Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс

Анохина, Екатерина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс"

На правах рукописи

АНОХИНА ЕКАТЕРИНА БОРИСОВНА

ВЛИЯНИЕ ПОНИЖЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС

03.00.13 - физиология

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003064736

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медяко-биологических проблем Российской академии наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Капланский Александр Самуилович доктор биологических наук, Романов Юрий Аскольдович

Ведущая организация:

Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломопосова

Защита диссертации состоится « » CMv^Jk^- 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета К 002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ—ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов [Fridenstein A.J. et al., 1976; Caplan A.I., 1994; Prockop D.J., 1997, 2003; Brader S.P. et al., 1997; Pittenger M.F. et al., 1999; Bianco P. et al., 2001; Barry F.P. et al., 2004; Fibbe W.E., 2002; Grove J.E. et al., 2004; Wagner W. et al., 2005]. В свою очередь, мультипотентность МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я. Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.

Одним из таких вопросов является функциональное состояние клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода. Парциальное давление кислорода во внеклеточной среде, обуславливающее концентрацию внутриклеточного кислорода, является одним из существенных факторов, определяющих жизнедеятельность любой клетки, в том числе, стволовой. Поддержание этого параметра в узких пределах является важнейшим компонентом гомеостаза и необходимо для предупреждения в клетке повреждений различного характера. Наиболее частым нарушением постоянства газового состава среды является снижение парциального давления кислорода во внеклеточной среде, или гипоксия. МСК могут оказываться в условиях пониженного содержания кислорода, обусловленного экзогенными факторами, рядом патофизиологических механизмов, а также ограниченным кровоснабжением имплантированных систем доставки клеток-предшественников (носителей) в место повреждения при применении современных репаративных технологий. Пониженное содержание кислорода может оказывать модифицирующее влияние на характеристики мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, отражающие их морфофункциональное состояние, такие как их жизнеспособность, способность к пролиферации, дифференцировочный потенциал, а также морфологические и иммунофенотипические показатели, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани. В противовес долгой истории изучения гипоксии на

организменном уровне, гипоксическое воздействие на культивируемые клетки исследовано значительно меньше. В частности, работы, посвященные воздействию пониженного содержания кислорода на культивируемые МСК, немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, а их результаты зачастую противоречивы [Lennon D.P. et al., 2001; Salim A. et al., 2004; Ren H. et al., 2006; Расагу E. et al., 2006; Malladi P. et al., 2006; Lin Q. et al., 2006]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование функционального состояния мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода является актуальной задачей клеточной биологии.

Цель исследования: изучение влияния пониженного содержания кислорода на морфо-функциональное состояние мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на разных этапах культивирования. Задачи исследования:

1. Отработка метода получения и культивирования мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода.

2. Морфологическая, иммунофенотипическая и функциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на различных этапах культивирования.

3. Исследование влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% О2) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.

4. Изучение влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% Ог) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип длительно культивируемых мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс.

5. Оценка влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (0% Ог) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.

Научная новизна. Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (5% Ог) на комплекс характеристик МСК костного мозга крыс, которые в своей совокупности отражают морфофункциональное состояние клеток-предшественников. Показано, что на начальных этапах культивирования (1-4 пассажи) МСК костного мозга крыс гипоксия снижает степень их морфологической гетерогенности, стимулирует пролиферацию, оказывает цитопротекторный эффект, а также модулирует ранние этапы их остеогенной, но не адипогенной дифференцировки при сохранении характерного для МСК иммунофенотипа.

Впервые при длительном культивировании (более 20 пассажей) мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлена субселекция морфологически гомогенных линий клеток со стабильным иммунофенотипом, пролиферативной активностью и различным остеогенным дифференцировочным потенциалом, и оценено влияние гипоксии (5% О2) на полученные культуры МСК. Показано, что эффекты гипоксии на морфологию, пролиферацию и жизнеспособность длительно культивируемых клеток-предшественников варьируют, однако в любом случае гипоксия не приводит к стимуляции их пролиферативной активности и изменению характерного для МСК иммунофенотипа.

Впервые при исследовании влияния аноксии на комплекс характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс выявлены временные пределы их устойчивости к аноксическому воздействию, а также механизмы повреждения клеток в условиях аноксии. Показано, что в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс сохраняется морфология и иммунофенотип клеток, их способность к пролиферации, а также возможность начальных этапов остеогенной и адипогенной дифференцировки. При этом в культурах не происходит значительного увеличения количества поврежденных клеток, а имеющее место повреждение обусловлено апоптозом, в то время как при более длительном аноксическом воздействии основньм повреждающим механизмом становится некроз.

Научно-практическая значимость работы. Показано стимулирующее влияние гипоксии на пролиферацию и жизнеспособность мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс, что может быть использовано для наращивания массы клеток-предшественников, сохраняющих свои морфофункциональные свойства при использовании технологий тканевой инженерии. Подана и зарегистрирована заявка на патент № 2007119977 от 30.05.2007.

Полученные данные о сохранении ряда морфофункциональных характеристик мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях

96-часовой аноксии расширяют представления об устойчивости клеток-предшественников, в частности, к значительному снижению концентрации кислорода в среде.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. 96-часовое воздействие гипоксии (5% 02) оказывает стимулирующее влияние на мезенхимальные стромалыпле клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования (1-4 пассажи), что выражается в снижении степени гетерогенности культур МСК, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении начальных этапов дифференцировки в остеогенном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее коммитированного состояния

2. Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс представляют собой клеточную популяцию, чрезвычайно устойчивую к значительному понижению содержания кислорода в среде, что подтверждается сохранением их морфологии, фенотипа, жизнеспособности, способности к пролиферации, а также возможностью дифференцировки, хотя и менее эффективной, в условиях аноксии, поддерживаемой в течение нескольких суток.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на IV, V и VI конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007); 4-й Всероссийской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005); VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, 2005); 2-й Международной конференции "Стратегии в тканевой инженерии " (Вюрцбург, Германия, 2006); 8-м Международном конгрессе Международного общества по адаптивной медицине (Москва, 2006); Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2006).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 21.06.2007 г. Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН "Физиологические механизмы регуляции внутренней среды и организации поведения живых систем" и контракта в рамках программы ФЦНТП (2002 - 2006 гг.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, заключения, списка литературы. Текст диссертации изложен на 161

странице машинописного текста, сопровождается 27 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 224 источника, из них 40 на русском и 184 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись культуры мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс. Культуры, используемые для оценки различных морфофункциональных характеристик МСК в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода были получены от 20 животных и поддерживались в течение 4 -130 пассажей.

Получепие и культивирование МСК. Стромальные клетки-предшественники получали из бедренных и больших берцовых костей молодых беспородных крыс и крыс линии Wistar путем стерильной промывки диафизов культуральной средой, дезагрегации полученной костномозговой суспензии и адгезии клеток к культуральному пластику с последующим удалением фракции неадгезивных клеток [Javazon Е. H. et al., 2001]. В качестве полной среды использовали среду а-МЕМ (ICN, США) с добавлением 2 мМ глутамина (Gibco или Sigma, США), 1мМ пирувата натрия (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 цг/мл стрептомицина в солевом буфере (Gibco, США), эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco или Hyclone, США) и, при необходимости, 10 мМ HEPES буфера (Gibco, США) или среду а-МЕМ (Биолот, Россия) с добавлением раствора антибиотиков и сыворотки. При достижении 80 - 90% монослоя в островках клеток первичной культуры или последующих субкультурах МСК проводили их пассирование. При этом использовали 20 мМ фосфатный буфер (Gibco, США) и раствор 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА (Gibco, США). Плотность посадки клеток составляла 500 - 1500 клеток/см2. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 3-4 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37°С в атмосфере 5% СОг с использованием СОг инкубатора (Sanyo,Япония).

Для создания пониженного содержания кислорода в среде культивирования использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo,Япония) или герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада), которую, после установки в нее культуральных флаконов или чашек Петри (Nunc, Дания) с культивируемыми МСК, продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления концентрации кислорода в среде 5% (гипоксия) или 0% (аноксия) и помещали в термостат. Содержание кислорода и давление в газовой среде контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков, полагая, что выравнивание концентраций кислорода в газовой и жидкой фазе происходит к трем часам инкубации [Allen C.B. et al., 2001].

Характеристика МСК. Оценку морфологических характеристик МСК проводили с помощью программы Sigma ScanPro 5 при анализе микрофотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового фазово-контрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия) и сопряженной с ним видеокамеры.

Так же осуществляли подсчет клеток в поле зрения для определения прироста их количества в случайно выбранных фиксированных полях зрения, количества удвоений за определенное время, а также времени удвоения популяции как показателей пролиферативной активности клеток.

Жизнеспособность МСК оценивачи по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии (проточный цитофлуориметр Beckman Coulter, США) с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя. Апоптотические клетки определялись за счет высокоаффинного связывания аннексина V, меченого FITC, с фосфолипидом фосфатидилсерином, который в норме находится во внутреннем слое

фосфолипидного бислоя мембран клеток, а при апоптозе, когда клетка теряет способность поддерживать ассиметричность локализации мембранных фосфолипидов, перемещается во внешний монослой. Некротические клетки определялись за счет происходящего при повреждении целостности клеточных мембран связывания пропидия йодида с ДНК.

Иммунофенотип МСК оценивали по экспрессии рада поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (BD Biosciences, США), меченых FITC (CD45, CD44, CD lib, CD29) и РЕ (CD90, CD54, CD106, CD73, CD62L, CD31), методом проточной цитофлуориметрии. В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC и РЕ моноклональных антител (BD Biosciences, США) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера.

При оценке дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс исследовали их способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке в ответ на определенные дифферепцировочные стимулы (индуцированная дифференцировка) или без них (спонтанная дифференцировка). Для индукции дифференцировки клеток-предшественников их культивировали в среде с добавлением остеогенных (108 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-Ь-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 цМ дексаметазона (Sigma, США), 10 цг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания)) дифференцировочных стимулов.

Начальные этапы остеогенной дифференцировки МСК анализировали с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США), оценивая гистохимическое выявление в клетках активности щелочной фосфатазы - раннего, но характерного маркера деятельности остеобластов. Клетки, в которых определялась активность этого фермента, рассматривали как вступившие на путь остеогенной дифференцировки (спонтанной или индуцированной). Поздние этапы остеогенной дифференцировки МСК оценивали по окрашиванию минерализованных компонентов матрикса красителем ализариновым красным (Sigma, США) с добавлением гидроксида аммония (ПО "Азот", Россия) или нитратом серебра (Sigma, США) по методу Коса (Пирс Э., 1963).

Адипогенный дифференцировочный потенциал оценивали по появлению в культуре клеток, накапливающих в цитоплазме лшшдные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США).

Статистическая обработка результатов. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для малых и средних выборок, п<30) или критерия Стьюдента (для больших выборок, п>30) при выбранном уровне значимости р=0,01. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ "Excel" и "Statistica 7.0" для WinXP.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс. МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались высокой степенью гетерогенности, которая выражалась в существовании в культуре разных клеточных типов, отличающихся по морфологии и скорости пролиферации. Используя в качестве критериев для классификации особенности организации цитоплазмы клеток, а также их форму и размер, в культурах МСК костного мозга крыс возможно было выделить три основных клеточных типа. Клетки первого типа обладали однородной по оптической плотности цитоплазмой, имели веретеновидную,

треугольную или звездчатую форму, и небольшой размер. Клетки второго типа характеризовались неоднородной по оптической плотности цитоплазмой и различались по размеру и форме. Клетки третьего типа характеризовались негомогенной цитоплазмой с хорошо заметной исчерченностью, они имели полигональную, округлую или неправильную форму без отростков или с большим количеством отростков, часто располагающихся на противоположных полюсах клетки, а их размеры варьировали в очень широких пределах. МСК первого и второго типов активно пролиферировали, в то время как клетки третьего типа отличались сниженной пролиферативной активностью.

