Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментные системы синтеза простаноидов. Препаративное получение природных и модифицированных тритием соединений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферментные системы синтеза простаноидов. Препаративное получение природных и модифицированных тритием соединений"

л

"и

и

ШРАМ Станислав Иванович

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ СИНТЕЗА ПРОСТАНОИДОВ. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТРИТИЕМ СОЕДИНЕНИИ

03.00.04 биохимия

03.00.23 биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Отделе химии физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН и в Секторе биокинетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Н.Ф. Мясоедов доктор химических наук, профессор С-Д. Варфоломеев Научный консультант: •

кандидат химических наук П.В. Вржещ

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, профессор А.И. Мирошников доктор биологических наук, профессор Н.К. Наградова Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.,

“ ММ"

Защита состоится ' ь>1995 года часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом Факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический Факультет,

Кафедра химической энзимсшогии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " (1££С7~'Л^г<р 1995 года

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

ост

. Простаноиды представляют собой большую группу физиологически активных метаболитов С20 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) , продуктов циклооксигеназного путо их превращения, включающую простагландины и тромбоксаны. Обнаружение новых соединений, обладающих уникальной структурой и биологической активностью, стимулировало поиск ферментов, ответственных за их синтез, и изучение механизма действия этих метаболитов. ■

Исследование биологической и фармакологической активности простаноидов показало, что в ряде случаев они могут быть успешно использованы в качестве лекарственных препаратов. Внедрение в лечебную практику новых препаратов на основе простаноидов требует разработки недорогих и эффективных методов получения этих соединений. В необходимых для производства лекарственных препаратов количествах простаноиды могут быть получены только путем синтеза, так как их содержание в животных тканях незначительно. Несмотря на то, что большинство ферментов синтеза простаноидов было выделено и охарактеризовано, их практически не используют для получения простаноидов. Причина заключается в низком выходе продуктов и больших затратах ферментов, выделяемых, как правило, из дефицитного сырья. Перспективы использования ферментов для практического синтеза простаноидов связаны с решением ряда задач, основными из которых являются оптимизация синтеза и поиск способов предохранения ферментов от инактивации, происходящей в ходе каталитической реакции.

Изотопномодифицированные простаноиды в большинстве случаев могут быть получены только ферментативным путем. В то же время, существующие методы сводятся к описанию способов получения лишь нескольких соединений этой группы и не позволяют получать их с высоким выходом.

Целью работы является разработка эффективных ферментативных методов препаративного получения природных и модифицированных тритием простаноидов.

♦ Список использованных в тексте сокращений: АА- арахилоновая кислота: 12-НЕТЕ- 12(5)-гндрохси-52,32,10Е. Ыг-эйкозэтстраеноныс кпслаш: 12-ННТ- 12(5)-гидрокси-52,8Е,10Е-гептаккатри«ювая кислота: 12-лнпоксигеназа- арахндоиовая кислсгга:12-лнпоксигеназа; ПНЖК- поливеаасышяшые жирные клслстга: Рй- просгаглашши; РС сиптаэа - простагланшшзвдоперокснд сиптаза; ТА- тимнодоновая кислота: ТХ- тромбоксаи.

Научнаиноцижи.раГшж

Разработаны новые методы синтеза природных и модифицированных тритием простаноидов. Они основаны на: а)-использовании биферментной реакции превращения эйкозаполиеновых кислот в простагландины О, £, Р типов и тромбоксан в установленных нами оптимальных условиях; б)- использовании для проведения ферментативного синтеза стабилизированных эмульсий органического растворителя в воде; в)- использовании простагландин(РО- и тромбоксан(ТХ)-специфичных кеторедуктаз и дегидрогеназ для стерео- и региоселективной модификации простагландиноо О, Е, Р типов и тромбоксана; г)- использовании каталаэной активности ферментного препарата Р6-эндопероксид синтазы (РС синтазы) для обеспечения быстрого протекания кислород-зависимого синтеза короткоживущих простагландинов; д)- использовании восстанавливающих агентов для направленного синтеза продуктов оксигенирования арахидоновой кислоты <АА) АА:12-липоксигеназой (12-липоксигеназой).

Впервые проведено исследование кинетики реакций синтеза простаноидов из эйкозаполиеновых кислот в искусственных биферментных системах, полученных из индивидуальных ферментов. Выявлены процессы, лимитирующие синтез простаноидов о биферментной системе.

Впервые показано, что инактивация в ходе реакции тромбоксак синтазы, 12-липоксигеназы и Рв синтазы протекает по одному и тому же кинетическому механизму. Обнаружено, что устойчивость РЭ синтазы в коде реакции в исследуемых системах зависит от химической природы субстрата и практически не зависит от факторов внешней среды.

Показано, что в присутствии нативных микросомальных мембран образуются стабилизированные эмульсии алифатических растворителей в воде и воды в алифатических растворителях, обладающие каталитической активностью.

Пржтан!жкаялва?1ш10с1ь.рй6(>111<

Разработанные нами методы ферментативного синтеза простаноидов позволяют получить большой набор природных и модифицированных тритием соединений с высоким выходом и низкой степенью расходования ферментов.

Получено 27 соединений, часть из которых была передана для проведения исследований в научные лаборатории институтов РАН и РАМН. Восемь соединений производятся Лабораторией изотопно-модифицированных физиологически активных веществ ИМГ РАН

(занелуютий Лабораюрией проф. Н Ф Мясоедов) по заказам 8.0 "Изоюи" Усынонтпю. чю оиопогические сиойстаа полученных нами из синтетических предшественников соединений полностью идентичны свойсшам ПРИВОДНЫХ. биосин юшческих соединений.

Предношенные нами способы синтеза простаноидов позволяют снизить рао.одоиание ферментов в десятки раз по сравнению с известными методами. На ооноир предложенных ним1/ способов ВЫДОЛкнич фермС-llTOU И нонучнния природных соединений может быть орущее тлен крупномасштабный синтез простаноидов (до ЮОгв год).

