Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Простаноиды и оптиоиды в регуляции функций клеточных систем

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Простаноиды и оптиоиды в регуляции функций клеточных систем"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.ВЛОМОНОСОВА

СЕРГЕЕВА МАРИНА ГЛЕБОВНА

ПРОСТАНОИДЫ И ОПИОИДЫ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

На правах рукописи

Москва-1998

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, Московский государственный университет им. М.В Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Е.С.Чухрай доктор химических наук С.О.Бачурин доктор биологических наук А.В.Филатов

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится " S " 1998 года в 1600 час на

заседании диссертационного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " У " 1998 года

Ученый секретарь /

диссертационного совета, / у/

0-А.Кост ^ " ■ /

кандидат химических наук £>■ ''

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы и выбор объектов исследования. С середины 80-х годов начались интенсивные исследования взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной клеточных систем на молекулярном уровне. Взаимосвязи этих систем наиболее ярко проявляются при установлении новых гомеостатических состояний, связанных со старением, длительным воздействием стрессирующих условий, употреблением наркотических веществ, хроническими заболеваниями, а также при изменениях, вызванных введением эндотоксинов и провоспалительных веществ. Для всех названных процессов характерны такие общие явления, как изменение концентраций простаноидов и опиоидов. Установление механизмов регуляции функций различных клеточных систем этими классами веществ позволит понять фундаментальную проблему поддержания гомеостаза организма и сформулировать принципы коррекции различных патологических процессов. Решение этой проблемы выдвигает на первый план комплексные биохимические и физико-химические исследования регуляции жизнедеятельности организма физиологически активными веществами на уровне клеток и взаимодействующих клеточных систем. Такого рода исследования и проводятся в данной работе.

Класс опиоидов включает в себя растительные алколоиды (морфин и другие компоненты опиума) и эндогенные опиоидные пептиды (энкефалины, эндорфины и другие). К настоящему времени достаточно хорошо сформировано представление о том, что опиоиды определяют устойчивость организма к различным дестабилизирующим факторам и ключевым этапом их воздействия на клетки является взаимодействие с рецепторами, однако молекулярные механизмы активации клеток опиоидами и клеточной адаптации к длительному воздействию этих веществ оставались не ясными. Нами выбраны клетки иммунной системы как объект, удобный для изучения взаимодействия различных клеток при прямом действии опиоидов и опиоидные рецепторы головного мозга для исследований динамики регуляции функций нервной системы при длительном введении опиоидов животным.

Класс простаноидов (простагландины, тромбоксаны, простациклины) - это производные полиненасыщенных жирных кислот, важнейшей из которых является арахидоновая. Простаноиды относятся к физиологически активным соединениям с широким спектром биологической активности. Они принципиально важны в системе крови, в репродуктивной системе,

в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, воспалительных и иммунных ответах организма. Эти вещества имеют короткое время полупревращения, поэтому количественные характеристики ферментов их синтеза и определяют во многих случаях физиологическую активность простаноидов. Ключевым ферментом биосинтеза простаноидов является простагландин Н синтаза (PGH-синтаза). В последние пять лет, после открытия новой изоформы PGH-синтазы, индуцируемой при активации клеток провоспалительными агентами, количество работ в этой области резко возросло. Широко используемые в фармакологической практике нестероидные противовоспалительные препараты являются ингибиторами фермента PGH-синтаза, и, следовательно, всего биосинтеза простаноидов. Тем не менее, к моменту постановки настоящей работы сведения о механизме образования простаноидов клетками, и их роли в регуляции функций клеточных систем были весьма ограничены. Объектом наших исследований выбраны макрофаги, т.к. синтезируемые ими простаноиды влияют на пролиферацию клеток, секрецию интерлейкинов, антителообразование и т.д., что проявляется в активном участии макрофагов в регуляции процессов воспаления, развитии иммунного ответа.

Возможность существования взаимосвязи опиоидной и простаноидной систем обсуждали еще в 70-х годах, однако эта взаимосвязь на уровне клеток была не изучена, что связано, в первую очередь, с многопараметровостыо исследуемых систем. Для выявления такого рода взаимосвязи нами выбраны клетки иммунной системы, т.к. они позволяют (1) моделировать in vitro ответы иммунной системы; (2) выделять компоненты этой системы и исследовать влияние изучаемых веществ на отдельные типы клеток; (3) иметь значительные количества биоматериала для биохимических исследований. Важно также, что клетки иммунной системы имеют рецепторы к исследуемым классам веществ и отвечают на активацию этих рецепторов изменением клеточных функций.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению взаимосвязи действия опиоидов и простаноидов на клетки иммунной системы, исследованию синтеза простаноидов макрофагами с целью понимания основных закономерностей действия этих веществ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить ряд фундаментальных и практических задач, основными из которых являлись следующие:

- выявить закономерности действия опиоидов на клетки иммунной и нервной систем;

- проанализировать участие нервной системы в установлении новых гомеостатических состояний при наркотической зависимости и возможность участия иммунной системы в формировании при этом неспецифических защитных реакций организма;

- осуществить поиск взаимосвязи простаноидов и опиоидов на уровне клеток;

- выделить и охарактеризовать РОН-синтазу из макрофагов;

- сравнить кинетические закономерности синтеза простаноидов целыми клетками и микросомами;

сравнить динамику синтеза простаноидов клетками из арахидоновой кислоты, вводимой извне или высвобождаемой из внутриклеточных источников;

выявить физиологическое значение процесса синтеза простаноидов макрофагами и возможность его регуляции.

Научная новизна. В диссертационной работе выдвинуто и экспериментально обосновано положение о непосредственном участии клеток иммунной системы в формировании неспецифических защитных процессов при введении в организм разлшшых наркотических веществ, выявлены закономерности действия опиоидов на В- и Т-лимфоциты и макрофаги, показано, что опиоиды непосредственно действуют на синтез простаноидов макрофагами. Впервые проведено изучение РОН-синтазы перитонеальных макрофагов мыши. Определен спектр основных простаноидов, синтезируемых макрофагами: РОЕ2, РОРаа и ТхВ2 и показано, что качественный состав простаноидов, базально синтезируемых клетками, не изменяется под действием различных физиологических агентов. Показано, что, кинетика синтеза простаноидов клетками из арахидоновой кислоты из внешних и внутренних источников различна, для РОН-синтазы в клетке предпочтительна эндогенная форма субстрата - арахидоновой кислоты. Обнаружено, что макрофаги поддерживают соотношение концентраций синтезируемых простагландинов на определенном уровне. Показано, что клетки в состоянии покоя, в отсутствие какого-либо физиологического стимула в процессе культивирования активно метаболизируют арахидоновую кислоту в простаноиды. Это свидетельствует о том, что одной из функций макрофагов может являться обеспечение постоянной эндогенной концентрации простаноидов в организме.