Длительные культуры МСК (Kl, К2, КЗ) были получены от трех животных в ходе субкультивирования клеток в течение более чем 30 пассажей и, фактически, представляли собой отдельные клеточные линии со стабильными морфологическими и иммунофенотипическими характеристиками. Следует отметить, что каждая из полученных длительных культур стромальных клеток-предшественников после длительного культивирования состояла, в отличие от культур МСК на ранних пассажах, из морфологически однотипных клеток, однако сами культуры отличались друг от друга по доминирующему клеточному типу.

Несмотря на нормированные условия культивирования (состав среды культивирования, количество сыворотки в среде, используемый культуральный пластик, начальная плотность посадки), получаемые клеточные популяции различались по пролиферативной активности. Однако общей тенденцией было поддержание более высокой скорости пролиферации клеток в течение первых пассажей и ее значительное снижение, в среднем, к 4 пассажу. Среднее для различных культур число удвоений популяции за 96 часов культивирования составляло 1,9 для первого пассажа, 1,7 - для второго, 1,3 - для третьего и 0,7 для четвертого, а среднее время удвоения популяции насчитывало 64 и 66 часа на первом и втором пассажах, увеличиваясь до 150 часов уже на третьем пассаже. Следует отметить, что на ранних этапах культивирования преобладали клетки первого и второго типов, в то время как доля клеток третьего типа не была превалирующей, а спад пролиферативной активности сопровождался доминированием в культурах медленно делящихся распластанных клеток третьего типа. При дальнейшем субкультивировании это, так называемое, "пролиферативное торможение" сменялось подъемом пролиферативной активности, сопровождающимся появлением и последующим доминированием в культурах однородных по морфологии клеток. Пролиферативная активность МСК при дальнейшем культивировании не только стабилизировалась, но и увеличивалась по сравнению с первичными культурами и культурами на ранних пассажах. Этот факт, вероятно, мог быть обусловлен, с одной стороны, большей

гомогенностью культур, а с другой стороны, адаптацией клеток к условиям культивирования. Время удвоения популяций во всех трех длительно поддерживаемых культурах возрастало по сравнению со временем удвоения популяций, характерным для первичных культур и культур на ранних пассажах, было стабильным и составляло, в среднем, 21 час.

Для исследуемых клеток была характерна экспрессия участвующих в процессах адгезии, миграции, рециркуляции, организации внеклеточного матрикса поверхностных молекул, выявляемых на мезенхимальных стромальных клетках-предшественниках и указывающих на их функциональную вовлеченность в межклеточные взаимодействия и взаимодействия с внеклеточным матриксом. Так, на начальных этапах культивирования от 98,0 до 99,9 % клеток в различных культурах экспрессировали маркер СБ90 (ТЪу-1). Такая же высокая степень экспрессии была характерна и для поверхностного антигена С029 - Р1 интегриновой цепи. Для 92,3 - 99,5 % клеток и для 96,9 - 99,7 % клеток была характерна экспрессия маркеров СП54 (рецептор 02 интегринов) и СБ44 (рецептор гиалуроновой кислоты и других лигандов, играющих важную роль в организации внеклеточного матрикса) соответственно. Маркер СБ73 (мембраносвязанная экто-5'-нуклеотидаза) экспрессировали от 61,9 до 94,6 % клеток. Количество клеток, положительных по маркеру СБ 106 (рецептор Р1 интегринов) варьировало в широких пределах и составляло от 3,3 до 47,1 %. В полученных популяциях МСК костного мозга крыс незначительная доля клеток на ранних пассажах несла на своей поверхности общий лейкоцитарный антиген СБ45 и характерный для моноцитов и макрофагов маркер СБПЬ, экспрессия которых не определялась при дальнейшем культивировании. Описанный иммунофенотип сохранялся и в случае длительного культивирования МСК в течение достаточно долгого времени после преодоления пролиферативного торможения. Изменения в экспрессии некоторых маркеров в двух из трех длительно поддерживаемых культурах МСК наблюдались только после более чем 200 удвоений популяций.

При оценке дифференцировочного потенциала клеток-предшественников было показано, что во всех культурах МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования количество клеток, в которых определялась активность ЩФ, увеличивалось в ответ на остеогенные стимулы по сравнению с контролем, где доля положительных на ЩФ клеток также выявлялась, но была ниже (Рис. 1а,б). Следует отметить, что доля положительных на ЩФ клеток в культурах МСК без воздействия остеогенных стимулов возрастала с увеличением времени культивирования клеток на протяжении одного пассажа, то есть при увеличении количества клеток за счет деления, а значит, увеличения их плотности и числа контактов между ними. Таким образом,

вероятно, в культурах МСК имела место спонтанная инициация днфференцировкн в остеогенном направлении пли. по крайней мере, ее начальных этапов. Интересно, что клетки, и которых выявлялась спонтанная пли индуцированная активность ЩФ, в культурах МСК были морфологически гетерогенпы. Однако, четкой корреляции между морфологическим типом клеток и степенью окрашивания на щелочную фосфатазу отмечено не было.

Рис.] Дифференцировочные потенции МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. 11редставлено гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы в клетках 3 пассажа, хЮО (а,б), окрашивание минерализованных компонентов матрикса клеток 6 пассажа, хЮО (в,г) и приобретение шян тонн тар] го го фенотипа клетками I пассажа, х400 (д,е) в отсутствие (спонтанная днфференцировка) (а,в,д) н при воздействий (индуцированная днфференцпровка) (б,г,с) дифферент!ровочных стимулов

Для МСК на начальных этапах культивирования была показана способность к минерализации матрикса в ответ па остеогештые стимулы, что, в отличие от активности щелочной фосфатазы, не было отмечено в случае отсутствия остеогенных стимулов (Рис !в,г). При этом минерализация матрикса МСК происходила не ранее чем через три недели культивирования клеток в среде с остсогепнымн стимулами,

В отличие от остеогенного направления лифференцировкн, для МСК костного мозга крыс был не характерен спонтанный адипогенез. В ходе индуцированной адиподифферсицировКИ клсгки-прсдшссгаенпикн приобретали характерную для адипоцитов форму, располагались в виде отдельных кластеров и накапливали в цитоплазме жировые включения, которые сначала имели небольшой размер, а затем

сливались, формируя большие липидные капли (Рис.1д,е). Интересно, что способность к адипогенезу была наилучшей у клеток первого пассажа. Вероятно, адипогенный потенциал МСК снижается при культивировании. Напротив, при длительном культивировании две из трех исследуемых культур сохраняли способность к увеличению активности щелочной фосфатазы в среде с остеогенными стимулами, после 200 удвоений популяций. Этот факт согласуется с представлениями о том, что длительно поддерживаемые культуры МСК долго сохраняют способность к остеогенной дифференцировке, однако перестают дифференцироваться в адипоциты, что может говорить о потере мультипотентности при старении культур [Digirolamo С.М. et al., 1999; Muraglia A. et al., 2000]. С другой стороны, согласно ряду исследований, прогениторные клетки взрослого организма способны давать более чем 80 удвоений популяции в случае МСК человека и более чем 120 удвоений популяции в случае культур МСК грызунов, без признаков изменения фенотипа, изменения длины теломер, потери дифференцировочного потенциала и других признаков старения [Jiang Y. et al., 2002; Reyes M. et al., 2001], a число удвоений популяции стволовых клеток из мышечной ткани мышей может достигать 200 без появления каких-либо признаков старения клеток и потери функциональной состоятельности [Deasy В.М. et al., 2005].

Таким образом, полученные культуры МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались экспрессией свойственных для клеток-предшественников поверхностных антигенов; возможностью реализации свойственных для МСК костного мозга дифференцировочных потенций; морфологической гетерогенностью, выражающейся в существовании в культуре различных типов клеток; высокой пролиферативной активностью и последующим ее спадом, происходившем, в среднем, к четвертому пассажу и сопровождающимся доминированием в культурах крупных распластанных медленно пролиферирующих клеток. При дальнейшем субкультивировании МСК костного мозга крыс, наряду с сохранением характерного для клеток-предшественников иммунофенотипа, их пролиферативная активность восстанавливалась, увеличивалась и стабилизировалась, что сопровождалось снижением степени гетерогенности культур МСК и формированием гомогенной клеточной популяции с определенными морфологическими характеристиками. Это, вероятно, объясняется субселекцией обладающей индивидуальными (в том числе, вероятно, в отношении сохранения дифференцировочного потенциала) морфофункциональными характеристиками популяции клеток, устойчивой к условиям культивирования, в том числе высокому, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде.

Влияние гипоксии па моенишалыыб сгромдльиье клетки-Предшественннкн костного иол а крыс. При оценке морфолэгических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования мри их экспозиции в пормо- и гипоксии было обнаружено, что в условиях 5% О; в культурах МСК снижалось количество варьирующих по размеру к разнородных по морфологическим особенностям кругшых: распластанных, медленно делящихся клеток. В культивируемых в гипоксических условиях популяциях МСК увеличивалась доля формирующих островки однотипных клеток небольшого размера с однородной но оптической плотности цитоплазмой. Таким образом, гипоксия снижала степень гетерогенности культур МСК (Рис .2).

' П—I—I—I——г У" 'Г'" Т " 6 128 STRUCTUM

в 128 STRUCTURE

а. б.

Рис.2 Морфологическая гетерогенность ML'K костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в пормоксии и гипоксии. Представлены двухпарамстрическке гистограммы распределения клеток по размеру (ось ординат) и Гранулярности (ось абсцисс) для клеток 4 пассажа, а также микрофотографии (х200) для клеток 2 пассажа после инкубации н течение % часов в пормоксии (а) и гипоксии (б)

R ряде исследований крупные распластанные клетки рассматривались как зрелые МСК, которые теряют часть своего дифферепцнровочного потенциал;! [Procknp D.J. ct al., 2001; Sekiya 1. ct al., 2002]. С другой стороны, снижение доли крупных распластанных медленно делящихся клеток н условиях пониженною содержа[1ия кислорода позволяй? предположить, что именно концентрация кислорода является фактором, регулирующим количество таких клеток в популяции МСК. Допуская, ч го особенности морфологии и подавление про лифератнввой активности in vitro клеток третьего типа отражают степень их повреждения в условиях повышенного, по сравнению со средой in vivo, содержания

кислорода, можно предположить, что приближение газового состава среды культивирования к таковому in vivo обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества поврежденных таким образом клеток.

В Случае длительно культивируемых МСК после Шпоксичеекого воздействия в течение четырех суток а К] (линии, потерявшей способность к осгеогенной дифферент [и ровкс") наблюдалось преобладание клеток, образующих длинные тонкие отростки. В случае К2 и КЗ (линий, сохраняющих способность к остеогенной дифферендировке) модифицирующего влияния гипоксии на морфологические характеристики клеток отмечено не было.

