Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода"

На правах рукописи

РЫЛОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРИ ПОНИЖЕННОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА

03.03.01 - физиология

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ДПР ш

Москва 2013

005051807

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научный руководи!ель:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

зав. лабораторией «Протеомики»

отдела «Молекулярно-клеточной биомедицины»

ГНЦ РФ - ИМБГТ РАН Ларина Ирина Михайловна

доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Института, зав. лабораторией «Энергетики биологических систем» Института

Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН Маевский Евгений Ильич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

диссертационного совета Д 002.111.и 1 в Федеральном 1 осударственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН

Автореферат разослан » 013 г.

учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН»

Защита диссертации состоится

заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.А. Левинских

- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ • —. Актуальность проблемы

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были открыты почти 40 лет назад в лаборатории А.Я. Фриденштейна (Фриденштейн, Лурия, 1980) при анализе клеточных популяций костного мозга по способности формировать колонии фибробластоподобных клеток и по аналогии с гемопоэтическими стволовыми были названы КОЕ-ф (колониеобразующие единицы фибробластов). В настоящее время ученые многих стран обнаружили высокую пластичность этих предшественников, заключающуюся в способности дифференцироваться в клетки разных типов тканей взрослого организма, а также выяснили, что они присутствуют не только в костном мозге. Близкие по свойствам к ММСК клетки выделены из целого ряда тканей и органов, таких как жировая ткань, синовиальная жидкость, скелетные мышцы, легкие, Вартоновский студень пупочного канатика, периодонтальные связки, пульпа зуба и др. (Caplan, 1991; Crisan et al., 2008; Da Silva Meirelles et al., 2006; Fraser et al., 2006; Griffiths et al., 2005; Beltrami et. al., 2003; Josse et al., 2010), что свидетельствует о широком распространении их в организме как тканеспецифичного резерва малодифференцированных мезенхимапьных клеток, которые способствуют поддержанию и регенерации этих тканей.

Хорошо известны такие свойства ММСК in vitro, как, например, дифференцировка в клетки различных тканей мезенхимального происхождения, (Clarke et al., 2000; Zuk et. al., 2002; Gimble et al., 2008), однако существует мало информации относительно естественного распределения и биологии этих клеток в организме, а также возможных изменений их свойств в процессе экспансии in vitro.

Внедрение клеточных технологий, основанных на использовании уникальных свойств ММСК, в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины и требует проведения многочисленных исследований. При этом быстро развивающиеся технологии предоставляют широкие возможности для контролируемого изменения параметров культивирования различных типов клеток. Однако чаще всего эти изменения касаются химических компонентов ростовой среды (содержание питательных веществ, факторов роста, солей и аминокислот). Газовый состав традиционно остается наиболее консервативным параметром при культивировании, при этом уровень СОг приближается к тканевому, тогда как содержание кислорода в обычных СОг-инкубаторах соответствует содержанию кислорода в воздухе (около 20%).

Вопрос о том, какая концентрация кислорода является физиологической для клеток in vitro, активно обсуждается в научной литературе. В связи с этим предпринимаются попытки изучения состояния культивируемых клеток при различном содержании

кислорода (Cooper et. al., 1999; Das et. al., 2001; Bosch et.al., 2006; Grayson et. al., 2006; Буравкова, Анохина, 2007; Буравкова и др., 2009). Однако нет единого мнения о том, какую концентрацию кислорода надо использовать, какое время клетки должны подвергаться воздействию измененного содержания кислорода, как при этом следует учитывать такие факторы, как состав среды, плотность субкультивирования клеток и др. Высказываются предположения, что физиологическое содержание кислорода (около 4%-7%) будет оптимальным для культивируемых клеток (Буравкова и др., 2009; Fehrer et. al., 2007), а более низкий уровень приведет к гипоксическому состоянию.

Особый интерес исследователей к ММСК, как наиболее перспективному клеточному элементу для тканевой инженерии и восстановительной медицины, диктует необходимость проведения исследований, посвященных оценке функционального состояния ММСК в процессе их экспансии ex vivo, а также оптимизации процесса культивирования с целью приближения к условиям физиологического микроокружения этих клеток.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является оценка влияния различного процентного содержания кислорода на морфофункциональное состояние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

Задачи исследования:

1. Сравнить эффект, оказанный различным содержанием кислорода (20%, 5%, 3%, 1% Ог), на морфологию ММСК жировой ткани человека in vitro;

2. Провести сравнительный анализ жизнеспособности ММСК, культивируемых при пониженной до 5%, 3% и 1% концентрации кислорода;

3. Изучить влияние газовой среды с измененным уровнем содержания кислорода на число КОЕ-ф и пролиферативную активность ММСК;

4. Исследовать экспрессию маркерных поверхностных антигенов ММСК, культивируемых при различном содержании кислорода;

5. Сравнить остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал ММСК в стандартных условиях и при пониженном до 5% и 1% уровне содержания кислорода;

6. Оценить влияние пониженного содержания кислорода (5%, 3%, 1% Ог) на метаболизм глюкозы в процессе гликолиза;

7. Исследовать обратимость эффектов пониженного содержания кислорода на ММСК

жировой ткани;

8. Исследовать влияние газовой среды с различным содержанием кислорода (20% и

5% О2) на уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК.

Научная новизна

Впервые проанализировано влияние постоянного воздействия различного содержания кислорода (20%, 5%, 3%, 1%) на метаболизм глюкозы и морфофункциональное состояние ММСК, а также проведен сравнительный анализ дифференциальной экспрессии генов при различном содержании кислорода в среде культивирования.

Впервые установлено, что снижение гетерогенности популяции ММСК и увеличение в ней доли веретенообразных клеток при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1% 02) сопровождается изменением экспрессии генов таких структурных и регуляторных белков цитоскелета как, р-тубулин, супервиллин, анкерин, тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки Rho-ГТФазы, трансгелин и саркогликан-у.

Получены новые данные, свидетельствующие о стимулирующем эффекте пониженного содержания кислорода в среде (5% О2) на пролиферацию ММСК, что соотносится с изменением экспрессии регуляторов клеточного цикла (белки семейства Fos, формирующие транскрипционный фактор API, ядерный антиген пролиферирующих клеток, циклин D2, регуляторная единица циклин-зависимой киназы и ингибитор циклин-зависимой киназы).

Впервые показано, что культивирование ММСК при пониженной концентрации кислорода приводит к уменьшению потребления глюкозы клетками и увеличению молярного соотношения продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы, что сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий и увеличением экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического расщепления глюкозы.

Впервые продемонстрирована обратимость изменений, вызванных пониженной концентрацией кислорода в среде, заключающаяся в восстановлении остеогенного дифференцировочного потенциала, уменьшении пролиферативной активности ММСК и способности к формированию КОЕ-ф.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование позволило продемонстрировать, что содержание кислорода в среде культивирования может быть использовано как фактор, модулирующий

свойства ММСК, что имеет большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований в области физиологии прогениторных клеток. Представленные результаты вносят существенный вклад в изучение основных механизмов вовлечения ММСК в процессы репарации с учетом специфики их локального микроокружения.

Полученные в настоящей работе данные показали, что использование низкого парциального давления в среде культивирования позволяет в 2-3 раза увеличить прирост клеточной массы по сравнению с условиями стандартного содержания кислорода в среде культивирования (20% О2). Получен патент на изобретение № 2418066 от 26.04.2010.