Изучение физиологической роли эндогенно синтезируемых простаноидов тканевыми макрофагами позволило впервые обнаружить бимодальный концентрационный эффект РОЕ2 на пролиферативную активность лимфоцитов. Исследование влияния нестероидных противовоспалительных препаратов на базальный синтез простаноидов макрофагами позволило впервые обнаружить явление активации синтеза простаноидов при действии пикомолярных концентраций этих препаратов, которые считались ранее классическими ингибиторами РОН-синтазы. Показана физиологическая значимость этих концентраций в регуляции функций иммунной системы.

Практическая значимость. Сформулирован ряд общих подходов к проведению биохимических исследований с животными клетками по схеме: стимул-субстрат-продукт ферментативного превращения-эффект, что представляет несомненный практический интерес для изучения механизмов взаимодействия различных классов физиологически активных веществ и целенаправленного поиска новых эффективных лекарственных средств. Разработан метод радиорецепторного анализа на основе лиофилизованных мембранных препаратов для детекции опиовдной активности в субклеточных жидкостях и плазме крови. Предложена схема кинетических экспериментов по исследованию эффектов иммуномодуляторов на пролиферацию лимфоидных клеток. Впервые показан противоположный эффект морфина на пролиферацию лимфоидных клеток разных типов, что существенно при терапии рака, когда опиоиды применяются как анальгетики. Оптимизирован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с детекцией флуоресцентных производных простаноидов, присутствующих в биологических объектах в виде многокомпонентной смеси. Метод позволяет проводить индивидуальный анализ этих веществ в биологических образцах с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью определения (1*2 нг). При изучении физиологической роли простаноидов, синтезируемых тканевыми макрофагами, показано, что вещества, в терапевтических дозах ингибирующие синтез простаноидов макрофагами, в более низких концентрациях активируют этот синтез. Установлено, что для физиологической регуляции принципиально важно изменение эндогенной концентрации РОЕз в любую сторону от базального уровня. Полученные результаты создают научные основы для выяснения механизмов различных заболеваний. Обнаруженное в работе явление активации нестероидныеми противовоспалительными

препаратами в пикомолярных концентрациях синтеза простаноидов клетками интересно не только с точки зрения фундаментальных аспектов исследования РОН-синтазы, но и имеет важное практическое значение для фармакологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на I Международном конгрессе Международного Общества Нейроиммуномодуляции (1990, Флоренция), на Всесоюзном симпозиуме по биохимии рецепторных систем (1990, Таллинн), на IX (1994, Флоренция) и X (1996, Вена) Международных конференциях "Простагландины и сопутствующие компоненты", на ГУ Европейском конгрессе по клеточной биологии (1994, Прага), на I Европейском конгрессе по фармакологии (1995, Милан), на VI Международной конференции "Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского" (1995, Москва), на Международной конференции "Биокатализ-95" (1995, Суздаль), на II съезде биохимического общества РАН (1997, Москва), на XVII Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (1997, Сан-Франциско)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работы.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из расширенного введения, 6 экспериментальных глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (429 наименований). Объем диссертации составляет 245 страниц, в том числе 52 рисунка и 28 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение.

Сформулирован ряд конкретных задач для решения проблемы установления новых гомеостатических состояний организма, даны основные понятия и определены границы данного направления исследований. Охарактеризованы преимущества выбранного подхода для решения общей проблемы установления гомеостаза через исследования взаимодействия опиоидов и простаноидов на уровне клеток иммунной системы.

Глава 1. Методы и методики исследования.

Методики, развитые в процессе исследования, выделены в специальные разделы и рассмотрены более подробно. Для решения задач данного исследования были предложены подходы и развиты методы, которые подробно рассмотрены в этой главе:

1) Оценка общей активности иммунной системы in vitro по реакции митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов (раздел 1.2.). Предложена модель пролиферации лимфоидных клеток in vitro, которая позволяет анализировать кинетику процессов в клеточном цикле и механизмы инактивации пролиферации. По результатам анализа модели предложена оптимальная схема проведения экспериментов по исследованию действия модулирующих агентов на пролиферацию лимфоидных клеток.

2) Определение простаноидов в субклеточных жидкостях методом ВЭЖХ с детекцией их флуоресцентных производных, получаемых с использованием флуоресцентного агента - 4-бромметил-7-метоксикумарина (раздел 1.3). Проведена оптимизация получения производных и условий их разделения, рассмотрено влияние различных веществ субклеточных жидкостей на чувствительность и воспроизводимость детекции.

3) Определение активности опиоидов в субклеточных жидкостях радиорецепторным методом анализа (раздел 1.4). Рассмотрены теоретические основы применения этого метода для количественного определения опиоидных лигандов. Проанализирована схема качественного анализа на опиовдную активность веществ неизвестной природы. Разработан метод определения опиоидов в плазме крови животных, основанный на использовании препарата лиофилизованных мембран и меченых лигандов с различной селективностью к типам опиоидных рецепторов.

Приведены также методики выделения клеток: перитонеальных макрофагов и спленоцитов мыши, мононуклеаров периферической крови человека, культивирования клеточных линий человека, лимфом и линий макрофагального ряда; методы гомогенного и гетерогенного сцинтилляционного счета; описаны методики выделения и исследования PGH-синтазы из перитонеальных макрофагов мыши, а так же методики биосинтеза простаноидов препаратами микросом, насыщения клеток меченой арахидоновой кислотой; приведены методики дополнительной очистки используемых реагентов.

Глава 2. Участие нервной и иммунной систем в установлении новых гомеостатических состояний при наркотической зависимости. Вопрос о причинах пристрастия к химическим веществам затрагивает фундаментальные аспекты теории биологических мотиваций. Рассмотрены основные понятия

проблемы возникновения пристрастия к химическим веществам и структуры центральной нервной системы, вовлеченные в установление новых гомеостатических состояний при наркотической зависимости. Для выяснения механизмов возникновения устойчивости (толерантности) к опиоидам и зависимости от них изучали влияние многократного введения крысам морфина и пептида ß-эндорфина на свойства опиоидных рецепторов головного мозга. Сравнивали параметры лиганд-рецепторного комплексообразования ц-, 5-, к- типов опиоидных рецепторов (табл.1). Показано, что при многократном введении морфина, изменяется только часть рецепторов, через которые морфин проводит сигнал (5-рецепторы). Обсуждается роль нескольких центров связывания действующего вещества в реализации регуляторных функций и феномене бимодальных эффектов опиодов на внутриклеточные биохимические процессы.