Алробашш p;iC>ojw

0(де/и>ные час/и диссертационной работы были представлены в ииде ыендоиых докладов на:

- 4-ом Международном симпозиуме "The Synthesis and

Applications of Isotopes and Isotopically Labelled Compounds", 3 -7 сентября 1991, Торонто:

- 9-ой Международной конференции "Prostaglandins and Related

Compounds". b-10 июня 1994, Флоренция;

- Vl-ow Симпозиуме no биохимии липидоя, 3-6 октября 1994,

Санкз lie. lepoypr;

- Международной конфеоенции "B!Ocata!ysis-95", 28 августа - 1 сентября

1996, Суздаль.

ИуГинк.тии

Основные положения диссертации отражены в 6 статьях в отечеепленных и зарубежных научных журналах и 4 патентах СССР и РФ.

OOl'Ot PWOTAI , , у

Диссертация изложена на / *Тстраницах машинописного текста, включая _3__ i < *п л и и. и :'■> оисункон, и состой г из введения, обзора /inn:paiypbi, результатов исследования и их обсуждения, у-.

экспериментальной части и выводов. Список литературы содержит у-У * ссылок.

СОДИ'ЖЛНИЕ РЛЬОТЫ

Литс;мту)>т,т оГно’к "Биохимия ферментов синтеза простаноидов" Первый раздел касается химической номенклатуры и классификации природных простаноидов. Они.основаны на химическом строении и метаболическом происхождении соединений. ‘

Второй раздел затрагивает вопросы, связанные с метаболизмом и физиологией простаноидов.

Третий раздел посвящен описанию структуры, биохимических и каталитических свойств основных ферментов синтеза простаноидов.

Материалы н методы исследования

Мече^ыелршиемлрелшественмики

В работе были использованы [5,6,8,9,11,12,14,15(п)-3Н] арахидоновая (120-180 Ки/ммоль). [8,9,11,12,14,15(п)- 3Н) дигомо-у -линоленовая {100 Ки/ммоль) и [5,6,8,9,11,12,14,15,17,18(п)-3Н) тимнодоновая (200 Ки/ммоль) кислоты и простагландины А] (70 Ки/ммоль), А; (115 Ки/ммоль), В! (45 Ки/ммоль) и В? (80 Ки/ммоль), полученные сотрудниками Лаборатории изотопномодифицированных физиологически активных веществ ИМГ РАН В.П,Шевченко,

И.Ю.Нагаевым и Т.Ю.Лазуркиной. Фесмеь1ьижш-еза.И-модиФикаши„вдос1аноидов

Описаны методы выделения и очистки 8 ферментов и ферментных препаратов (табл. 1) из тканей животных и тромбоцитов человека. Определение акгивности-Феомеяюе...Кинетическиеисследования

Активность Рй синтазы, 12-липоксигеназы и кат ал азы определялась по изменению в реакционной среде концентрации молекулярного кислорода с использованием селективного электрода Кларка.

Для определения активности ферментов и проведения кинетических исследований в большинстве случаев использовался радиоизотопный метод. В реакционную среду вносили радиоактивномеченный субстрат и, при необходимости, другие субстраты, кофакторы и стабилизирующие агенты. Стандартная процедура анализа радиоактивных продуктов включала экстракцию непрореагировавшего субстрата и продуктов органическим растворителем, удаление растворителя под вакуумом и разделение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ или ТСХ.

Радиоактивные продукты определялись путем жидкостного сцинтилляционного счета (ВЭЖХ анализ), а распределение радиоактивности на пластинке после ТСХ анализа - с помощью сканера радиоактивности ВегПюЮ 2027 (ФРГ).

Пояууен1ле^1рэдохшь1х.ммодифишро2ан11Ъ1хл)йгие^соед!лнений

Описаны методы получения 27 соединений. Основными стадиями являлись: 1)- проведение ферментативной реакции синтеза необходимого целевого продукта с использованием определенной ферментной системы и соответствующего предшественника; 2)-экстракция продуктов из водной фазы; 3)- разделение продуктов и

экстракция продуктов из водной фазы; 3)- разделение продуктов и очистка целевого соединения; 4)- определение характеристик полученного соединения.-

Таблица 1. Выделение ферментов синтеза н модификации простаноидов

Фермент

ОКСИГЕНАЗЫ

1. Простатанднн-эндопсроксид сингаза (PG синтаза)

[КФ 1.14.99.1]

2. Арахкдонвая кислота: 12'Липоксигеназа (12-липоксигеназа)

[КФ 1ЛЗЛ1.П] ИЗОМЕРАЗЫ

3. Простагландин I) синтаза (PGD син таза)

[КФ 5.3.99.2]

А. Простагландин Е сяитаза (PGE синтаза)

[КФ 5.3.99.3]

5. Тромбоксан синтаза (ТХ синтаза)

[КФ 5.3.99.5]

ДЕГИДРОГЕНАЗЫ,

РЕДУКТАЗЫ

6. 15-гкдрок.си-простзгпакдин-дегидрогеназа

[КФ 1.1,1.141]

7. И-гидроксн-тромбоксан дегидрогеназа (КФ 1.2.1.3]

8. Препарат простапіандші Dll -ксторедухтазы

[КФ 1.1.1.188} и иросталіащщн Е 9-ксторсдуктазы [КФ 1.1Л.189] .

Источник. Стадии очистки

выдел сияя

везикулярные получение микросои; железы солюбилизация детергентом;

барана хроматография на ОЕАЕ-

. целлюлозе*

тромбоциты получение цитозольной фракции;

человека осаждение при pH 6;

хроматография на Р-целлюлозг; лиофштизаиня.

головной поаучепие цитозольном фракции;

мозг крысы хроматография на Р-исллюлозе;

хроматография на ОЕАН-целлюлозе. везикулярные получение микросом;

железы солюбилизация дстсргстом;

барана хроматография на ОЕАЕ-

целлюлозе* тромбоциты получение микросом;

человека солюбилизация детергентом;

хроматография на ОЕЛЕ-целлюлозг.

тробоииты получение цитозольной фракции;

человека высаливание сульфатом аммония;

хроматография на ВІис-^срИагозе

СЬ-6В

печень получение цитозольной фракции;

кролика диализ.

печень получение цитозольной фракции;

кроли&а высаливание сульфатом аммония;

хроматография на Р-цсллюлозе.

Активность*, Е/мг (субстрат)

8.6

(арахидоновая

кислота)

0.044

(арахидоновая

кислота)

0.099

(простагландин

Нз)

0.467

(прост аглзщин

Н2)

0.039

(просталіаіщин

Ну

0.0055

(простат анлин

о:)

о.т

(простагландин

о;) .