При оценке црОлмферативной активности МСК костного мозга крыс на начальных этапах куяьтиаированиа при их экспозиции в нормо- и гипоксии в течение 96 часов было доказано, что пониженное содержание кислорода стимулирует пролиферацию клеток (Рис.3). Усиление про ли ф еративпой активности МСК в условиях пониженного содержания кислорода наблюдалось в каждом эксперименте как в случае первичных культур, так и в субкультурах в течение первых четырех исследованных пассажей. В среднем, пролиферация клеток м условиях гипоксии была в 2,5 раза активнее по сравнению с норм оксией.

Рис.3 Пролиферация МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в вдрмоксии и гипоксии (5% 02). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для различных культур в зависимости от ггассажа и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Манна-Уитни для PI. Р2 и РЗ и по t-критсршо для Р2.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрирующих возможность стимуляции пролиферации недифференцированных клеток в условиях пониженного содержания кислорода [Lennon D.P. et al, 2001; Ren H. et al., 2006; Bosch P. et al., 2006; Grayson W.L. et al., 2006].

т ОНормаксия ггп □ Гипоксия

Изменение пролиферативного ответа клеток в условиях гипоксии, очевидно, может быть связано с регуляторным влиянием активирующихся при гипоксии определенных сигнальных путей, а также транскрипционного фактора HIF-1 на механизмы, контролирующие клеточный цикл. Активация транскрипционного фактора HIF-la является универсальным ответом клеток на гипоксию и была описана в различных типах клеток [Kaelin W.G., 2002; Semenza G.L., 2001, 2004; Wenger R.H., 2000, 2001, 2002; Bruick R.K., 2003]. С другой стороны, в ряде экспериментов было показано, что высокое содержание HIF-la может коррелировать со сверхэкспрессией белков-маркеров пролиферации фаз S-G2 клеточного цикла, таких как циклин А и Ki-67, и с активацией клеточной пролиферации [Bos R. et al., 2004; Gardner L.B. et al., 2003]. Другой механизм активации пролиферации МСК при гипоксии может быть связан с индукцией SAP-киназных каскадов (INK и р38), активируемых обычно в ответ на стрессовые факторы и приводящих к стимуляции пролиферативной активности клеток. Так, в ряде экспериментов доказывается участие этих сигнальных путей в активации клеточной пролиферации [Scott Р.Н. et al., 1998; Das М. et al., 2001]. С другой стороны, индукция стресс-активируемых протеинкиназ была продемонстрирована на многих клетках при помещении их в гипоксические условия [Tobiume К. et al., 2000; Alfranca A. et al., 2002]. Следует отметить, что факторы, обуславливающие степень стимуляции пролиферативной активности клеток-предшественников, остаются невыясненными. Возможно, что степень стимуляции МСК гипоксией может в какой-то мере определяться коммитированностью клеток в составе популяции МСК. В этой связи интересно, что, например, подвергавшиеся гипоксическому воздействию гематопоэтические стволовые клетки демонстрировали неодинаковый пролиферативныи ответ в зависимости от степени дифференцированности [Gardner L.B. et al., 2003].

Стимуляция пролиферативной активности в условиях пониженного содержания кислорода не наблюдалась в случае длительно культивируемых МСК костного мозга крыс (Рис.4). Гипоксия подавляла пролиферацию клеток в К1 (линии, потерявшей способность к остеогенной днфференцировке) и не оказывала существенного влияния на пролиферативную активность клеток линий К2 и КЗ (линии, сохраняющие способность к остеогенной днфференцировке).

ОНормохснл

Е' Гц г: О КС и :-

КуЛцтурш иск

Рис.4 Пролиферация длительно культивируемых МСК костного мозга крш в нормоксии и гипоксия (5% 01). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в ралдомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральпых флаконах для культур Kl, К2, КЗ к стандартная ошибка среднего, суммарные данные 8 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Маниа-Уитни для К1.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 ~ 4 пассажах, культивируемых в норм о- и гипоксии в течение % часов показала, что для МСК в условиях пониженного содержания кислорода характерно снижение количества поврежденных клеток, главным образом, за счет подавления процессов апоптоза (Рис.5). В некоторых культурах суммарное число поврежденных клеток в условиях гипоксии было в 2,5 раза меньше по сравнению с нормокеяей, а в среднем, этот показатель составил 1,5 раза.

Антиашжготеческое действие гипоксии на клетки согласуется с активацией в гипокснчсских условиях Р13-киназы [Alvarez-Tejado М. et а!., 2002], что, в свою очередь, ведет к отмене инги биро пап ия функций антиапоптотического белка Bel-xL проапоптотическим белком Bad. а также к индукции транскрипционного фактора NF-kB, который обеспечивает усиление активности ряда антиапоптотнческих белков (tic 1-2 , Bcl-xL и !АР2), наряд)' с подавлением функции проапоп то' ш чес кого белка Ва.х. и индукция которого также может быть достигнута через другие сигнальные пути, активируемые при гипоксии [Greijer А.Е. et а]„ 2004].

Рис.5 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на нача-шкых этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и гипоксии (5% 02). Представлено среднее количество атютотччеъкта (ЛппУ-^} и некретн/меских (Р11) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 5-6 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

» —-------

! ' !

1 1

■ !

—

ДОИрМ ИЛг4СТ14

б.

Рис.6 Жизнеспособность длительно культивируемых МСК костного мозга крыс после 96 часов экспозиции в Нормоксии и гипоксии (5% О;}. Г (релставлено среднее количество апоптотических (Агт\'+), некротических (Р1+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для культур К1 (а), К2 (б), КЗ (в), а также стандартам ошибка среднего, суммарные данные & экспериментов, в каждом из которых анализировала 5-10 тыс. клеток.

Пониженное с одержан не кислорода оказывало различные эффекты на длительно культивируемые МСК'. только б одной из культур — наименее подверженной влиянию

гипоксии и наиболее длительно поддерживающей остеогенный дифференпировочный потенциал - наблюдалось протективное действие гипоксии на клетки, в то время как доля поврежденных клеток возрастала при воздействии гипоксии в двух других культурах (Рис.6).

Таким образом, эффекты снижения парциального давления кислорода на длительно культивируемые МСК отличались от таковых для клеток на ранних пассажах и зависели от полученной линии клеток. Такая вариабельность согласуется с представлениями о том, что при длительном культивировании клеток происходит субселекция популяции, устойчивой и приспособленной к повышенному, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде, которое, на определенных этапах культивирования может действовать как фактор отбора. Случайность такой субселекции определяет индивидуальные особенности клеточной популяции, в том числе, в отношении ее чувствительности к гипоксии.

При исследовании влияния гипоксии на иммунофенотип МСК костного мозга крыс, было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода, поддерживаемого в течение 96 часов, сохраняется экспрессия характерных для клеток-предшественников поверхностных маркеров (CD90+, CD45", CD54+, CD44+, CD73+, CD106+, CDllb", CD294). Эта тенденция была характерна как для клеток на начальных этапах культивирования, так и для длительно культивируемых МСК.

При оценке влияния гипоксии на остеогенный дифференцировочный потенциал МСК костного мозга крыс было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода число недифференцированных клеток было больше по сравнению с нормоксией как в среде без остеогенных стимулов, так и в среде, содержащей остеогенные дифференцировочные стимулы (Рис.7). Таким образом, гипоксия, вероятно, подавляла, по крайней мере, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.

При анализе адипогеняого дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс было отмечено, что дифференцирующиеся клетки обнаруживались только в случае инкубирования МСК в среде, содержащей адипогенные дифференцировочные стимулы как в нормоксии, так и в гипоксии. При этом количество формирующихся кластеров адипоцитов было одинаково в обоих случаях. Более того, количество формирующихся адипоцитов в пределах одного кластера также не зависело от содержания кислорода в среде (Рис.8). Таким образом, гипоксия не оказывала существенного влияния на адипогенную дифференцировку МСК костного мозга крыс.

5 и

Рис.7 Оетсотвднаа дифференцкроака МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлена средняя доля негативных по ЩФ клеток после 96 часов экспозиции МСК в нормоксии и гипоксии (5% О2) и стандартная ошибка среднего. СД, ИД -спонтанная к индуцированная

дифференшровка. Данные

репрезентативного эксперимента для клеток третьего пассажа.

Рис.6 Адииогенная ди.фферыщирой№ МСК косшого мозга крыс па начальных этапах культивирования. Представлено среднее количество адипонитов в кластере после 14 суток инкубирования с адипогенными стимулами в нормоксии и гипоксии (5% 02) и стандартная ошибка среднего. Данные репрезентативною эксперимента для клеток первого пассажа.

Таки>) образом, 96-час о вое воздействие гипоксии (5% От) оказывало стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клепси-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования, что выражалось в снижении степени гетерогенности культур МСК. стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении, по крайней мере, начальных этапов процессов дяфференцировки в о creo генном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее хоммитироваиного состояния.

Стимулирующий эффект гипоксии на МСК на ранних нассажах может объясниться снижением интенсивности окислительного стресса, в котором оказываются клетки в течение первых пассажей после выделения. Снижение концентрации кислорода до 5% обуславливает, с одной стороны, помещение клеток в среду, приближенную к естественным условиям m vivo, что обеспечивает меньшее напряжение антиоксвдантных механизмов, и, с другой стороны, активацию ряда сигнальных путей. Таким образом, снижение la víiro концентрации кислорода в среде до 5%, по-видимому, не является "истинным" пшокеическим воздействием для культивируемых мезенхим адьньк етромальных клеток-предшественников, что говорит об актуальности исследования морфофункциокального состояния культивируемых МСК при значительно более выраженном снижении парциального давления кислорода н среде.

Н.'1ияш1е аноксии на мезенэшмвльные стромальные клетки-предшественники костиогп мозга крыс. При оценке морфологических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и аноксии в течение 96 часов было обнаружено, что аноксия существенно не влияет на морфологическую картину культур МСК. Количество крупных распластанных клеток было примерно одинаковым как в норм окончен их культурах, так и в культурах МСК в условиях аноксии.

Оценка пролиферации МСК костного мозга крыс па начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо- и аноксии в течение 96 часов, во/греки ожиданиям, показала, что в условиях аноксии не происходит ингибироваиия пролиферативной активности мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (Рис ,9).

! 2 з J

Пассаж

Рис.9 Пролиферация МСК костного мозга крыс па начальных этапах культивирования в нормоксии и аноксии. Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культур альных флаконах для различных культур и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 7 экспериментов, различия недостоверны, р>0,01 по критерии Маппа-Уитни для Р2-Р4 и по t-критсрию дтя РI,

Апоксия приводила либо к незначительной стимуляции пролиферативной активности МСК костного мозга крыс, либо не оказывала на нее никакого эффекта, в среднем, обуславливая н 1,2 раза большую пролиферативную активность по сравнению с нормокси чески ми условиями.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 - 4 пассажах, культивируемых в нормо- и аноксии в течение 96 часов показала, что аноксия незначительно увеличивает суммарный процент поврежденных клеток в культурах, что происходит, главным образом, за счет активации процессов апоптоза (Рис. 10).

