые в процессе исследования, выделены в специальные разделы и рассмотрены более подробно. Для решения задач данного исследования были предложены подходы и развиты методы, которые подробно рассмотрены в этой главе:

1) Оценка общей активности иммунной системы in vitro по реакции митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов (раздел 1.2.). Предложена модель пролиферации лимфоидных клеток in vitro, которая позволяет анализировать кинетику процессов в клеточном цикле и механизмы инактивации пролиферации. По результатам анализа модели предложена оптимальная сх