Таблица 1. Влияние многократного введения морфина животным на параметры рецепторного связывания: константу диссоциации (К) и концентрацию мест связывания ([R]o). Приведены медианы интервалов значений параметров, полученные для каждой группы животных. Группа 1 -морфинизированные животные; группа 2 - контрольные животные._

1 2 центр

центр

Рецептор Группа

к, [Rio, IRlo/K к, [R]°, (R|o/K

нМ нМ нМ нМ

ц- 1 0,59 0,011 0,018 11,9 0,018 0,003

(морфин) 2 0,60 0,008 0,030 15,0 0,030 0,004

8- 1 0,32 0,011 0,025 20,1 0,132 0,007

(DAD LE) 2 0,25 0,008 0,033 7,0 0,118 0,016

к- этилкето- 1 0,28 0,007 0,023 5,9 0,056 0,010

цикло- 2 0,81 0,017 0,021 4,7 0,059 0,014

зоцин**

* Центры связывания: 1 - супервысокоаффинный, 2 - высокоаффинный

** Связывание этилкетоциклозоцина изучали в присутствии 100 нМ морфина и 100 нМ DADLE (0-А1а2-0-Ьеи5-энкефалин)

Исследована фармакокинетика морфина и опиоидного ггептида даларгина при их внутривенном введении в организм

животных, показано, что опиоидная активность присутствует в плазме крови длительное время после деградации даларгина и параметры элиминации опиоидной активности для опиоидов и опиоидных пептидов близки. Анализ современных данных по влиянию наркотических средств на установление новых гомеостатических состояний на уровне всего организма и его отдельных систем показал, что распространенность поЛинаркоманий, наличие наркогенного действия у широкого круга психотропных средств указывает на неспецифичность психофизиологического механизма наркотического пристрастия. В результате рассмотрения возможных биохимических механизмов этого явления сформулированы представления о роли иммунной системы как основного компонента, ответственного за развитие неспецифических процессов при установлении новых гомеостатических состояний, и вероятном участии опиоидов и простаноидов в регуляции этих явлений на уровне клеток.

Глава 3. Влияние опиоидных веществ на функции клеток иммунной системы. Функции иммунной системы реализуются при взаимодействии различных типов клеток и физиологически активных веществ. Для выявления участков взаимодействия опиоидной и простаноидных систем в реализации функций иммунной системы в работе проведено детальное исследование влияния опиатов на пролиферацию клеток иммунной системы. Пролиферация под действием антигенов или митогенов является ключевым этапом в развитии ответов клеток.

Анализ литературных данных показал, что введение морфина in vivo приводит к ингибированию митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов (супрессия до 90%). Оставалось не ясным, влияет ли морфин на пролиферацию лимфоцитов при его введении in vitro; если влияет, то можно ли соотнести эти эффекты с прямым действием морфина на клетки иммунной системы. Литературные данные по эффектам морфина и опиоидных пептидов на митоген-стимулированную пролиферацию лимфоцитов человека не согласовывались между собой. Не существовало также однозначного мнения о блокировании этих эффектов антагонистами опиоидных рецепторов. Как правило, влияние опиоидных лигандов оценивали в одной временной точке, а динамика процесса не рассматривалась в связи с большой трудоемкостью экспериментов. В данной работе пролиферацию лимфоцитов определяли на протяжении всего процесса, т.е. в течение 7-8 дней после активации процесса митогеном. Проведены

исследования влияния различных концентраций морфина, ¡5-эндорфина, а также антагониста налоксона на пролиферацию мононуклеаров периферической крови человека. Установлено, что морфин и (3-эвдорфин вызывают множественные эффекты, величина и направленность которых определяются индивидуальными особенностями донора, концентрацией эффектора и временем экспозиции. Показано, что налоксон не блокирует эффекты морфина и обладает собственным модулирующим действием на пролиферативную активность лимфоцитов. В результате проведенных комплексных исследований действия морфина показано, что (1) морфин снижает уровень пролиферации лимфоцитов периферической крови человека стимулированных ФГА (Т-клеточный митоген) и МФ (В-клеточный митоген); (2) максимальное модулирующее влияние проявляется на 3-5 сутки инкубации с митогеном, величина эффекта зависит от донора и не превышает 50% от контроля (рис.1); (3) удаление морфина из системы перед добавлением митогена приводит к усилению ингибирующего эффекта до уровня, сопоставимого с влиянием морфина in vivo (рис.2); (4) морфин влияет на стад™ активации митогеном, удаление морфина из системы через 12 ч не влияет в дальнейшем на проявление модулирующего эффекта (рис.2).

200 А 200

о 175 - 1 175

150 — 150

5. и 125 - 125

S н U 100 - ' 2 100

о 75 - 75

а s í-i 50 - 50

'ы < 25 25

л_

30 60 90 1 20 1 50 1 80 Время,

30 60 90 часы

120 150 1 80

Рис.1. Кинетика митоген-сшмулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови различных доноров (А и Б) под действием морфина. Пролиферативную активность оценивали по включению [3Н]-тимидина каждые 24 ч. Время инкубации с меткой - 24 ч. 1 - контроль; 2 - 10"6М морфин

12 3 4

Рис.2. Митоген-стимудированная пролиферация лимфоцитов

человека, прединкубированных с морфином (10"6М).

1 - одновременно добавили морфин и митоген (контроль);

2 - клетки инкубировали с морфином 12 ч, затем добавили митоген;

3 - клетки инкубировали с морфином 12 ч, отмыли и добавили митоген;

4 - клетки инкубировали с морфином 12 ч, отмыли и добавили митоген и морфин.

В результате проведенных исследований выяснено влияние морфина на разные типы клеток иммунной системы и определена зависимость модулирующего действия морфина от соотношения клеток разных типов, участвующих в процессе пролиферации. Показано, что морфин (1) снижает уровень пролиферации клеток линий В-лимфоцитов человека, трансформированных ЭБВ, и В-лимфомы человека ИатаЬ/а (рис.3); (2) активирует пролиферацию клеток Т-лимфомы человека 1игка1; (3) активирует митоген-стимулированную пролиферации лимфоцитов при удалении моноцитов из фракции мононуклеаров (рис.4). На основании собственных и литературных данных' предложена схема регуляции функций клеток иммунной системы опиоидами.

Рис.3. Влияние морфина на пролиферацию различных

клеточных линий лимфоидного происхождения.

1, 2 - ЭБВ-трансформированные лимфоциты человека;

3 - №та1уа (В-лимфома);

4 - 1игка1 (Т-лимфома); 5 - К562 За 100% принята величина пролиферации

каждой линии в отсутствии морфина

л

В

о X

СО

3

н <

ш

Среди клеток, участвующих в развитии пролиферативных ответов моноциты (макрофаги) служат основным источником простаноидов. Простаноиды ингибируют

¡-о 175

о г-н 150

£ 125

о. 100

и

Л 75

н

о о 50

я сз 25

0

н

5<й

<

175 А 150 125 100 75 50 25 -0

п

72 96 120 72 96 120

Время инкубации, ч

Рис.4. Влияние морфина (10"бМ) на пролиферативную активность ФГА-стимулированных лимфоцитов в присутствии моноцитов в системе меток. Белые столбики - контрольные клетки, заштрихованные столбики - с морфином. А - исходная клеточная система; Б - та же система после удаления моноцитарной фракции.