0.535 :

(простагландин

Е2)

‘Активность ферментов выражали в Е/мг белка; одна единипа активности (1 Е) соответствует количеству фермента, превращающего Ыкмоль субстрата за 1мии при стандартных условиях.

Результаты работы

СТРАТЕГИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО синтеза простаноидов

В настоящей работе предлагается новая стратегия синтеза лростаноидов, основанная на использовании искусственных биферментных систем, проведении ферментативного процесса в гетерофазных системах и использовании методов ферментативной модификации простагландинов и тромбоксана дли получения новых соединений (рис.1). Для реализации предложенной схемы разработаны методы выделения ферментов синтеза лростаноидов, проведено экспериментальное исследование и оптимизация биферментных реакций синтеза простаноидов и реакций модификации простагландинов и тромбоксана. _____

.... Сыстскд СТАВДЛШИрОЫ V ШьКШ/ЬОМП ^ V /< ’.. -к I, ;; и ВЖ й «г ПНЖК —г-*"-Р< ■я'и-Р ■/. , .•< ;, у;« V ■<?.к ишшшрлъсин , | 9<*,11^-РСК :. ^ ~ | '^15к-13,14(1и-1*СО :!К^ • м ) ) , 'Ч-^Г^-РСК —=^>-15к-13,141Ш-ТОК —^ , ""^ТХВ Пйе-ТХВ . ; ;|

РО саитаза | ФерМСПТЫ МОДифлКйЦИН фсрменг ] ттггагмаилнил*»

Бнфсрмоитном система ] и тримбоксаиа

Рпс. 1. Оптимальная схема синтеза лростаноидов. к- ксто-; сШ- лишдро-; ас- дашро.

I. ФЕРМЕНТЫ СИНТЕЗА ПРОСТАНОИДОИ

Оъшедацие. и. очистка феомеяша

Выделен ряд ферментов синтеза простаноидов (таблица 1), включающий оксигеназы жирных кислот, простагландин Н-лревращающие ферменты (изомеразы) и ферменты модификации простагландинов и тромбоксана (кеторедуктазы, дегидрогеназы). Все ферментные препараты, за исключением Р6Е синтазы, хорошо сохраняли активность в процессе хранения (в течение 6 месяцев при -60°С). Было обнаружено, что РйЕ синтаза содержит высоколабильную форму (ок. 80%

активности; Т05=12дней при -60°С).

Рис. 2. Получение гомогенного препарата РС спнтазы. Л. Очистка сЬермен га ^фракция после хромаюграфмп иНЛИ) на колонке с ВІие Тоуореагі о50М1 + П.5*б см). качмЯ-фосф.тгмыО буфер; Ь- МАІ) (ГОмМ); с- .Ч’АЇМ5

і* и,.К'ііі‘ ,,д і.мчсгчл ча к*.*.•<>мКо с

' * - Г'' '' . м. *• *.пг \ I ; и к • >. I ц- И ''ДЛ' •: V. 1'- ;ч !.Ч

* - •; ч',*»к »■ і{.. ц,к ' 11 г' .Г)акл'','у. 'іос.мс ’о’.Ч’Се:''‘ пМ‘\11.

С'Ч*\ Ч'М • ’ (і1 ! ■ і >! ч г* м 11о1 ?! і 1 •1 (■!!' 11 V о >'рС‘М'К; ! <“, ! ’( і <. !* 1' ''Ь! З.М!/М '': ‘

" а ' Ч їіМ *.! (' гм^їЛ1 *'* 1 ! 14% ' И-' ч-И !Ми’.’: !.И Ь’.'І С?;си!Ч 1'<чЧ !; Г!; ' С М ' ^ м ^ '

,Ч'!':чм.!'(г,* 11 м-1 > Ч* »* ** ' л { Н'^.а £)(У'^' і.'"//\!0'1і, (1 ч‘ '-м ' К~

V Ли? : ч і >ч /.-- и^’., ' " ‘

Г !

— Ч •

!/ О/'

л

25II

о лл

І ис. 3. Л. Кліпсі ни онфсрмеїпкоіі !*реяра!иенпя арахнлоионоіі

кислоты в тромбоксгш В;, каталюпруеьюіі ферментной системой РО ешітаза/ ТХ сянтаза. Б. Спектр продуктов, образующихся її результате бнферментноіі реакции !іри ТСХ анализе (іиіасітікп“Ь'іІаГо!", система: хлороформ/метанол/ уксусная кисліла- У0:У:1, \7\7vj. 20мМ каліні-фосфатш.ііі буфер (pH 7.4); • 1„иЬго1 РХ - 0.037с,; алреналіш -2мМ; іемті - 2мк.М; арахндоиоиая кислота -25мкМ; ГО сіштаїа- 0.15 17мл; ТХ сшітаза- 7.6 тІ'Ап: 25' С.

и неферментативных продуктов. Показано, что сорбция носит необратимый, неспецифичесхий, ненасыщаемьгЛ характер, причем концентрация непрореагировавшей ПНЖК прямопропорционально зависит от концен грации оелка.

Ыафермеша1ишаялеша,ааш1я_£ен

PGH в водной среде превращается Ст0 5 = 5 мин при 37°С) в ряд продуктов, основными из которых «ваяются простагландины 0, Е. F, а также малоновый диальдегид и 12-гидроксигепгадекалолиеновая кислота (см. рис. ЗА. 35 и табл 2). Кинетика этих реакций характеризуется константами скоростей реакций первого порядка. Показано, что соотношение продуктов реакции зависит от состава буфера и pH среды, тогда как наблюдаемая константа скорости превращения PGH не зависит от перечисленных факторов.

Кинетическое описание этого процесса в настоящее, время выполнено только для PG синтезы, причем выявленные закономерности справедливы только для малых степеней превращения субстрата.

Графический анализ зависимостей кинетических характеристик ферментативных реакций с инактивацией фермента ог начальной концентрации субстрата позволяет дискриминировать три случая (Вржещ. 1932. 1985), для которых получены в простой форме уравнения, описывающие кинетику инактивации ферментов. Для анализа кинетики инактивации, протекающей при больших степенях превращения субстрата, а также в условиях, когда субстратом является нестабильное соединение, предложен новый способ графического анализа (рис. 6).

