Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ингибиторный анализ роли процессинга ростовых факторов в индукции пролиферации культивируемых клеток

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соркин, Александр Давидович

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения о ростовых факторах.

2.2. Биологическое действие ЭФР.

2.3. ЭФР и его клеточный рецептор.

2.4. Процессинг ЭФР.

2.5. Исследования роли процессинга ЭФР в индукции пролиферации клеток

2.6. Начальные реакции клеток на ЭФР.

2.7. Фосфорилирование уридина и его стимуляция при действии ЭФР.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Получение и очистка ЭФР, его производных и антител к ЭФР.

3.2. Методы культивирования и остановки пролиферации клеток.

3.3. Оценка уровня пролиферативной активности клеточных культур.

3.4. Изучение связывания, кластеризации интернализации

ЭФР флуоресцентными методами.

3.5. Изучение связывания, интернализации и деградации 1251-ЭФР

3.6. Приготовление и хранение растворов.

3.7. Поступление и распределение ДК в клетках ЗТЗ.

3.8. Измерение величины рН в лизосомах

3.9. Измерение степени поляризации флуоресценции ДФГТ

3.10. Измерение скорости транспорта и фосфорилирования уридина.

3.11. Описание кинетической модели поступления уридина в клетки.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Влияние ингибиторов на индукцию пролиферации клеток.

4.2. Экспериментальное исследование кинетики поступления уридина в клетки.

4.3. Стимуляция фосфорилирования уридина РФ

4.4. Действие ингибиторов пролиферации на активацию уридинкиназы

4.5. Влияние аминов и других ингибиторов на кластеризацию, интернализацию и деградацию ЭФР

4.6. Действие аминов на величину рН в лизосомах . . . 105 '4.7. Поступление и локализация ДК в клетках ЗТЗ . . . 112 4.8. Поляризация флуоресценции ДФГТ в мембранных фрагментах и интактных клетках.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ингибиторный анализ роли процессинга ростовых факторов в индукции пролиферации культивируемых клеток"

Исследования механизмов регуляции пролиферации клеток занимают одно из центральных мест в клеточной биологии. Широта и разноплановость задач, входящих в круг проблемы, огромное число методических подходов к решению этих задач, определяются многообразием физиологических, биохимических и молекулярно-генетических процессов, участвующих в регуляции размножения клеток. Высокие темпы прогресса в этой области, как и во всей современной клеточной биологии, стали возможны благодаря расширению исследований с применением культивируемых клеток млекопитающих, особенно постоянных клеточных линий.

Наиболее распространенным подходом при анализе механизмов регуляции пролиферации клеток является изучение процессов, происходящих при переходе клеток из состояния покоя (период gq) к синтезу ДНК и митозу. Для остановки пролиферации культивируемых клеток используются различные приемы, например, снижение содержания сыворотки в среде или получение плотного монослоя, а в качестве наиболее эффективного стимулятора деления клетки чаще всего применяется эмбриональная и другие типы сыворотки.

Значительное повышение уровня и интенсивности исследований в последнее время связано с выделением и широким применением очищенных специфических стимуляторов пролиферации клеток - ростовых факторов (РФ), из которых наиболее хорошо охарактеризован эпидермальный фактор роста - ЭФР (Carpenter, 1981). Изучение механизма действия РФ приобрело в настоящее время особое практическое значение в связи с развитием представлений об общности механизмов регуляции пролиферации и опухолевой трансформации клеток ( Heldin, Westermark, 1984).

Взаимодействие РФ с рецепторами, находящимися на плазматической мембране, ведет к целому каскаду биохимических реакций в клетке. В настоящее время изучено большое число метаболических параметров клетки, которые затрагиваются действием РФ, и это число постоянно растет с расширением методических возможностей исследователей. Однако роль и специфичность большинства реакций, причинно-следственные связи между ними остаются пока не выясненными. в 70-х годах этапы взаимодействия РФ с рецепторами стали более тщательно исследоваться цитоморфологическими методами. Оказалось, что ЭФР поступает в клетку путем рецепторно-опосре-дованного эндоцитоза, как и ряд других лигандов: инсулин, 062-макроглобулин, липопротеины низкой плотности. Особенность этого типа эндоцитоза заключается в том, что после связывания лиганда с рецепторами происходит агрегация лиганд-рецепторных комплексов (кластеризация) и их поступление в цитоплазму через специализированные районы мембраны - окаймленные ямки (интерна лизация). В дальнейшем лиганды обнаруживаются в области аппарата Гольджи и в лизосомах. В настоящее время сформировалось понятие процессинга РФ как совокупности последовательных изменений, происходящих с каждым РФ-рецепторным комплексом в течение пребывания РФ в клетке с момента его "посадки" на рецептор. Таким образом, из общей проблемы механизма действия РФ выделилось новое направление - изучение роли процессинга РФ в индукции пролиферации клеток, - и появилась возможность использования ингибиторов для анализа отдельных стадий эндоцитоза РФ.

Задачей настоящей работы было изучение влияния различных химических агентов на индукцию пролиферации клеток под действием ЗФР, начальные реакции, вызываемые ростовым факторов, и на отдельные стадии процессинга ЭФР с целью выяснения их роли в пролиферативном ответе клетки.

В качестве возможных ингибиторов были выбраны, главным образом, амины, что обусловлено наличием большого дискуссионного литературного материала относительно способности аминов блокировать кластеризацию, интернализацию и деградацию ЭФР. Однако, несмотря на то, что исследования велись ведущими научными коллективами (Maxfield et al., 1979а; King et al,, 1981), полученные данные весьма противоречивы: действие аминов на эндоцитоз ЭФР значительно отличается от действия этих же веществ на эндоцитоз других лигандов. Также противоречивы и малочисленны данные о влиянии аминов на процесс инициации входа клеток в фазу синтеза ДНК. Наличие противоположных экспериментальных данных привело к тому, что разные группы исследователей приписывали решающее значение в проведении митогенного сигнала различным стадиям процессинга ЭФР: микрокластеризации рецепторов, интернализации или деградации ЭФР в лизосомах.

Интерес к аминам объясняется не только их возможным влиянием на процессинг ЭФР, но также и вероятностью обнаружения других клеточных мишеней (Dean et al., 1984). Так, ранее в нашей лаборатории были получены данные о способности ряда аминов и амидов блокировать процесс стимуляции инсулином транспорта глюкозы в мышце лягушки (Виноградова и др., 1971, 1978).

В настоящей работе в качестве основного объекта изучения действия аминов использовались клетки ЗТЗ и ЗТб, наиболее часто применяемые в исследованиях, касающихся регуляции клеточной пролиферации.

Синтез ДНК в покоящихся культурах иницировался сывороткой или ЭФР, иногда с добавлением инсулина. Используемые в работе амины, амиды и ионофор моненсин ни в одном из экспериментов не оказывали потенциирующего действия на эффект сыворотки и ЭФР, а, наоборот, в большинстве опытов блокировали вступление клеток в S-фазу.

Влияние ингибиторов пролиферации на процессинг ЭФР изучалось флуоресцентными и радиоизотопными методами с использованием производных ЭФР и антител к ЭФР на клетках ЗТЗ, а также на клетках линии M3I, имеющих самое большое число рецепторов ЭФР.

Показано, что амины, бацитрацин (ингибитор протеаз и трансглутаминазы) и моненсин практически не влияют на связывание ЭФР, кластеризацию и интернализацию ЭФР-рецепторных комплексов в концентрациях, достаточных для подавления пролифера-тивного ответа клеток на ЭФР.

Для проверки возможности влияния аминов и других веществ на индукцию пролиферации за счет блокирования деградации ЭФР в лизосомах был разработан метод измерения величины рН в лизо-сомах (рНл) в отдельных интактных клетках ЗТЗ по флуоресценции декстрана, меченного флуоресцеином. Показано, что не все первичные амины, как это можно было ожидать, вызывают повышение величины рНл, хотя и накапливаются в кислых компартментах клетки. Поскольку ряд ингибиторов пролиферации не влиял и на деградацию ЭФР, можно утверждать, что способность аминов, амидов и моненсина блокировать проведение митогенного сигнала не объясняется повышением величины рНл и замедлением деградации ЭФР в лизосомах.

Наряду с анализом влияния аминов на процессинг ЭФР, проверилось действие ингибиторов пролиферации на одну из ранних реакций клетки на ЭФР - стимуляцию фосфорилированйя уридина. Оказалось, что амины, в особенности дансилкадаверин (ДК), являются эффективными блокаторами активации уридинкиназы, причем тормозящее действие ДК связано, по-видимому, с влиянием амина на свойства клеточных мембран.

В связи с большим значением, которое придается в литературе параметру "текучести" клеточных мембран, был разработан микрофлуориметрический метод измерения степени поляризации флуоресценции мембранного зонда 1,б-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГТ) в отдельных небольших участках интактной клетки. Полученные данные позволяют утверждать, что динамические свойства мембран, измеренные в характеристиках поляризации мембранного зонда, мало отличаются у культур с разным уровнем пролифера-тивной активности. Не наблюдалось изменений "текучести" мембраны и при внесении к покоящимся клеткам ЭФР. Следовательно, микровязкость мембраны вряд ли может рассматриваться как сигнальный пролиферативный параметр.

На основании полученных результатов и литературных данных сделано заключение, что блокирование индукции пролиферации клеток аминами и моненсином осуществляется на этапе прохождения сигнала от мембраны в цитоплазму, т.е. затрагивается процессинг ЭФР на стадиях пребывания ЭФР-рецепторных комплексов в эндосомах и аппарате Гольджи.

2v ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2*1. Общие сведения о ростовых факторах

Пролиферация культивируемых клеток млекопитающих находится под контролем большого числа компонентов культуральной среды. Постоянные клеточные линии имеют разную степень зависимости размножения от состава базальной среды и содержания в ней сыворотки. Так, клетки минимально трансформированных линий, например ЗТЗ, C3HIOTI/2, переходят в состояние покоя (<*0) при отсутствии или низком содержании сыворотки в среде и начинают активно пролиферировать при внесении в среду свежей сыворотки (Никольский, 1984). В настоящее время считается хорошо установленным, что главными компонентами сыворотки, регулирующими активность пролиферации культуры, являются специализированные молекулы - ростовые факторы (РФ). Исследования механизма действия РФ на клетки привлекают сейчас специалистов из самых различных областей биологии и медицины. Проблема РФ стала точкой пересечения разнообразных гипотез, теорий и методических подходов, приобрела большое теоретическое и практическое значение.

К ростовым факторам (митогенам) относят вещества, как правило полипептидной природы, обладающие способностью стимулировать синтез ДНК (пролиферацию клеток) непосредственно или в совокупности с другими факторами, действуя в низких (меньше 10"^ М) концентрациях (Никольский, 1984). РФ обладают высокой специфичностью, обеспечиваемой за счет связывания со специализированными клеточными рецепторами. Действие РФ может проявляться не только в регуляции пролиферации клеток, но и в стимуляции определенных метаболических процессов, инициации диф

- II ференцировки и в осуществлении функций дифференцированной клетки ( Johnson et al,, 1980; Bradshow, Sporn, 1983).

В настоящее время идентифицировано более десятка ростовых и трансформирующих факторов. В таблице I представлены сведения о молекулярной массе, источнике получения и рецепторах наиболее популярных и хорошо изученных РФ.