Морфин и ФГА добавляли одновременно. Пролиферативную активность оценивали по включению [3Н]тимидина.

пролиферацию лимфоцитов. Мы установили, что именно макрофаги являются теми клетками, на которых происходит ключевой этап взаимодействия опиоидной и простаноидной систем. Для получения информации об этом взаимодействии мы исследовали динамику высвобождения радиоактивных продуктов из макрофагов, предварительно меченых [ЗН]-арахидоновой кислотой (АК). Полученные результаты позволили выбрать оптимальные условия и охарактеризовать высвобождаемые метаболиты методом ВЭЖХ. Показано, что опиоиды влияют на выброс арахидоновой кислоты и ее метаболитов, величина влияния имеет колоколообразный вид, в зависимости от концентрации с максимумом 10"8М для морфина, 10~9М для налоксона, Ю_10-10-ПМ для опиоидных пептидов ((3-эндорфина и Меоэнкефалина). В качестве примера на рис.5, приведены данные по влиянию морфина. Эффект проявляется также при действии опиоидов на фоне различных стимуляторов синтеза простаноидов (рис.6). Развитая в диссертации методика ВЭЖХ детекции позволила доказать прямое действие опиоидных веществ на синтез простаноидов макрофагами (рис.7). Обнаруженное явление регуляции способности клеток к базальному синтезу простаноидов в зависимости от концентрации опиоидов указывает на возможность взаимодействия опиоидных и простаноидных систем

в установлении новых гомеостатических состояний организма и о возможной роли базального синтеза простаноидов в этом процессе.

2

время, мин

Рис.5. Влияние морфина на высвобождение [3Н]арахидоновой кислоты (АК) и ее метаболитов из макрофагов.

Концентрация морфина (М): 1-Ю"6; 2-Ю-8; 3-Ю"10; 4-0 (контроль)

Рис.6. Влияние морфина (10"8М) и налоксона (10~8М) на высвобождение [3Н1арахидоновой кислоты (АК) и ее метаболитов макрофагами, при их стимуляции А23187- и Липополисахаридом (ЛПС). Клетки инкубировали 2 ч: I-нестимулированные клетки; 2-ЛПС; 3- ЛПС и морфин; 4 - А23187; 5 -А23187 и морфин; б- А23187, морфин, налоксон; 7 - А23187, налоксон.

В

а.

3 га

5

4 -

з -2 1

о

Рис.7. Влияние опиоидов на синтез простаноидов макрофагами. 1 - контроль; 2 - налоксон (10'9)М;

3 - морфин (10"8)М;

4 - Ме1:-энкефалин (10"8)М. Белые столбики - РОЕг; Заштрихованные столбики - РОР2а

8 200 б

Глава 4. Базадьный синтез простаноидов в регуляции функций клеточных систем. Макрофаги являются главным звеном в развитии воспалительных процессов, одним из биохимических носителей которых являются простаноиды, поэтому в литературе имеются сведения преимущественно о действии провоспалительных агентов на синтез простаноидов. Наши исследования с огоюидами впервые указали на возможное значение базального синтеза простаноидов макрофагами в поддержании гомеостаза. Выявление этого факта и явилось целью дальнейшего исследования.

Проведенное исследование свидетельствует о том, что нестимулированные макрофаги не только синтезируют простаноиды, но и поддерживают их концентрацию на постоянном уровне. Более того, в наших исследованиях мы показали, что любые отклонения от этого уровня изменяют функциональное влияние простаноидов. Характерной особенностью кинетики процесса является то, что после смены внеклеточной жидкости в синтезе простаноидов наблюдается период индукции около часа, а к 4 часам уровень простаноидов достигает стационарного состояния (рис.8, табл.2).

Рис.8. Кинетика высвобождения меченых метаболитов арахидоновой кислоты макрофагами в процессе культивирования.

Таблица 2.

Синтез простаноидов несгимулированными макрофагами.

Время, часы

Время инкубации, ч Синтез РОЕ2 простаноидов, РОР2„ кг/млн клеток ТхВ2

1 следы* следы следы

2 33а=13 31±7 16+2

4 98+12 89±20 24±10

6 85+10 80±13 следы

ерш

срга

концентрации РОЕэ:

в - О М (контроль) □ - 10"7М О - 10"8М О - 10-»М Д - ю-им

V - 10-12М

О 20 40

60 80 100 Время, часы

о:

в:

48 часов пролиферации клеток

-И -и -12 -и -20

К 1ГСЕ, М1

| 90

72 часа пролиферации клеток

-II -и -12 -XI -10

;> [рое,. М1

Рнс.9. Пролиферация лимфоцитов селезенки мьшш в присутствии разных концентраций РОЕг- а: кинетика пролиферации клеток, б-в: зависимость пролиферации от концентрации экзогенного РОЕ1 в разных временных точках. Степень пролиферации оценивали по включению [3Н]тимидина в клеточную ДНК. Тимидиновый тест проводили каждые 24 часа инкубации. Концентрация конканавалина А - 2 мкг/мл, начальное число клеток - 1 млн/мл.

Для определения физиологического значения этого процесса исследовали влияние простагландина Е2 (РОЕг), основного простаноида, синтезируемого макрофагами, на митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов, клеток, полученных из селезенки мыши, которые представляют собой смесь лимфоцитов и макрофагов. Найдено, что спленоциты синтезируют простаноиды в наномолярном диапазоне. РОЕз добавляли одновременно с митогеном в условиях, когда собственный синтез простаноидов макрофагами незначителен. Из рис.9 видно, что при наномолярной концентрации РОЕ2, соответствующей базальной, уровень пролиферации не меняется по сравнению с контролем. Концентрации же выше (10_7М) и ниже (10"10М) базального, вызывают снижение уровня пролиферации. Таким образом, иммунная система адаптирована к базальной концентрации простаноидов и способна реагировать на ее изменения. Нами продемонстрирована прямая корреляция между уровнем эндогенных простаноидов и индексом пролиферативной активности клеток. Обнаружено явление двойственной роли РСЕ^, когда не только повышение, но и понижение его концентрации относительно базального уровня имеет регуляторный эффект. Этот факт открывает новое направление в исследовании роли простаноидов в регуляции жизнедеятельности организма.