Как следует из проведенного нами анализа, инактивация PG-синтазы, 12'Липоксигеназы и ТХ синтазы (в последнем случае для анализа использованы данные работы (Jones, 1990)) имеет кинетические закономерности, характерные дли первой группы механизмов инактииации* (рис. 6). В этом случае кинетика инактивации ферментов описывается уравнением

de/ds = 1/ V ,

где е- концентрация активных форм фермента; s- концентрация субстрата; V - безразмерный параметр, отражающий количество оборотов фермента до его полной инактивации.

•Для утой Группы соблюдается услоине: любая илахтииирунтияси

пролежу* о*ш;и форма фермента шдслсна и о ходу гЦкгриентатишюй релкнин ог пункта донировлтиа субстрлтл иеобоаптмои стадией, пункт локирования еуилр.и*» ПС ии&ктииируетса (Ьрлст, 19.^, 1985),

ТХ синтлза.

4, ПигЪериентнма cnmti т^юмбокслна ь

W4X. »tm М'ИЧКШлИ»?* ’! X C»1»fraj*J НСХ<1ДНЫМ iluvHitn {ИИуККЛ Мчммшс jdncnij ИСХОДНОЮ AA, на промежуючный продукт, PGH l)) и способа яоблнплния (1ЧЛ!

ра(Нл(<нИ1»П (jjCpMC'lll MClti'.l l..*' МИМ

с нлчд'м 1 *( * I..»!* i л »гь»и ()»> J) на 1*ыкод

|Ги»ки,им и К{.НЙЛЛ i> - СООГГВСТСТНуСГ ррИС<ГШОН |УСАА11Им, нроьолимон при •Ячменной ДобацЛ£ИНИ (ЬерМППХШ и при ШЬЭОП*И»И V САЧССГОС сунлрлгд ЛА (25w*M).

. 5. Чин*imc ш'«.т «кфнч*/* пои coiHSiihm

нлдом.жои кнсш/kj «л cicitcm, сс !М»с.«рлтсннн(А)

IA »>jJ Mpit/iyK'lOH О») И fiH(|<rpUCtiinOH системе umUAJrt/i'Cih сшггдм № ис*>хсп^нма«^|н1лрментная

r.U4, noiiyvcmirt.t# из очипн^нпм* «,}.<{*«от>г»; ,<Hfcj4r,OJ.lrt<il.*<UM »1{*С.МврЛ| >И>СЛС

l>6l»mt штп itc'trpicirtuu (1 ween 20, 1%).

. 6 Дискрпшишшя механизмов инютивацкн

ментов сшггс*а ггросташжлой. А и Г, Б я Д, В к Е • nvcixriMyioT трси ноэможнии фупнам мехаяизмов стикаикм. Экснерниетаиьные данное, полученные да* еннтиной реакции при мсночьзоытим а хачестве Ttpnttk арахидонопой (1, 7) и пшшигшшнои (3, 4) пт, дял 12* лшшксн'сна^иой реа&щш О) и сшетдзной реа&ини (Jones, 1990; <6)).

50 100 150

\К& Синтаза, иЕ/«л

200

V О

п

О \

< *>

5* U \

40

» ”

Vo

\

(РИ>и

Величина Л' определяется химической природой субстрата. Оценка величины V, проведенная нами для реакций превращения арахидоновой и тимнодоновой кислот Рб-синтазой (рис. 7), показала, что значения этого параметра для рассматриваемых реакций различаются более, чем в 10 раз.

Оптимизация синтеза^ростшотод_в_биферментной системе.

Установленные закономерности были учтены в математической модели, описывающей биферментную систему синтеза простаноидов, которая, в свою очередь, была использована для проведения оптимизации синтеза. При проведении оптимизации по начальным концентрациям ферментов и субстрата решались две отдельные задачи, с которыми приходится сталкиваться на практике: определение условий для достижения 1)- максимального выхода целевого продукта и 2)-минимального расходования ферментов.

Количественные рассчеты. проведенные с использованием математической модели, и результаты экспериментального исследования биферментной системы показали (рис. 8), что максимального выхода целевого продукта и минимального расходования фермента можно достичь при постепенном вводе субстрата в реакционную смесь, содержащую оба фермента. При этих условиях выход целевых продуктов лимитируется только инактивацией ферментов в процессе реакции.

Были определены также оптимальные значения температуры (рис.

9) и pH (рНопт =8-9 Для всех исследуемых типов биферментных систем) среды инкубации.

Проведенные исследования показали, что эффективность работы биферментной системы может быть значительно увеличена за счет выбора определенных начальных концентраций ферментов и субстрата, выбора определенного режима ввода субстрата и, в гораздо меньшей степени, за счет изменения характеристик внешней среды.

3. СИНТЕЗ ПРОСТАНОИДОВ В ГЕТЕРОФАЗНЫХ СИСТЕМАХ

Для целого ряда ферментов было показано, что их каталитическая активность и стабильность могут быть значительно увеличены при помещении их в разного рода искусственные гетерофазные системы.

Поиск способов увеличения "производительности* работы ферментов синтеза простаноидов, подверженных процессу необратимой инактивации в ходе реакции, привел к рассмотрению гетерофазных

ферментов исследовались в макрогетерофазных системах (вода в октане и октан в воде). Обнаружено, что при добавлении к водной суспензии микросом небольшого количества октана или воды к лшфилизированным

S

lS]</iPG сингаза), ы*АШ-/л)

Рис. 7.

Рис. 8.

Рис* 7. Количество оборотов фермента до его полной инахтавашш (V) зависит от шмическон природы субстрата. 1У арахндоновая кислота: 2)- тимнодоцовая кислота.

Рис. 8. Увеличение выхода целевого продукта и снижение степени расходования второго Ъермента бифсрмеитнои системы синтеза простановдов при постепенном вводе субстрата '2), по сравнению с однократным сводом субстрата (1). Результаты рассчстов математической модели биферментн он системы.

Рпс. 9. Влияние температуры на выход ЧЗЕг (1) и РвЕз (2) в биферментнон системе эО светтаза/РОЕ сингаза. [АА]сг 150икМ*

ТА]о“ 50мхМ, время инкубации - 0,5- 30 часов.