Рецепторы РФ обнаружены в большинстве типов клеток и тканей млекопитающих ( Adamson, Kees, 1981). Количество рецепторов варьирует в зависимости от типа клеток, стадии клеточного цикла, степени трансформированности культивируемых клеток. Известные рецепторы РФ представляют собой интегральные мембранные белки - гликопротеины, обладающие высоким сродством к РФ (Кд = 10"^ - 10"М). Рецепторы обладают латеральной подвижностью в мембране с коэффициентом латеральной диффузии около 2-6 х Ю""10 см^с*"1 ( Schlessinger et al., 1982). Наличие за-якоривания рецепторов элементами цитоскелета и роль цитоскеле-та в движении рецепторов дискутируется в литературе (Васильев, Гельфандт, 1982; Geiger, 1983). По-видимому, рецепторы всех РФ, особенно в составе РФ-рецепторного комплекса, поступают в клетку путем рецепторно-опосредованного эндоцитоза ( Pastan, Willingham, 1981). Эти процессы будут подробнее описаны ниже на примере эндоцитоза ЭФР.

Широкая распространенность РФ и их рецепторов в различных тканях млекопитающих свидетельствует о важной роли РФ в обеспечении нормального хода эмбриогенеза, контроле пролиферации клеток взрослого организма, ответе на повреждающие воздействия. Многие нормальные и опухолевые клетки в культуре и in vivo обладают способностью секрётировать ростовые и трансформирующие факторы в среду (Roberts et al., 1983).

Таблица I

Ростовые факторы i Название Молекулярная масса 1 Источник получения ! Молекулярная масса рецептора

Эпидермалъный фактор роста (ЭФР) 6000 подчелюстные железы мыши, моча человека 170000

Фактор роста, выделяемый тромбоцитами (ВТФР) 2800031000 тромбоциты человека 185000

Фактор роста фиб-робластов 13400 гипофиз мыши

Инсулиноподобные ростовые факторы: ИРФ-1 (соматоме-дин С)- 6000 плазма человека 2 субъединицы ■ 135000 и 2 субъединицы ■ 90000

ИРФ-2 6000 плазма человека 250000

Фактор роста Т-клеток (интер-лейкин - 2) 14000 лимфоциты человека 55000

- 13

Близкая связь регуляторных механизмов пролиферации и трансформации клеток сейчас уже не вызывает сомнений. Одним из первых серьезных доказательств этой связи было обнаружение 87% гомологии первичной структуры фрагмента фактора роста, выделяемого тромбоцитами (ВТФР) и белка p28sis вируса рака обезьян ( Waterfieid et al,, 1983). Это открытие позволило авторам предложить гипотезу о самостимуляции клеток опухоли посредством экспрессии гена ВТФР. Важнейшее значение для понимания механизмов онкогенеза имела полная расшифровка гена и аминокислотой последовательности рецептора ЭФР, выделенного из клеток линии A43I и человеческой плаценты, а также установление близкой гомологии в первичной структуре внутриклеточного домена рецептора ЭФР и белка - продукта онкогена v-erb-B (Downward et al., 1984b; Ulrich et al., 1984). Наличие уникальной тирозинкиназной активности у белков - продуктов онкогенов и у рецепторов РФ также служит доказательством общности механизмов индукции пролиферации и трансформации клеток (не1-din, Westermark, 1984). Известно также, что гены РФ располагаются в тех же участках хромосом человека, что и некоторые онкогены (Brissenden et al,, 1984), а действие ВТФР на клетки сопровождается экспрессией ряда онкогенов (Armelin et al,, 1984), Таким образом, изучение механизма действия РФ может сыграть важную роль в решении многих теоретических и практических проблем онкологии.

Для исследования действия РФ обычно используется такая постановка эксперимента, при которой клетки лишаются РФ и останавливаются в стадии Gq (G1), после чего пролиферация клеток стимулируется внесением в среду РФ, Наиболее часто для этого применяются мышиные клетки ЗТЗ, сохранившие плотностное торможение роста и сильную зависимость пролиферации от факторов сыворотки (Баркан, Никольский, 1985), Растет число работ, сделанных на различных клонах клеток A43I, фибробла-стах человека и мыши, эпителиальных клетках и других линиях, реагирующих на ЭФР.

В литературе накопилось большое количество данных об изменении интенсивности физиологических, биохимических и морфологических показателей в течение переходного (пререпликатив-ного) периода после получения клеткой пролиферативного сигнала (Когеп, 1980; Carpenter, 1981; Епифанова и др., 1983; Das, 1983; Stiles, 1983). Однако пока нельзя с достоверностью определить последовательность событий, по крайней мере, в начальной фазе инициации пролиферации клеток. Ситуация осложняется тем, что для решения проблемы используются клетки с неодинаковой глубиной покоя, т.е. с различным уровнем активности многих биохимических реакций. Кроме того, какой-либо один РФ, по-видимому, не способен, действуя как ключ, открывающий -замок, обеспечить выход клетки из покоящегося состояния, т.е. должна действовать комбинация факторов в последовательном или параллельном приложении (Никольский, 1984). Так, ВТФР эффективно стимулирует пролиферацию клеток ЗТЗ только в присутст-. вии плазмы крови или соматомединов (Ross, 1981). Ряд авторов выдвигают гипотезу двухшаговой стимуляции клеток, считая, что после получения пролиферативного стимула клетки входят в фазу "компетентности" (подготовленности) к синтезу ДНК. Компетентные (или компилированные) клетки способны необратимо, т.е. независимо от фактора компетентности, однако в присутствии промоторов, переходить в фазу s (Ross, 1981; Smith, Stiles, 1981).

- 15

Всю гамму начальных реакций при получении клеткой проли-феративного стимула, не зависимых от синтеза новых информационных РНК, разделяют в настоящее время на моментальные и ранние реакции (Stiles, 1983). Роль этих реакций, их связь с различными этапами рецепторно-опосредованного эндоцитоза РФ и с отдаленными реакциями клетки (синтезом ДНК и митозом), пока не ясна и требует дальнейших исследований. На сегодняшний день наиболее обширен и разнообразен экспериментальный материал, касающийся механизма действия эпидермального фактора роста (ЭФР).