Данные настоящего исследования демонстрируют возможность поддержания недифференцированного статуса активно пролиферирующей популяции ММСК в условиях пониженного содержания кислорода, что может иметь большое значение для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Положения, выносимые на защиту

1. Снижение концентрации кислорода (до 5%-1%) в среде культивирования оказывает протективное действие на ММСК жировой ткани человека, что выражается в увеличении жизнеспособности клеток, а также снижает гетерогенность популяции, активирует пролиферацию и смещает метаболизм глюкозы ММСК в сторону гликолитической составляющей.

2. Концентрация кислорода в среде культивирования около 5% является наиболее оптимальной для постоянной экспансии in vitro и моделирования физиологической ниши прогениторных клеток жировой ткани, тогда как более низкое содержание кислорода (< 1% Ог) может быть использовано для сокращения времени экспансии и получения большего количества клеток для нужд регенеративной медицины.

3. Вызванное низким парциальным давлением кислорода в среде культивирования увеличение пролиферативной, клоногенной активности и сохранение менее коммитированного состояния ММСК является обратимым.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 8-й — 10-й конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2009 - 2011); 6-й Всероссийской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2011); 7-й Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, 2009); Всероссийской научной школе по биомедицинской инженерии «БМИ - 2010» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для

молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 4-й Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecuiar, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 2nd International Conference on Medical Physiology «Recent researches in modern medicine» (Cambridge, UK, 2011); World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany, 2011).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.

Работа выполнена при поддержке программы поддержке программы ОБН РАН и гранта Минобрнауки РФ№ 11.G34.31.0006.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 24.10.2012 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 39 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 371 источника, из них 34 на русском и 337 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследований

Получение и культивирование ММСК. Для получения первичной культуры использовали метод ферментативной обработки стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани человека (Zuk et al., 2001, Буравкова и др., 2009). Культивирование клеток осуществляли в среде а-МЕМ (МР Biomedicals, США) с добавлением 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США). Плотность посадки клеток составляла 3 х 103 клеток/см2.

Стандартное культивирование проводили при 37°С в атмосфере 5% СО2 с использованием СОг-инкубатора (Sanyo, Япония) Для создания пониженного содержания кислорода в среде использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония) (5% Ог) и герметичную камеру (Stern Cell Technologies, США), модифицированную датчиками давления и концентрации О2, которую продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления 1% и 3% концентрации кислорода В работе использовали клетки 1-8 пассажа. Каждый эксперимент воспроизводился 3-6 раз с дублированием аналитических измерений.

Характеристика ММСК. Оценку морфологии ММСК и подсчет клеток для определения их прироста проводили с помощью программы Sigma ScanPro 5 при анализе

фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL, оснащенного системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия).

Число удвоений популяций (PD) подсчитывали по формуле PD = log2N/No, где No и N - начальное и конечное количество клеток (Wolfrom С., Raynaud N., Maigne J., 1994). Время удвоения популяции (TD) определяли по формуле TD = (log32). t/[log2(N/N0)], где t - время прироста популяции, N - количество клеток через время t, No - исходное количество клеток (Романов, 2011 ).

Способность ММСК формировать колонии в процессе культивирования на разных пассажах оценивали методом, описанным в работе А.И. Фриденштейна и сотрудников (1987). В чашки Петри (0 60 мм) высевали по 50 клеток и культивировали в ростовой среде. Через 14-15 дней культуры окрашивали 0,5% раствором кристаллвиолета в метаноле в течение 5 мин. (Фриденштейн и др., 1967).

Иммунофенотип клеток оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (Immunotec, Франция), меченых FITC (HLA-ABC, CD9, CD90, CD106, CD54, CD31, CD117) и РЕ (CD34, CD54, CD73, CD105, CD62L, CD62P, CD62E), на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали неиммунные меченые FITC и РЕ моноклональные антитела (Immunotec, Франция) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера.

Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.

Индукцию дифференцировки осуществляли с помощью остеогенных (10" M дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ г-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 цМ дексаметазона (Sigma, США), 10 цг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания), 200 цМ индометацина (Sigma, США)) дифференцировочных стимулов. Выявление щелочной фосфатазы проводили с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Выявление минерализованных компонентов матрикса проводили, окрашивая культуры клеток ализариновым красным (Sigma, США). Коммитирование ММСК в адипогенном направлении оценивали по появлению клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США).

Концентрацию лактата и глюкозы в среде определяли ферментативным колориметрическим методом, согласно инструкции производителя наборов (Biocon, Германия) на спектрофотометре Eppendorf (Германия) и затем пересчитывали на 1 клетку по формуле:

. [AMet]

Чма - Xv

где [AMet] величина, на которую изменилась концентрация глюкозы/лактата в среде за 24 часа и Xv среднее количество клеток в данный момент времени. Молярное соотношение продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы (YLa/Giu) рассчитывали как соотношение Фл/qG/u.

Выявление и оценку функционального состояния митохондрий в ММСК проводили с помощью флуоресцентного красителя MitoTracker Red 580 (Invitrogen, США).

Исследование дифференциальной экспрессии генов проводили в ММСК подвергавшихся 96 часовой экспозиции, а также при постоянном культивировании в условиях 20% и 5% содержания О2. Результаты уровня экспрессии генов ММСК, полученные с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США) сотрудниками фирмы ООО «Геноаналитика» анализировали с помощью базы данных littp://w\vw.ncbi.nlm.nih.gov.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ "Excel" и "Statistica 7.0" для WinXP. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека

Культивируемые ММСК, выделенные из СВФ жировой ткани, представляли собой морфологически гетерогенную популяцию адгезивных клеток, в которой можно выделить треугольные или звездчатые клетки (40-60 мкм), веретеновидные клетки (60-100 мкм) и очень крупные (до 200 мкм) клетки с большим количеством отростков (рис. 1). При субкультивировании ММСК происходила постепенная смена одного типа клеток другим: преобладающие на 1-2 пассаже клетки 1-го и 2-го типа постепенно заменялись клетками 3-го типа, что сопровождалось торможением пролиферации. К 6-му пассажу снова наблюдалось появление клеток 2-го типа и изменение морфологической картины культур ММСК, что вероятно объясняется субселекцией определенной клеточной популяции на данном этапе культивирования. Однако доминирования этого типа клеток не происходило и в последующем в культурах 8-го пассажа снова начинали преобладать крупные распластанные клетки 3-го типа.

Пролиферативный потенциал ММСК характеризовался сходной динамикой

показателей пролиферативной активности (число удвоения и время удвоения популяции)

вне зависимости от количества ядросодержащих клеток после выделения. Сравнительный

анализ числа удвоений и времени удвоения популяции позволил выявить общую

тенденцию, которая заключалась в поддержании более высокой скорости пролиферации в

течение первых 3-х пассажей и ее значительном снижении, как правило, к 4-му пассажу

(табл. 1). Более длительное культивирование сопровождалось сокращением числа

удвоений и увеличением доли крупных распластанных клеток 3-го типа и клеток, в

которых была выявлена активность Р-галактозидазы, свидетельствующей об их старении.

Таблица I. Показатели, характеризующие пролиферативную активность ММСК на начачьных этапах культивирования. Данные представлены как М ± т, п~5, * - достоверное отличие от значении на 1 пассаже, р < 0,05.

Пассаж Число удвоений Время удвоения, часы

1 2,2 ± 0,45 78 ±9

2 1,5 ±0,11 96 ±8

3 1,9 ±0,42 87 ±18

4 ,0,8 ±0,10* 186 ± 21*

Изучаемые клетки экспрессировали ряд поверхностных антигенов, которые регулируют такие процессы как адгезия, миграция, рецепция, ко-рецепция и межклеточные взаимодействия и формируют характерный иммунофенотипический профиль резидентных ММСК жировой ткани. Иммуноцитохимическое исследование клеток показало стабильную экспрессию ряда поверхностных антигенов, которые в настоящее время широко используются для идентификации ММСК (Gronthos, et al., 2001; Zuk et. al., 2002; Буравкова и др., 2009; Mafi et al., 2011), а именно: HLA-ABC (антиген лимфоцитов человека - А, -В, -С), CD105 (эндоглин, рецептор TGF-p), CD73 (5'-нуклеотидаза), CD90 (рецепторная тирозинкиназа-1), а также CD54 (ICAM-1, молекула межклеточной адгезии 1 типа), CD106 (VICAM-1, молекула адгезии клеток сосудов 1 типа) и CD9 (тетраспанин), при этом клетки не экспрессировали маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток, такие как CD45, CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR (рис. 2).

При оценке дифференцировочного потенциала ММСК была подтверждена их способность коммитироваться в остеогенном и адипогенном направлении в ответ на присутствие соответствующих стимулов в среде культивирования. Наблюдаемый на 1-ом пассаже достаточно высокой уровень активности щелочной фосфатазы (маркера ранней остеодифференцировки) в клетках, не подвергавшихся индукционным стимулам, значительно снижапся к 3-му пассажу. При этом клетки в отсутствии стимулов не формировали минерализованного матрикса, тогда как добавление остеогенных индукторов сопровождалось активной кальцификацией соединительно-тканных структур матрикса (рис. 7, а). ММСК также не дифференцировались спонтанно в адипогенном направлении. В ходе индуцированного адипогенеза клетки приобретали близкую к сферической форму, группировались в кластеры клеток, накапливающих в цитоплазме липидные включения различного размера (рис. 7, б).

Таким образом, клетки-предшественники, выделенные из СВФ жировой ткани, характеризовались комплексом морфофункциональных свойств, отражающих их фенотипическую принадлежность к мезенхимальным стромальным клеткам: обладали свойственными этим клеткам морфологическими особенностями и потенциалом к экспансии in vitro, экспрессировали характерные поверхностные маркеры и были способны подвергаться направленной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлении.

сом 94,9%

....... .......

(1)31

0,55%

(1)105

• 97,5%

С 1)73

Рис. 2. Иммунофенотип ММСК, выделенных из жировой ткани человека. Представлены репрезентативные данные для клеток 4-го пассажа.

Д. 13'2%

Рис. 1 Морфологическая гетерогенность ММСК. Представлены клетки первого типа (а), второго типа (б) и третьего типа (в) в культуре 4 пассажа, фазовый контраст, ув. хЮО

Рис. 3. Морфология ММСК 2-го пассажа при экспозшщи в условиях 20% (а), 5% (б). 3% (в) и 1% (г) содержания кислорода в среде культивирования, фазовый контраст, ув. х 100.

а б в г

Рис. 5. Формирование колоний ММСК 2-го пассажа в условиях 20% (а). 5% (б), 3% (в) и 1% (г) концентрации кислорода. Окраска кристаллвиолетом, ув. х 0.6.

Влияние пониженного содержания кислорода на морфофункциональные характеристики ММСК

При снижении содержания кислорода популяция крупных клеток 3-го типа уменьшалась, и уже на 2-ом пассаже преобладали клетки 1-го и 2-го типа (рис. 3). Более длительное культивирование в течение 4-х пассажей не вызывало дальнейших морфологических изменений ММСК в условиях 5% 02, тогда как экспансия в условиях 1% и 3% 02 приводила к появлению распластанных клеток с большим количеством отростков.

Клетки с морфологией, отличной от наблюдаемой в стандартных условиях культивирования, имели отличия в уровне экспрессии ряда генов. Было отмечено, что в ММСК при 5% 02 уровень экспрессии генов ТШВЗ, ЭУИ и ЛЫК2, продукты которых ф-тубулин, супервиллин, анкерин) участвуют в примембранной перестройке и стабилизации цитоскелета был выше, а генов ТРМ2, АСТЫ1, СШЗ. СОС42ЕРЗ, СОС42ЕР1, ТЛак Ъ'ССС, продукты которых (тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки Юю-ГТФазы, трансгелин и саркогликан-у) участвуют в формировании адгезионных контактов, взаимодействии с ВКМ и формировании псевдоподий, был ниже, чем в стандартных условиях культивирования (20% 02) (табл. 2). Допуская, что появление клеток 3-го типа связано с их повреждением в процессе культивирования, можно предположить, что приближение концентрации кислорода в среде к тканевому уровню обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества таких клеток, о чем свидетельствует увеличение гомогенности культур ММСК в условиях 5% и 3% 02.

Оценка пролиферативного потенциала культивируемых клеток показала, что уменьшение концентрации кислорода (до 5%-1%) способствовало активации пролиферации (на 2-ом пассаже максимальное количество удвоений в 2 раза превышало значение при 20% 02). При этом более выраженный стабильный прирост клеток наблюдался в условиях 5% 02 (рис. 4, а). Уменьшение концентрации кислорода сокращало время лаг-фазы на кривой пролиферации до нескольких часов, тогда как при 20% 02 лаг-фаза длилась не менее двух дней (рис. 4, б). Экспансия клеток в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась увеличением числа КОЕ-ф, в то время как при 20% 02 формирования колоний не происходило. Перенос клеток в условия пониженного содержания кислорода (5%-1%) активировал эту способность, максимально выраженную на втором пассаже (рис. 5). Механизм влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный потенциал ММСК остается не совсем понятным. Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток может быть уменьшение окислительного повреждения клеток в результате окислительного стресса (Бурнаевский и др., 2010).

Таблица 2. Соотношение уровня дифференциальное экспрессии генов ММСК 2-го пассажа при 5% и 20% О» ■ * - достоверное отличие от значении в условиях стандартного содержания кислорода.

Интенсивности

Символ Продукт сигнала 5% / 20% 02

TUBB3 Р-тубулин, 3 2,2*

SVIL супервиллин 2,3*

н ANK2 анкерин 2 3,6*

5 ТРМ2 тропомиозин 2 0,5*

К ACTN1 актинин 1 0,5*

и CNN3 кальпонин 1 0,4*

-е- CDC42EP3 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 3 0,3*

а. о CDC42EP1 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 1 0,3*

£ TAGLN трансгелин 0,3*

SGCG саркогликан-у 0,2*

К FOSB белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор API 4,2*

« о. FOSL1 белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор API 3,2*

■©■ S PCNA ядерный антиген пролиферирующих клеток 2,1*

п о CCND2 Gl/S-специфичный циклин D2 2,0*

с CKS2 регуляторная единица циклин-зависимой киназы 2,0*

CDKN2C ингибитор циклин-зависимой киназы 0,4*

НК1 гексокиназа, изоформа 1 1,1

НК2 Гексокиназа, изоформа 2 1,1

шй PFKL Фосфофруктокиназа, изоформа L 1,6

а PFKP Фосфофруктокиназа, изоформа Р 1,9

5 PFKFB3 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-6исфосфатаза, изоформа 3 2,1*

S ч с PFKFB4 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-бисфосфатаза, изоформа 4 1,6

ALDOC альдолаза С 2,1*

о g РКМ2 пируваткиназа, изоформа М2 1,5

LDHA лактатдегидрогеназы А 1,5

PDK1 киназу пируватдегидрогеназы1 0,9

BIRC5 антиапоптотические белок белок IAP 3,5*

PSF.N2 пресенилин 2 3,2*

о STAMBP1J металлопротеаза, взаимодействующая с FADD 2,4*

С BCL2L1 антиапоптотический белок Вс12 2,2*

С Т1МРЗ ингибитор металлопептидазы 3 0,4*

1GFBP3 белок, связывающий IGF 0,3*

BNIP3 белок, взаимодействующий с Вс12 0,3*

Рис. 4. Пролиферативная активность ММСК в условиях различного содержания кислорода. Представлены средние значения числа удвоения популяций (а) и кривые пролиферации ММСК 2-го пассажа (б), культивируемых в условиях 20%, 5%, 3% и 1% От. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% 02. р < 0,05, п = 6.

Рис. 7. Влияние пониженного содержания кислорода на эффективность остеогенеза и адипогенеза ММСК. Гистохимическое выявление компонентов минерализованного матрикса (ализариновый красный) (а) и липидных включений (масляный красный) (б) в культурах ММСК 2-го пассажа и полуколичественный анализ, * - достоверные отличия от значений в условиях 20% 02, р < 0.05. п = 3.

Рис. 8. Потребление глюкозы (белые столбики) и продукция лактата (черные столбики) (а), молярное соотношение Ушаш (б), средняя интенсивность флуоресценции потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red (в) в ММСК 2-го пассажа в предмонослойной культуре, в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% 02, р < 0,05. п = 3.

а б в г

Рис. 9. Выявление митохондрий ММСК 2-го пассажа, культивируемых при 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержании кислорода, с помощью потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red.

Рис. 10. Выявление колоний, формируемых при 20% (а,г) и 5% (б,в) содержании кислорода клетками: а - постоянно культивируемыми при 20% 02, б - предкультивируемыми при 20% 02, в - постоянно культивируемыми при 5% 02, г - предкультивируемыми при 5% 02-Окраска кристаллвиолетом, ув. х. 0,6.

J

Активация пролиферации ММСК в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась более выраженной экспрессией генов семейства Fos (FOSB. FOSL1), продукты которых формируют транскрипционный фактор АР-1, генов PCNA, CCND2, кодирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток и циклин D2, а также гена CKS2, кодирующего регуляторную единицу циклин-зависимой киназы при значительном подавлении экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2Q (табл. 2). Можно предположить, что увеличение пролиферативной активности ММСК обусловлено активирующимся в этих условиях JNK сигнальным путем, с последующим образованием транскрипционного фактора АР-1, о чем косвенно свидетельствует увеличение экспрессии генов семейства Fos и гена CCND2, кодирующего циклин D2, экспрессия которого происходит под воздействием этого транскипционного фактора. Активация SAPK/JNK и р38 киназных путей при гипоксии была продемонстрирована во многих типах клеток, в том числе ММСК (Scott et al., 1998; Kunz et al., 2003, Lee et al., 2011).

Экспозиция при 5% - 1% СЬ на 1-ом пассаже сопровождалась снижением доли клеток, экспрессирующих CD73 и CD54, пропорционально уменьшению концентрации кислорода в среде (рис. 6, а, б), не вызывая изменения количества клеток, экспрессирующих CD105 и CD90. Дальнейшая экспозиция ММСК в условиях пониженного содержания кислорода в течение 3-х пассажей не оказывала влияния на долю CD105+- и С090+-клеток и способствовала восстановлению количества CD73+- и С054+-клеток до исходного уровня. Однако, при длительном культивировании в условиях 20% 02 происходило практически двукратное снижение доли С054+-клеток (рис. 6, в, г).

Рис. б.

Количество CD73' - и CD54*-клеток через 6 суток (а,б) и при длительной экспозиции (в.г) в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О?, р < 0,05, п = 3.

Известно, что 5'-нуклеотидаза (С073) осуществляет гидролиз АМФ до аденозина и фосфата, а 1САМ-1 (СЭ54) выступает в качестве ко-рецептора (32-интегрина. Для

15

выраженной экспрессии этих двух мембранных белков необходима активация клеток такими цитокинами как, IFN-y, IL-ip (Pober et al., 1986; Muro et al., 1989; Murray, 1988; Stefanovic, 1989). В ряде работ было отмечено, что экспрессия CD73, зависит от уровня содержания кислорода, а гипоксическое состояние провоцирует увеличение концентрации аденозина (Synnestvedt et. al., 2002; Ledoux et. al., 2003). Молекулярные механизмы, приводящие к увеличению аденозина в условиях пониженного содержания кислорода, в настоящий момент активно изучаются. Показано, что увеличение и уменьшение уровня экспрессии CD73 в условиях пониженного содержания кислорода может быть вызвано регуляторными факторами, среди которых активируемый гипоксией транскрипционный фактор HIF-1 и эритроидные транскрипционные факторы -1 и -2 (GATAI и GATA2) (Synnestvedt et. al., 2002).

При исследовании влияния пониженного содержания кислорода на дифференцировочный потенциал ММСК обнаружено двукратное подавление индуцированного остеогенеза как при 5%, так и при 1% Ог (рис. 7, а), тогда как при стимуляции адипогенеза выраженное снижение наблюдалось только при 1% Ог (рис. 7, б). Культивирование ММСК в условиях пониженной концентрации кислорода не вызывало спонтанного коммитирования клеток.

Известно, что в условиях низкой концентрации кислорода происходит увеличение фосфорилирования Erkl/2-киназы, которое сопровождается уменьшением экспрессии ключевых транскрипционных факторов Runx2/Cbfal и активности ЩФ в клетках-предшественниках костного мозга (Xiao et al., 2000; Wang et al., 2012). Сохранение экспрессии некоторых адипогенных маркеров ММСК в условиях пониженного содержания кислорода широко обсуждается (Matsumoto et al., 2008; Nobusue et al., 2008). В нашем исследовании сохранение адипогенного дифференцировочного потенциала в условиях 5% содержания кислорода может объясняться более высоким уровнем экспрессии основного адипогенного маркера PPARy (в 7,5 раза) по сравнению со стандартными условиями культивирования.

При оценке метаболизма глюкозы мы обнаружили, что при 20% Ог ММСК потребляли значительно большее количество глюкозы и продуцировали большее количество лактата, чем клетки в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) (рис. 8, а). Для оценки эффективности катаболизма глюкозы в процессе гликолиза использовали молярное соотношение Yu/giu- Результаты показали, что при приближении культур клеток к состоянию монослоя в условиях 20% Ог, несмотря на повышенный уровень продукции лактата в среду, Yu/giu было ниже, чем при 5%-1% Ог (рис. 8, б). При этом флуоресцентная микроскопия (рис. 9) и цитофлуориметрический анализ окрашенных

потенциал-зависимым зондом MitoTraker Red клеток выявили двукратное снижение интенсивности флуоресценции зонда при уменьшении концентрации кислорода (рис. 8, в).

Эти данные могут свидетельствовать об увеличении гликолитического вклада в процесс катаболизма глюкозы при уменьшении концентрации кислорода в среде культивирования, что подтверждается увеличенной экспрессией генов, кодирующих ферменты всех стадий расщепления глюкозы в процессе гликолиза. Необходимо отметить, что в условиях 5% Ог экспрессия ряда генов гликолигических ферментов увеличивалась уже через 96 часов экспозиции, среди которых НК1, НК2, кодирующих две изоформы гексокиназы, PFKL, PFKP, кодирующих различные изоформы фосфофруктокиназы, PFKFB3, PFKFB4, гены двух изоформ бифункционального фермента 6-фосфофруктокиназы-2/фруктозо-2,6-дифосфатазы, осуществляющего регуляцию на уровне второго субстратного цикла, ALDOC, гена альдолазы С, РК.М2, кодирующего пируваткиназу. При этом отмечается возрастание уровня экспрессии LDHA, гена лактатдегидрогеназы А, и незначительное уменьшение экспрессии гена PDK1, кодирующего киназу пируватдегидрогеназы (табл. 2). Снижение экспрессии PDKI и увеличение LDHA в ММСК пуповины при уменьшении концентрации кислорода было показано в работе A. Lavrentieva и сотрудников, полагающих, что снижение способности митохондрий к потреблению кислорода в этих условиях происходит в результате фосфорилирования пируватдегидрогеназы киназой пируватдегидрогеназы и подавления поступления пирувата в цикл Кребса (Lavrentieva et al., 2010).

Оценка жизнеспособности показала, что длительное культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода не оказывает повреждающего воздействия, более того, наблюдается снижение доли некротических и апоптотических клеток (табл. 3).

Таблица 3. Жизнеспособность ММСК 2-го пассажа в условиях различного содержания кислорода. Представлено среднее количество живых (AnnV/РГ), апоптотических (AnnV), некротических (РГ) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (ArmV/РГ). Данные представлены как (М±т).п-3. ___________

условия РГ, % AnnV+/PI+, % AnnV+, % AnnVVPl", %

20% 02 1,7 ±0,47 4,6 ± 1,62 2,3 ± 0,57 91,4 ±2,39

5% 02 1,4 ±0,43 4,4 ± 1,44 1,8 ±0,55 92,4 ± 1,74

3% о2 1,2 ±0,23 2,6 ± 0,86 1,6 ±0,64 94,6 ± 1,43

1%02 1,3 ±0,59 2,2 ± 0,33 1,1 ±0,24 95,5 ± 0,95

Сравнительный анализ уровня экспрессии генов показал, что уменьшение концентрации кислорода сопровождается увеличением экспрессии ВШС5, РЗЕЫ2, ЗТАМВРЫ, Ва2И, кодирующих такие антиапоптотические белки как белок 1АР, пресенилин 2, металлопротеазу, взаимодействующую с РАОО и каспазами 8 и 9 и Вс12.

При этом отмечено уменьшение экспрессии TIMP3, IGFBP3, кодирующих ингибитор металлопептидазы 3, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, экспрессия, которых наблюдается, как правило, на начальных этапах апоптоза (Thomas et. al., 2006; Natsuizaka et al., 2012) и гена BNIP3, продукт которого, взаимодействуя с Вс12, приводит к выходу цитохрома с из митохондрий (Ray et al., 2000) (табл. 2).

В настоящее время механизмы, опосредующие выживание клеток-предшественников в условиях гипоксии активно изучаются. Один из возможных механизмов может осуществляться за счет активации PI3K/Akt-1 сигнального пути (Greijer et al., 2004; Stubbs et al., 2012). В результате в клетках индуцируется экспрессия ядерного транскрипционного фактора NF-кВ, мишенями которого являются антиапоптотические белки 1АР2, Вс1-2 и Bcl-xL (Quanungo et al., 2004).

Таким образом, культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) способствует поддержанию гомогенности активно пролиферирующей, менее коммитированной популяции мезенхимальных клеток-предшественников, сохраняющих высокий уровень жизнеспособности, что коррелирует с изменением экспрессии генов структурных и регуляторных белков цитоскелета, регуляторов клеточного цикла, а также регуляции экспрессии некоторых про- и антиапоптотических белков. Уменьшение концентрации кислорода приводит к снижению потребления клетками глюкозы, увеличению молярного соотношения La/Glu и уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий, что сопровождается увеличением экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического пути катаболизма глюкозы.

Обратимость эффектов влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный и дифференцировочный потенциал ММСК

Оценив эффекты влияния пониженного содержания кислорода на морфофункциональные свойства прогениторных клеток из жировой ткани, нам было важно определить, являются ли наблюдаемые изменения обратимыми.

При изучении обратимости эффектов воздействия пониженного содержания кислорода на клоногенный, пролиферативный и дифференцировочный потенциал мы показали, что предкультивируемые в условиях 20% Ог и переставленные в 5% О2 ММСК формируют количество колоний сходное с клетками, постоянно экспонируемыми в условиях 5% О2. Тогда как клетки, предкультивируемые в условиях 5% 02 и перенесенные для оценки этого параметра в 20% Ог, формировали значительно меньшее количество колоний уже через 6 суток экспозиции (рис. 10).

Подобные изменения наблюдались при оценке пролиферативного потенциала ММСК, предкультивируемых при 5% 02 и подвергавшихся экспансии при стандартных условиях. Уже через 6 часов экспозиции наблюдалось двукратное уменьшение числа удвоений, по сравнению с клетками, культивируемыми при 5% 02. В культурах ММСК переставленных из 20% в условия 5% содержания кислорода наблюдалось некоторое увеличение числа удвоений популяции, по сравнению со стандартными условиями культивирования (рис. 11, а).

Оценка остеогенного и адипогенного дифференцировочного потенциала ММСК показала, что в культурах клеток, предкультивируемых в условиях 20% 02 и переведенных для дифференцировки в условия 5% 02, площадь минерализованного матрикса снижалась до 30% от общей площади как и при дифференцировке ММСК, постоянно культивируемых в условиях 5% 02. При обратном переносе клеток постоянно культивируемых при 5% 02 и помещенных для дифференцировки в условия 20% 02, отмечалось увеличение площади минерализованного матрикса до контрольных значений ~ 50% от общей площади (рис. 11,6).

5%-20% 20%-5%

5-20% 20-5%

5%-20% 20%-5%

Рис. 11. Оценка пролиферативного, остеогенного и адипогенного потенциала ММСК, индуцируемого при 20% и 5% содержании кислорода в среде. По оси ординат - число удвоений популяции (а), полуколичественная оценка площади, занятой минерализованным матриксом (б) и доли клеток, содержащих внутриклеточные липидные включения (в). * -достоверное отличие от значений в условиях 20% О2, р < 0,05, п — 3.

При оценке эффектов различного уровня содержания кислорода на способность ММСК подвергаться дифференцировке в адипогенном направлении было обнаружено, что индукция в условиях 5% 02 не сопровождалась выраженным подавлением дифференцировки как постоянно культивируемых в этих условиях клеток, так и предкультивируемых в условиях атмосферного содержания кислорода (рис. 11, в).

Аналогичный эффект обратимости воздействия пониженного содержания кислорода ранее был показан для ММСК костного мозга, однако этот эффект наблюдался и в отношении дифференцировки в адипогенном направлении (Ре11гег е! а!., 2007).

Таким образом, после помещения ММСК, постоянно культивируемых при 5%С>2, в условия атмосферного содержания кислорода их способность к дифференцировке в остеогенном направлении восстанавливается, тогда как ММСК, подвергающиеся экспансии в условиях 20% О2, при помещении в условия пониженного содержания кислорода приобретают признаки менее дифференцированных предшественников, что коррелирует с увеличением пролиферации и образованием КОН-ф при 5% О2. В связи с этим, можно предположить, что низкий уровень содержания кислорода (5% О2) в среде культивирования является, по-видимому, фактором, замедляющим, но не отменяющим процесс коммитирования ММСК.

ВЫВОДЫ

1. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% Ог) способствует поддержанию морфологической гомогенности культуры ММСК и сопровождается более высоким уровнем экспрессии некоторых генов, продукты которых участвуют в примембранной реорганизации (SV1L, ANK2) и стабилизации цитоскелета (TUBB3).

2. Уменьшение концентрации кислорода (5% - 1% О2) активирует клоногенный потенциал, пролиферацию и вызывает изменение кинетики роста ММСК. Увеличенный уровень экспрессии генов, кодирующих циклины (PCNA, CCND2), циклин-зависимую киназу (CKS2) и низкий уровень экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) коррелирует со стабильно высокой пролиферацией ММСК при 5% О2. Более низкий уровень концентрации кислорода (3% - 1%) оказывает наибольший стимулирующий эффект на начальных этапах экспозиции.

3. Длительное культивирование ММСК in vitro не влияет на экспрессию основных поверхностных антигенов стромальных клеток - CD54, CD73, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC. Экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода (5% -1% Ог) вызывает кратковременное (в течение 1 пассажа) изменение популяционного состава, проявляющееся в сокращении доли CD54+- и С073+-клеток с последующим возвращением их числа к исходному уровню.

4. Экспансия ММСК in vitro сопровождается постепенной элиминацией клеток, спонтанно экспрессирующих щелочную фосфатазу. При индукции дифференцировки ММСК в условиях пониженного содержания кислорода показано, что замедление процесса коммитирования клеток в остеогенном направлении отмечается при 5% и 1%

Ог, тогда как выраженное подавление направленной дифференцировки в адипогенном направлении происходит только при 1%Oj.

5. Показано, что культивирование ММСК при различном содержании кислорода (20%, 5%, 3%, 1% 02) сопровождается сокращением потребления глюкозы и продукции лактата, что соотносится с кинетикой роста культуры. Экспансия ММСК до состояния предмонослоя в условиях пониженного содержания кислорода сопровождается увеличением уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза (ALDOC, PFKFB, LDHA, PGK-I, FBP-I и др.), увеличением молярного соотношения La/Glu и снижением трансмембранного потенциала митохондрий.

6. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% Ог) не оказывает повреждающего воздействия на ММСК. Отмечено снижение доли апоптотических клеток в результате NF-кВ-зависимого увеличения уровня экспрессии антиапоптотических белков-регуляторов апоптоза (STAMBPL1, BIRC5, BCL2LI), а также уменьшения экспрессии проапоптотических белков (TIMP3, BNIP3, IGFBP3).

7. Постоянная экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода поддерживает клетки в менее коммитированном состоянии. Эффекты пониженного содержания кислорода на ММСК являются обратимыми: увеличение концентрации кислорода с 5% до 20% сопровождается уменьшением клоногенного, пролиферативного и увеличении остеогенного дифференцировочного потенциала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гринаковская О С., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б., Рылова Ю.В., Косовский Г.Ю. Пониженное содержание Ог замедляет коммитирование культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников из жировой ткани в ответ на остеогенные стимулы.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147. -№ 6. -С. 704-707.

2. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Рылова Ю.В. Модификация свойств мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани с помощью снижения содержания кислорода в среде культивирования. // В кн. «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения». Под редакцией В.А. Ткачука. - М.: Литтерра, 2009, С. 125-145.

3. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Пролиферация и метаболический статус мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани при различном содержании кислорода в среде культивирования. // Авиакосмическая и экологическая медицина. -2010. -Т.44. -№5. - С.38-41.

4. Буравкова Л.Б., Рылова Ю.В., Гальчук C.B., Андреева Е.Р. Особенности метаболизма и экспрессии генов ММСК го жировой ткани человека, культивируемых при различном содержании кислорода. // В кн. «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Под редакцией В.А. Ткачука. - М.: Макс Пресс, 2010, С. 113-130.

5. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Rylova J.V., Grigoriev A.I. Resistance of multipotent mesenchymal stromal cells to anoxia in vitro. // Anoxia, InTech, Texas, USA, 2012, P.61-80.

6. Рылова Ю.В. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников из жировой ткани при пониженном содержании кислорода. // VIII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики, г. Москва, 2009. С. 45-46.

7. Рылова Ю.В., Гальчук С.В., Буравкова Л.Б. Влияние аноксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из жировой ткани человека. // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», г. Звенигород, 2009, С. 78.

8. Рылова Ю.В. Метаболический статус и пролиферативный потенциал МСК при различном содержании кислорода в среде культивирования. // IX «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики, г. Москва, 2010. С.66-67.

9. Рылова Ю.В. Модификация способа культивирования мультипотентных мезенхимальных сромапьных клеток с целью применения в клеточной инженерии. // Всероссийская научная школа по биомедицинской инженерии «БМИ - 2010». г. Санкт-Петербург, 2010, С.21-28.

10. Рылова Ю.В. Кислород - опосредованное изменение дифференциальной экспрессии генов ММСК из жировой ткани. // X «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос, г. Москва, 2011.С. 59.

11. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Изменения экспрессии генов ММСК из жировой ткани культивируемых при пониженном содержании кислорода. // VI Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», г. Москва, 2011.

12. Rylova J.V., Grinakovskaya O.S., Andreeva E.R., Buravkova L.B. The long-term effects of reduced oxygen tension on cultured mesenchymal stem cells. // French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers, France, 2010. P. 44.

13. Rylova J.V., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Metabolic and gene expression profile of MMSCs under low oxygen. // World Conference on Regenerative Medicine. Leipzig, Germany, 2011.

14. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Rylova J.V. Ог-influence on MMSCs metabolic and differentiation status. // 2nd International Conference on Medical Physiology «Recent researches in modern medicine». Cambridge, UK, 2011. P. 43-48.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

СВФ - сгромально-васкулярная фракция

ВКМ - внеклеточный матрикс

CD - кластер дифференцировки

FITC - флюоресцеинизотиоционат

РЕ - фикоэритрин

SAPK - стресс-активируемая киназа семейства митоген-активируемых киназ

PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназа

АР-1 - белок активатор 1

IAP - белок ингибирующий апоптоз

IGF - инсулиноподобный фактор роста

Akt или РКВ - протеинкиназа В

FADD - Fas-ассоциированный белок с доменом гибели (Fas-Associated protein with Death Domain)

JNK - C-Jun N-концевая киназа (c-Jun N-terminal kinase)

Подписано в печать: 14.02.2013 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 854 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7, стр. 1 (495) 623-93-06; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рылова, Юлия Владимировна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук»

04201354965

Рылова Юлия Владимировна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРИ ПОНИЖЕННОМ СОДЕРЖАНИИИ

КИСЛОРОДА

Специальности 03.03.01 - физиология, 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН

Л.Б. Буравкова

На правах рукописи

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...................................................6

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................8

Цели и задачи исследования...............................................................................10

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................11

1.1 Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток............11

1.1.1 Локализация ММСК...............................................................................11

1.1.2 Иммунофенотип культивируемых ММСК....................................................16

1.1.3 Морфология культивируемых ММСК.........................................................20

1.1.4 Колониеобразование и пролиферативная активность ММСК...........................22

1.1.5 Дифференцировочный потенциал ММСК...................................................25

1.1.6 Механизмы, регулирующие пролиферацию и диффернцировку ММСК..............28

1.2 Влияние пониженного содержания кислорода на свойства ММСК...........................32

1.2.1 Иммунофенотип и морфология ММСК

в условиях пониженного содержания кислорода............................................34

1.2.2 Влияние пониженного содержания кислорода

на колониеобразование и пролиферативный потенциал ММСК........................35

1.2.3 Дифференцировочный потенциал ММСК

в условиях пониженного содержания кислорода............................................39

1.2.4 Механизмы поддержания жизнеспособности ММСК

в условиях пониженного содержания кислорода...........................................45

1.3 Метаболизм глюкозы и биоэнергетическая функция

митохондрий ММСК в условиях пониженного содержания кислорода................49

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................55

2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы......................................55

2.1.1 Оборудование.......................................................................................55

2.1.2 Химические реагенты.............................................................................55

2.1.3 Антитела.............................................................................................56

2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК.........................................56

2.2.1 Приготовление ростовой среды................................................................56

2.2.2 Приготовление остеогенной среды.............................................................56

2.2.3 Приготовление адипогенной среды............................................................57

2.2.4 Приготовление среды для криоконсервации клеток........................................58

2.3 Получение и культивирование ММСК жировой ткани человека.........................58

2.3.1 Получение первичных культур ММСК........................................................58

2.3.2 Культивирование ММСК.........................................................................59

2.3.3 Экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода...................59

2.3.4 Криоконсервация культивируемых ММСК..................................................60

2.4 Индукция дифференцировки ММСК жировой ткани in vitro............................60

2.4.1 Индукция остеогенной дифференцировки...................................................60

2.4.2 Индукция адипогенной дифференцировки...................................................61

2.5 Оценка характеристик ММСК жировой ткани...............................................61

2.5.1 Метод проточной цитофлуориметрии.........................................................61

2.5.2 Иммуноцитохимическое окрашивание для выявления

поверхностных маркеров.........................................................................62

2.5.3 Исследование морфологии культивируемых ММСК......................................62

2.5.4 Оценка колониеобразующей способности...................................................62

2.5.5 Анализ пролиферативной активности.........................................................63

2.5.6 Выявление [3-галактозидазы в культивируемых ММСК...................................63

2.5.7 Количественная оценка апоптотических и некротических клеток......................63

2.5.8 Определение стадии клеточного цикла культивируемых ММСК.......................64

2.5.9 Оценка дифференцировочного потенциала ММСК.........................................65

2.5.9.1 Оценка дифференцировки ММСК в остеогенном направлении..........................65

2.5.9.2 Оценка дифференцировки ММСК в адипогенном направлении........................66

2.5.10 Определение количественного содержания глюкозы

и лактата в среде культивирования............................................................67

2.5.11 Выявление митохондрий и характеристика

их трансмембранного потенциала..............................................................67

2.6 Определение уровня экспрессии генов........................................................68

2.6.1 Определение уровня экспрессии гена теломеразы.........................................68

2.6.2 Определение уровня дифференциальной экспрессии генов ММСК....................69

2.7 Статистическая обработка результатов.......................................................69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................70

3.1 Морфология ММСК жировой ткани............................................................70

3.1.1 Морфологическая гетерогенность культуры ММСК........................................70

3.1.2 Влияние различного содержания кислорода на морфологию ММСК....................73

3.1.3 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с морфологией............................75

3.2 Пролиферативный потенциал ММСК жировой ткани.....................................78

3.2.1 Характеристика пролиферативной активности культивируемых ММСК.............78

3.2.2 Влияние пониженного содержания кислорода

на пролиферативную активность...............................................................82

3.2.3 Клоногенный потенциал ММСК

в условиях различного содержания кислорода..............................................86

3.2.4 Экспрессия генов, ассоциированных с пролиферацией ММСК.........................88

3.2.4.1 Уровень экспрессии гена теломеразы

в условиях различного содержания кислорода..............................................88

3.2.4.2 Уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК,

опосредующих пролиферацию.................................................................90

3.3 Иммунофенотип ММСК жировой ткани......................................................93

3.3.1 Характеристика иммунофенотипа культивируемых ММСК.............................93

3.3.2 Влияние пониженного содержания кислорода на иммунофенотип ММСК..........97

3.4 Дифференцировочный потенциал ММСК жировой ткани..............................100

3.4.1 Остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал.......................100

3.4.2 Остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал

в условиях пониженного содержания кислорода..........................................104

3.5 Метаболизм глюкозы ММСК при различном содержании кислорода...............111

3.5.1 Потребление глюкозы и продукция лактата

при различном содержании кислорода......................................................111

3.5.2 Влияние различного содержания кислорода на

функциональное состояние митохондрий ММСК........................................116

3.5.3 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с метаболизмом глюкозы.............118

3.6 Жизнеспособность ММСК жировой ткани.................................................122

3.6.1 Влияние различного содержания кислорода на жизнеспособность...................122

3.6.2 Экспрессия генов ММСК, ассоциированных с жизнеспособностью..................126

3.7 Обратимость эффектов пониженного содержания кислорода

на функциональные характеристики ММСК жировой ткани...........................129

3.7.1 Эффект воздействия пониженного содержания кислорода

на колониеобразование и его обратимость.................................................129

3.7.2 Обратимость эффекта снижения содержания кислорода

в среде на пролиферативную активность клеток..........................................130

3.7.3 Эффект воздействия пониженного содержания кислорода на остеогенный и адипогенный дифференцировочный

потенциал и его обратимость..................................................................132

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................135

ВЫВОДЫ...................................................................................................136

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................138

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат БМ - базальная мембрана ГТФаза - гуанозинтрифосфатаза ДТТ - дитиотреитол

КОЕ-ф - колониеобразующая единица фибробластов

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

а - SMA - а-актин гладких мышц (a-smooth muscle actin)

a-SMA-GFP - a-актин гладких мышц - зеленый флуоресцентный белок (Green fluorescent protein)

APRIL - лиганд, вызывающий пролиферацию клеток (A proliferation-inducing ligand) Akt или РКВ - протеинкиназа В (Protein kinase В)

BAFF - фактор семейства TNF, активирующий В-клетки (B-cell activating factor belonging to the TNF-family)

BMP - костный морфогенный белок (Bone morphogenic protein) CD - кластер дифференцировки (Cluster of differentiation)

Cbfal - Core-связывающий фактор, субъединица a 1 (Core-binding factor subunit alpha 1)

DMEM - Дальбекко-модифицированная среда Игла (Dulbecco's modified eagle medium)

Erk - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами (Extracellular signal-regulated kinase)

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза (Endothelial NO-synthase)

FITC - флуоресцеинизотиоцианат (Fluorescein isothiocyanate)

HIF 1 - фактор активируемый гипоксией 1 (Hypoxia-inducible factor 1)

HGF - фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor)

HSP90 - белок теплового шока 90 (Heat shock protein 90)

Isl-1 - белок, усиливающий экспрессию гена инсулина - 1 (Insulin gene enhancer protein) Ipf-1 - транскрипционный фактор, активирующий экспрессию инсулина 1 (Insulin promoter factor 1)

IPAS - PAS-домен - ингибирующий белок (Inhibitory PAS domain protein) МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы (Mitogen-activated protein kinases) MyoDl - белок миогенной дифференцировки 1 (Myogenic differentiation 1) mTOR - мишень рапамицинау млекопитающих (Mammalian target of rapamycin) Ngn-3 - нейрогенин-3 (Neurogenin 3)

PPARy - пероксисомальный рецептор активации пролиферации у (Peroxisome proliferators-

activated receptor у)

Pax-6 - Paired box protein 6

рЗОО/СВР - белок рЗОО, связывающий El A (El A binding protein рЗОО/ CREB-binding protein)

РЕ - фикоэритрин (Phycoerythrin)

Runx2 - Runt-связанный транскрипционный фактор 2 (Runt-related transcription factor 2)

Rho - родопсин (Rhodopsin)

Ref-1 - фактор рестрикции 1 (Restriction factor 1)

SAPK - стресс-активируемая киназа семейства митоген-активируемых киназ (Stress-activated protein kinase)

TNF - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor)

TGF - трансформирующий фактор роста (Transforming growth factor)

VHL - ЕЗ убиквитин-протеинлигаза (von Hippel-Lindau tumor suppressor, E3 ubiquitin

protein ligase)

ВВЕДЕНИЕ

Каждая клетка обладает ограниченным периодом жизни, поэтому в организме должно происходить постоянное обновление тканевых клеточных систем. Такая последовательная замена клеток в тканях предполагает существование клеток-предшественников, которые замещают поврежденные и стареющие дифференцированные клетки. Существующая в настоящее время концепция о наличии во взрослом организме малодифференцированных клеток-предшественников мезенхимального происхождения сформировалась на основе результатов классических экспериментов, начатых в 1960-70 годах, показавших существование в костном мозге минорной популяции клеток, которые в системе in vitro отличались от гемопоэтических клеток, что позволило предположить о наличии стромального предшественника в костном мозге (Фриденштейн, Лурия, 1980).

К настоящему моменту клетки, близкие по свойствам к мультипотентным клеткам-предшественникам, выделены не только из костного мозга, но из целого ряда тканей и органов, таких как жировая ткань, синовиальная жидкость, скелетные мышцы, легкие, Вартоновское желе пупочного канатика, периодонтальные связки, пульпа зуба и др. (da Silva Meirelles, Chagastelles., Nardi, 2006; Терехов, Крохина, Шишкин и др., 2001), что свидетельствует о широком распространении этих клеток в организме как тканеспецифичного резерва малодифференцированных мезенхимальных предшественников. Долгое время исследователи полагали, что тканеспецифичные клетки-предшественники могут дифференцироваться только в клетки данной ткани. Однако исследования, проведенные в последние годы, доказали несостоятельность этой точки зрения. Так, ряд экспериментов свидетельствует о том, что эти клетки обладают способностью к трансдифференцировке от одного фенотипа к другому, как in vitro при воздействии соответствующих стимулов, так и при трансплантации in vivo (Clarke, Erskine, Lumsden, 2000; Zuk, Zhu, Ashjian et. al., 2002; Gimble, Guilak, Nuttall et al., 2008).

Однако, на основании проведенных работ можно заключить, что, несмотря на потенциальный терапевтический эффект, широкое применение клеток-предшественников некоторых типов тканей ограничено в связи со сложностью процедуры их получения (костный мозг, клетки-сателлиты, легкие и др.) (Traktuev, Merfeld-Clauss, Li et. al., 2008). В связи с этим в настоящее время основные направления исследований в этой области включают в себя поиск подходящих источников мультипотентных стромальных клеток, получение которых связано с минимальным оперативным вмешательством, таких как жировая ткань, пульпа зуба, волосяной фолликул, околоплодная жидкость, исследование их биологических свойств и оценку возможности применения их в медицинской практике (Бурунова, Суздальцева, Воронов и др., 2008; Шахпазян, Кобзева, Астрелина и др., 2011).

В настоящее время, ММСК из жировой ткани, рассматриваются как один из наиболее перспективных источников клеточного материала для тканевой инженерии и восстановительной медицины. Это связано, в первую очередь, с возможностью минимально травматичного для пациента извлечения фрагментов жировой ткани и последующей экспансии ММСК in vitro для получения достаточного количества клеточного материала (Moon, Kim, Kim et al., 2006; Kim, Kim, Cho et al., 2007; Banas, Teratani, Yamamoto et al., 2008).

Быстро развивающиеся клеточные технологии предоставляют широкие возможности для контролируемого изменения параметров культивирования различных типов клеток. Однако чаще всего эти изменения касаются химических компонентов ростовой среды (содержание питательных веществ, факторов роста, солей и аминокислот) (Романов, Даревская, Кабаева и др., 2006). Газовый состав традиционно остается наиболее консервативным параметром при культивировании, при этом уровень СО2 приближается к тканевому, тогда как содержание кислорода в обычных СОг-инкубаторах соответствует содержанию кислорода в воздухе (около 20%).

Вопрос о том, какая концентрация кислорода является физиологической для клеток in vitro, активно обсуждается в научной литературе. В связи с этим предпринимаются попытки изучения состояния культивируемых клеток при различном содержании кислорода (Cooper, Beasley, 1999; Das, Bouchey, Moore et. al., 2001; Bosch, Pratt, Stice, 2006; Grayson, Zhao, Izadpanah et. al., 2006; Буравкова, Анохина, 2007; Буравкова, Гринаковская, Андреева, 2009). Однако, нет единого мнения о том, какую концентрацию кислорода надо использовать, какое время клетки должны подвергаться воздействию измененного содержания кислорода, как при этом следует учитывать такие факторы, как состав среды, плотность субкультивирования клеток и др. Высказываются предположения, что физиологическое содержание кислорода (около 4-7%) будет оптимальным для культивируемых клеток (Буравкова, Гринаковская, Андреева и др., 2009; Fehrer, Brunauer, Laschober et. al., 2007), а более низкий уровень приведет к гипоксическому состоянию.

Особый интерес исследователей к ММСК как наиболее перспективному клеточному элементу для тканевой инженерии и восстановительной медицины диктует необходимость проведения исследований, посвященных оценке функционального состояния ММСК в процессе их длительной экспансии in vitro, а также оптимизации процесса культивирования с целью приблизиться к условиям физиологического микроокружения этих клеток.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлась оценка влияние различного процентного содержания кислорода на морфофункциональное состояние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников жировой ткани (жтММСК).

Заявленная цель подразумевала решение следующих задач:

1. Сравнить эффект пониженного содержания кислорода (5%, 3%, 1% Ог) на морфологию ММСК жировой ткани человека in vitro;

2. Провести сравнительный анализ жизнеспособности ММСК, культивируемых при пониженном до 5%, 3% и 1% уровне кислорода;

3. Изучить влияние газовой среды с измененным уровнем содержания кислорода на колониеобразование и пролиферативную активность ММСК;

4. Исследовать экспрессию поверхностных антигенов ММСК, культивируемых при различном содержании кислорода;

5. Сравнить остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал ММСК в стандартных условиях и при пониженном до 5% и 1% уровне содержания кислорода;

6. Оценить влияние пониженного содержания кислорода (5%, 3%, 1% 02) на метаболизм глюкозы в процессе гликолиза;

7. Исследовать обратимость эффектов пониженного содержания кислорода на ММСК жировой ткани;

8. Изучить влияние газовой среды с различным содержанием кислорода (20% и 5% О2) на уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

1.1.1 Локализация ММСК

Стволовыми клетками принято считать клетки, обладающие потенциалом к самовоспроизведению и дающие начало, по крайней мере, одному типу высоко дифференцированных потомков (Watt, Hogan, 2000). Все больше исследований сви