Глава 5. Синтез простаноидов макрофагами. Фермент РСН-синтаза является ключевым в синтезе простаноидов клетками. Достаточно хорошо изучена РОН-синтаза, выделенная из везикулярных желез барана. Сведения же о характеристиках этого фермента из макрофагов в литературе отсутствовали. По разработанной нами методике выделена РОН-синтаза из перитонеальных макрофагов мыши и проведено сравнение кинетических свойств полученного фермента с известными свойствами фермента из классического источника - везикулярных желез барана. В работе показано, что РОН-синтазы из двух источников практически сходны по: (1) значениям константы Михаэлиса реакции окисления арахидоновой кислоты; (2) чувствительности к действию бруфена, конкурентного ингибитора фермента; (3) по константам скорости инактивации фермента в процессе реакции, определенным по кинетике накопления РвЕг (рис.10). Таким образом установлено, что кинетические характеристики РОН-синтазы из макрофагов не отличаются от соответствующих характеристик аналогичного фермента из везикулярных желез.

Рис.10. Сравнение кинетических характеристик РОН-синтазы из перитонеальных макрофагов мыши и везикулярных желез барана

Определение Км

60 80 100

[АК.мкМ]

20 40 60 80 100 1/(АК, мкМ]-10'

Определение 1Сзо для бруфена

О 50 100 150 200 250 (Бруфен, мкМ1

3

«г

Определение константы инактивации фермента в ходе реакции Р=Р1ш(1-ехр(-к;паа0).

кшасг=0.21±0,02 мин"1

Время, мим.

15 20 25 30

Время, К КН.

кшас1=0Д7±0,02 мин"1

го ;о :з

Времд, «кн.

Обозначения:

• - РОН-синтаза из перитонеальных макрофагов мыши О - РОН-синтаза из везикулярных желез барана

Исследована также зависимость синтеза простаноидов от концентрации исходного субстрата, арахидоновой кислоты (АК), для целых клеток и микросом. Использование метода ВЭЖХ позволило впервые провести анализ спектров синтезируемых продуктов в зависимости от концентрации исходного субстрата (Рис.11). Показано, что микросомы метаболизируют АК в РОЕг и р0р2а, и РСЕ2 остается основным метаболитом. Соотншение синтезируемых простаноидов остается постоянным при изменении концетрации АК (приблизительно 2:1), их количество пропорционально концентрации АК. Для клеток характерна колоколообразная зависимость синтезируемых метаболитов от концентрации АК (рис.11 А) и, кроме РОЕг и РОРза, появляется ТхВ2. Стремление поддерживать соотношения концентраций синтезируемых простагландинов на определенном уровне в условиях различной стимуляции клеток является особенностью синтеза простаноидов макрофагами.

Арахидоновая кислота, как физиологически активное вещество, модулирует многие функции клеток и может находится во внеклеточном пространстве в значительных количествах. В

Рис.11. Синтез простаноидов РОРза (1), РСЕо (2), ТхВ2 (3) макрофагами (А) и микросомами (Б) при инкубации клеток с разными концентрациями арахидоновой кислоты (АК). Время инкубации - 2 часа.

Z PGs

300 • 250 •

PGE2

.a" 8

200 -

150

100 -

50

A

140

120 -100

S3

8 80 -&

I 60

UJ*

о

Оч

20 -0 -

Time (hours)

Рис.12. Синтез простаноидов кальций-ионофора А23187 (•) или (106/мл) инкубировали в стерильных в течение часа с момента выделения синтез простаноидов макрофагами в за нулевой уровень.

2 3 4

Time (houa)

макрофагами при действии 5 мкМ Ю"5 М АК (□). Условия: макрофаги условиях в среде DMEM с 0,5% БСА до добавления стимула. Базальный момент добавления стимула принят

Б

о

работе проведено сравнение синтеза простаноидов макрофагами из АК, поступающей к ферменту в клетке из экзогенного и эндогенного источника. Для исследования синтеза простаноидов из эндогенной АК использовали кальций ионофор А23187, который активирует процессы высвобождения АК из фосфолипвдов клеточных мембран.. Исследование синтеза простаноидов клетками из экзогенной АК проводили при добавлении субстрата в среду культивирования клеток. Известно, что АК с высокой скоростью проникает через плазматическую мембрану (Ц/2<1с). В то же

время, как показано нами, кинетика синтеза простаноидов при стимуляции клеток АК значительно отличается от кинетики синтеза при стимуляции А23187 (рис.12), при этом качественный состав синтезируемых простаноидов в условиях различной стимуляции клеток не изменяется. Уровень простаноидов, которые синтезируются макрофагами, достигается уже через 5 минут активации клеток А23187, а при действии экзогенной АК только через 2 часа инкубации. Отличия в кинетике синтеза простаноидов клетками при использовании субстрата РОН-синтазы, поступающего к ферменту из разных источников, является важной особенностью синтеза простаноидов клетками и позволяет считать, что для РОН-синтазы в клетке предпочтительна эндогенная форма субстрата, вероятно, обеспечиваемая клеточными фосфолипазами.

Глава 6. Регуляция базального синтеза простаноидов в макрофагах нестероидными противовоспалительными препаратами. С целью дальнейшей характеристики значения базального синтеза простаноидов и поиска путей его регуляции было исследовано влияние нестероидных противовоспалительных препаратов на базальный синтез простаноидов перитонеальными макрофагами. Изучено действие бруфена в широком диапазоне концентраций на высвобождение радиоактивной метки из [3Н]АК-меченых клеток. Показано, что высокие концентрации бруфена, необходимые для ингибирования РОН-синтазы, ингибируют и этот процесс. При этом определяемая величина Ю50 согласуется с величиной Ю50, найденной для препарата микросом (рис.13). Однако пикомолярные концентрации бруфена вызывают

противоположный эффект - активацию высвобождения радиоактивной метки из перитонеальных макрофагов (рис. 13,А). Высвобождаемые макрофагами в присутствии низких концентраций бруфена метаболиты АК были идентифицированы методом ВЭЖХ. Установлено, что инкубация макрофагов с пикомолярными концентрациями бруфена ведет к 2-3-х кратному увеличению высвобождения в межклеточное пространство РОЕг и РО?2а (табл.3). Обнаруженное явление активации синтеза простаноидов может быть связано с воздействием на ключевой фермент синтеза - РОН-синтазу или с доступностью субстрата -АК. Для проверки последнего предположения исследовано влияние бруфена в широком диапазоне концентраций на высвобождение метаболитов АК макрофагами, активированными А23187 (рис.13,Б). Видно, что добавление А23187 к макрофагам не влияет на проявление активирующего эффекта пикомолярных

175

«К 150 -

I

125 -

100

75 -

50 -

10 8 6 -[Бруфен, М]

Рис. 13. Влияние бруфена в широком диапазоне концентраций на высвобождение [3Н] метаболитов арахидоновой кислоты перитонеальными макрофагами мыши. Условия: клетки инкубировали в стерильных условиях при 37°С в атмосфере воздуха с 5% СО2. Время инкубации макрофагов с бруфеном -2 часа. А: базальный выброс метки. Б: выброс метки на фоне действия А23187, 5 мкМ. За 100 % принят уровень радиоактивности в среде в отсутствие бруфена.

Таблица 3. Влияние низких концентраций бруфена на синтез

Бруфен,М Уровень простагландинов, % *

РвЕг

ю-' 149±11 150+25

10"10 154±27 175+25

10-12 315±84 320+20

10-13 180±25 230+20

Ю-14 - 122±20 200+30

•за 100% принят уровень каждого простагландииа, синтезируемого клетками к двум часам инкубации в отсутствие бруфена

концентраций бруфена.

Методом ВЭЖХ доказано, что наблюдаемая и в этом случае активация обусловлена

увеличением синтеза

простаноидов (табл.3). Таким образом, нами установлено, что обнаруженное явление активации синтеза

простаноидов при действии пикомолярных концентраций бруфена на

не стимулированные макрофаги сохраняется и при активации клеток и не связано непосредственно с регуляцией доступности субстрата - АК.

Более того, оказалось, что явление активации синтеза простаноидов бруфеном сравнимо по величине с влиянием А23187, т.е. величина обнаруженного нами эффекта находится в типичных пределах изменения клеточных ответов.

Для того, чтобы определить, связано ли наблюдаемое явление именно с ферментами синтеза простаноидов или это возможные проявления свойств самого бруфена и его влияния на какие-либо клеточные процессы, было исследовано влияние других ингибиторов РСН-синтазы:

индометацина и анальгина на синтез простаноидов клетками. Из табл.4 видно, что эти соединения имеют различное химическое строение, значения Ю. для них отличаются друг от друга на порядок. Однако, нами установлено, что при действии пикомолярных концентраций любого из выбранных препаратов, независимо от класса препарата наблюдается активация синтеза простаноидов (табл.4). Следовательно, обнаруженное явление активации синтеза простаноидов не связано с индивидуальными химическими свойствами молекул бруфена. Таким образом, при изучении регуляции базального синтеза простаноидов макрофагами впервые показано, что нестероидные противовоспалительные препараты в пикомолярных концентрациях активируют синтез простаноидов в макрофагах.

Таблица 4. Нестерокдные противовоспалительные препараты -ютгибиторы фермента простаглащцш Н-синтазы.

Структура Ингибирование Рв Н-синтазы Активация синтеза простаноидов клетками, %*

0 СН — Оч -V. Г 3 V ;! '■' ] снг с\ Ч^Ч А он ^ =н3 С—О 0 1 С1 индометацин К1=(2,4±0.7)10-6 М 166±9

СН, ГЛ 1 / 3 он бруфен К[=(1±0.1)10-5М 200±10

/СН3 Сн3\ -"ч | ( чон2—$огм. п анальгин К1=(9,8±2,2)10"4М 173±15

Рис. 14. Кинетика

высвобождения [3Н| АК и ее метаболитов при действии 10"12М бруфена на перитонеальные макрофаги мыши. За 100 % принят уровень радиоактивности в среде культивирования в отсутствие бруфена.

Время, часи

2 0 0 -

175

150

125 -

100 -

75 -

Полученные данные позволили предположить, что наблюдаемая активация синтеза простаноидов связана с регуляцией активности РОН-синтазы. Мы исследовали влияние пикомолярных концентраций бруфена на кинетические характеристики фермента в микросомах, однако не обнаружили никакого влияния на начальную скорость РОН-синтазной реакции, степень конверсии АК, на параметры инактивации фермента в ходе реакции. Таким образом, наблюдаемое явление существует только на клеточном уровне.

Активирующее влияние бруфена изменяется в зависимости от времени его нахождения в системе. Обнаружено, что максимум активации наблюдается при 2 часах инкубации, но после 4 часов эффект исчезает и восстанавливается прежний уровень эндогенных простаноидов (рис.14). Таким образом активация клеточного синтеза простаноидов под действием пикомолярных концентраций нестероидных противовоспалительных препаратов имеет временный характер и дополнительно свидетельствует о способности макрофагов поддерживать строго определенный уровень синтезируемых простаноидов.

Для выявления возможной физиологической роли действия бруфена в различных концентрациях исследовано его влияние на пролиферацию спленоцитов мыши. Показано, что низкие концентрации бруфена, также как и высокие, активируют пролиферацию (рис.15). Это подтверждает высказанное нами предположение, что изменение концентрации эндогенных простаноидов в сторону понижения или повышения от базального уровня модулирует ответы иммунной системы. Исследования на животных по влиянию низких концентраций бруфена на

4

I 100

I

so

•10 -8 ig [нпвп, mi

ко

140 120 100

•10 -I LS 1КПВП. Ч|

Рис.15. Влияние бруфена (•) и аспирина (В) на пролиферацию спленоцитов для 48 (А) и 72 (Б) часов инкубации клеток с конканавалином А. 100 % -уровень митоген-стимулированной пролиферация клеток без добавления препаратов.

60 -

-в

4

заживление линейных ран у крыс позволили нам продемонстрировать существование этого явления in vivo.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что макрофага в покоящемся состоянии синтезируют простаноиды, которые с одной стороны, поддерживаются на строго определенном уровне, а с другой стороны, этот уровень может модулироваться. При этом активация синтеза простаноидов может осуществляется теми же веществами, которые в высоких концентрациях ингибируют их синтез. Установлен факт активации синтеза простаноидов клетками в присутствии нестероидных противовоспалительных препаратов в пикомолярных концентрациях. Это является наиболее интересной особенностью синтеза простаноидов клетками, т.к. имеет важное значение не только для фундаментальных исследований фермента PGH-синтазы, но и для фармакологии.

выводы

1. В результате комплексных исследований показано, что простаноиды и опиоицы активно участвуют в регуляции функций клеточных систем. Установлено влияние опиоидов на синтез простаноидов. Физиологическое действие опиоидов связано с активным участием простаноидов.

2. Методом радиорецепторного анализа установлено, что при многократном введении морфина крысам, происходит изменение 8-опиоидных рецепторов, ц-рецепторы остаются неизмененными.

3. На основе препаратов лиофилизованных мембран с применением разработанного радиорецепторного метода анализа исследовано кинетическое поведение морфина и пептида даларгина в крови животных, определены параметры фармакокинетических процессов при внутривенном введении опиошшых веществ.

4. Исследована кинетика митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови человека под воздействием морфина и опиоидных пептидов. Показано, что классический антагонист опиоидных рецепторов - налоксон не блокирует эффекты морфина и обладает собственным модулирующим действием на пролиферацию лимфоцитов. Предложена схема влияния опиатных лигандов на клетки иммунной системы.