В средней, количество апоптотических клеток а культурах МСК костного мозга крыс статистически достоверно возрастало в два раза при их культивировании в условиях аноксии в течение 96 часов, в то время как доля некротических клеток в этих же условиях увеличивалась в 1,2 раза. Суммарный процент поврежденных как некротически, гак и ашптотически клеток, в условиях аноксии был также п 1,2 раза выше но сравнению с нормохсией, что может говорить о значительной устойчивости клеток-предшественников костного мозга крыс к аноксическим условиям.

te ■ * г ? Ю -1 AnnV+ tntiKH 1 Plr K/»l ,fl ки Сумиарнов ког П0190КД4ННЫ1 ' • D HopuaKüi'» | H яАнвиям L ИЦ4С1Б0 «петок

Рис.10 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и аноксии. Представлено среднее количество апоптотических (ArmV+) некротических (Р1+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11-12 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

Несмотря ш относительную устойчивость мезевхимадькых кромальных клеток-предшественников костного мозга крыс к 90-часовой аноксии, более длительная экспозиция клеток в аноксических условиях приводила к существенном}' снижению их жизнеспособности (Рис.11). Так, суммарный процент поврежденных клеток возрастал с 22% после первой недели культивирования до более чем 50% через неделю, а к концу третьей недели практически все клетки в культуре гибли, в то время как в нормоксических и гипоксичсских условиях суммарный процент поврежденных клеток оставался относительно стабильным и составлял в среднем 10%. Основы™ механизмом гибели клеток при длительной аноксии являлся некроз, хотя доля апоптотических клеток также возрастала значительно, что могло свидетельствовать о существенном вкладе вторичного костапоптоткческого некроз а. Превалирование процессов те крота над процессами апоптоза в случае длительной экспозиции клеток в аноксии представляется естественным: запрограммировать клеточная гибель, в отличие от некроза, требует затрат энергии, поэтому вариант гибели обусловлен в том числе энергетическим состоянием клетки [Leist

М. е! а1., 1997]. Таким образом, несмотря на отсутствие явно выраженного повреждающего характера аноксии при ее относительно недолговременном воздействии, увеличение времени пребывания клеток-предшественников в нноксических условиях приводило к потере их жизнеспособности. Напротив, цитопротекторное действие гипоксии, наблюдаемое при ее кратковременном воздействии, подтверждалось при увеличении времени экспозиции клеток в гипоксии. Механизмы регуляции численности клеток в условиях гипоксии, а также на начальных стадиях аноксии, видимо, связаны с апоптозом, в то время как массовая гибель клеток в более жестких аноксических условиях, главным образом, связана с некрозом.

Рис. 11 Жизнеспособность МСК на начальных этапах культивирования в

нормокеии, гипоксии и аноксии и течение 21 суток. Представлен средний процепт поврежденных клеток в культурах и стандартное отклонение в нормокстк гипоксии и аноксии после 1,2 и 3 недель культивирования.

Как и в случае гипоксии, мезенхималыше етромальные клетки-предшественники костного мозга крыс сохраняли свой иммунофенотип при экспозиции в аноксии в течение 96 часов (СТ)90+, С045", СБ54\ СБ44+, СБ73Т, СВ106*, СШ1Ь , С029*).

При исследовании остеогенного дифференцировочно! о потенциала МСК костного мозга крыс было показано, что аноксии подавляла, по крайней мерс, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остсогенной дифференцировки клеток-предшественников. Тем ие менее, следует отметить, что в культурах МСК при их экспозиции в аноксии определенная доля клеток, в которых выявлялась активность ЩФ, все же детектировалась, что, вероятно, говорит об отсутствии полной блокады внутриклеточных механизмов, ответственных за дифференцировку клеток-предшественников в остеобласты. Полагают, что одним из таких механизмов является экспрессия ключевого для процессов остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора Кипх2, ингибироаание которого в случае аноксии, но не гипоксии было показано в одной из работ [ЭаПт А. й а1., 2004], Учитывая, что более длительное культивирование МСК в условиях аноксии приводило к нарушению их жизнеспособности, дальнейшая дифференцнровка этих клеток в осгеогенном направлении становилась невозможной.

Анализ адипогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс показал, что на начальных этапах культивирования МСК в аноксии часть клеток вступала на путь дифференцировки в адипоциты: в цитоплазме дифференцирующихся клеток начинали накапливаться липидные капли, клетки приобретали более сферическую форму и формировали кластеры. Однако при дальнейшей экспозиции в условиях аноксии происходила гибель дифференцирующихся клеток. Видимо, в условиях аноксии основным лимитирующим дифференцировку фактором являлось нарушение клеточной жизнеспособности, а не блокирование процессов дифференцировки.

Таким образом, в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс не происходило изменения морфологии и иммунофенотипа клеток, ингибирования их пролиферации, значительного увеличения количества поврежденных клеток, а также сохранялась возможность начальных этапов их остеогенной и адипогенной дифференцировки. Жизнеспособность клеток-предшественников при аноксии определялась временем их пребывания в этих условиях, а основным повреждающим механизмом МСК на начальных этапах аноксии являлся апоптоз, а при более длительном воздействии - некроз.

Суммируя полученные данные, следует повторить, что 96-часовая экспозиция гетерогенной на начальных этапах культивирования популяции мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях снижения концентрации кислорода in vino до 5%, то есть до значений, не являющихся гипоксическими in vivo, приводило к стимулирующему эффекту, заключающемуся в модуляции ряда морфофункциональных характеристик клеток-предшественников. Этого эффекта не наблюдалось при выраженном понижении содержания кислорода в среде, которое, тем не менее, не приводило и к значительному повреждению клеток, наблюдаемому в случае более длительной экспозиции, что расширяет представления об устойчивости клеток-предшественников взрослого организма, в частности, к недостатку кислорода в среде.

ВЫВОДЫ

1. Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризуются высокой степенью гетерогенности, которая выражается в наличии в культуре нескольких типов клеток с различными морфофункциональными характеристиками. При длительном культивировании происходит снижение гетерогенности культур клеток-предшественников и стабилизация их пролиферативной активности, что, по-видимому, объясняется субселекцией

клеточной популяции, адаптированной к условиям культивирования, в том числе, к высокому, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде.

2. 96-часовое воздействие гипоксии (5% Ог) оказывает стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования (1-4 пассажи), что выражается в снижении степени гетерогенности культур клеток, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для клеток-предшественников фенотипа.

3. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% О2) приводит к снижению в культуре доли клеток, в которых гистохимически выявляется спонтанная и индуцированная активность щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о подавлении начальных этапов спонтанной и индуцированной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.

4. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% 02) не оказывает существенного влияния на их адипогенную дифференцировку.

5. Эффекты гипоксии на морфологию, пролиферацию и жизнеспособность длительно культивируемых (более 20 пассажей) мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс варьируют, однако в любом случае гипоксия не приводит к стимуляции их пролиферативной активности и изменению характерного для клеток-предшественников иммунофенотипа.

6. 96-часовое воздействие аноксии на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс не приводит к изменению их морфологии и иммунофенотипа, к ингибированию их пролиферативной активности, к значительному увеличению доли поврежденных клеток, а также не отменяет начальных этапов дифференцировки клеток-предшественников.

7. Снижение жизнеспособности культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях аноксии определяется продолжительностью аноксического воздействия. На начальных этапах воздействия аноксия активирует в клетках-предшественниках процессы апоптоза, а основным повреждающим механизмом при дальнейшем их пребывании в условиях аноксии является некроз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Методические аспекты получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга крысы и высокая гетерогенность их популяции // Сборник материалов IV конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики. - 2005. - С. 5.

2. Влияние гипоксии на пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток крыс // Сборник материалов 4-й Всероссийской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция". - 2005. - С. 17 - 18 (Соавтор: Буравкова Л.Б.)

3. Гетерогенность и фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крыс // Сборник материалов VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток". - 2005. - С. 86. (Соавторы: Буравкова Л.Б., Григорьева О.В.)

4. Влияние гипоксии на гетерогенность, жизнеспособность и пролиферативную активность стромальных клеток-предшественников из костного мозга крыс // Сборник материалов V конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дгао космонавтики. - 2006. - С. 5.

5. The effect of hypoxia on rat bone marrow stroma-derived progenitor cells // Abstracts of the 2-nd International Conference "Strategies in tissue engineering", Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8. - N. 2. - P. 37. (Coauthor: Buravkova L.B.)

6. Susceptibility of rat bone marrow stroma-derived progenitor cells to hypoxia // Abstracts of the VIII World Congress of International Society for Adaptive medicine (ISAM). - 2006. - P. 90. (Coauthor: Buravkova L.B.)

7. Пролиферация, жизнеспособность и фенотип культивируемых мезенхимальных клеток-предшественников при гипоксии // Сборник метериалов Всероссийского симпозиума "Биология клетки в культуре", Цитология. - 2006. - Т. 48. - № 9. - С. 748 (Соавторы: Буравкова Л.Б., Жамбалова А.П., Гринаковская О.С.)

8. Влияние гипоксии на длительно культивируемые стромальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2006. - Т. 4. - С. 26 - 28. (Соавторы: Буравкова Л.Б., Воложин А.И., Григорьева О.В.)

9. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т.143. - № 4. - С. 386 - 389. (Соавтор: Буравкова Л.Б.)

10. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс // Цитология. - 2007. - Т. 49. - №1. - С. 40 - 47 (Соавтор: Буравкова Л.Б.)

11. Дифференцировочный потенциал стромальных клеток-предшественников из костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода в среде // Сборник материалов VI конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной Дню космонавтики. - 2007. - С. 10.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники FITC - флюоресцеинизотиоционат РЕ - фикоэритрин

SAP-киназы - стресс активируемые киназы семейства митоген-активируемых киназ (МАР-киназ)

Р13-киназа - фосфатидшшиозитол-3-киназа ЩФ - щелочная фосфатаза

Подписано в печать 28.08.2007 г. Исполнено 29.08.2007 г. Печать трафаретная

Заказ № 643 Тираж: ЮОэкз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анохина, Екатерина Борисовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

1.1.1 Понятие стволовости, стволовой клетки, мезенхимальной 9 стволовой клетки

1.1.2 Морфология культивируемых МСК и их гетерогенность

1.1.3 Пролиферативная активность культивируемых МСК и их 13 гетерогенность

1.1.4 Иммуннофенотип культивируемых МСК и их гетерогенность

1.1.5 Дифференцировочные потенции МСК in vitro и in vivo и их 25 гетерогенность

1.2 Механизмы реализации воздействия гипоксии на клетки

1.3 Эффекты гипоксии на клетки in vitro

1.3.1 Гипоксия и клеточная пролиферация

1.3.2 Гипоксия и жизнеспособность клеток

1.3.3 Гипоксия и иммунофенотип клеток

1.3.4 Гипоксия и дифференцировка клеток

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Используемое оборудование, материалы и реактивы

2.2 Приготовление сред для культивирования МСК костного мозга крыс

2.2.1 Приготовление полной среды

2.2.2 Приготовление остеогенной среды

2.2.3 Приготовление адипогенной среды

2.2.4 Приготовление среды для криоконсервации клеток

2.3 Получение и культивирования МСК костного мозга крыс

2.3.1 Получение первичных культур МСК костного мозга крыс

2.3.2 Пассирование первичной культуры и последующих субкультур 71 МСК костного мозга крыс

2.3.3 Культивирование клеток в условиях пониженного содержания 72 кислорода

2.3.4 Криоконсервация культивируемых МСК костного мозга крыс

2.4 Индукция дифференцировки МСК костного мозга крыс in vitro

2.4.1 Индукция остеогенной дифференировки

2.4.2 Индукция адипогенной дифференцировки

2.5 Оценка характеристик культивируемых МСК костного мозга крыс

2.5.1 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа 74 антигенов и морфологических характеристик клеток

2.5.2 Оценка морфологических характеристик культивируемых МСК 75 костного мозга крыс

2.5.3 Оценка пролиферативной активности культивируемых МСК 75 костного мозга крыс