микросомам, помешенным в октан, происходит образование стабилизированных эмульсий.

Показано (табл. 3), что во всех исследуемых гетерофазных системах активность ферментов синтеза простаноидов, Р<3> синтазы, РвЕ синтазы и ТХ синтазы, а также 12-лилоксигеназы сохранялась. Наибольшая активность и значение V для Рв синтазной реакции наблюдались при использовании систем стабилизированных эмульсий октан в воде.

д октан \_У -^вода ^ кода г.'..'

: '-.'.Л^ЧоктаН'"'

В 0" Л 0°О° 0 0°0° 0 0 0 Г| с/ о — о о о V." оо О

Рис. 10. Махрогетероф;пиые системи,в которых исследовались каталитические свойства ферментов синтеза простаноидои. А, В - вода в октане; Б, Г - октан и «оде; А, Б - макродвулфазные системы; В, Г - системы стабилизировали* эмульсий.

Таблица 3. Синтез простаноидов в гетерофазных системах.

©гриснтняя система: Рв синпиа/РОЕ сиитазд Рб сшптил/ТХ сштоа

Выход продукта, % рое2 ТХВ2 12-НЕТЕ

1. Калнн-фосфэтныц буфер 100 100 100

Махродвухфазиыс системы

2. Вода к октане (рис. 10А) 118 96 46

3. Октаи н веще (рис. 10Б) 93 - -

Системы стабнлтмроианлик ииульснн

4. Вшл К ОХТкИС (рис. КШ> 104 167 34

5. От~«ш в воде (рис.ШО 246 - -

Л\Ч1М 1; '.'УДС

Выяо Обнаружено, ЧГО УНЙЛИЧ»*И1*^ доли ОКЫнн мп.п0ть до

пасоп^исьния сиоьмы ипт/»лпИ-г .< уменьшению аюикности РС

,игиааы и подпой фпзе и увеличению ее общей активности. Обнаружено 1акже, что при соонюшениях иояа/окшн/лиофилизироеаниые мембраны, элизких к границе расслаивания системы, каталитическая активность Рв 'ичщзы иозраоыег почти о 10 раз по сравнению с ев значением в системе, не содержащий органический расшоритель (рис. 1!). При этом происходило изменение и других параметров РО синтазной реакции, константы Михаэлиса. Км, иА1„ад.

Я 0!*с?ем*> стглмг!иииоонйе!иь!х эмульсий арахидоновая нислота

КОН'!'.-н I ('ИОуг ь Я I 11 "Л * ^ V'1-''г-1 ‘НПО М ’У- >' ;5НИ”есК0М ОаСГНОрИ 4!.’!^, тогда Кг!К НРО/’УК! О'"’! СМ 'П'цу.О !< :ЧО/\НСЙ ф^ЗС* 'ОНО.

Полученные нами сис»еми стаОияу.зи’.млч'чщуч эму.'ч-сий ок^аи в чо/;*- 'чтиг'дпчч ;п>л>>г." !ч г1 гг.’ исг1о;'1>ло"с!Нии их Д!!« ЧО^КТИчеЧЖО: (I СИ!’ :>:м I !рОС I гдНО'/ДОН ПО СОанНСПИЮ С 1 ОМО! НННЬ'МИ

нод,1 и.(люникл.м^ 1)- уне/ч’чен'/е копи* №С та оборотов фермента ДО его сонной иКаКН/ММ'.'.и'Л, обнаруженное ДЛЯ этого типа систем, позволяет сниэи|ь степень расходования фермента; ?)- уве.п,/чеч'/е кг!Тгл;"/ч-иес<;о/

П^’И^ММ'.: 'г1 м 1.: ' V -: ■. 1' у1 /' , ' / ' '’.'у:'.'.’.'

ЧрОН'!Дг_‘‘|ИЯ С'.Ч! См- е:;мду<'и !'>‘аКЦ1/./., фОрМеН! и

непрореагироиавший субсграг легко разделяются центрифугированием, что позволяет избежать использования трудоемких методов для предварительного разделения компонентой оврег/ончой смеси гюсле

ПОО'»:)‘>'1'|.ДЛ| СМИ‘11:11! '

Ряс, 11. Сунеркитиямш* 5*0 еннтдеи и Рис. 12. Распределение субспрагл (АД),

V А

О .05 .1 .15 -2

ос<«пл *г<!Сй<ш

РС£2

СМСТСл/С СТд6|<ЛНУЙ^»<1п4ИМ14^ Й«уЛЬСИН олтая П МЩС.

*ф<у?уктд /РСН?) II И’ТрМГАта (МНКрОСдМАПЬП&Я «}х>рма РО сжшоы) и сиеггме счлСшлишронанных ьмут-сий октаи и йолс (рис. ЮГ*).

4. ©ЕРМКНТЛТИМНЛЯ МОДИФИКАЦИЯ 1И»ОСТЛГЛЛНД1ШОВ и ТРОМБОКСАНЛ

Ряд простаноидов может быть получен путем реакций модификации функциональных групп в молекуле предшественника. Проведение этих реакций химически;/ путем сопряжено с образованием стереоизомеров и с необходимостью проведения дополнительных стадий, связанных с зашитой близких по реакционной способности функциональных групп. Использованные для модификации ферментативные методы лишены этих недостатков. Нами было рассмотрено три типа ферментативной модификации простагландиноз. •

Для проведения реакции восстановления кетопростагландиное был использован ферментный препарат, обладающий ЫАОРН-зааисимыми РОО 11 -кетсредуктазной и Рв£ 9-кеторедуктазной активностями (табл. 1):

11-МТО-РС

Продукты реакций восстановления РЭЕг и Рв02 были выделены с помощью 83ЖХ и идентифицированы как РвР2а и 9а, 11 р-Р6Р2> соответственно.

Способность препарата Рй-редуктаэ из печени кролика восстанавливать различные 9-кето- и 11-кетопростаглгндины определялась по степени превращения соответствующих меченных тритием простагландиноа в присутствии и в отсутствие донора водорода (табл. 4). Было обнаружено, что структура циклопентанового кольца имеет решающее значение при восстановлении кетолоостаглаядинов, тогда как степень ненасыщенноети боковых цепей простагландиков . существенно не влияет на эффективность реакции (табл. 4).