5. Обнаружен противонаправленный эффект морфина на лимфоидные клетки различных типов: ингибирование пролиферации клеток, происходящих от В-лимфоцитов, и активация пролиферации клеток, происходящих от Т-лимфоцитов. Предложена модель пролиферации аутокринных лимфоидных клеток in vitro, которая позволяет анализировать кинетику процессов в клеточном цикле и механизмы инактивации пролиферации. Разработана оптимальная схема проведения экспериментов по исследованию действия модулирующих агентов на пролиферацию лимфоидных клеток.

6. Впервые установлено явление прямого влияния опиоидных лигандов на синтез простаноидов клетками макрофагального ряда, т.е. показана взаимосвязь простагландиновой и опиоидной систем на уровне клеток.

7. Исследовано физиологическое значение базального синтеза простаноидов макрофагами. Впервые обнаружен бимодальный эффект действия экзогенного PGE2 на пролиферацию клеток в диапазоне концентраций 10"8 и 1СИ2М. Показано, что при концентрации, соответствующей базальному уровню PGE2 -

10'9М, - экзогенный PGE2 не влияет на пролиферативную активность клеток.

8. Впервые из перитонеальных макрофагов выделен ключевой фермент синтеза иростаноидов - PGH-синтаза и проведено сравнение ее кинетических свойств со свойствами PGH-синтазы, получаемой из везикулярных желез барана. Показана идентичность кинетических характеристик ферментов из обоих источников по основным параметрам: Км, IC50 бруфена, инактивации фермента в ходе реакции (k^J.

8. Установлено, что соотношение синтезируемых макрофагами простаноидов сохраняется в условиях различной стимуляции клеток. Показано, что синтез простаноидов клетками зависит от динамики поступления субстрата PGH-синтазы - арахидоновой кислоты. Предложена схема метаболизма арахидоновой кислоты в клетках макрофагального ряда.

9. Исследована регуляция базального синтеза простаноидов макрофагами под действием широкого диапазона концентраций нестероидных противовоспалительных препаратов классических ингибиторов синтеза простаноидов. Впервые обнаружено, что пикомолярные концентрации этих ингибиторов активируют синтез простаноидов макрофагами и ускоряют заживление линейных ран крыс.

Основные результаты диссертации изложены в следующих

публикациях:

1. И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева. С.В.Зайцев (1982) "Исследование стабильности препарата синаптосом головного мозга крыс" В сб.: Тезисы 3 Всесоюзной межуниверситетской конференции по "физико-химической биологии", Тбилиси, с. 282-283.

2. С.В.Зайцев. И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева (1983) "Радиорецепторный анализ опиатов и опиоидных пептидов с использованием препаратов лиофилизованных мембран" В сб.: Тезисы докладов 1У Всес.симпозиума "Инженерная энзимология", Киев, с. 100

3. Сергеева М.Г. (1983) "Радиорецепторный метод анализа опиатов и опиоидных пептидов с использованием препарата лиофилизованных мембран. - В сб: Тезисы научных сообщений IX Всес. конференции по биохимии нервной системы, Ереван, с.85.

4. С.В.Зайцев. И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева. С.Д.Варфоломеев (1983) "Использование препарата лиофилизованных мембран головного мозга для скрининга и количественного анализа

опиоидных пептидов и опиатов" В сб.: Тезисы докл. У1 Всес.симпозиума "Химия белков и пептидов", Рига, с.239-240.

5. С.В.Зайцев, И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева. А.С.Молокоедов, М.И.Титов, С.Д.Варфоломеев (1983) "Влияние лиофилизации мембран головного мозга на свойства опиатных рецепторов" Докл. АН СССР, т.272, N 4, с.982-983.

6. И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева. С.В.Зайцев, С.Д.Варфоломеев (1984) "Корреляция между изменением свойств опиатных рецепторов и структурной целостностью синаптосом" Биохимия, 49, вып.6, с. 948-952.

7. С.В.Зайцев, И.Н.Курочкин. М.Г.Сергеева. С.Д.Варфоломеев

(1984) "Стабильность опиатных рецепторов "сырых" и лиофилизованных препаратов мембран головного мозга крыс" Биохимия, т.49, вып.7, с. 1127-1133.

8. С.В.Зайцев. М.Г.Сергеева. С.Д.Варфоломеев (1985) "Радиорецепторный анализ: теоретические основы метода. -Биоорг. химия, т.И, № 3, с. 370-379

9. Сергеева М.Г. (1985) "Использование радиорецепторного метода анализа на основе стабильного препарата лиофилизованных мембран для изучения фармакокинетики опиатных лигандов" В сб: Тезисы докладов У Всесоюз. симпозиума по инженерной энзимологии, Олайне, с. 143.

10. С.В.Зайцев. И.Н.Курочкин, М.Г.Сергеева. О.А.Склянкина

(1985) "Влияние условий лиофилизации мембранных препаратов рецепторов на их активность и стабильность" В сб.: Тезисы докладов У Всесоюз. симп. по инженерной энзимологии, Олайне, с.99.

11. М.Г.Сергеева. И.Н.Курочкин, О.А.Склянкина, С.В.Зайцев, С.Д.Варфоломеев (1986) "Использование препаратов лиофилизованных мембран для радиорецепторного анализа опиатов и опиоидных пептидов" Нейрохимия, т.5, N 1, с. 11-19.

12. С.В.Зайцев. М.Г.Сергеева. О.Н.Чиченков, В.Е.Петров, СД.Варфоломеев (1986) "Изменение характеристик опиатных рецепторов в головном мозге у крыс в условиях развития привыкания к морфину" Биохимия, т. 51, вып.8, с. 1334-1339.

13. C.B. Зайцев, В.А.Виноградов, М.Г.Сергеева. О.Ф.Дмитриева, И.О. Иваников, С.Д.Варфоломеев, М.И.Титов (1986) "Радиоиммунное и радиорецепторное изучение фармакокинетики аналога энкефалинов даларгина у человека" Бюлл. эксп. биол. мед., N 6, 702-704.

14. М.Г.Сергеева. О.Ф.Дмитриева, Ж.Д. Беспалова, С.В.Зайцев

(1986) "Сравнительное изучение радиорецепторным методом

фармакокинетики опиатных лигандов морфина и даларгина" Бюллетень ВКНЦ АМН СССР, вып.2, с. 81-83.

15. Шестак К.И., Сергеева М.Г.. Зайцев С.В., Харченко Е.П., Варфоломеев С.Д., Калихевич В.Н., Ардемасова З.А. (1989) "Анализ новых опиатоподобных пептидов радиорецепторным методом" Укр. биохимический журнал, т. 62, N 2, с.23-29.

16. Шестак Г.И., Сергеева М.Г.. Зайцев С.В., Калихевич В.Н., Ардемасова З.А. (1989) "Взаимодействие новых опиатоподобных пептидов с опиоидными рецепторами головного мозга крыс" Тезисы докл. Всес. конф. "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффекторные клетки" Суздаль, с.218.

17. Varfolomeev S. D., Sergeeva M.G.. Z.V.Leshenko (1990) "The kinetics of the mitogen-stimulated proliferation of human lymphocytes under influence of morphine" Abstracts of 1-st Int. Congress Int. Society of Neuroimmunomodulation, Firenze, Italy, P. 209.

18. Sergeeva M.G.. Z.V.Leshenko, Varfolomeev S.D. (1990) "Determination of opioid receptors on blood cells and immunomodulator properties of morphine" Abstracts of Soviet Union's Symposium on Biochemistry of Receptor Systems, Tallinn.

19. Сергеева М.Г.. Гришина 3.B., Куликов В.В., Варфоломеев С.Д. (1992) "Роль иммунной системы в механизмах действия наркотических веществ" Нейрохимия, т.11, N 1, с.89-102 (обзор).

20. М.Г.Сергеева. З.В.Гришина, С.Д.Варфоломеев (1992) "Влияние морфина на кинетику митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови человека" Иммунология, N 5, с.62-63.

21. М.Г.Сергеева. З.В.Гришина, С.Д.Варфоломеев (1992) "Модуляция пролиферации первичных лимфоцитов и трансформированных лимфоидных клеток человека морфином" Иммунология, N 6, с. 63-64.

22. Сергеева М.Г.. Ильина Ф.Д., Зайцев С.В., Варфоломеев С.Д. (1992) "Десенситизация рецепторов низкомолекулярных лигандов" Успехи биохимических наук, с.252-279 (обзор).

23. Sergeeva. M.G.. Terentjeva, I.V., Mevkh, А.Т. (1993) "Opioid ligands exert the direct influence on the release of arachidonic acid and its metabolites from peritoneal macrophages" Abstracts of the 22nd FEBS Meeting, Stockholm, p. 204.

24. Sergeeva M.G.. Terentjeva I.V., Z.V.Grishina, and Varfolomeev S.D. (1993) "Direct influence of morphine on the release of

arachidonic acid and its metabolites" FEBS Lett., V. 323, N 1,2, P. 163-165.

25. Sergeeva M.G, Z.V.Grishina, S.D.Varfolomeev (1993) "Morphine effect on proliferation of normal and tumor cells of immune origin" Immunol. Lett., v.36, p.215-218.

26. M.G.Sergeeva. M. Grigoijan, Z.V.Grishina, A.T.Mevkh (1994) "The existence of low concentration effects of ibuprofen and aspirin on the immune cell responses" Abstracts of 9th International Conference on Prostaglandins and Related Compounds, Firenze, Italy, P. 120.

27. Z.V.Grishina, M.G.Sergeeva (1994) "New approach to modeling of cell cycle events of lymphoid cells" Abstracts of the 4th European Cell Biology Congress, Praga, Czech Republic. Cell Biology International, V.18, P. 495.

28. M.Sergeeva. Z.Grishma, I.Terentjeva, A.Mevkh (1994) "Interaction of opioid and eicosanoid systems in regulation of immune cell functions" Abstracts of 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Delhi, India, P.217.

29. Z.V.Grishina, M.G.Sergeeva (1995) "Suppression of human blood lymphocyte proliferation upon in vitro preincubation of cells with morphine" Abstracts of First European Congress of Pharmacology, Milan, Italy, P.331.

30. Sergeeva M.G.. Gonchar M.V., Grishina Z.V., Mevkh A.T. (1995) "Macrophage prostaglandin synthesis under influence of ultra-low concentrations of Ibuprofen" Pharmacological research, vol.31-SuppI., P.133.

31. M.G.Sergeeva. M.V.Gonchar, Z.V.Grishina, A.T.Mevkh, S.D.Varfolomeyev (1995) "Low concentrations of nonsteroidal antiinflammatory drugs affect cell functions" Life Sci., v.56 (16), PL313-319.

32. М.Г.Сергеева. З.В.Гришина СД.Варфоломеев (1995) "Механизм влияния морфина на пролиферацию лимфоцитов человека" Иммунология, 5, 35-38 .

33. M.G.Sereeeva. M.V.Gonchar, A.T.Mevkh (1996) "Biphasic effects of prostaglandin E2 on the cell proliferation" Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, v. 55 (suppl.l), p. 29.

34. M.V.Gonchar. M.G.Sergeeva. B.B.Chystyakov (1996) "HPLC method with fluorescence detection of cell prostaglandin synthesis" Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, v. 55 (suppl.l), p. 29

35. M.G.Sergeeva. M.V.Gonchar, V.V.Chistyakov, A.T.Mevkh (1996) "Ultra-Low Concentrations of Ibuprofen Activate Cell Prostaglandin Synthesis" Appl.Biochem.Biothech, 61(1/2), 167-171.

36. Гончар M.В., Сергеева М.Г.. Намгаладзе Д.А., Мевх А.Т. (1997) "Регуляция ферментативного синтеза простаноидов в макрофагах" Второй съезд биохимического общества Российской Академии наук 19-23 мая, Москва. Тезисы стендовых сообщений, 4.1, С. 19.

37. Kurochkin I.N., Nicolova L.A., Barsegov V.A., Sereeeva M.G. and Sukhomlin Т.К. (1997) "Irregular fluctuatuations in opiate antagonist binding with immune cells" J.Physiol., 499, 41P.

38. Gonchar M.V.. Sereeeva M.G.. Mevkh A.T. (1997) "Lymphocyte proliferation is adapted to basal prostaglandin E2 concentration influence." FASEB.J., vol.11, №3, P.AI055.

39. Namgaladze D.A.. Sergeeva M.G., Gonchar M.V., Mevkh A.T. (1997) "Dymamics of arachidonic acid turnover upon differentiation of human monocytoid cells" Abstracts of FEBS Advanced Course on lipid signals (Santa Maria Imbaro (Chieti), Italy, Consorzio Matio Negri Sud) p.56

40. Сергеева М.Г.. Гончар M.В., Намгаладзе Д.А., Мевх А.Т., Варфоломеев С.Д. (1997) "Простаглацдин Н-синтаза макрофагов мыши: ингибирующее и активирующее действие бруфена" Биохимия, 62, 3, 316-322.

41. Сергеева М.Г.. Намгаладзе Д.А., Гончар М.В., Мевх А.Т. (1997) Изменение метаболизма арахидоновой кислоты при дифференцировке клеток макрофагального ряда, Вестник Московского университета, сер. 16, биология, N4, 19-23.

42. Sergeeva M.G.. Gonchar M.V., Mevkh А.Т., Varfolomeyev S.D. (1997) "Prostaglandin E2 biphasic control of lymphocyte proliferation: inhibition by picomolar concentration" FEBS Lett., 418, 235-238.