2.5.4 Оценка жизнеспособности культивируемых МСК костного 76 мозга крыс

2.5.5 Оценка иммунофенотипа культивируемых МСК костного мозга 76 крыс

2.5.6 Оценка дифференцировочного потенцала культивируемых МСК костного мозга крыс

2.5.6.1 Оценка остеогенной дифференцировки МСК

2.5.6.2 Оценка адипогенной дифференцировки МСК

2.6 Определение транскрипционного фактора HIF-1а в 79 культивируемых МСК костного мозга крыс

2.7 Оценка теломеразной активности в культивируемых МСК 80 костного мозга крыс

2.8 Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Характеристика культивируемых МСК костного мозга крыс

3.1.1 Первичные культуры МСК костного мозга крыс

3.1.2 Морфология культивируемых МСК костного мозга крыс

3.1.3 Пролиферативная активность культивируемых МСК костного 89 мозга крыс

3.1.4 Иммунофенотип культивируемых МСК костного мозга крыс

3.1.5 Дифференцировочный потенциал МСК костного мозга крыс in 97 vitro

3.2 Влияние гипоксии на культивируемые МСК костного мозга крыс

3.2.1 Влияние гипоксии на морфологию культивируемых МСК 105 костного мозга крыс

3.2.2 Влияние гипоксии на пролиферативную активность 108 культивируемых МСК костного мозга крыс

3.2.3 Влияние гипоксии на жизнеспособность культивируемых МСК 112 костного мозга крыс

3.2.4 Влияние гипоксии на иммунофенотип культивируемых МСК 116 костного мозга крыс

3.2.5 Влияние гипоксии на дифференцировочный потенциал 117 культивируемых МСК костного мозга крыс

3.3 Влияние аноксии на культивируемые МСК костного мозга крыс

3.3.1 Влияние аноксии на морфологию культивируемых МСК 124 костного мозга крыс

3.3.2 Влияние аноксии на пролиферативную активность 125 культивируемых МСК костного мозга крыс

3.3.3 Влияние аноксии на жизнеспособность культивируемых МСК 127 костного мозга крыс

3.3.4 Влияние аноксии на иммунофенотип культивируемых МСК 133 костного мозга крыс

3.3.5 Влияние аноксии на способность МСК костного мозга крыс к 133 дифференцировке in vitro

3.5 Пониженное содержание кислорода и транскрипционный 137 фактор HIF-la в культивируемых МСК костного мозга крыс

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс"

На протяжении всей истории изучения стволовых клеток к ним всегда было приковано особое внимание в связи с выполняемой ими уникальной функцией генерации новых клеточных элементов для формирования тканей в эмбриогенезе и их поддержания на более поздних этапах развития. Функции стволовых клеток обуславливаются рядом уникальных характеристик, отличающих их от остальных клеток организма. Так, стволовые клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, то есть способны делиться гораздо большее количество раз, чем любая другая клетка, способная к делению. Деление стволовых клеток при этом ассиметрично и дает одну дочернюю клетку, которая сохраняет свойства стволовой, обеспечивая самоподдержание пула стволовых клеток, и одну дочернюю клетку, которая способна к дифференцировке с образованием менее или более комитированных предшественников, а также дифференцированных клеток. Термин "стволовая клетка" применяют чаще всего к клеткам, способным к различным направлениям дифференцировки, то есть к клеткам, в той или иной мере обладающим свойством пластичности. Особый интерес представляют собой стволовые клетки взрослого организма как клеточные элементы, оставшиеся недифференцированными при завершенном процессе формирования тканей, состоящих, прежде всего, из дифференцированных клеток, выполняющих свои специфические функции. В добавление к обнаруженным относительно давно и используемым гемопоэтическим стволовым клеткам, являющимся клетками-предшественниками для клеточных элементов крови, в последнее время было показано наличие во взрослом организме так называемых мезенхимальных стволовых клеток, или мультипотентных мезенхимальных стромальных (МСК), находящихся, в том числе, среди клеток стромы костного мозга, в жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки не только играют важную роль в гемопоэзе как составляющие микроокружения гемопоэтических клеток, но и являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, обладают высоким пролиферативным потенциалом, а также в определенных условиях способны к дифференцировке в различные клеточные типы, то есть обладают всеми характеристиками стволовых клеток (Сухих, Малайцев, Богданова и др., 2002; Вермель, 2004; Гольдберг, Дыгай, Жданов, 2005; Пальцев, Смирнов, Романов и др., 2006; Caplan, 1994; Prockop, 1997, 2003; Bruder, Jaiswal, Haynesworth, 1997; Pittenger, Mackay, Beck et al., 1999; Bianco, Riminucci, Gronthos et al., 2001; Barry, Murphy, 2004; Fibbe, 2002; Grove, Bruscia, Krause, 2004; Wagner, Wein, Seckinger et al., 2005). Колоссальный интерес к МСК объясняется прежде всего их мультипотентностью, обуславливающей возможность их использования в регенеративной медицине. Это, в свою очередь диктует необходимость детальных исследований биологии этих клеток. Растущее число работ, посвященных этой теме, однако, ставит все новые вопросы в отношении функционирования MCK in vivo и in vitro.

Одним из существенных факторов, определяющих функциональное состояние любой клетки, в том числе стволовой, является содержание кислорода в окружающей среде, определяющее концентрацию внутриклеточного кислорода. Поддержание этого параметра в узких пределах является важнейшим компонентом гомеостаза и необходимо для предупреждения в клетке повреждений различного характера. Наиболее частым нарушением постоянства газового состава среды является снижение парциального давления кислорода во внеклеточной среде, или гипоксия. МСК могут оказываться в условиях пониженного содержания кислорода по ряду причин. Так, гипоксия может быть обусловлена экзогенными факторами, рядом патофизиологических причин, а также ограниченным кровоснабжением имплантированных систем доставки клеток-предшественников (носителей) в место повреждения при применении современных репаративных технологий. Пониженное содержание кислорода может оказывать модифицирующее влияние на различные характеристики мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, отражающие их морфофункциональное состояние, такие как их жизнеспособность, способность к пролиферации, дифференцировочный потенциал, а также морфологические и иммунофенотипические показатели, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани. Следует отметить также, что при применении репаративных технологий с использованием клеток-предшественников важным фактором является возможность получения необходимой клеточной массы, что требует культивирования клеток в течение определенного времени. В свою очередь, время культивирования клеток in vitro, может модифицировать их характеристики, в том числе изменять чувствительность клеток к тому или иному воздействию, например, содержанию кислорода в среде.

История исследования гипоксии насчитывает не один десяток лет, и к настоящему времени накоплено большое число работ, обобщающих и интегрирующих полученные данные (Малкин, Гиппенрейтер, 1977; Агаджанян, 1985; Агаджанян, Елфимов, 1986; Агаджанян, Гневушев, Катков, 1987; Агаджанян, Чижов, 2003; Лукьянова, Ушаков, 2004; Сазонтова, Жукова, Анчишкина и др., 2007; Лукьянова, Дудченко, Цыбина и др., 2007; Kaelin, 2002; Semenza, 2001, 2004; Wenger, 2000, 2001, 2002; Bruick, 2003). Однако в противовес прицельному изучению гипоксии на организменном уровне гипоксическое воздействие на культивируемые клетки исследовано значительно меньше. В частности, работы, посвященные воздействию пониженного содержания кислорода на культивируемые МСК, немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, а их результаты зачастую противоречивы (Lennon, Edmison, Caplan, 2001; Salim, Nacamuli, Morgan et al., 2004; Ren, Cao, Zhao et al., 2006; Pacary, Legros, Valable et al., 2006; Malladi, Xu, Chiou et al., 2006; Lin, Lee, Yun, 2006). Таким образом, дальнейшее комплексное исследование функционального состояния мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода является актуальной задачей клеточной биологии.

Задачи исследования:

3. Исследование влияния пониженного содержания кислорода в среде культивирования (5% Ог) на морфологию, пролиферативную активность, жизнеспособность, иммунофенотип и остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал мезенхимальных стромальных клеток предшественников костного мозга крыс на начальных этапах культивирования.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Анохина, Екатерина Борисовна

ВЫВОДЫ

3. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% Ог) приводит к снижению в культуре доли клеток, в которых гистохимически выявляется спонтанная и индуцированная активность щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о подавлении начальных этапов спонтанной и индуцированной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.

4. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в течение 96 часов в условиях гипоксии (5% Ог) не оказывает существенного влияния на их адипогенную дифференцировку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анохина, Екатерина Борисовна, Москва

1. Агаджанян Н.А. (ред.). Адаптация человека и животных к экстремальным условиям внешней среды.// Сб. научных трудов под ред. Н.А.Агаджаняна. М.: Изд-во УДН.-1985. —184 с.

2. Агаджанян Н.А., Елфимов А.И. Функции организма в условиях гипоксии и гиперкапнии.// М.: Медицина. 1986. - 272 с.

3. Агаджанян Н.А., Гневушев В.В., Катков А.Ю. Адаптация к гипоксии и биоэкономика внешнего дыхания.// Монография. М.: Изд-во УДН. - 1987 - 186 с.

4. Агаджанян Н.А., Чижов А.Я. Гипоксические, гипокапнические и гиперкапнические состояния.// М.: Медицина. 2003. - 96 с.

5. Бочков Н.П., Воронина Е.С., Косякова Н.В. и др. Хромосомная изменчивость мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека.// Клеточные технологии в биологии и медицине. -2007. -№1. С. 11 - 15.

6. Вермель А.В. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике.// Клиническая медицина. 2004. - №1. - С. 1 - 5.

7. Гальчук С.В., Туровецкий В.Б., Буравкова Л.Б. и др. Действие кратковременной гипоксии и реоксигенации на перитонеальные макрофаги мышей in vitro.// Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2003. - Т. 89. - №3. - С. 329-338.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. - №4. - С. 15-20.

9. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Сериков В.Б. и др. Участие трансфузированных клеток костного мозга в репаративном остеогистогенезе.// Цитология. 2005. - Т. 47. -№9.-С. 755-759.

10. Деев Р.В., Николаенко Н.С., Цупкина Н.В. и др. Формирование и морфофункциональная характеристика остеобластического фенотипа в клеточных культурах in vitro.// Цитология. 2004. - Т. 46. - №3. - С. 185-190.

11. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др. Влияние сингенных мезенхимных стволовых клеток на восстановление костной ткани у крыс при имплантации деминерализованного костного матрикса.// Цитология. 2005. - Т. 47,-№6.-С. 466-477.

12. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Аминева Х.К. и др. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта.// Цитология. 2005. - Т. 47. - №5. - С. 404 - 416.

13. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др. Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток в кардиомиоцитарном направлении in vitro и in vivo.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. - №4. - С. 194 - 197.

14. Лагарькова М.А., Лякишева А.В., Филоненко Е.С. и др. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, выделенных методом иммуномагнитной селекции.// Клеточные технологии в биологии и медицине. -2006.-№1.-С. 3-7.

15. Лукьянова Л.Д., Ушаков И.Б. (ред.). Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты под ред. Л.Д. Лукьяновой, И.Б. Ушакова.// М.; Воронеж: Издательство "Истоки". 2004. - 590 с.

16. Лукьянова Л.Д., Дудченко A.M., Цыбина Т.А. и др. Регуляторная роль митохондриальной дисфункции при гипоксии и ее взаимодействие с транскрипционной активностью.// Вестник Российской АМН. 2007. - №2. - С. 3 -13.

17. Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г. и др. Цитофлюориметрический анализ фенотипов фибробластоподобных клеток из костного мозга и пуповины человека.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. - №4. - С. 212 -217.

18. Малкин В.Б., Гиппенрейтер Е.Б. Острая и хроническая гипоксия.// Проблемы космической биологии. М.: Наука. - 1977. - Т. 35. - 315 с.

19. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Белявский А.В. и др. Мезенхимальные стволовые клетки пуповинной крови. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. -№1. - С. 16-20.

20. Пальцев М.А., Смирнов В.Н., Романов Ю.А. и др. Перспективы использования стволовых клеток в медицине.// Вестник Российской Академии Наук. 2006. - Т. 76.-№2.-С. 99-111.

21. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. Мезенхимные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к дифференцировке.// Известия РАН. Серия биологическая. 2006. - №1. - С.6 - 25.

22. Паюшина О.В., Буеверова Э.И., Сатдыкова Г.П. и др. Сравнительное исследование мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и эмбриональной печени мыши и крысы.// Известия РАН. Серия биологическая. -2004. №6. - С.659 - 664.

23. Пирс Э. Гистохимия.// М., Издательство иностранной литературы. -1963. С.884.

24. Романов Ю.А., Даревская А.Н., Кабаева Н.В. и др. Выбор оптимальных условий культивирования мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга и жировой ткани человека.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. -№4.-С. 206-211.

25. Сазонтова Т.Г. Адаптация организма к изменению уровня кислорода к гипоксии и гипероксии: роль активных форм кислорода и редокс-сигнализации.// Вопросы гипербарической медицины. - 2006. -№1. - С. 4 - 19.

26. Сазонтова Т.Г., Жукова А.Г., Анчишкина Н.А. и др. Фактор транскрипции HIF-la, белки срочного ответа и резистетнтность мембранных структур в динамике после острой гипоксии.// Вестник Российской АМН. 2007. - №2. - С. 17-25.

27. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть.//Биохимия.-2000.-Т. 65.-№8.-С. 1029- 1046.

28. Сергеев B.C. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005. -№2.-С. 39-41.

29. Соколова И.Б., Федотова О.Р., Зинькова Н.Н. и др. Влияние трансплантации мезенхимальных стволовых клеток на когнитивные функции крыс после ишемического инсульта.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. -№4.-С. 202-205.

30. Соколова И.Б., Зинькова Н.Н., Шведова Е.В. и др. Распределение мезенхимальных стволовых клеток в области тканевого воспаления при разных способах трансплантации клеточного материала.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. - №1. - С. 34-37.

31. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Петракова Н.В. и др. Сравнительный анализ цитофенотипов клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. - №1. - С. 38 - 45.

32. Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М. и др. Мезенхимальные стволовые клетки.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. - Т. 133. -№2.-С. 124-131.

33. Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З. и др. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани.// Цитология. 2005. - Т. 47. - №.2. - С. 130 - 135.

34. Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы.// Известия АН. Серия биологическая. 1998. - №2. - С. 134 -141.

35. Хейфлик Л. Смертность и бессмертие на клеточном уровне.// Биохимия. 1997. -Т. 62.-№11.-С. 1380- 1393.

36. Чертков И.Л., Дризе Н.И. Дифференцировочный потенциал стволовых клеток (проблема пластичности).// Вестник Российской АМН. 2005. - №10. - С. 37 - 44.

37. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови.// М., Медицинское информационное агенство. -2004.-128 с.

38. Alfranca A., Gutierrez M.D., Vara A. et al. c-Jun and hypoxia-inducible factor 1 functionally cooperate in hypoxia-induced gene transcription.// Molecular and Cellular Biology. 2002. - Vol. 22. - N. 1. - P. 12 - 22.

39. Allen C.B., Schneider B.K., White C.W. Limitations to oxygen diffusion and equilibration in in vitro cell exposure systems in hyperoxia and hypoxia.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001. - Vol. 281. - P. L1021 - 1027.

40. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Garcia-Verdugo J.M. et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes.// Nature. 2003. -Vol. 425. - N. 6961. - P. 968 - 973.

41. Alvarez-Tejado M., Narano-Suarez S., Jimenez C. et al. Hypoxia induces the activation of the phosphatidylinositol-3-kinase/Akt cell survival pathway in PC 12 cells.// The Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. - N. 25. - P. 22368 - 22374.

42. Amellem 0., Loffler M., Pettersen E.O. Regulation of cell proliferation under extreme and moderate hypoxia: the role of pyrimidine (deoxy)nucleotides.// Br J Cancer. 1994. -Vol. 70.-N. 5.-P. 857-866.

43. An W.G., Kanekal M., Simon M.C. et al. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1 alpha.// Nature. -1998. Vol. 392. - N. 6674. - P. 405 - 408.

44. Anjos-Afonso F., Siapati E.K., Bonnet D. In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions.// Journal of Cell Science. 2004. - Vol. 117. - P. 5655 - 5664.

45. Annabi В., Lee Y.T., Turcotte S. et al. Hypoxia promote murine bone-marrow-derived stromal cell migration and tube formation.// Stem Cells. 2003. - Vol. 21. - P. 337 -347.

46. Arany Z., Huang L.E., Eckner R. et al. An essential role for рЗОО/CBP in the cellular response to hypoxia.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - N. 23 - P. 12969 -12973.

47. Awad H.A., Butler D.L., Boivin G.P. et al. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon.// Tissue Eng. -1999. Vol. 5. - N. 3. - P. 267 - 277.

48. Azizi S.A., Stokes D., Augelli B.J. et al. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats similarities to astrocyte grafts.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95. - N. 7. - P. 3908 - 3913.

49. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization.// The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. -Vol. 36.-P. 568-584.

50. Baxter M.A., Wynn R.F., Jowitt S.N. et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion.// Stem Cells. 2004. - Vol. 22.-N. 5.-P. 675-682.

51. Beresford J.N., Bennett J.H., Delvin C. et al. Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures.// Journal of Cell Science. 1992. - Vol. 102. - N. 2. - P. 341 - 351.

52. Bertani N., Malatesta P., Volpi G. et al. Neurogenic potential of human mesenchymal stem cells revisited: analysis by immunostaining, time-lapse video and microarray.// Journal of Cell Science. Vol. 118.-N. 17.-P. 3925-3936.

53. Bianco P., Riminucci M., Grothos S. et al. Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biology, and Potential Application.// Stem Cells. 2001. - Vol. 19. - P. 180 - 192.

54. Bianco P., Robey P.G. Stem cells in tissue engineering.//Nature. -2001. Vol. 414. -N.1.-P. 118-121.

55. Bos R., van Diest P.J., van der Groep P. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-la and cell cycle proteins in invasive breast cancer are estrogen receptor related.// Breast Cancer Res 2004. Vol. 6. - P. R450 - R459.

56. Bosch P., Pratt S.L., Stice S.L. Isolation, characterization, gene modification and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells.// Biology of reproduction. 2006. -Vol. 74.-P. 46-57.

57. Brazelton T.R., Rossi F.M.V., Keshet G.I. et al. From marrow to brain: Expression of neuronal Phenotypes in adult mice.// Science. 2000. - Vol. 290. - N. 5497. - P. 1775 -1779.

58. Brazelton T.R., Nystom M., Blau H.M. Significant differences among skeletal muscles in the incorporation of bone marrow-derived cells.// Dev Biol. 2003. - Vol. 262. - N. 1. -P. 64-74.

59. Bruick R.K. Expression of the gene encoding the proapoptotic Nip3 protein is induced by hypoxia.// PNAS. 2000. - Vol. 97. - N. 16. - P. 9082 - 9087.

60. Bruick R.K. Oxygen sensing in the hypoxic response pathway: regulation of the hypoxia-inducible transcription factor.// Genes and Development. 2003. - Vol. 17. - N. 21. - P. 2614-2623.

61. Caplan A.I. The mesengenic process.// Clin Plast Surg. 1994. - Vol. 21. - N. 3. - P. 429-435.

62. Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.M. et al. Role of HIF-1 alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis.// Nature. 1998. - Vol. 394. - N. 6692.-P. 485-490.

63. Chandel N.S., Maltepe E., Goldwasser E. et al. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia induced transcription.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -N. 20-P. 11715- 11720.

64. Cheng L., Qasba P., Vanguri P. et al. Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34(+) hematopoietic progenitor cells.// J Cell Physiol. 2000. - Vol. 184. - N. 1. - P. 58 - 69.

65. Clarke D., Frisen J. Differentiation potential of adult stem cells.// Current opinion in Genetics and Development. 2001. - Vol. 11 - P. 575 - 580.

66. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M. et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - N. 7. - P.3213 - 3218.

67. Colter D.C., Sekiya I., Prockop D.J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - N. 14. - P. 7841 - 7845.

68. Conget P.A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells.// Journal of cellular physiology. 1999. - Vol. 181. - P. 67-73.

69. Cooper A.L., Beasley D. Hypoxia stimulates proliferation and interleukin-la production in human vascular smooth muscle cells.// Am J Physiol. 1999. - Vol. 277. - P. HI 326 -H1337.

70. Coyne T.M., Marcus A.J., Woodbuiy D. et al. Marrow stromal cells transplanted to the adult brain are rejected by an inflammatoiy response and transfer donor labels to host neurons and glia.// Stem Cells. Vol. 24. - N. 11. - P. 2483 - 2492.

71. Covello K.L., Kehler J., Yu H. et al. HIF-2a regulate Oct-4: effect of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth.// Genes and Development. -2006. Vol. 20. - N. 5. - P. 557 - 570.

72. Da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues.// Journal of Cell Science. 2006. - Vol. 119.-N. 11.-P. 2204-2213.

73. Davis R.J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases.// Cell. 2000. - Vol. 103.-P. 239-252.

74. Deasy B.M., Gharaibeh B.M., Pollett J.B. et al. Long-term self-renewal of postnatal muscle-derived stem cells.// Molecular Biology of the Cell. 2005. - Vol. 16. - P. 3323 -3333.

75. Deng W., Obrocka M., Fischer I. et al. In vitro differentiation of human marrow stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular cyclic AMP.//BiochemBiophysResCommun.-2001.-Vol.282.-N. l.-P. 148-152.

76. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A. et al. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse.// J Bone Miner Res. 1999. - Vol. 14. -N. 5.-P. 700-709.

77. Dirmeier R., O'Brien K.M., Engle M. et al. Exposure of yeast cells to anoxia induces transient oxidative stress.// The Journal of Biological Chemistry. 2002. - Vol. 277. -N. 38.-P. 34773-34784.

78. Doege K., Heine S., Jensen I. et al. Inhibition of mitochondrial respiration elevates oxygen concentration but leaves regulation of hypoxia-inducible factor (HIF) intact.// Blood. 2005. - Vol. 106. - N. 7. - P. 2311 - 2317.

79. Dominici M., Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.//Cytotherapy. -2006. Vol. 8. -N. 4. - P. 315 -317.

80. Dougherty C.J., Kubasiak L.A., Frazier D.P. et al. Mitochondrial signals initiate the activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) by hypoxia-reoxygenation.// The FASEB Journal. 2004. - Vol. 18. - P. 1060 -1070.

81. Ehleben W., Boiling В., Merten E. et al. Cytochromes and oxygen radicals as putative members of the oxygen sensibg pathway.// Respiration Physiology. 1998, - Vol. 114. -N. l.-P.25-36.

82. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors.// Science. 1998. - Vol. 279. - N. 5356. - P. 1528- 1530.

83. Fibbe W.E. Mesenchymal stem cells. A potential source for skeletal repair.// Annals of the Rheumatic Diseases. 2002. - Vol. 61. - P. ii29 - ИЗ 1.

84. Floyd Z.E., Zvonic S., Nuttall M.E. et al. Fine-tuning reception in the bone: PPARy and Company.// PPAR Research. 2006. - Vol. 2006. - P. 1 - 7.

85. Friedenstein A.I., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs.// Exp Hematol. 1976. - Vol.4. - N. 5. - P. 267 -274.

86. Galmiche M.C., Koteliansky V.E., Briere J. et al. Stromal cells from human long-term marrow cultures are mesenchymal cells that differentiate following a vascular smooth muscle differentiation pathway.// Blood. Vol. 82. - N. 1. - P. 66 - 76.

87. Gardner L.B., Li Q., Park M.S. et al. Hypoxia inhibits Gl/S transition through regulation of p27 expression.// The Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. - N. 11.-P. 7919-7926.

88. Gardner L.B., Li F., Yang X. et al. Anoxic fibroblasts activate a replication checkpoint that is bypasses by Ela.// Molecular and cellular biology. 2003. - Vol. 23. - N. 24. - P. 9032-9045.

89. Goda N., Ryan H. E., Khadivi B. et al. Hypoxia-inducible factor la is essential for cell cycle arrest during hypoxia.// Molecular and Cellular Biology. 2003. - Vol.23. - N.l -P. 359-369.

90. Gojo S., Gojo N., Takeda Y. et al. In vivo cardiovasculogenesis by direct injection of isolated adult mesenchymal stem cells.// Exp Cell Res. 2003. - Vol. 288. - N. 1. - P. 51 -59.

91. Gozal E., Sachleben L.R., Rane M.J. et al. Mild sustained and intermittent hypoxia induce apoptosis in PC-12 cells via different mechanisms.// Am J Physiol Cell Physiol. -2005. Vol. 288. - P. C535 - C542.

92. Graeber T.G., Osmanian C., Jacks T. et al. Hypoxia-mediated selection of cells with diminished apoptotic potential in solid tumours.// Nature. 1996. - Vol. 379. -N. 6560. -P. 88-91.

93. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R. et al. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs.// J Cell Physiol. 2006. - Vol. 207. -N. 2.-P. 331 -339.

94. Greijer A.E., van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis.//J Clin Pathol. -2004.-Vol. 57.-P. 1009-1014.

95. Grove J.E., Bruscia E., Krause D.S. Plasticity of bone marrow-derived stem cells.// Stem Cells. 2004. - Vol. 22. - P. 487 - 500.

96. Heberlein W., Wodopia R., Bartsch P. et al. Possible role of ROS as mediators of hypoxia-induced ion transport inhibition of alveolar epithelial cells.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000. - Vol. 278. - N. 4. - P. L640 - L.648.

97. Heidbreder M., Frohlich F., Johren O. et al. Hypoxia rapidly activates HIF-3a mRNA expression.// The FASEB Journal. 2003. - Vol. 17. - P. 1541 - 1543.

98. Herbertson A., Aubin J.E. Cell sorting enriches osteogenic populations in rat bone marrow stromal cell cultures.// Bone. 1997. - Vol. 21. - N. 6. - P. 491 - 500.

99. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The international Society for Cellular Therapy position statement.// Cytotherapy. -2005. Vol. 7. - N. 5. - P. 393 - 395.

100. Hu C.J., Wang L.Y., Chodosh L.A. et al. Differential roles of hypoxia-inducible factor la (HIF-la) and HIF-2a in hypoxic gene regulation.// Molecular and Cellular Biology. -2003. Vol. 23. - N. 24. - P.9361 - 9374.

101. Hu C.J., Iyer S., Sataur A. et al. Differential regulation of the transcriptional activities of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-la) and HIF-2a in stem cells.// Molecular and Cellular Biology. 2006. - Vol. 26. - N.9. - P. 3514 - 3526.

102. Huang J.I., Kazmi N., Durbhakula M. et al. Chondrogenic potential of progenitor cells derived from human bone marrow and adipose tissue: a patient-matched comparison.// Journal of Orthopaedic Research. 2005. - Vol. 23. - P.1383 - 1389.

103. Humar R., Kiefer F.N., Berns H. et al. Hypoxia enhances vascular cell proliferation and angiogenesis in vitro via rapamycin (mTOR)-dependent signaling.// The FASEB Journal. -2002.-Vol. 16.-P. 771 -780.

104. Ichida F., Nishimura R., Hata K. et al. Reciprocal role of Msx2 in regulation of osteoblast and adipocyte differentiation.// J Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - N. 32. - P. 34015-34022.

105. Jacobson M.D., Raff M.C. Programmed cell death and Bcl-2 protection in very low oxygen.// Nature. 1995. - Vol. 374. -N. 6562. - P.814 - 816.

106. Jaiswal N., Haynesworth S.E., Caplan A.I. et al. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.// J Cell Biochem. 1997. -Vol. 64.-N. 2.-P. 295-312.

107. Jewell U.R., Kvietikova I., Sched A. et al. Induction of HIF-la in response to hypoxia is instantaneous.//FASEB J.-2001.-Vol. 15.-N. 7.-P. 1312-1314.

108. Jiang B.H., Semenza G.L., Bauer C. et al. Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of 02 tension.// Am J Physiol Cell Physiol. -1996. Vol. 271. - N. 4. - P. CI 172 - С1180.

109. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.// Nature. 2002. - Vol. 418. - P. 41 - 49.

110. Ichida F., Nishimura R., Hata K. et al. Reciprocal roles of Msx2 in regulation of osteoblast and adipocyte differentiation.// J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - N. 32. - P. 34015-34022.

111. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A. et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro.// Cell Transplant. -1997. Vol. 6. - N. 2. - P. 125 - 134.

112. Kaelin W.G. How oxygen makes its presence felt.// Genes and Development. 2002. -Vol. 16.-N. 12.-P. 1441 -1445.

113. Kashiwakura Y., Katoh Y., Tamayose K. et al. Isolation of bone marrow stromal cell-derived smooth muscle cells by a human SM22a promoter.// Circulation. 2003. - Vol. 107.-P. 2078. .

114. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R. et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.// Science. 1994. - Vol. 266. - P. 2011-2015.

115. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of nich, self-renewal and differentiation.// Arthritis Research and Therapy. 2007. - Vol. 9. -N. 204.-P.

116. Kunz M., Ibrahim S.M. Molecular responses to hypoxia in tumor cells.// Mol Cancer. -2003.-Vol. 2.-N. 23.-P.

117. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S. et al. Circulating skeletal stem cells.// The Journal of Cell Biology. 2001. - Vol. 153. - N. 5. - P. 1133 - 1139.

118. Laderoute K.R., Webster К.A. Hypoxia/Reoxygenation stimulates Jun kinase activity through redox signaling in cardiac myocytes.// Circulation Research. 1997. - Vol. 80. -P. 336-344.

119. LaBarge M.A., Blau H.M. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury.// Cell. -2002.-Vol. lll.-N.4.-P.589-601.

120. Lahiri S. Historical perspectives of cellular oxygen sensing and responses to hypoxia.// J Appl Physiol. 2000. - Vol. 88. - N. 4. - P. 1467 - 1473.

121. Lanza R. (editor). Essentials of stem cell biology.// Elsevier Inc. 2006. - 548 pp.

122. Lee H.S., Huang G.T., Chiang H. et al. Multipotential mesenchymal stem cells from femoral bone marrow near the site of osteoporosis.// Stem Cells. 2003. - Vol. 21. - P. 190-199.

123. Lee R.H., Hsu S.C., Munoz J. et al. A subset of human rapidly self-renewing marrow stromal cells preferentially engraft in mice.// Bllod. 2006. - Vol. 107. - N. 5. - P. 2153 -2161.

124. Lee J.H., Kemp D.M. Human adipose-derived stem cells display myogenic potential and perturbed function in hypoxic conditions.// Biochem Biophys Res Commun. 2006. -Vol. 341.-N. 3. -P. 882-888.

125. Leist M., Single В., Castoldi A.F. et al. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis.// J. Exp. Med. -1997.-Vol. 185.-N. 8.-P. 1481 -1486.

126. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis.// J Cell Physiol. 2001. - Vol. 187. -N.3. - P. 345 - 355.

127. Lin Q., Lee Y. J., Yun Z. Differentiation arrest by hypoxia.// The Journal of Biological Chemistry. 2006. - Vol. 281. - N. 31. - P. 30678 - 30683.

128. Lopez-Barneo J., del Того R., Levitsky K.L. et al. Regulation of oxygen sensing by ion channels.// J Appl Physiol. 2004. - Vol. 96. -N. 3. - P. 1187 -1195.

129. Louboutin J.P., Liu В., Reyes B.A. et al. Rat bone marrow progenitor cells transduced in situ by rSV40 vectors differentiate into multiple central nervous system cell lineages.// Stem Cells. 2006. - Vol. 24. - N. 12. - P. 2801 - 2809.

130. Lu D., Mahmood A., Wang L. et al. Adult bone marrow stromal cells administered intravenously to rats after traumatic brain injury migrate into brain and improve neurological outcome.// Neuroreport. 2001. - Vol. 12. - N. 3. - P. 559 - 563.

131. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.// J Cell Physiol.-1998.-Vol. 176.-N. 1,-P. 57-66.

132. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro.// J Clin Invest. 1999. - Vol. 103. - N. 5. - P. 697 - 705.

133. Malladi P., Xu Y., Chiou M. et al. Effect of reduced oxygen tension on chondrogenesis and osteogenesis in adipose-derived mesenchymal cells.// Am J Physiol Cell Physiol. -2006. Vol. 290. - N. 4. - P. 1139 - 1146.

134. Maxwell P.H., Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Inducible operation of the erythropoietin 3' enhancer in multiple cell lines: evidence for widespread oxygen-sensing mechanism.// Proc Natl Acad Sci USA. 1993. - Vol. 90. - N. 6. - P. 2423 - 2427.

135. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells.// Experimental Biology and Medicine. 2001. - Vol. 226. - N. 6. - P. 507 - 520.

136. Miura M., Miura Y., Padilla-Nash H. et al. Accumulated chromosomal instability in muribe bone marrow mesenchymal stem cells leads to malignant transformation.// Stem Cells. 2006. - Vol. 24. - N. 4. - P. 1095 - 1103.

137. Munoz-Elias G., Woodbury D., Black I.B. Marrow Stromal Cells, mitosis and neuronal differentiation: stem cell and precursor functions.// Stem Cells. 2003. - Vol. 21. - N.4. -P. 437-448.

138. Munoz-Elias G., Marcus A.J., Coyne T.M. et al. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long-term survival.// The Journal of Neuroscience. 2004. - Vol. 24. - N. 19. - P. 4585 - 4595.

139. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bine marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.// Journal of Cell Science.-2000. Vol. 113.-N. 7.-P. 1161-1166.

140. Oldershaw R., Hardingham T. Low-oxygen tension affects the chondrogenic potential of human mesenchymal stem cells.// International Journal of Experimental Pathology. -2006.-Vol. 87.-P.A1-A58.

141. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium.// Nature. Vol. 410. - P. 701 - 705.

142. Oswald J., Boxberger S., Jorgensen B. et al. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro.// Stem Cells. 2004. - Vol. 22. - P. 377 -384.