Обнаружено, что с помощью препарата РС-редуетаз из печени можно проводить реакцию региоселективного восстановления 9,15-

иосемнонление С9-- и СП - клп огрупп

дегидратация

СООН

сдвиг Д)3 связи

ои4^ С15 — гидрокси — 4 дегидрирование

восстановление Д13 связи

Таблица 4. Субстратная специфичность ГС; редухтги т печени кролика и 15-голрокпМ'О-депирсменач ;п тромбоцитов челойекл.

1'(; псдуктдчм

( у6с1«)л1’ ( ' |тч»гт, прг№Дги1*Н1!Я

! 5-П!Л1*ЛКСП-?Ч5-дегИЛрОГМ!!'ЗЯ

С'убс ГрЛ7 Стгпгш. ГТреНП.ЛГ'СПНЯ суба ;>■! Ь1

РПЕ, У5

Р&О, ?■:<

РСГ:-, 90

!Ь-ке''о-13 14-с№ус)го--РСЕт

а? 82 13 13

Г, 1

РСП4 4 1 Ь-ке 10-13.14-б Щус! Г0-

Р0£,

РСА^

РСА,

РСГГ,

РвО-,

роз,

РОЗ,

РСЕ,

РСРм

рсе2

РСГ^

36

30

22

15

10

9.4

87

-РЭО,

<2

дикетопростагландинов £ типа с эффективностью не меньшей, чем для

рпакций носсгнноиления РСЕ.

Окисление С15(5)ггяпсоксияэуппы^восстановление^А^сзнзи

. л. и 15-1 нл}>««сн-К* *«гндрогс*ивл

^ {Р.СЬЫШ}

15(8Нндро«™НрС \т °

^ NЛDP -------------------.ll5.iero.PC-

& 3-(* Я3«т«м

1\!ЛГ>Р —--------— * „

о

__________________________________________15шето»13у14-д>ппкдро"РС

Для проведения этих реакций был использован ферментный препарат, выделенный из тромбоцитов человека (табл. 1). Субстратная специфичность 15-гидрокси-РС-дегидрогеназы была исследована на ряде природных субстратов (табл. 4). Использованный нами препарат фермента содержал также Л13-редуктазную активность, что позволяет сразу переводить 15-кето-РО в устойчивые 13,14-дигидропроизводные этих соединений.

лз

он

РСР

РСУ

Л |2-13,14-ди гидро-РСМ

В присутствии различных альбуминов ИЗО превращается в соединение, обладающее высокой антиопухолевой и антивирусной р р активностью, Д была проведена оптимизация синтеза Л

12

Соотношение двух основных продуктов реакции, Д -РСчй и РОЛ, достигало значения 6:1 при использовании оптимальных условий проведений реакции (приведены на схеме)

он он

11 -дегидро-ТХ является основным метаболитом ТХВз в крови человека. Иммуннохимические методы, основанные на его определении в

крови, широко используются в медицинских исследованиях. Нами был

выделен ферментный препарат 11-дегидро-ТХ-дегидрогеназы (табл. 1), который был использован для получения меченного тритием соединения.

5. ОПТИМИЗАЦИЯ СИНТКЗА 1Н*ОСТ Л ГД ЛНД И НЭНДОП Е!*С КС I -ДОК

РО эндопероксиды, РОН2 и РОНз. являются нестабильными продуктами РО синтазной реакции превращения аоахидоноеой и 5ИМИОДип«1НОИ КИСПОТ, ГООТССТСТВёННО.

Проведена оптимизация условий их синтеза: начальных концентраций РО синтазы (рис. 13Л) и субстрата (рис. 13Б), температураы (рис. 14) и времени проведения реакции (рис. 13-14). Выход РОН в значительной степени зависел от соотношения субстрат/ фермент, количественный рассчет, проведенный для серии экспериментов, показывает, что максимальный выход РСН достигается в условиях большого расходования фермента, когда молярное соотношение фермент/субстраг ринио ок. ! 0/\', 8 этих условиях происходит быстрое (в течение 0.5- ’..5 мин) и полное превращение субстрата. За это время процесс неферметатимного превращения РвН не успевает пройти слишком глуРико. Показано (рис. 14), что выход РО-эндопероксидов практически не занио/н ог температуры среды инкубации в диапазоне значении 01 1‘.) по Ь0°С. Проведение синтеза РО-эндопероксидов в условиях П|,к;|ро'о преооащения субстрата требует оптимизации синтеза по кислороду, коюрыи расходуема в ходе реакции и соотношении [РСН|/[0?]~1.2 В процессе исследования кинетических закономерностей РО-син гаэнои реакции обнаружено, что микросомы везикулярных желез барана, используемие в качестве ферментного препарата, обладают кагамазнои. зкн/вносныо. Предложено использовать это свойство Ферментного препарат для насыщения реакционной среды кислородом в ходе синтеза Рв-эндопероксидов.

Л

Б

I

(ТА]0, мкМ

Рис. п. Онтимтлпих с«шт^ РСзН, сгтосигельио ««мьгадферметта (А) * (1>|. Л. |ТЛ],Г 25-*М, 25“С Б. РО-синтма- 0.9э Е/ил, 25 С. [РСЩоат. и Т опгг.-дичсяна концентрации ГСП н ■гремсни к точке экстремум» в» гаяегаческои кротои. Аналогичные ре7ушл.пи были получены при оптимизации сшггета 1 ОНз-

Таблица 5. Влияние восстапашшишоших агентов на синтез 12-НЕТЕ

Восстанавливающий агент, 200мкМ

Контроль 34 . 85

1. Ь-Цнстеин 44 73

2. Ь-Метионин 32 83

3. Е-Триптофан 36 84

4. Фенол 29 74

5. Ь-И/ШН 31 бб

б. МАБРН 21 73

7. Ь-Адреналин 32 83

8. Глутатион 49 60

9. Дитиотреитол 51 59

Ю.Анилин 34 85

г-1 зэ

12-НЕТЕ, Степень % 'превращения субстрата, %

_ температура, <

Рис. 14. Оптимизация сшггсза РЙ1з огаостггельно температуры пниубашга [ТА]о- 25мкМ, РС-синтаза- 0.95 Е/ил

6. СИНТЕЗ АЦИКЛИЧЕСКИХ ЭЙКОЗАНИДОВ

Ациклические эйкозаноиды представляют собой другую большую группу эйкозаноидов. Одним из путей их образования является тжсигенирование полиненасыщенных жирных кислот липоксигеназами.

Нами было проведено исследование возможности использования 12-липоксигеназы, выделенной из тромбоцитов человека (табл. 1), для препаративного получения модифицированных тритием соединений. Основным продуктом превращения АА являлась 12(5)-гидрокси-5г,82,10Е,14г-эйк.озатетраеновая кислота (12-НЕТЕ). Отсутствие первичного продукта 12-липоксигеназной реакции, 12-гидроперокси-эйкозатетраеновой кислоты (12-НрЕТЕ), объясняется наличием в ферментном препарате высокой пероксидазной активности. Использование индометацина для подавления пероксидазной активности позволило получить 12-НрЕТЕ с выходом 65-80%.

В ходе исследования влияния различных агентов на реакцию образования 12-НЕТЕ было обнаружено, что выход этого продукта существенно увеличивается при проведении реакции в присутствии восстанавливающих агентов (табл. 5).

7. ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ И . МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТРИТИЕМ ПРОСТАНОИДОВ Приведенные выше результаты исследования синтеза простаноидов в биферментных системах, в гетерофазных системах, путем модификации функциональных групп в молекуле предшественника и проведение оптимизации синтеза простаноидов в этих системах

ились осноеой для разработки новых методов препараіивного синтеза •иродных и модифицированных тритием соединений.

Оптимальним способом получении нооогаї ланлинон О, Е, Р типов и СВ является проведение биферментной реакции синтеза в системе абилизированных эмульсий органического растворителя в воде с эстепемным вводом субстрата. Синтез нестабильных в водной среде 3-эндопероксидов следует проводить в условиях избытка РС-синтазы с ^пользованием каталазной реакции для компенсации о системе лслорода, расходуемого в ходе Рй-синтазной реакции. Разработанный ами метод выделения Рв-специфичных редуктаз из печени кролика озгшияет мромол.'/кь пренарагияный синтез проотагландиное г іигіа.

Для МОМучгНИМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ гриіием соединений особые ребовамин 1!('сдьянл1!Ю!ся к ферментным препаратам, используемым іля сииіс.Зсі Они должны характеризоваться высокой степенью очистки

І.ПЯ предотвращения неспнидлфической сорбции меченных тритием юлиненасытенных жирных кисло! и не должны содержать примесей >НДО) ниных жирныл міС'ЧЛ

Релульиии преіир.кинних синтезов природных и иодифициронанных іриіием соединений, проведенных с учетом «речислениых условии, суммированы в таблице 6

Полученные нами молифшциродонмые тритием соединения по СПОИМ Ри<>Л/ і( ИЧиСКіїМ СІІМИОЇН.ІМ но отличались ОГ ПОИРОДНЬ'Х соединении (рис. 15).

Я г

о-1/Н]Р<ЗР2

о-!ч;ь;,

\

-/3 ~/2

-//

фРСЕ]

5*ОС, 15. ЛЛншбироішшс 1*Н]ЇЧЗОг нъодашюй ЛОР агрегации тромбоцнтол. Б. С»шіи*иише [3Н)РОЕг со спсиифнческлии поликлональными антителами. 1- [3Н}РСЕг; 2*

РСН2

Таблппа 6. Препаративное получение природных и модифицированных тріпнем соединении

Природные соединенна Выход -

Простагландин 112 0.1-0.5мг/г везикулярних желез барана

Тромбоксаи В2 3-10иг/г тромбоцктарной массы

9а, 1 Ц)-Простагландим F2 1-5мг/г печени пролиті

Рмноактнш/омеченные саеттсічія

Соединение Молярная Количество Выход на

рддиоакпншость фермеїпагиниих каждой in

(5,6,8,9,12,14,15(n>-JH) стадні) синтеза сталий

Нростдгллшіші 02 120-140 1 50-65

1З-кеїо- 13,14-дн гндро-(5,6,8,9, і 2,1 4(п)-аіі]-

ГІростаглаїишн D2 100-120 2 50-65,35-45

15,6,8,9,12,14,15,17,18(п)-3Н)

Простагландин D3 160-180 1 20-25

[8,11,12,14,15(п)-3Н]Простагландин Е1 80-100 1 40-65

15-кет о-13,14-дигидро- [8,11,12,14( »)-3Н]-

Ilpocraniuunm Е1 [5,6,8,11,12,14,15(n),3liJ 60-80 2 40-65, 10-15

Простагландин Е2 100-120 1 50-80

[5,6,8,11,12,14,15,17,18<п)-3Н]

Простагландин ЕЗ 9а,ПР-[5Д8,9,12,14,15(п)-'Н]- 160-180 1 30-50

ГІростаглаїшин F2 120-140 2 50-65, 65-95

(8,11,12,14,15(п)-3Н]Простагландин Fla (5.6,iS,9,11,12,14,15(п)'Н] 80-100 2 40-65,95-100

Простагландин F2a [5,6,8,11,12.14,15(п)-3Н] 120-140 1 50-65

Простагландкп F2a 100-120 2 50-80,95-100

[5,6,8,9,11,12,14,15,17,18(n)-3HJ

Просгаглаїиши F3a 180-200 1 25-30

[5,6,8,11,12,14,15,17,18(n»-3HJ

Простаглдндші F3a [5,6,8,9,11,12,14,15<n)-sHj 160-180 2 30-50, 80-90

Простагландин H2 ' 140-160 1 50-70

[5,6,8,12,14,15(п)-3Н]Простаглашіин J2 90-110 2 50-65, 40-45

. Д/2,- -13,14-дшидро-|5,6,8,М,15<л>-3Н)-

Піюсглглліиічн J2 [5,6,8,9,11,12,14,15(n)- 11) 70-90 2 50-65, 50-55

Тромбоксаи В 2 140-160 1 25-35

11-дегидро-[5,6,8,9,12,14,15(п)-3Н)-

Тромбочсаи В2 120-140 2 25-35, 70-80

[5,6,8,9,11,12,14,15,17,18(n)-31IJ

Троыбоксан ВЗ 180-200 1 15-20

12-гндроісн-(8,9,11,І2(п>-3Н)-

Гентадскадиеновая кислота 60-80 1 65-80

12-гндрокси-[5,6,8,9,П,12(»>- Н)-

Гептаїїскатриеновая кислота 100-120 1 20-30 .

І2-підропсрокси-(5,6,8,9,11,12,14,15(п>- Н]-

ЭйхозэтетраеионАа Емслогта 140-160 1 65-75

12-гилрокси-[5,6,8,9,11,12,14,15(л)- 11]- •

Эйкозлгетраеновая кислота 140-160 1 75-85

1*ц|ц<>пы

1. Разработаны методы син'еза ноиоодных и мидисЬиииоооанных тритием простаноидов, основанные на использовании: биферментных систем синтеза простаноидов; каталитически активных ферментсодержащих гетерофазных систем; ферментов модификации простагландинов и іромбоксана. Получено 27 природных и модифицированных тритием соединений.

2. Проведены кинетические исследования реакций синтеза простагландинов и тромбоксана в биферментной системе простагландин-эндопероксид синтаза/простагландин Н-превращающий фермент (іних:іімл.іидии О сииіазгі, или іТ'Остйгландин С сиитяда. или тромбоксак

СИИіаза). 6|.п|г<1ЦЧ1Ы И ОПИСЛНЫ !1‘'>ОЦ*'ССЫ. лимитирующие синтез проеганоидон и би<$к*г;іметіюи системе. Ростоена и проанализирована ма іем** іичесчач модмь обо^’н^ннои би<?>ермеч чюй системы синтеза просьлюидои,

3. Усмионтчю, что инактивация н ходе оеакции тромбоксан синтазы, 12-липоксии-н.мы и мрскдагдандинзндопероксил синтазы протекает

С()І ЛаОнО механизму, ори МКОрОМ КОМИЧОСНЮ оборотов фег>мента ДО его полной иниктм.щии нм заиисиі о г начальной концентрации субстрата. Показано, что количесию оборотом простаї латідиіїмідоиероксид синтазы до ее полной инактивации в исследуемых системах зависит от природы исгюпьзу»*мого субстрата и практически не зависит от факторои инокини согды.

Л. С использованием маїематической модели биферментной системы синтеза простаноидов показано, что оптимальные условия для проведения синтеза, соответствующие максимальному выходу целевого продукта и минимальному расходованию ферментов, достигаются при постепенном М«»ч> <;уби!;>а(а. При ;'.|ИХ услочипх пыход целепых продуктов лимитируеіся только инакіивамией й>орментов в процессе реакции. Получено -жсперимешадьное пидщср.чдепи^ отого фагота.

5. Показано, что и мриоуісгнии нативных мироеомалытых мембран, содержащих <|>ермеіт,? синтеза простаноидов, образуются стабилизированные эмульсии алифаіических растворителей е воде и воды в алифатических растворителях, обладающие кагалитмческой активностью. Обнаружен эффект суперакгивации простагландин-эидопероксид синтазы в системе стабилизированных эмульсий. Предложено использовать систему стабилизированных эмульсий для синтеза просіаиоидов.

6. На основе результатов исследования антиагрегационной активности

модифицированных тритием простагландинов и их взаимодействия со • специфическими антителами установлено, что биологические свойства этих соединений, полученных из синтетических предшественников, идентичны свойствам полученных биосинтетически природных соединений. •

(2)-

(3)-

(4)-

-(5)-

(б)-

(7)-

(8)-

(9)-

(10)-

СППСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Shevchenko V.P., Myagkova G.I., Lazurkina T.Yu., Dyomin P.M., Shram S.I. Zabolotsky D'.A., NagaevT.Yu., Belosludtscv Yu.Yu., Evstigneeva R.P., Myasoedov N.F.:

Synthesis of Tritium Labelled Natural Prostaglandins of Series 1, 2, 3.

J. Labelled Compound and Radiopharm.,27:l 177(1989)

Шрам С.И.. Вржеш П.В., Бобровнч O.A., Татарипцев А.Б., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф.:

Получеппе меченного тритием простагландина Дз с высокой молярной радиоактивностью

Бноорганическая химия,15:1274(1989)

Shram S.I.., Lazurkina T.Yu., Nagaev I.Yu., Shevchenko V.P.,

Myasoedov N.F.:

Synthesis of Tritium Labelled Prostaglandins and Thromboxane from Thymnodonic Acid by Using Combined Enzymes

In: Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds 1991, (Ed by E.Buncel and G.W. Kabalka), Elsevier Sci.Pub.,p.456( 1992)

Lazurkina T.Yu., Shram S.I. ., Nagaev I.Yu., Shevchenko VP.,

Myasoedov N.F.: ■

Stereo-Specific Synthesis of Tritium-Labelled 9a,l lp-Prostagiandin Fi and PGFia by Using Enzymes from Rabbit Liver

In: Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds 1991 (Ed. by E.Buncel and G.W. Kabalka) Elsevier SciJ5ub.,p.502(1992)

Shram S.I.., Lazurkina T.Yu., Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu.,

Myasoedov N.F.:

Enzymatic Synthesis of Tritium-Labelled Prostaglandin D2 and Its Conversion to Other Prostaglandins.

J. Labelled Compound and Radiopharm.,34:359(1994)

Vrzheshch P.V., Demina.O.V., Shram S.I. ., Varfolomeev S.D.: Supercooperativity in platelet aggregation: substituted pyridyl isoxazoles, a new class of supercooperative platelet aggregation inhibitors.

FEBS-Leo.,351 (2):168-70( 1994)

Лазуркина Т.Ю., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И.: Способ получения кратпомеченных тритием простагаандинов типа Е первой или второй или. третьей серии или их производных типа А, В, F или метиловых эфиров простатащщвов типа I.

Патент СССР No 1646252, кл. С 07 В 59/00, 1988

Лазуркина Т.Ю., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П„ Шрам С.И.: Способ получения мечеапого тритием простатапдина Fja.

Патент РФ No 1774660, кл. С 12 Р 31/00, 1990

Лазуркина Т.Ю., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С И.: Способ получения простагландина F3o.

Патент РФ No 1774659, кл. С 12 Р 31/00, 1990 ■ .

Лазуркина Т.Ю., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И.: Способ получения меченного тритием тромбоксана В3.

Патент СССР No 1732513, кл. А61 К 37/00, 1990