Заключение Диссертация по теме "Цитология", Соркин, Александр Давидович

б. ВЫВОДЫ

1. Проведен ингибиторный анализ процесса индукции пролиферации культивируемых клеток. Индукция пролиферации покоящихся культур Swiss ЗТЗ и ЗТб осуществлялась добавлением в среду сыворотки,эпидермального фактора роста (ЭФР) и инсулина. Установлено, что такие амины как дансилкадаверин, 5-метокси-триптамин, цистамин, хлорохин, а также диметилмочевина и моненсин блокируют вход клеток в фазу синтеза ДНК.

2. С целью исследования роли начальных реакций в проведении пролиферативного сигнала была детально изучена кинетика мембранного транспорта и внутриклеточного фосфорилирования уридина. Проанализирована математическая модель поступления уридина как тандемного процесса и на ее основании рассчитаны кинетические параметры транспорта и фосфорилирования уридина в культурах ЗТб, L и Lebr-625. Подобраны оптимальные условия для измерения скорости транспорта и фосфорилирования уридина в интактных клетках.

3. Показано, что ЭФР и инсулин вызывают ускорение фосфорилирования уридина в покоящихся культурах ЗТЗ и ЗТб, которое достигает максимума через 25 мин после начала стимуляции клеток. Установлено, что амины, в особенности дансилкадаверин, блокируют активацию уридинкиназы. Анализ поступления и распределения дансилкадаверина в клетках позволил высказать предположение, что тормозящий эффект амина объясняется влиянием на свойства клеточных мембран и не связан с накоплением амина в кислых компартментах клетки.

С помощью 1251-ЭФР и ЭФР, меченного родамином, а также антител к ЭФР, были исследованы стадии рецепторно-опосредован

- 138 ного эндоцитоза ЭФР: связывание ЭФР с рецепторами, кластеризация и интернализация ЭФР-рецепторных комплексов. Показано, что амины и моненсин, в концентрациях, достаточных для блокирования митогенного сигнала, не влияют на связывание, кластеризацию и интернализацию ЭФР в клетках ЗТЗ и A43I.

5. Для изучения влияния аминов на деградацию ЭФР был разработан метод измерения величины рН в лизосомах отдельных ин-тактных клеток ЗТЗ по интенсивности флуоресценции ФЙТЦ-декстра-на. Показано, что метиламин, хлорохин и моненсин способны быстро повышать величину рН в лизосомах с 4,7 до 6,2-7,0, тогда как дансилкадаверин, 5-метокситриптамин и диметилмочевина не изменяли рН в лизосомах. Таким образом, повышение рН в лизосомах не является общим механизмом блокирования аминами деградации ЭФР и не связано с действием всех агентов на проведение митогенного сигнала.

6. На основании полученных результатов и литературных данных сделан вывод, что блокирующий эффект аминов, амидов и моненсина на генерацию пролиферативного сигнала, наиболее вероятно, осуществляется на стадиях процессинга ЭФР в эндосомах и аппарате Гольджи.

7. Для проверки возможного изменения микровязкостных свойств мембраны при действии ЭФР был разработан микрофлуори-метрический метод измерения степени поляризации флуоресценции 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена в отдельных зонах интактных клеток и сферических мембранных фрагментов. Показано, что в характеристиках поляризации флуоресценции данного мембранного зонда динамические свойства мембран клеток культур с разным уровнем пролиферативной активности и стимулированных ЭФР практически не отличаются.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соркин, Александр Давидович, Ленинград

1. Баркан Р.С., Зенин В.В., Скопичева В.И., Сорокин А.Б» Влияние условий культивирования на ростовые свойства клеток ЗТЗ. Цитология, 1984, т. 26, Ш 10, с. II6I-II67.

2. Баркан Р.С., Никольский Н.Н. Минимально трансформированныеклеточные линии ЗТЗ как объект исследования механизмов пролиферации. Цитология, 1985, т. 27, № I, с. 5-27.

3. Булычев А.Г., Веселкина М.Н. Влияние ингибиторов энергетического метаболизма и синтеза белка на процесс сегрегации нейтрального красного в эритроцитах лягушки. Цитология, 1983, т. 25, Ш 4, с. 426-433.

4. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. Взаимодействие нормальных инеопластических клеток со средой. М.: Наука, 1981. 220 с.

5. Виноградова Н.А., Никольский Н.Н., Семенова Е.П. Транспорт

6. Д-ксилозы в клетки млекопитающих в культуре. Цитология, 1980, т. 22, N2 3, с. 303-308.

7. Виноградова Н.А., Никольский Н.Н., Трошин А.С. Тормозящеевлияние мочевины на процесс стимуляции транспорта Сахаров в мышечных волокнах. ДАН СССР, 1971, т. 197, Ш 5, с. II83-II86.

8. Виноградова Н.А., Никольский Н.Н., Трошин А.С. Ингибирование аминами и амидами процесса стимуляции транспорта Сахаров в портняжных мышцах лягушки. Цитология, 1978, т. 20, Ш 3, с. 315-320.

9. Дотри-Варса А., Лодиш Х.Ф. Как рецепторы затягивают белкии частицы внутрь клеток. В мире науки, 1984, К0. 7, с. 28-35.9." Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся- 140 клетки. М.: Наука, 1983. 176 с.

10. Зенин В.В., Никольский Н.Н., Скопичева В.И., Сорокин А.Б.

11. Зависимость пролиферации клеток ЗТ6 от концентрации сыворотки в среде. Цитология, 1982, т. 24, № 8, с. 947-953.

12. Игнатова Т.Н., Плескач В.А., Сальников К.В. Получение ихарактеристика клеток китайского хомячка и мыши, устойчивых к бромистому этидию. В кн.: Функциональная морфология, генетика и биохимия клетки. Л.: Наука, 1974, с. 142-144.

13. Литинская Л.Л., Оглоблина Т.А., Векслер A.M., Агроскин

14. Розанов Ю.М., Барский И.Я., Боровиков Ю.С. Двухканальныймикрофлуориметр. Цитология, 1970, т. 12, № 12, с. 1477-1480.

15. Рудченко С.А., Молодковский Юл.Г., Орехюв Л.Н., Бергельсон Л.Д. Использование периленоилмеченого триглицерида в качестве флуоресцентного зонда для окрашивания липид-ных включений в культивируемых клетках. ДАН СССР, 1983, т. 269, № 6, с. 1487-1483.

16. Сорокин А.Б., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. Транспорт ифосфорилирование уридина в клетках ЗТЗ и СНО в зависимости от условий роста культур. Цитология, 1981а, т. 23, № 4, с. 419-426.- 141

17. Сорокин А.Б., Соркин А.Д., Никольский Н.Н. Транспорт и фосфорилирование уридина в клетках ЗТЗ и СНО при индукции клеточной пролиферации. Цитология, I98I6, т. 23, Ш 5, с. 523-529,

18. Aharonov A., Pruss R.M., Hershman H.R. Epidermal growthfactor, Relationship between receptor regulation and mitogenesis in 3^3 cells. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, P. 3970-3977.

19. Adamson E.D., Rees A.R. Epidermal growth factor reseptors.- Mol. Cell. Biochem., 1981, v. 34, p. 129-152.

20. Armelin H.A., Armelin M.C.S., et al., Functional role forc-myc in mitogenic response to platelet-derived growth factor. Nature, 1984, v. 310, p. 655-660.

21. Becker M.A., Rozengurt E. Inorganic phosphate is necessaryfor the stimulation of ША synthesis in Swiss ЗШЗ cells by pure mitogenic agents. Езф. Cell. Res., 1982, v. 139, P. 431-436.

22. Beguinot L,, Lyall R.M., Wiliingham M.C., Pastan I. Downregulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomes, Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 2384-2388.

23. Bockus B.J"., Stiles G.D. Regulation of cytosceletal architecture by platelet-derived growth factor. Exp. Cell. Res., 1984, v. 153, Ш 1, p. 186-197.

24. Bradshaw R.A., Sporn M.B. Polypeptide growth factors andthe regulation of cell growth and differentiation. -Fed. Proc., 1983, v. 42, p. 2590-2591.

25. Brissenden J.E., Ullrich A., Fpancke U. Human chromosomal- 142 mapping of genes for insulin-like growth factors I and IX and epidermal growth factor. Nature, 1984, v. 310, p. 781-784.

26. Brown K.D., Holley R.W. Epidermal growth factor and thecontrol of proliferation of Balb 3^3 and benzopyrene-transformed Balb 3^3 cells. J. Cell. Physiol., 1979, v. 100, p. 139-146.

27. Buss J.E., Ghouvet C., Gill G.H. Comparison of proteinphosphorylation in variant A431 cells with different growth responses to epidermal growth factor. J. Cell. Physiol., 1984, v. 119, p. 296-306.

28. Carpenter G. Epidermal growth factor. In: Tissue growthfactors /Ed. R.Baserga, Berlin, etc.: Academic Press, 1981, p. 89-132.

29. Carpenter G. Properties of the receptor for epidermal growthfactor. Cell, 1984, v. 37, p. 357-358.1 PS

30. Carpenter G., Cohen S. <E-labeled human epidermal growthfactor. Binding, internalization and degradation in human fibroblasts. J. Cell Biol., 1976, v. 71, p. 159171.

31. Chiba Т., Hirata Г., Taminato Т., Kadowaki S., Matsukufca S.,

32. Fujita Ф. Epidermal growth factor stimulates prostaglandin E release from isolated perfused rat stomach. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1982, v. 105, p. 370-374.

33. Chiva V.A., Cao D.M., Mato J.M. Stimulation by epidermalgrowth factor of phospholipid methyltransferase in isolated rat hepatocytes. FEBS Lett., 1983, v. 160, p. 101-104.

34. Ciarald T.P., Olefsky J.M. Comparison of the effects of insulin and on adipocyte glucose transport. J.

35. Cunningham D.D., Pardee A.B. Transport changes rapidlyinitiated by serum addition to "contact-inhibited" 3^3 cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, v. 64, Ш 3, p. 1049-1056.

36. Das M. Epidermal growth factor: mechanisms of action.1.t. Rev, Cytol., 1982, v. 78, p. 233-256.

37. Das M, Epidermal growth factor receptor and mechanisms foranimal cell division. Curr. Top. memb. Trans. 1983, v. 18, p. 381-405.

38. Dean R.T., Jessup W., Robers C.R. Effect of exogenous amines on mammalian cells, with particular referense to membrane flow. Biochem. J., 1984, v. 217, № 1, p.27-40.- 144 ~

39. Decker T.S. Aspects of the metabolism of the epidermalgrowth factor receptor in A431 human epidermoid carcinoma cells. Mol. Cell. Bjol., 1984, v. 4, N2 4, p.571-575.

40. De Duve C., Barsi Т., Pool В., Trouet A., Tulcens P., van

41. Hoof. Lysosomotropic agents. Bioch. Pharmacol., 1974, v. 23, p. 2435-2534.

42. Dicker P., Heppel L.A., Rozengurt E. Control of membranepermeability by external and internal ATP in 3T6 cells grown in serum free medium. - Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, MS 4, p. 2103-2107.

43. Dickson R.B., Schlegel R., Willinghgm M.O., Pastan I.H.

44. Binding and internalization of «^-niacroglobulin by cultured fibroblasts. Effects of monovalent ionophores. -Exp. Cell. Res., 1982a, v. 142, p. 127-140.

45. Dickson R.B., Schlegel R., Wiliingham M.C., Pastan I.H. Reversible and irreversible inhibitors of clustering of Л in clathrincoated pits on the surface of fibroblasts. Exp. Cell. Res., 1982b, v. 140, p. 215-226.

46. Downward J., Parker P., Waterfield M.D. Autophosphoiylation sites on the epidermal growth factor receptor. -Nature, 1984a, v. 311, p. 483-485.

47. Downward J., Yarden Y. et al. Close similarity of epidermalgrowth factor receptor and v-erb-B oncogene protein sequences. Nature, 1984b, v. 307, p. 521-527.

48. Fox C.F., Vale R., Peterson S.W., Das M. The EGF receptor:identification and functional modulation. In: Hormones and cell culture. Gold Spring Harbor Confer, on cell proliferation. / Eds. G.Sato and R.Ross, 1979, v. 6, p. 143-157.

49. Ghost-Dastidar P., Fox C.F. cAMP-dependent protein kinasestimulates epidermal growth factor-dependent phosphorylation of epidermal growth factor receptors. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, № 6, p. 3864-3869.

50. Gill G.U., Kawamoto Т., Cochet C., Le A., Sato J.D., Masui

51. Goldenberg G.J., Stein W.D. Stimulation of uridine uptakein 3T3 cells is associated with increased ATP affinity of uridine-phosphorylating system. Nature, 1980, v. 2711 P. 4-75-477.

52. Goldstein J.L., Anderson R.C.W., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis and the cellular uptake of low density lipoprotein. In: Membrane recycling. / Ed. Pitman, London: Books Ltd, 1982, p. 77-95.

53. Gospodarowicz D., Moran J. Effect of a fibroblast growthfactor, insulin, dexametasone and serum on the morphology of Balb/c 3T3 cells. Proc. Hat. Acad. Sci. ISA, 1974, v. 71, p. 4648—%52.

54. Green D.A., Moore J.B. Demonstration of protease activityfor EGF-binding protein. Arch. Biochem. Biophys., 1980, v. 202, p. 201-209.

55. Gregoroiu N., Rees A. Properties of a monoclonal antibodyto epidermal growth factor, receptor with implications for the mechamism of action of EGF. EMBO Д., 1984, V. 3, rn 5, p. 929-937.

56. Haigier H.T., Ash J.F., Singer S.J., Cohen S. Visualizationby fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, p. 3317-3321.

57. Haigier H.T., Maxfieid F.R., Wiliingham M.C., Pastan I.125

58. Dansylcadaverine inhibits internalization of -\E-epi-dermal growth factor in Balb 3^3 cells. J. Biol. Chem., 1980a, v. 255, 1Й 4, p. 1239-1241.

59. Haigier H.T.M., Wiliingham Ы.С., Pastan I. Inhibitors of

60. T-epidermal growth factor internalization. Bioch. Biophys. Res. Commun., 1980b, v. 94, p. 630.

61. Heine U.L., Keski-Oja J., Wetzed B. Rapid membrane changesin mouse epithelial cells after exposure to epidermal growth factor. J. Ultrastruct. Res., 1981, v. 72, Ш 2, P. 335-343.

62. Heldin C.-H., Westerraark B. Growth factors: Mechanism ofaction and relation to oncogenes. Cell, 1984, v. 37, p. 9-20.

63. Hirata F., Toyoshima S., Axelrod J., Waxdal M.J. Phospholipid methylation: A biochemical sygnal modulating lymphocyte mitogenesis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, Ш 2, p. 862-865.

64. Hopkins C.R., Broothroyd В., Gregory H. Early events following the binding of epidermal growth factor to surface receptors on ovarian granulosa cells. Eur. J, Cell B50I., 1981, v. 24, p. 259-265.

65. Johnson L.K., Baxter J., Vlodavsky I., Gospodarowicz D. Epidermal growth factor and expression of specific genes: effects on cultured rat pituitary cells are dissociable from the mitogenic response. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 394-398.

66. Johnson L.K., Eberhardt N.L. Nucleic actions of internal!zed epidermal growth factor in rat pituitary cells. -J. Cellul. Biochem., 1982, suppl. 6, p. 139.

67. Johnson S.M. Steady state diphenyl hexatriene fluorescencepolarisation in the study, of cells and cell membranes. -In: Fluorescent probes / Eds. Beddard G.S., West M.A. London etc.: Academic Press, 1981, p. 143-158.

68. King A.C., Davies L.H., Cuatrecasas P. Lysosomotropic alkylamies inhibit mitogenesis induced by growth factors. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 717-721.

69. King A.C., Hernaez-Davis L., Cuatrecasas P. Lysosomotricamines cause intracellular accumulation of receptors for epidermal growth factor.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980a, v. 77, P. 3283-3287.

70. King A.C., Willis R.A., Cuatrecasas P. Accumulation of epidermal growth factor within cells does not depend on receptor recycling. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1980b, v. 97, Ш 3, p. 840-845.

71. Korea R., Bercovitz H. The effect of verapamil a calciumantagonist, of the serum-dependent regulation of uridine uptake by cells in culture. Exp. Cell Res., 1983, v. 143, 1 1, p. 71-77.

72. Koren R., Shohami E. The interaction of ionophore A23187with the uridine uptake system of quiescent and serum-activated Hamster fibroblasts. Exp. Cell. Res., 1980, v. 127, P. 55-61,

73. Koren R., Shohami E., Bibi 0., Stein W. Uridine transportproperties of mammalian cell membranes are not directly involved with growth control or oncogenesis. FEBS Lett., 1978, v. 86, № 1, p. 71-75.

74. Krieger M., Brown M.S., Goldstein J.L. Isolation and characterization of Chinese hamster cell mutants defective ia recepto^iediated endocytosis of LDL. J. Cellul. Biochem., 1982, suppl. 6, p. 119.

75. Levitzki A., Wiliingham M., Pastan I. Evidence for paticipation of transglutaminase in receptor-mediated endocytosis. Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, p. 27062710.

76. Lorand L., Lockridge O.M., Campbell L.K., Myhrman R., Bruner-Lorand J. Transamidating enzymes. II. A continuous fluorescent method suited for automating measurements of factor XIII in plasma. Analyt. Biochem., 1971, v. 44, Ш 1, p, 221-231.

77. Lowry O.H., Rosenbrough H.J., Farr A.L., Randell J. Proteinmeasurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, Ш 1, p. 265-275.

78. Mato J.M., Pencev D., Vasanthakumar G., Schiffmann E.,

79. Pastan I. Inhibitors of endocytosis perturb phospholipid metabolism in rabbit neutrophils and other cells. -Proc. Nat. Acad. Sci.pSA, 1983, v. 80, Ш 7, p. 1929-1932.

80. Maxfieid F.R. Weak bases and ionophores rapidly and reversibly raise the pH of endocytic vesicles in ciltured mouse fibroblasts. J. Cell Biol., 1982, v. 95, p. 676-681.

81. Maxfieid F.R., Davies P.J.A., Klempner L., Wiliingham M.,

82. Pastan I. Epidermal growth factor stimulation of DNA synthesis is potentiated by compounds that inhibit its clustering in coated pits. Proc. Nat. Acad. Sci. ША, 1979a,v. 76, p. 5731-5735.

83. Maxfieid F.R., Wiliingham M.C., Davies P.A., Pastan I. Amines inhibit the clustering of o(2-macroglobulin and EGF on the fibroblast cell surface. Nature, 1979b, v.277, p. 661-663.

84. McKanna J.A., Haigier H.T., Cohen S. Hormon receptor topology and dynamics: morphological analysis using ferritin--labeled epidermal growth factor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, p. 5689-5693.

85. Moolenaar W.H., Tertoolen L.G,, de Laat S.W. Growth factors immediately raise cytoplasmic free Ca in human fibroblasts. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, N2 13, p. 8066-8069.

86. Mroczkowski В., Mosig G., Cohen S. ATP-stimulated interaction between epidermal growth factor receptor and super-coiled DM. Nature, v. 309, p. 270-273.

87. Muller P., Volloch Z., Shinitzlci M. Correlation betweencell density, membrane fluidity, and the availability of transferrin receptor in Freind erythroleukemic cells. Cell biophys., 1980, v. 2, p. 233-240.

88. O'Farrell U.K., Clingan D., Rudland Ph. S., Jimenez de

89. Asua L. Stimulation of the initiation of DNA synthesis and cell division in several cultured mouse cell types (Effect of growth-promoting hormones and nutrients). -Exp. Cell Res., 1979, v. 118, p. 311-321.

90. Ohkuma S., Moriyama Y., Takano T. Identifiecation and characterization of a proto pump on lysosomes by fluorescein isothiocyanate-dextran fluorescence. Proc. Natl,

91. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, N2 9, p. 2758-2762.

92. Ohlmma S., Poole B. Fluorescence probe measurement of theintralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc, Nat. Acad. Sci. USA,1978, v. 75, P. 3327-3331.

93. Parker J.P., Stabel S., Waterfield M.D. Purification tohomogeneity of protein kinase Ofrom bovine brain -identity with the phorbol ester receptor. EMBO J., 1984, v. 3, № 5, p. 953-959.

94. Pastan I.H., Wiliingham M.C. Receptor mediated endocytosisof hormones in cultured cells. Ann. Rev. Physiol., 1981, v. 43, p. 239-250.

95. Plagemann P.G.W., Marz R., Wohlhueter R.M. Uridine transport in Novikoff rat hepatoma cells and other lines and its relationship to uridine phosphorylation and phospho-rolysis. J. Cell. Physiol., 1978, v. 97, Ш 1, p.49-72.

96. Plagemann P.G.W., Wohlhueter R.M., Erbe J. Facilitatedtransport of inosine and uridine in cultured mammalian cells is independent of nucleoside phosphorylases. -Biochim. Biophys. acta., 1981, v. 640, p. 448-462.

97. Rees A.R., Gregoriou M., Johnson P., Garland P.B. Highaffinity epidermal growth factor receptors on the surface of A431 cells have restricted lateral diffusion. -EMBO J., 1984, v. 3, N2 8, p. 1843-1847.

98. Robbins A.R. Preliminary characterization of a mutant defective in receptor-mediated endocytosis. J. Cell. Biochem., 1982, suppl. 6, p. 120.

99. Roberts А.В., Frolik C.A., Anzano M.A., Sporn M.B. Transforming growth factors from neoplastic and nonneoplas- 153 tic tissues. Fed. Proc., 1983, v. 42, p. 2b21-2626.

100. Ross R. The platelet-derived ractor. In: Tissue growthractors / Ed. R.Baserga. Berlin etc.: Academic Press, 1981, p. '133-160.

101. Ross S.P., Pruss R.M., Hershman H.R. Initiation of 3^3fibroblast cell division by epidermal growth factor. -J. Cell Physiol., 1975, v. 86, p. 593-598.

102. Rozengurt E., Mierzejewski K., Wigglesworth N. Uridinetransport and phosphorylation in mouse cells in culture: effect of growth-promoting factors, cell cycle transit and oncogenic transformation. J. Cell. Physiol., 1978, v. 97, p. 241-252.

103. Rozengurt E., Stein W.D. Regulation of uridine uptake byserum and insulin in density-inhibited 3T3 cells. -Biochim. biophys. acta., 1977, v. 464, p. 417-4-32.

104. Rozengurt E., Stein W.D., Wigglesworth N.M. Uptake ofnucleosides in density-inhibited cultures of 3^3 cells. Nature, v. 267, p. 442-445.

105. Savage C.R., Cohen S. Epidermal growth factor and a newderivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization. J. Biol. Chem., 1972, v. 247, P. 7609-7611.

106. Savage C.R., Inagami Т., Cohen S. The primary structureof epidermal growth factor. J. Biol. Chem., 1972, v. 247, p. 7612-7621.

107. Savion N., Vlodavsky I., Gospodarowitz D. Role of the degradation process in the mitogenic effect of epidermal growth factor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p. 1466-1470.- 154

108. Schlessinger J., Schreiber А.В., Levi A., Lax I., Libermann Т., Yarden Y. Regulation of cell proliferation by epidermal growth factor. CRC Crit. Rev. Biochem., 1983, v. 14, p. 93-111.

109. Schreiber А.В., Libermann T.A., Lax I., Yarden Y., Schlessinger J. Biological role of epidermal growth factor-receptor clustering. Investigation with monoclonal anti-receptor antibodies. J. Biol. Chem., 1983, v. 258,1. Ш 2, p. 846-853.

110. Scott R.E., Perkins E.G., Zschunko M.A., Hoerl B.J.,

111. Maercklein P.B. Plasma membrane vesiculation in З'-^З and SV3T3 cells. I. Morphological and biochemical characterization. J. Cell. Sci., 1979, v. 35, p. 229-243.

112. Shechter Y., Hernaez L., Cuatrecasas P. Epidermal growthfactor: biological activity requires persistent occupation of high affinity cell surface receptors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1978a, v. 75, p. 5788-5791.

113. Shechter Y., Hernaez L., Schlessinger J., Cuatrecasas P.1.cal aggregation of hormone-receptor eomplexes is required for activation by EGF. Nature, 1979, v. 278, P. 835.

114. Shimizu N., Miskimins W.K., Camou S., Shimizu Y. Toxinhoimone conjugates and resistant variants. J. Cell. Biochem., 1982, suppl. 6, p. 133.

115. Simpson D.L., Cawley D.B., Herschman H.R. Killing of cultured hepatocytes by conjugates of asialofetuin and EGF linked to the A chains of ricin or diphteria toxin. -Cell,, 1982, v. 29, p. 469-473.

116. Smith J.C., Stiles G.D. Cytoplasmic transfer of the mitogenic response to platelet-derived growth factor. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 4363-4367.

117. Soderquist A.M., Carpenter G. Developments in the mechanisms of growth factor action: activation of protein kinase by epidermal growth factor. Fed. Proc., 1983» v. 42. p. 2615-2620.

118. Stiles C.D. The Molecular Biology of platelet-derived

119. Growth factor. Cell, 1983, v. 33, p. 653-655.

120. Stoscheck C.M., Carpenter G. Characterization of the metabolic turnover of epidermal growth ractor receptor protein in A-431 cells. J. Cell. Physiol., 1984a, v. '! dO, p. 296-302.

121. Vidair G., Rubin H. Evaluation of Mg as an intracellularregulator of uridine uptake. J. Cell. Physiol., 1981, v. 108, ffi 3, P. 317-325.

122. Wardzala L.J., Jeanrenaud B. Potential mechanism of insulin action glucose transport in the isolated rat diaphragm. Apparent translocation of intracellular transport units to the plasma membrane. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, p. 7090-7093.

123. Waterfield M.D., Scrace G.T. et al. Platelet-derivedgrowth factor is structurally related to the putative transforming protein p28s^"s of simian sarcoma virus. -Nature, 1983, v. 304, p. 35-39*

124. Wharton W., Pledger W.J. Regulation of uridine kinaseactivity in Balb/c-ЗТЗ cells by serum components. In vitro, 1981, v. 17, N2 8, p. 706-712.

125. Wibo M., Poole B. Protein degradation in cultured cells.1.. The uptake of chloroguine by rat fibroblasts and the inhibition of cellular protein degradation and cathepsin- 157

126. Bv J. Cell. Biol., 1974, v. 63, p. 430-440.

127. Wiliingham M.C., Haigler H.T., Fitzgerald D.Y.P., Gallo

128. M.G., Rutherford A.V., Pastan I.H. The morphological pathway of binding and internalization of epidermal growth factor in cultured cells. Studies on A 431, KB and 3T3 cells using multiple methods of labelling* -Езф. Cell Res., 1983, v. 146, p. 163-175.

129. Wiliingham M.O., Hanover J.A., Dickson R.B., Pastan I.

130. Morphologic characterization of the pathway of transferrin endocytosis and recycling in human KB cells. -Proc. ITat. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, N2 1, p. 175-179.

131. Wiliingham M.G., Pastan I. The morphologic pathways of receptor-mediated endocytosis cultured fibroblasts. In: Cellular Controls in differentiation / Lloyd C.W., Rees D.A. London etc.: Academic Pi?ess, 1981, p. 59-80.

132. Wiliingham M.C., Pastan I.H. Transit of epidermal growthfactor through coated pits of the Golgi system. J. Cell. Biol., 1982, v. 94, NS 1, p. 207-212.

133. Wolhluter R., Plagemann P.G.W. The role of transport andphosphorylation in nutrient uptake in cultured animal cells. Intern. Rev. Cytol., 1980, v. 64, p0 171-240.

134. Yarden Y., Gabbay M., Schlessinger J. Primary amines donot prevent the endocytosis of epidermal growth factor into 3T3 fibroblasts. Biochem. Biophys. Acta, 1981, v. 674, p. 188-203.

135. Xeh Y.C., Yeh H.W. Modulation of epidermal growth factorbinding by serum. Fed. Proc., 1983, v. 42, p. 1903.

136. Young M.R., D'Arcy Hart P., Geisow M.J. Action of weakbases on phagosomes of cultured macrophages. Suppressionby ammonium ions of an early increase in phagosomal pH. Exp. Cell Res., 1981, v. 135, p. 44-2-445.

137. Yuli I., Wilbrandt W., Shinitzky M. Glucose transportthrough cell membranes of modified lipid fluidity. -Biochemistry, 1981, v. 20, p. 4250-4256.

138. В заключение хочу поблагодарить своего научного руководителя доктора биологических наук, профессора Николая Николаевича Никольского за постоянное внимание и помощь в работе.

139. Выражаю искреннюю благодарность всем сотрудникам лаборатории физиологии клеточного цикла, где была сделана эта работа.