143. Pacary E., Legros H., Valable S. et al. Synergistic effects of CoC12 and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuron-like cells.// Journal of Cell Science. 2006. - Vol. 119. -N. 3. - P.2667 - 2678.

144. Pereira R.F., Halford K.W., O'Hara M.D. et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage and lung in irradiated mice.// Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - Vol. 92. - N. 11. - P. 4857 - 4861.

145. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells.// Science. 1999. - Vol. 284. -N. 5417. - P. 1168 - 1170.

146. Phinney D.G., Kopen G., Isaacson R.L. et al. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth and differentiation.// J Cell Biochem. 1999. - Vol. 72. -N. 4. - P. 570 - 585.

147. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.// Science. 1999. - Vol. 284. - P. 143 - 147.

148. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.// Science. 1997. - Vol. 276. -N. 5309. - P. 71 - 74.

149. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair.// The Journal of Cell Biology. 2003. - Vol. 160. -N.6. - P. 807 - 809.

150. Prockop D.J., Sekiya I., Colter D.C. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells.// Cytotherapy. 2001. -Vol.3.-N. 5.-P. 393-396.

151. Qanungo S., Wang M., Nieminen A.L. N-acetyl-L-cysteine enhances apoptosis through inhibition of nuclear factor-кВ in hypoxic murine embryonic fibroblasts.// The Journal of Biological Chemistry. 2004. - Vol. 279. - N. 48. - P. 50455 - 50464.

152. Ren H., Cao Y., Zhao Q. et al. Proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells under hypoxic conditions.// Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - Vol. 347. - N. 1. - P. 12 - 21.

153. Reyes M., Verfaillie C.M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells.// Annals of the New York Academy of Sciences. 2001. - Vol. 938. - P. 231 - 235.

154. Richards M., Huibregtse B.A., Caplan A.I. et al. Marrow-derived progenitor cell injections enhance new bone formation during distraction.// J Orthop Res. 1999. - Vol. 17.-N. 6.-P. 900-908.

155. Risbud M.V., Albert T.J., Guttapalli A. et al. Differentiation of mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposus-like phenotype in vitro: implications for cell-based transplantation therapy.// Spine. 2004. - Vol. 29. - N. 23. - P. 2627 - 2632.

156. Robins J.C., Akeno N., Mukherjee A. et al. Hypoxia induces chondrocyte-specific gene expression in mesenchymal cells in association with transcriptional activation of Sox9.// Bone. 2005. - Vol. 37. - P. 313 - 322.

157. Rochefort G.Y., Delorme В., Lopez A. et al. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia.// Stem Cells. 2006. - Vol. 24. - N. 10. - P. 2202-2208.

158. Rose F., Grimminger F., Appel J. et al. Hypoxic pulmonary artery fibroblasts trigger proliferation of vascular smooth muscle cells: role of hypoxia-inducible transcription factors.//The FASEB Journal.-2002. Vol. I6.-N.12.-P. 1660-1661.

159. Ross J.J., Hong Z., Willenbring B. et al. Cytokine-induced differentiation of multipotent adult progenitor cells into functional smooth muscle cells.// The Journal of Clinical investigation. Vol. 116.-N. 12.-P. 3139-3149.

160. Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R. et al. Circulating mesenchymal stem cells.// The international Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. - Vol. 36. - P. 585 -597.

161. Sabatini F., Petecchia L., Tavian M. et al. Human bronchial fibroblasts exhibit a mesenchymal stem cell phenotype and multilineage differentiating potentialities.// Lab Invest. 2005. - Vol. 85. - N. 8. - P. 962 - 971.

162. Sahai A., Mei C., Pattison T.A. et al. Chronic hypoxia induces proliferation of cultured mesangial cells: role of calcium and protein kinase C.// Am J Physiol. 1997. - Vol. 273. -P. F954-F960.

163. Salim A., Nacamuli R.P., Morgan E.F. et al. Transient changes in oxygen tension inhibitosteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts.// The Journal of Biological Chemistry. 2004. - Vol. 279. - N. 38. - P. 40007 - 40016.

164. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro.// Exp Neurol. 2000. - Vol. 164. - N. 2. - P. 247 -256.

165. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion.// Blood. Vol. 106. -N. 2.-P. 756-763.

166. Scherer K., Schunke M., Sellckau R. et al. The influence of oxygen and hydrostatic pressure on articular chondrocytes and adherent bone marrow cells in vitro.// Biorheology. 2004. - Vol. 41. - N. 3-4. - P. 323-333.

167. Schmaltz C., Hardenbergh P.H., Wells A. et al. Regulation of proliferation-survival decisions during tumor cell hypoxia.// Molecular and Cellular Biology. Vol. 18. -N. 5. -P. 2845-2854.

168. Schroedl C., McClintock D.S., Budinger G.R. et al. Hypoxic but not anoxic stabilization of HIF-la requires mitochondrial reactive oxygen species.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002. - Vol. 283. - P. L922 - L933.

169. Schumacker P.T. Hypoxia, anoxia, and 02 sensing: the search continues.// Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002. - Vol. 283. - P. 918 - 921.

170. Scott P.H., Paul A., Belham C.M. et al. Hypoxic stimulation of the stress-activated protein kinases in pulmonary artery fibroblasts.// Am J Respir Crit Care Med. 1998. -Vol. 158.-P. 958-962.

171. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality.// Stem Cells. 2002. - Vol. 20. - N. 6. - P. 530 - 541.

172. Semenza G.L. Perspectives on oxygen sensing.// Cell. 1999. - Vol. 98. - N. 3. - P. 281 -284.

173. Semenza G. L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor.// Genes and development. 2000. - Vol. 14. - P. 1983 - 1991.

174. Semenza G.L. HIF-1, 02, and 3 PHDs. How animal cells signal hypoxia to the nucleus.//Cell.-2001.-Vol. 107.-N.1.-P. 1-3.

175. Semenza G.L. Hydroxylation of HIF-1: oxygen sensing at the molecular level.// Physiology.-2004.-Vol. 19.-N.4.-P. 176- 182.

176. Sodhi C.P., Batlle D., Sahai A. Osteopontin mediates hypoxia-induced proliferation of cultured mesangial cells: role of PKC and p38 МАРК.// Kidney Int. 2000. - Vol. 58. -N.2.-P. 691 -700.

177. Sodhi C.P., Phadke S.A., Batlle D. et al. Hypoxia stimulates osteopontin expression and proliferation of cultured vascular smooth muscle cells.// Diabetes. 2001. - Vol. 50. - P. 1482-1490.

178. Sowter H.M., Raval R., Moore J. et al. Predominant role of hypoxia-inducible transcription factor (HIF)-la versus HIF-2a in regulation of the transcriptional response to hypoxia.// Cancer Research. 2003. - Vol. 63. - P. 6130 - 6134.

179. Srinivas V., Leshchinsky I., Sang N. et al. Oxygen sensing and HIF-1 activation does not require an active mitochondrial respiratory chain electron transfer pathway.// The Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. - N. 25. - P. 21995 - 21998.

180. Suzuki H., Tomida A., Tsuruo T. Dephosphorylated hypoxia-inducible factor la as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia.// Oncogene. 2001. - Vol. 20. -N.41.-P. 5779-5788.

181. Terada N., Hamazaki Т., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion.// Nature. 2002. - Vol. 416. - N. 6880. - P. 542 - 545.

182. Theise N.D., Badve S., Saxena R. et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation.// Hepatology. 2000. - Vol. 31. - P. 235-240.

183. Tobiume K., Matsuzawa A., Takahashi T. et al. ASK1 is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis.// EMBO reports. 2001. - Vol. 2. -N.3.-P. 222-228.

184. Tuncay O.C., Barker M.K. Oxygen tension regulates osteoblast function.// Am J Orthod Dentofacial Orthop. -1994. Vol. 105. - N. 5. - P. 457 - 463.

185. Vaux E.C., Metzen E., Kay M. et al. Regulation of hypoxia-inducible factor is preserved in the absence of a functioning mitochondrial respiratory chain.// Blood. 2001. - Vol. 98.-N. 2.-P. 296-302.

186. Wagner W., Wein F., Seckinger A. et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood.// Experimental Hematology. 2005. - Vol. 33. - P. 1402 - 1416.

187. Wakitani S., Saito Т., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine.// Muscle Nerve. 1995. - Vol. 18. -N. 12.-P. 1417- 1426.

188. Wang J., Shum-Tim D., Galipeau J. et al. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages.// J Thorac Cardiovasc Surg. 2000. - Vol. 120. - P. 999 - 1006.

189. Wang G., Bunnell B.A., Painter R.G. et al. Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells: potential therapy for cystic fibrosis.// Proc Natl AcadSciUSA.-2005.-Vol. 102.-N. l.-P. 186-191.

190. Wang Z., Song J., Taichman R.S. et al. Ablation of proliferating marrow with 5-fluorouracil allows partial purification of mesenchymal stem cells.// Stem Cells. 2006.- Vol. 24. N. 6. - P. 1573 - 1582.

191. Wenger R.H. Mammalian oxygen sensing, signaling and gene regulation.// The Journal of Experimental Biology. 2000. - Vol. 203. - N. 8. - P. 1253 - 1263.

192. Wenger R.H. Cellular adaptation to hypoxia: 02-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and 02-regulated gene expression.// The FASEB Journal.- 2002. Vol.16. - N. 10. - P. 1151 - 1162.

193. Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P. et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not.// 2003. Vol. 121. - P. 368 - 374.

194. Wislet-Gendebien S., Leprince P., Moonen G. et al. Regulation of neural markers nestin and GFAP expression by cultivated bone marrow stromal cells.// Journal of Cell Science. -2003.-Vol. 116.-N. 16-P. 3295-3302.

195. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J. et al. Adult rat and human marrow stromal cells differentiate into neurons.// J Neurosci Res. 2000. - Vol.61. - N. 4. - P. 363 -370.

196. Woodbury D., Reynolds K., Black I.B. Adult bone marrow stromal cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis.// Journal of Neuroscience Research. 2002. - Vol. 96. - P. 908 - 917.

197. Ying Q.L., Nichols J., Evans E.P. et al. Changing potency by spontaneous fusion.// Nature. 2002. - Vol. 416. - N. 6880. - P. 545 - 548.

198. Yun Z., Maecker H.L., Johnson R.S. et al. Inhibition of PPAR gamma 2 gene expression by the HIF-1-regulated gene DEC1/Stral3: a mechanism for regulation of adipogenesis by hypoxia.// Dev Cell. 2002. - Vol. 2. - N. 3. - P. 331 - 341.

199. Zelko I.N., Folz R.J. Extracellular superoxide dismutase functions as a major repressor of hypoxia-induced erythropoietin gene expression.// Endocrinology. 2005. - Vol. 146. -N. 1.-P. 332-340.

200. Zhou S., Lechpammer S., Greenberger J.S. et al. Hypoxia inhibition of adipocytogenesis in human bone marrow stromal cells requires transforming growth factor-p/Smad3 signaling.// J Biol Chem. 2005. - Vol. 280. - N. 24. - P. 22688 - 22696.

201. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.// Tissue Engineering. 2001. - Vol. 7. - N. 2. - P. 211 -228.

202. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.// Molecular Biology of the Cell. 2002. - Vol. 13. - P. 4279 - 4295.

203. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G. et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals.// Arthritis Res. 2000. - Vol. 2. - P. 477 - 488.

Информация о работе

Анохина, Екатерина Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы