Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода

Жамбалова, Арюна Пурбодоржиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода"

На правах рукописи

003493633

ЖАМБАЛОВА Арюна Пурбодоржиевна

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ПОНИЖЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА

03.03.01 - физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010 ~ 4 МАР 2010

003493633

Работа выполнена в Учреждении Российской Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем РАН

академии

наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна доктор медицинских наук, профессор Гаврилюк Борис Карпович

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится марта 2010 г. в ^^часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН Автореферат разослан «. _» Февраля 2010 г.

доктор биологических наук

Романов Юрий Аскольдович

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению и высоким дифференцировочным потенциалом, заслужили пристальное внимание исследователей в связи с возможным использованием их в терапевтических целях. Мезенхимальные стволовые клетки, входящие в состав стромы костного мозга, главного кроветворного органа в постнатальном периоде онтогенеза, относятся к важным компонентам ниши гемопоэтических клеток, являющихся родоначальными элементами кроветворения (Фриденштейн и др. 1976, 1980; Чертков и др., 1984, 1998, 2005; Сухих и др., 2002; Паюшина и др., 2004; Fridenshtein et al., 1970, 1987). Несмотря на то, что к настоящему времени и мезенхимальные, и гемопоэтические стволовые клетки достаточно подробно охарактеризованы (Андреева и др., 1999, 2002; Романов и др., 2005; Тепляшин и др., 2005; Тракгуев и др., 2006; Owen et al., 1987, 1988; Caplan, 1991; Pittenger et al., 1999; Muraglia et al., 2000; Colter et al., 2000; Prockop et al., 2001; Sekia et al., 2002; Gronthos et al., 2003; Shmelkov et al., 2005; Dominici et al., 2006; Montgomery et al., 2009), исследований, посвященных взаимодействию этих двух типов стволовых клеток, значительно меньше (McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Muguruma et al., 2006; Wagner et al., 2007", 2008). Известно, что комплекс межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий регулируется различными сигнальными молекулами (мембранно-ассоциированными рецепторами, цитокинами, факторами роста) (Пальцев, Иванов, 1995). При нормальном гемопоэзе так же важна непосредственная кооперация гемопоэтических клеток-предшественников с элементами кроветворного микроокружения, межмембранное связывание служит при этом для переноса регуляторной информации, передачи необходимых веществ, миграции, хоминга и представления ростовых факторов в биологически доступной форме (Гольдберг и др., 1999). Следует отметить, что используемые в настоящее время экспериментальные модели дают неполное представление о реальных биологических эффектах от действия сигнальных молекул, поскольку не воспроизводят физиологические особенности происходящих при гемопоэзе процессов. Функциональные и структурные изменения элементов микроокружения под действием различных эндогенных факторов могут быть причиной нарушений кроветворения, однако исследования в этой области немногочисленны. Кроме того, традиционно, культуральные исследования проводят в нормоксических условиях, при 20% С>2, в то время как, например, при эмбриональном развитии человека содержание кислорода в тканях не превышает 3% (Rodesch et al., 1992; Burton, Jaunaiux, 2001), в артериальной крови - 12%, венозной - 5,3%, в гипоталамусе - 1,4-2,1%, в костном мозге -

3-7% (Ishikava, Ito, 1988; Mostafa et al., 2000). Участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в создании микроокружения, способного поддерживать рост и развитие гемопоэтических клеток, показано во многих работах (Clausen et al., 2000; Shimakura et al., 2000; Kusadasi et al., 2001; Kadereit et al., 2002; Majumdar et al., 2003; McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Mugumma et al., 2006; Wagner et al., 2007, 2008; Walenda et al., 2009). Однако функциональные особенности и тесные клеточные взаимодействия элементов кроветворного микроокружения с учетом парциального давления кислорода во внеклеточном пространстве костного мозга практически не исследованы. Таким образом, несомненный научный и практический интерес представляет не только изучение некоторых аспектов взаимодействия прогениторных клеток различных типов в условиях максимально приближенных in vivo, но и воссоздание гемопоэзиндуцирующей ниши, позволяющей оптимизировать рост и развитие кроветворных стволовых клеток в культуре.

Цель работы: Изучение роли мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в создании гемопоэзиндуцирующего микроокружения при совместном культивировании с гемопоэтическими стволовыми клетками человека при различном содержании кислорода.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие

задачи исследования:

1. Изучить влияние пониженного содержания кислорода (1% и 5%) на морфофункциональные особенности культивируемых МСК;

2. Разработать экспериментальную модель совместного культивирования МСК и ГСК в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода;

3. Оценить функциональную активность (способность поддерживать гемопоэз) МСК при сокультивировании с ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;

4. Изучить колониеобразующую функцию ГСК после совместного культивирования с МСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;

5. Исследовать иммунофенотип совместно культивируемых МСК с ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;

6. Проанализировать продукцию цитокинов в культурах МСК, ГСК и совместно культивируемых МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

Научная новизна. Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (1% и 5%) на совокупность морфофункдиональных параметров культивируемых МСК костного мозга человека. Впервые показано, что при культивировании МСК костного мозга человека в условиях пониженного содержания кислорода происходит снижение доли клеток, несущих рецепторы адгезии (VCAM-1), на фоне устойчивости основного иммунофенотипа. Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что при пониженном содержании кислорода на определенных этапах культивирования (96 ч, 5% Ог) МСК костного мозга человека скорость пролиферации возрастает по сравнению с нормоксией и снижается при 1% 02 на всех этапах субкультивирования. Показано, что при культивировании МСК в условиях пониженного содержания кислорода морфология и жизнеспособность клеток не меняется.

Оценено значение МСК костного мозга в регуляции гемопоэзиндуцирующего микроокружения, проявляющееся в межмембранном связывании с гемопоэтическими предшественниками и способности к секреции важных гемопоэтических ростовых факторов. Впервые показано, что в условиях пониженного содержания кислорода культивируемые МСК костного мозга человека способны к поддержанию гемопоэза, что выражается в активации образования очагов кроветворения. Впервые установлено, что при совместном культивировании МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода повышается доля клеток, экспрессирующих VCAM-1 и активируется продукция интерлейкинов (IL-6, IL-8).

Полученные экспериментальные данные расширяют существующие представления о функционировании системы «МСК-ГСК» в нормоксических условиях и при пониженном содержании кислорода.

Научно-практическая значимость работы. Представленные результаты являются важным шагом на пути к пониманию механизмов регуляции гемопоэза при пониженном содержании кислорода in vitro. Предложенная и успешно апробированная экспериментальная модель для изучения процессов экспансии и дифференцировки гемопоэтических предшественников дает возможность не только рассмотреть основные функциональные закономерности кроветворения, но и оценить вклад мезенхимальных стволовых клеток в формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать использование совместно культивируемых МСК и ГСК при пониженном содержании кислорода, а именно при 5% Ог, как наиболее приближенную к естественным условиям экспериментальную модель гемопоэза.

Положения, выносимые на защиту:

1. В условиях пониженного содержания кислорода функциональная активность культивируемых мезенхимальных стволовых клеток, выражающаяся в изменении скорости роста, способности к дифференцировке и продукции цитокинов, модифицировалась, при этом их основные морфологические и фенотипические особенности сохранялись.

2. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека способны in vitro к созданию кроветворного микроокружения и поддержанию гемопоэза путем прямых межклеточных контактов с кроветворными элементами и посредством продукции гемопоэтических ростовых факторов.

3. При совместном культивировании мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека при 5% содержании кислорода происходит стимуляция гемопоэза, которая проявляется в увеличении числа кроветворных островков.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на V, VI и VII Конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2006-2008); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); XII Симпозиуме студентов биологов Европы «SymBioSE'2008» (Коимбра-Авейро, Португалия, 2008); V Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008); XXII Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008).

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 08.12.2009 г.

Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке программы ОБН РАН и гос. контракта Роснауки № 02.552.11.2006.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 151 страницах, иллюстрирован 28 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 334 цитируемых источников, из которых 32 на русском и 302 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись культуры МСК костного мозга человека, любезно предоставленные научно-практической лабораторией стволовых клеток Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий и ГСК пуповинной крови, которые были любезно предоставлены Банком стволовых клеток «КриоЦентр» (г. Москва). Культуры эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ) были любезно предоставлены лабораторией роста клеток и тканей ИТЭБ РАН (г. Пущино).

Культивирование клеток. В качестве среды культивирования использовали среду Игла в модификации Дальбекко с содержанием глюкозы 1г/л (Биолот, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone США), 1 тМ пирувата натрия, 2 тМ L-глутамина, 25 мМ HEPES (Gibco, США), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Биолот, Россия). При достижении популяцией клеток субконфлуенгной плотности проводили пересев клеток. При этом использовали солевой раствор Хенкса и раствор 0,05% трипсина/0,02% ЭДТА (Gibco, США). Плотность посева клеток составляла 5-10 тыс. кл/см2. Замену среды проводили каждые 3-4 дня. Культивирование в стандартных (нормоксических) условиях проводили при 37°С, 20% 02, 5% С02 в ССЬ-инкубаторе (Sanyo, Япония).

Культивирование клеток при пониженном содержании кислорода. Для изучения свойств и характеристик исследуемых клеточных культур в условиях пониженного содержания кислорода (5% 02, 5% С02, 90% N2 и 1% 02, 5% С02, 94% N2) в работе использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония) или специальную герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада). Камеру продували газовой смесью (94% N2 или 90% N2, 5% С02) (АКЕЛА-Н, Россия) и помещали в термостат (37°С). Содержание кислорода и давление в газовой среде камеры контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков.

Пролиферативиую активность МСК оценивали путем подсчета клеток в нескольких случайно выбранных фиксированных полях зрения с помощью микрофотографий, выполненных с использованием фазово-контрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия), оборудованного цифровой видеокамерой (Axio HRm, Zeiss, Германия). Анализ изображения осуществляли с помощью программного обеспечения Sigma Scan Pro 5 (Sigma, США). В каждом флаконе (NUNC, Дания) с культурами клеток анализировали не менее десяти полей зрения.

Иммунофенотип, жизнеспособность и экспрессию HIF-la МСК анализировали с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson, США или Epics XL, Beckman Coulter, США) с применением флуорохромных конъюгатов моноклональных антител к следующим поверхностным маркерам: CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD54, CD71, CD73, CD90, CD105, CD106, CD146, CD117, HLA-ABC (BD, США и Beckman Coulter, Франция), наборов для определения апоптотических и некротических клеток ANNEXIN V-FITC (Immunotech, Франция) и моноклональных антител против HIF-la (Н1-alpha-67, Abeam, Великобритания), при этом в качестве вторичных антител использовали соответствующие антивидовые антитела IgG, меченые FITC, (Jackson Immunoresearch, США), позитивным контролем служили моноклональные антитела против виментина (Dako Cytomation, Дания), в негативном контроле - первичные антитела не вносили. Уровни неспецифического связывания контролировали по соответствующим изотипическим контролям.

Оценка дифференцировочного потенциала МСК. Для подтверждения возможности дифференцировки, демонстрирующей остеогенный потенциал МСК, клетки инкубировали в среде роста, содержащей 1 пМ дексаметазона (Sigma, США), 10 тМ Р-

глицерол-2-фосфата, 0,2 мМ 2-фосфо-Ь-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия) (Jaiswal et al., 1997). Способность к дифференцировке МСК в остеогенном направлении оценивали гистохимически по активности щелочной фосфатазы (Alkaline phosphatase 86C-lkit, Sigma, CIIIA) и по степени минерализации внеклеточного матрикса Гистохимическое окрашивание Са2+ внеклеточного матрикса проводили Ализариновым красным S (40 mM, pH 4,2), (Sigma, США) (Пирс, 1962). Для анализа способности МСК к адипогенной дифференцировке монослойные культуры клеток культивировали в среде, содержащей 1 цМ дексаметазона, 10 цМ инсулина (Sigma, США), 200 цМ индометацина, 0,5 mM 3-изобутил-1-метилксантина (Fluka, Германия) (Janderova et al., 2003). Адипогенную дифференцировку оценивали визуально по образованию липидных капель во внутриклеточном пространстве, которые окрашивали с помощью специфического красителя - 0,36% масляный красный О в изопропаноле (Sigma, США). Для выявления способности МСК образовывать капилляроподобные структуры суспензию МСК, инкубировали в матригеле (ECMatrix™, CHEMICON®, США). Визуальный анализ и фотографирование клеток проводили с помощью микроскопа, оборудованного цифровой фотокамерой (Leica DMIL, Германия).

Для количественного анализа продукции цитокинов исследуемыми культурами клеток использовали образцы сред культивирования. Измерения титра цитокинов в образцах сред культивирования проводили с помощью стандартного иммуно ферментного (BioSource Int. Inc., Бельгия) и флуориметрического иммуноферментного анализа (FlowCytomix human Thl/Th2 1 lplex; chemokines 6plex; adhesion 6plex, Bender MedSystems Inc., Австрия) в соответствии с инструкциями фирм-производителей. В качестве контролей использовали идентичные культуральные среды с равным содержанием сыворотки.

Сокультивирование мезенхимальных клеток-предшественников и ГСК. Перед инициализацией культур, клетки пуповинной крови размораживали на водяной бане при температуре +37°С и отмывали от криопротектора в физиологическом растворе с добавлением 2,5% человеческого сывороточного альбумина (Baxter, Швейцария) и 10% реополиглюкина. После осаждения центрифугированием ядерные клетки ресуспендировали в среде культивирования и доводили их концентрацию до 106 кл/мл. МСК и ЭФЧ культивировали до достижения монослоя, суспензии ГСК вносили при замене среды. Замену среды проводили через 3-4 дня, среду с неадгезированными ГСК центрифугировали с ускорением 200g 10 минут, супернатант сливали, суспензию ГСК и свежую питательную среду переливали в культуральный флакон. Формирование гемопоэтических островков - очагов взаимодействия клеток и ГСК выявляли визуально -клетки отмывали ФБД (Gibco, США), фиксировали 4% параформальдегидом (Sigma, США) и окрашивали нейтральным красным (Sigma, США).

Выявление колониеобразующих единиц. Для постановки стандартного теста на колониеобразование клетки пуповинной крови, предварительно «¡культивированные с МСК, инкубировали в течение 14 суток в коммерческой полужидкой среде на основе метилцеллюлозы с добавлением необходимых факторов роста (MethoCult, Stem Cell Technologies Inc., CIIIA) (McNiece et al., 2004). Клетки окрашивали метиленовым синим по Май-Грюнвальду (ПО TOC, Россия). Контролем служили клетки пуповинной крови, культивированные в отсутствие МСК.

Статистическая обработка данных. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета математического анализа MS Excel. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Межгрупповые отличия считали достоверными при р<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика культивируемых мезенхнмальных стволовых клеток костного мозга человека.

Для исследуемых клеток, полученных от различных доноров, были свойственны основные морфометрические характеристики и особенности роста МСК в культуре, отмечаемые во многих исследованиях (Caplan, 1991; Pittenger et al., 1999; Prockop et al., 2001). Выделенные из суспензии аспиратов костного мозга и адгезированные клетки формировали дискретные колонии клеток с фибробластоподобной и тригональной формой. Монослойные популяции МСК равномерно покрывающие поверхность флакона в процессе роста культуры были представлены преимущественно фибробластоподобными клетками. Время культивирования от момента пассирования клеток с обычной плотностью (5000 кл/см2) до достижения культурой стадии монослоя составляло в среднем 7-10 суток. В культурах второго пассажа клетки обладали различной морфологией: крупные полигональные с отростками и мелкие веретеновидные, размеры таких клеток варьировали от 10-20 мкм до 40-50 мкм (рис. 1).

Культивируемые МСК демонстрировали высокий потенциал к экспансии на протяжении многих пассажей (до 15), при этом характер роста МСК зависел от плотности посева, что крайне важно учитывать при работе с данным типом клеток. Отмечено, что для монослойных культур МСК было свойственно контактное торможение.

Известно, что МСК экспрессируют на своей мембране многочисленные кластеры дифференцировки (CD), вовлеченные в различные процессы жизнедеятельности клеток. Однако на сегодняшний день не выявлен специфический маркер или набор маркеров, позволяющий четко идентифицировать популяцию МСК, поэтому в нашей работе иммунофенотип клеток определялся достаточно широким набором маркеров. Анализ профиля поверхностных антигенов исследуемых МСК выявил присутствие маркеров, характерных для данного типа клеток (Тепляшин и др., 2005; Паюшина и др., 2006; Pittenger et al., 1999; Majumdar et al., 2003; Dominici et al., 2006) таких как CD13, CD29, CD44, CD73, CD71, CD90, CD105, CD146, HLA-I, которые демонстрировали постоянство на протяжении многих пассажей, за исключением, лабильно экспрессируемых на различных пассажах, молекул межклеточной адгезии - ICAM-1 (CD54) и VCAM-1 (CD106). При этом изучаемые клетки характеризовались отсутствием таких маркеров гемопоэтических предшественников, как CD34, CD38, CD45, CD117.

1 Г-1!

л б в \ 1 •

/ ■ 1

.V. V

■ ' ' -л / ; 1 /

г " \ ч . хЮО хЮО : / / хЮО

Рисунок 1. Морфология культивируемых МСК костного мозга человека. А - популяция МСК после выделения. Б - монослойная культура первого пассажа. В - популяция МСК второго пассажа. Фазовый контраст, увеличение хЮО.

а N х400 1 б , г-'.; -:. ■ - ■ • ■ ' г' г. - - *" - . " ^ ' ^ .хЮО в хЮО

г х400 д Те 1 » - ■ ■ ■ хЮО

Рисунок 2. Дифференцировочный потенциал МСК костного мозга человека. А, Б, В - Культивирование МСК в среде роста без дифференцировочных стимулов. Г - активность щелочной фосфатазы в культуре МСК при индуцированной остеогенной дифференцировке (14 сут). Д- образование внеклеточного Са2+ матрикса в культуре МСК при индуцированной остеогенной дифференцировке (21 сут). Окрашивание ализариновым красным Б. Е - накопление липидных капель в культуре МСК при индуцированной адипогенной дифференцировке (21 сут). Окрашивание масляным красным О.

После 14 дней инкубации МСК в среде без индукторов и в среде с остеогенными стимулами часть клеток положительно окрашивалась на щелочную фосфатазу - ранний маркерный фермент остеобластов (рис. 2, А, Г). Количество клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу в культуре МСК, инкубируемых в среде со стимулами, преобладало по сравнению с не индуцированными. Для выявления признаков более поздних стадий остеогенеза (образование и минерализация внеклеточного матрикса) клетки культивировали в обычной среде и с индукторами в течение 3 недель. МСК в ответ на остеогенные стимулы синтезировали межклеточное вещество, которое выявляли гистохимически с помощью ализаринового красного как соли кальция, тогда как МСК, культивируемые без индукторов не кальцифировали матрикс (рис. 2, Б, Д).

При индукции в адипогенном направлении в монослойных культурах МСК приобретали округлую форму, в цитоплазме клеток уже на 3 сутки происходило накопление липидных включений, которые сначала имели небольшой размер, а затем сливались, формируя крупные капли. Включения при окрашивании липофильным красителем приобретали оранжево-красный оттенок (рис. 2, Е). МСК, культивированные в среде без стимулов, не проявляли признаков адипогенеза (рис.2, В).

Скрининг продукции цитокинов МСК в среде культивирования показал, что исследуемые клетки являлись продуцентами целого комплекса медиаторов иммуномодуляции и межклеточного взаимодействия, таких как П.-1-Р, 1Ь-2, 1Ь-4, 11.-5, 1Ь-6, ГЬ-8, ПТМ-у, ЮТ-а, ЮТ-Р, УЕОБ, бУСАМ-1, МСР-1. В кондиционированной среде МСК разных пассажей не регистрировали: НЛО, 1Ь-12р70, з1САМ-1 (СБ54), эГСАМ-З (С050), Р-эексйп (С062), Е-вексйп (СБ62Е), ЕРО, вМ-СБР.

Таким образом, культивируемые МСК костного мозга человека, которые использовались в нашей работе, характеризовались адгезией к поверхности культурального субстрата, гетерогенной на стадии роста морфологией, проявляющейся в приобретении клетками веретеновидной фибробластоподобной, полигональной с множеством отростков формой. При пассировании МСК в течение нескольких пассажей отмечалась высокая способность данного типа клеток к экспансии, при этом кинетика роста клеток в культуре зависела от плотности посадки. Список положительных маркеров, экспрессирующихся на поверхности клеток, который определяли с помощью проточной цитофлюориметрии, включал как маркеры, используемые для идентификации МСК, так и антигены свойственные другим типам клеток, при этом присутствие гемопоэтических маркеров на поверхности МСК не отмечалось. Уникальные мультипотентные особенности МСК подтвердились при направленной (стимулируемой специфическими индукторами, добавленными в среду культивирования) дифференцировке в остеогенном, адипогенном направлениях. Кроме того, установлено, что МСК продуцируют широкий набор цитокинов и факторов роста.

Сравнительная характеристика МСК, культивируемых в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода.

Для анализа и корректной оценки роли культивируемых МСК в создании гемопоэзиндуцирующего микроокружения в условиях приближенных in vivo, т.е. при содержании кислорода соответствующему в костном мозге, проводили сравнительный анализ структурно-функциональных параметров исследуемых клеток в нормоксических условиях и при пониженном содержании кислорода. Важной особенностью проведенных исследований являлось наличие дополнительного параметра - «жесткого» гипоксического воздействия на клетки, а именно, культивирование при 1% О2.

В результате было показано, что изменения кинетики роста МСК при пониженном содержании кислорода носили разнонаправленный характер. Так, на определенных этапах культивирования (96 ч) при понижении кислорода до 5% О2 в среде отмечали стимулирующий эффект, тогда как при 1% О2 пролиферация МСК на всех этапах культивирования существенно угнеталась по сравнению с нормоксией, однако морфология клеток при этом не менялась (рис. 3). Полученные нами результаты подтверждают данные других исследователей, демонстрирующие возможность стимуляции пролиферации недифференцированных клеток в условиях пониженного содержания кислорода (Анохина, 2007; Lennon et al., 2001; Ren et al., 2006; Bosch et al., 2006; Grayson et al., 2006). Полагают, что при 1% Oj, признанным предельным в физиологической гипоксии, уже возникают патологические изменения некоторых клеточных процессов (Villaurel et al., 2008).

600

о 0 500

i 400

в t u а 300

ff 200

§ •х в а 100

г-ЗН *

F§=

□ 20% и 5%

□ 1%

72 ч

Экспозиции, часы

Рисунок 3. Прирост числа клеток при культивировании в нормоксии и при пониженном содержании кислорода (М±80, р<0,01 - достоверные различия по сравнению с 20% О2).

Количественная оценка доли апоптотических и некротических клеток при анализе жизнеспособности МСК, культивируемых в нормоксических условиях и при пониженном содержании кислорода показала, что, несмотря на изменения скорости роста клеток, пониженное содержание О2 не оказывало существенного влияния на их жизнеспособность (табл. 1). Морфология клеток в полученных культурах не различалась.

Таблица 1. Жизнеспособность МСК при культивировании в нормоксии и при _пониженном содержании кислорода в течение 7 суток._

Содержание кислорода, % Annexin V\ % клеток Р1+, % клеток

20% 02 6,8±1,4 9,2±4,6

5% 02 4,9±3,3 8,1±4,4

1% 02 5,8±4,4 10,1±5,1

Доля апоптотических клеток - ANN V+, доля некротических клеток - РГ в % от общего количества клеток (M±SD).

Результаты проведенных экспериментов, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что МСК, культивируемые в течение суток при 5% О2, сохраняли стабильность экспрессии поверхностных антигенов. Длительное культивирование (14 сут) МСК при 5 и 20% 02 существенных изменений в экспрессии основных маркеров также не оказало, за исключением молекул адгезии - 1САМ-1 (СЭ54) и УСАМ-1 (СИ 106).

Таблица 2. Экспрессия поверхностных маркеров МСК, культивируемых при 5 и 20% Ог __в течение 1 и 14 суток._

CD, % 1 сут 14 сут

20% Oi 5% 02 20% 02 5% 02

CD13 (ANPEP) 95,87±0,26 96,08±0,45 96,16±2,69 96,09±2,06

CD29 (fH-integrin) 98,24±1,71 98,32±1,66 96,09±2,12 90,44±5,13

CD44 (НСАМ) 98,27±1,74 98,43±1,37 95,84±2,83 90,85±8,34

CD54 (ICAM-I) 51,73±12,07 54,67±10,44 54,14±22,37 38,83±13,25

CD73 (NT5E) 95,6±4,37 96,59±3,56 95,28±3,07 79,02±12,42

CD90 (Thy-1) 98,23±1,44 98,13±1,84 88,02±10,27 75,37±22,51

CD106 (VCAM-I) 29,12± 15,61 24,24±13,16 68,99±13,36 48,37±3,03

CD146 (MCAM) 20,9±5,35 21,61±4,95 27,02±14,88 15,37±7,93

HLA-I (MHC-I) 90,19±9,73 95,18±4,3 95,7±4,11 96,7±4,03

(М± SD).

Известно, что данные молекулы адгезии являются весьма вариабельными маркерами. Так, при воздействии на эндотелиальные клетки пупочной вены (HUVEC) гипероксических газовых смесей (40, 95% О2) in vitro экспрессия поверхностных ICAM-I и VCAM-1 и на уровне тРНК повышалась (Willam et al., 1999). Экспрессия VCAM-1 на мембране клеток многократно снижалась при остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке МСК (Liu et al., 2008). Наши исследования показали, что при снижении уровня кислорода в среде доля клеток, экспрессирующих VCAM-1 и продукция в растворимой форме (sVCAM-1) уменьшалась (табл. 3). По-видимому,

реакция клетки на гипоксию проявлялась на уровне экспрессии отдельных достаточно лабильных молекул адгезии, не затрагивая при этом основной иммунофенотип клетки.

Таблица 3. Влияние пониженного содержания кислорода на экспрессию и синтез _ УСАМ-1 (СРЮб). _

Содержание кислорода, % VCAM-1, % клеток sVCAM-1, пг/мл

20% 02 40,8±9,5 2,1±0,2

5% 02 29±9,9 1,7±0,2

1% 02 23±9,9 1,3±0,1*

(M±SD, р<0,01 - достоверные различия по сравнению с 20% О2).

Комплекс межклеточных, клеточно-матриксных взаимодействий, регулируемых многочисленными гуморальными факторами и сигнальными молекулами, может модифицироваться при воздействии различных эндогенных факторов. Поэтому на следующем этапе работы было исследовано влияние пониженного содержания кислорода на продукцию цитокинов культивируемых МСК. При сопоставлении результатов анализа ряда цитокинов (1Ь-1 р, 11,-2, 1Ь-4, 1Ь-5, ЮТ-а, ЮТ-р, 1Ш-у) в кондиционированных средах монослойных культур МСК, экспонированных в нормоксии и при пониженном содержании кислорода, существенных различий не установлено, за исключением, увеличения уровня 1Ь-б, 1Ь-8, УЕСБ, МСР-1 при 5% (табл. 4). Индукцию ангиогенных цитокинов и хемокинов, в основном, связывают с позитивной регуляцией транскрипционными факторами, которые активируются в гипоксических условиях (Рогоо^ап й а!., 2007;). Аутокринная и паракринная регуляция прогениторных стромальных клеток в условиях пониженного содержания кислорода, в отличие других морфофункциональных особенностей клеток, изучена в наименьшей степени и требует дальнейших исследований.

Таблица 4. Продукция цитокинов МСК после 14 суток культивирования _при различном содержании кислорода._

Цитокины, пг/мл 20% 02 5% 02

IL-6 296,45±45,73 335,28±43,88

IL-8 64,79±0,67 216,92±1,96

VEGF 745±6,87 8б1±10,09

МСР-1 3893,75±300,99 4346,71±170,15

(M±SD).

Одним из наиболее важных транскрипционных факторов, вовлеченных в реализацию эффектов гипоксического воздействия, является гипоксия-индуцируемый фактор HIF-la (Hypoxia Inducible Factor). В ряде исследований было показано, что среди генов-мишеней, зависимых от индукции HIF-la, есть гены, ответственные не только за поддержание клеточного гомеостаза, но и регулирующие клеточную пролиферацию, активирующие синтез цитокинов и ростовых факторов, проапоптотических белков (Wang, Semenza, 1993; Semenza, 2000; Stroka et al., 2001; Cangul, 2004). Примененный нами подход позволил определить, что культивирование клеток при пониженном содержании кислорода приводит к снижению HIF-1 а в цитоплазме клеток (рис. 4).

Рисунок 4. Доля клеток, с выявляемым транскрипционным фактором ЮТ-1а в цитоплазме МСК, культивируемых при различном содержании кислорода в течение 24 ч (А) и 7 суток (Б).

20% 02 5% 02 1%02

А V Б ,100 в хШ -

20% 02 5% 02 1%02

г Ъ-Яш+Л "Ч . х400 д. ? х400 Е * х400

Рисунок 5. Способность МСК, культивируемых в среде с дифференцировочными стимулами в нормоксии и при пониженном содержании кислорода, к образованию внеклеточного минерализованного матрикса (А, Б, В) и к накоплению липидных капель во внутриклеточном пространстве (Г, Д, Е). Окрашивание ализариновым красным в и масляным красным О.

По-видимому, при гипоксии избегая убиквитин-протеосомальной деградации, HIF-la транслоцируется в ядро и, взаимодействуя с родственной р-субъединицей, способен индуцировать работу зависимых генов-мишеней. Продемонстрированные в наших исследованиях через 24 часа различия в экспрессии HIF-la в нормоксических и гипоксических культурах МСК (рис.4, А) подтверждают, что HIF-la является одним из ранних регуляторов клеточного системного ответа. Некоторые исследователи не исключают, что дифференцировочные процессы некоммитированных клеток в условиях пониженного содержания кислорода регулируются за счет модуляции HIF-la (D'Ippolito et al., 2006).

В наших исследованиях признаки, свидетельствующие о реализации дифференцировочных потенций МСК, в существенной степени варьировали в зависимости от концентрации кислорода. Если в среде, содержащей 5% Ог, наблюдалось понижение способности МСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель по сравнению с таковыми при 20% Ог, то в условиях 1% СЬ МСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли успешно дифференцироваться в адипоцитарном направлении, что, вероятно, свидетельствует о невозможности завершить фенотипическую трансформацию в условиях «жесткой» гипоксии (рис. 5). На культурах МСК и остеобластов человека было показано, что в гипоксических условиях (0,2-2% СЬ) происходит снижение экспрессии ключевого для остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора - Runx2. Как следствие этого продемонстрировано снижение образования нодул и минерализованных участков в культуре исследуемых клеток (Salim et al., 2004). Культивирование МСК из костного мозга крыс в среде с остеогенными стимулами при 5% Ог приводило к снижению активности щелочной фосфатазы - раннего маркера остеогенеза (Буравкова и др., 2008).

Потенциал МСК не ограничивается только дифференцировкой по ортодоксальным направлениям (Prockop et al., 2003; Hermann et al., 2004; Wislet-Gendebien et al., 2005). Наши исследования, по выявлению возможности клеток образовывать капилляроподобные структуры, показали, что МСК, инкубируемые в течение 6-8 ч в матригеле с факторами роста как при 5% Ог, так и при 20 % 02, способны к организации сетевидаых трехмерных структур (рис. 6). ЭФЧ такой способностью не обладали.

Рисунок 6. Способность к образованию капилляроподобных структур МСК, инкубируемых при 20% (А) и 5% Ог (Б), и ЭФЧ (В).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода, функциональная активность (пролиферация, дифференцировочный потенциал и способность к синтезу ростовых факторов) МСК модифицировалась, при этом морфологические особенности, основные фенотипические показатели и жизнеспособность клеток сохранялись.

Совместное культивирование мезенхимальиых клеток-предшественников и ГСК пуповинной крови в нормоскии и при пониженном содержании кислорода.

Проведенные нами исследования позволили установить, что культивируемые МСК способны поддерживать рост и развитие ранних предшественников гемопоэза, выражающееся активной адгезией двух типов клеток. Через 3-4 суток после совместного культивирования ГСК и МСК наблюдалось прикрепление ГСК к поверхности МСК и образование, так называемых, «зон булыжной мостовой» - скопления незрелых клеток-предшественников гемопоэза, которых при 5% Ог отмечено больше, по сравнению с нормоксией (рис. 7). После прочной адгезии и активного взаимодействия двух типов клеток и в нормоксических, и гипоксический культурах (5% Ог) отмечали созревание кроветворных клеток, происходившее в гемопоэтических островках - структурно-функциональных единицах кроветворной ткани (рис.7, В, Г).

20% 02

Рисунок 7. Совместное культивирование МСК и ГСК в течение 7 суток в нормоксических условиях (20% 02) (А, Б, В) и при 5% СЬ (Г, Д, Е). Стрелками указаны гемопоэтические островки (В, Г) и «зоны булыжной мостовой» (Е). Окрашивание нейтральным красным.

Дискретно расположенные по поверхности монослоя МСК островки были хорошо видимы макроскопически в виде узелков. Подсчет гемопоэтических островков показал, что после культивирования в течение 7 и 14 суток при 5% содержании кислорода образовывалось достоверно большее количество очагов кроветворения по сравнению с 20% 02 (рис.8).

Рисунок 8.

Количество гемопоэтических островков при совместном культивиров ании МСК и ГСК в течение 7 и 14 суток при 5 и 20% 02 (р<0,01*; р<0,05*-достоверные различия по сравнению с 20% Ог).

Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками стромы, составляющими основу гемопоэзиндуцирующего микроокружения (Старостин, 1988; Тгепйп, 1976). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками ГИМ при участии молекул клеточной адгезии. Клетки ГИМ обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с гемопоэтическими клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку ГСК. В связи, с чем исследование иммунофенотипа и синтеза гуморальных факторов МСК при тесном взаимодействии с ГСК в условиях пониженного содержания кислорода представлял особый интерес. Выявленная в наших исследованиях консервативность иммунофенотипа МСК, за исключением отдельных адгезивных молекул, в частности, УСАМ-1, при совместном культивировании с ГСК в условиях пониженного содержания кислорода (табл. 5), может свидетельствовать об активации межмембранных ассоциативных связей между кроветворными и стромальными клетками. Так, нами установлено, что при совместном культивировании МСК и ГСК происходило увеличение доли клеток, положительных по УСАМ-1, как при 5% Ог, так и в нормоксических условиях по отношению к несокультивированным МСК, но при этом, при сравнении нормоксических и гипоксических популяций МСК сокультивированных с ГСК установлено, что при 5% О? доля положительных по УСАМ-1 клеток снижалась по сравнению с нормоксией.

Таблица 5. Иммунофенотип МСК после 14-суточного сокультивирования с ГСК в _нормоксии и при пониженном содержании кислорода (5% 02)._

CD, % MCK MCK + ГСК

20% 02 5% 02 20% 02 5% 02

CD13 (ANPEP) 95,87±0,26 96,08±0,45 93,31±6,06 93,82±5,2

CD29 (pl-integrin) 98,24±1,71 98,32±1,66 96,07±0,92 91,61±0,28

CD44 (HCAM) 98,27±1,74 98,43±1,37 96,7±0,01 96,64±2,02

CD54 (ICAM-I) 51,73±12,07 54,67±10,44 33,42±12,88 41,23±12,32

CD73 (NT5E) 95,6±4,37 96,59±3,56 94,73±3,4 94,84±3,69

CD90 (Thy-1) 98,23±1,44 98,13±1,84 56,6±40,88 58,56±38,24

CD 106 (VCAM-I) 29,12±15,61 24,24±13,16 46,39±30,63 34,71±18,18

(M±SD).

Интересно отметить, что при анализе VCAM-1 в растворимой форме (sVCAM-1) в кондиционированных средах МСК, сокультивированных с ГСК в нормоксии и гипоксии, было обнаружено повышение в 1,5-2 раза концентрации исследуемого маркера по сравнению с образцами сред не сокультивированных МСК. Кроме того, наши исследования показали, что при пониженном содержании кислорода происходило уменьшение концентрации sVCAM-1 в среде культивирования (рис. 9). По-видимому, такое комбинированное диффузное и локальное действие группы молекул адгезии служит важным механизмом регуляции межклеточных взаимодействий. В настоящее время установлено, что молекулы межклеточной адгезии, также как и рецепторы растворимых химических сигналов генерируют внутриклеточные сигналы, изменяющие клеточное поведение и межмембранные взаимодействия. В то же время, в отличие от внеклеточного домена специфических мембранных рецепторов, связывающих свои лиганды с высокой аффинностью, молекулы адгезии кооперируются с клеточной поверхностью и внеклеточным матриксом с относительно низкой аффинностью (Пальцев, Иванов, 1995). Вероятно, усиление взаимодействия, осуществляемого молекулами клеточной адгезии, достигается за счет одновременного связывания множества рецепторов с множеством лигандов на поверхности соседней клетки или в прилегающем матриксе, а также за счет стабилизации растворимых рецепторов, что, возможно обеспечивает многоточечное прикрепление (рис. 10).

Адгезия клеток к различным компонентам внеклеточного матрикса так же, как межклеточная адгезия, сопровождается индукцией синтеза различных цитокинов и факторов роста (Пальцев, Иванов, 1995; Majumdar et al., 1998). Кроме того, важнейшую роль для жизнедеятельности ГСК играют гемопоэтины, которые клеточные элементы ГИМ способны вовлекать в ауторегуляцию (Rameshwar, Gascon, 1995; Gascon et al., 2006).

с мск □ мск+гск

Рисунок 9. Концентрация эУСАМ-1 в среде при

различном содержании кислорода после 7 суток культивирования.

Содержание кислорода

20% 02

5% 02

ш*.. %

*л ш* ^

х400\

Рисунок 10. Адгезия двух типов клеток (МСК и ГСК) при совместном культивировании в течение 7 суток при 20 (А, Б) и 5 % 02 (В, Г). Окрашивание нейтральным красным.

В1Ъ-6 ■ 1Ь8

Рисунок 11. Концентрация ТЬ-6 и 1Ь-8 в среде МСК в нормоксии и при 5% 02 и при сокультивировании с ГСК. 1-7 суток, 20% 02; 2-7 суток, 5% 02; 3 - 14 суток, 20% 02; 4-14 суток, 5% 02; 5-7 суток, сокультивирование, 20% 02; 6-7 суток, сокультивирование, 5% 02; 7- 14 суток, сокультивирование, 20% 02; 8-14 суток, сокультивирование, 5% 02.

В связи с этим, мы предприняли исследование продукции цитокинов МСК при совместном культивировании с ГСК в различных условиях. В результате проведенных экспериментов было показано, что секреция МСК таких важных гемопоэтинов, как 1Ь-6 и 1Ь-8 возрастала в десятки раз в условиях совместного культивирования МСК и ГСК как в нормоксии, так и при пониженном содержании кислорода по сравнению с не сокультивированными культурами (рис. 11). Необходимо отметить, что при анализе кондиционированных сред ГСК установлено, что данные клетки не синтезировали исследуемые цитокины. Известно, что 1Ь-6 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов и эритроидных прекурсоров. В свою очередь, 1Ь-8 известен как основной активатор молекул межклеточной адгезии, усиливающий контакты нейтрофилов с эндотелиальными клетками. Указанные цитокины относятся к «ранним» гемопоэтинам, которые самостоятельно, либо в сочетании с другими факторами участвуют в стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки ранних кроветворных предшественников, либо индуцируют ГСК, находящиеся в фазе во к делению (Гольдберг, 1999). Возможно, что именно синхронная выработка цитокинов клетками костного мозга способствует успешному поддержанию и дифференцировке ГСК в культуре. В основе указанных реакций во всех случаях лежат повышение секреции стимуляторов кроветворения, при этом секреторная активность в условиях пониженного содержания кислорода была интенсивнее, чем в нормоксии. Становится понятным, что стимуляция кроветворных клеток-предшественников зависит не столько от количества клеток микроокружения, сколько от их функционального состояния, которое, в свою очередь, может модулироваться и варьировать в широких пределах.

Функциональная активность МСК в отношении поддержания роста и дифференцировки гемопоэтических предшественников подтвердилась в тестах на колониеобразование. При инкубировании в течение 14 суток в специфических полужидких средах после сокультивирования ГСК проявили способность к интенсивному формированию колониеобразующих единиц (КОЕ), которая свидетельствует о начальных этапах дифференцировки гемопоэтических предшественников. ГСК, не сокультивированные с МСК, не формировали КОЕ (рис. 12).

Для оценки способности терминально-дифференцированных клеток мезенхимного происхождения поддерживать рост и развитие гемопоэтических предшественников проводили сокультивирование ГСК с ЭФЧ. В экспериментах по сокультивированию ГСК и ЭФЧ в нормоксии и при 5% Ог не было выявлено тесного межклеточного контакта между двумя типами клеток. К монослойным культурам ЭФЧ прикреплялось небольшое количество ГСК, но при этом гемопоэтические островки не формировались (рис.13).

Рисунок 12. Формирование колоний ГСК в полужидкой среде совместно культивированных с МСК (А, В) и не культивированных с МСК (Б, Г) в течение 14 суток при 5 и 20% СЬ. Окрашивание эозином метиленовым синим по Май-Грюнвальду.

20% 02 А хЮО Б я х400

5% 02 ШШШтшШЪ ¡Ш | Г ♦ * х400

Рисунок 13. Совместное культивирование ЭФЧ и ГСК при 20 (А, Б) и 5 % От (В, Г) в течение 14 суток. Окрашивание нейтральным красным.

Таким образом, нами установлено, что рост и развитие ГСК в культуре могут быть оптимизированы за счет взаимодействия с гемопоэзиндуцирующей нишей, представленной функционально активными в этом отношении МСК костного мозга. Непосредственный контакт двух типов клеток, реализуемый посредством формирования гемопоэтических островков может существенно модифицироваться (стимулироваться) в условиях пониженного содержания кислорода (5% Ог).

ВЫВОДЫ

1. При культивировании МСК костного мозга человека в условиях пониженного содержания кислорода (5% Ог), пролиферация клеток возрастает по сравнению с нормоксией. При 1% 02 скорость роста клеток в культуре снижается.

2. В условиях пониженного содержания кислорода МСК на всех этапах субкультивирования не экспрессируют антигены клеток гематогенного происхождения (CD34, CD38, CD45, CD117) и сохраняют экспрессию основных поверхностных маркеров (CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, HLA-1). При снижении уровня кислорода в среде, доля VCAM-I-положителышх клеток уменьшается.

3. Разработана и апробирована экспериментальная модель совместного культивирования МСК и ГСК человека в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода.

4. Культивируемые МСК способны поддерживать рост и развитие предшественников гемопоэза (ГСК), выражающиеся в активной адгезии двух типов клеток, формировании очагов кроветворения и последующем созревании ГСК. Сокультивирование при 5% Ог приводит к достоверному увеличению количества гемопоэтических островков по сравнению с нормоксией.

5. Показано увеличение доли клеток, положительных по VCAM-1, и увеличение продукции IL-6 и IL-8 при сокультивировании МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода, по отношению к несокультивированным МСК.

6. В отличие от несокультивированных ГСК, кроветворные предшественники после сокультивирования с МСК при 5 и 20% О2 способны к интенсивному формированию колониеобразующих единиц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение влияния гипоксии на культивируемые мезенхимальные стволовые клетки человека. / Жамбалова А.П., Гринаковская О.С. // V конференция молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики: Тезисы докладов. - Москва, 2006. - С. 17.

2. Пролиферация, жизнеспособность и фенотип мезенхимальных клеток-предшественников при гипоксии. / Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б., Жамбалова А.П., Гринаковская О.С. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре»: Тезисы докладов и сообщений. - Санкт-Петербург, 2006. - Цитология. - Т.48. -№9.-С. 748.

3. Влияние гипоксии на пролиферацию мезенхимальных клеток-предшественников человека, выделенных из липоаспирата. / Гринаковская О.С., Жамбалова А.П. //

VI конференция молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики: Тезисы докладов. - Москва, 2007. - С. 19.

4. Сравнительная характеристика морфункциональных и иммуннофенотипических особенностей стромальных клеток-предшественников костного мозга человека, культивируемых в нормоксии и условиях пониженного содержания кислорода. / Жамбалова А.П., Константинова Н.А., Гринаковская О.С. // Всероссийская конференция молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи»: Тезисы докладов. - Улан-Удэ, 2007. - С. 359.

5. Мезенхимальные клетки-предшественники, культивируемые при гипоксии: фенотип и потенции к остеогенной дифференцировке. / Жамбалова А.П., Буравкова Л.Б. // Международная научно-практическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине»: Тезисы докладов. -Ростов-на-Дону, 2007. - С. 19.

6. Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных стволовых и гемопоэтических клеток человека в условиях гипоксии. / Жамбалова А.П. //

VII конференция молодых ученых и специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики и 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН: Тезисы докладов. - Москва, 2008,- С. 21-22.

7. Функциональная активность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода. / Жамбалова А.П., Буравкова Л.Б., Романов Ю.А. // Всероссийская школа-конференция «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения»: Тезисы докладов. - Москва, 2008.-С. 40.

8. Functional activity of human bone marrow mesenchymal stem cells under reduced oxygen tension. / Zhambalova A.P. // The 12th annual Symposium for Biology Students of Europe «SymBioSE'2008»: Тезисы докладов. - Коимбра-Авейро (Португалия), 2008.-Р.26.

9. Влияние пониженного содержания кислорода на гемопоэзиндуцирующие свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека in vitro. / Жамбалова А.П., Буравкова Л.Б., Романов Ю.А. // 5 Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция»: Тезисы докладов. - Москва, 2008. - Патогенез. - Т.6. - №3. - С. 60.

10. Interaction of different precursor cells under reduced oxygen tension. / Zhambalova A.P., Romanov Y.A., Buravkova L.B. //3rd Congress on Regenerative Biology and Medicine; 3rd Congress of the German Society for Stem Cell Research: Тезисы докладов. - Штутгарт (Германия), 2008. - P. 53.

11. Гемопоэзиндуцирующие свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, культивируемых в нормоксии и при пониженном содержании кислорода. / Жамбалова А.П., Буравкова Л.Б., Романов Ю.А. // 12 Международная школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века»: Тезисы докладов. -Пущино, 2008. -С. 129.

12. Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода. / Жамбалова А.П., Даревская А.Н., Кабаева Н.В., Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. - № 2. -С. 89-95.

13. Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro. / Жамбалова А.П., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б., Гальчук C.B., Романов Ю.А. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. -Том 4. -№3. - С. 47-51.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГСК - Гемопоэтические Стволовые Клетки ГИМ - Гемопоэзиндуцирующее Микроокружение КОЕ - Колониеобразующие Единицы МСК - Мезенхимальные стволовые Клетки СК — Стволовые Клетки ФБД- Фосфагно-солевой Буфер Дальбекко ЭФЧ - Эмбриональные Фибробласты Человека

CD - Cluster of Differentiation (Cluster of Designation) - Кластер

Дифференцировки

EPO - Erythropoietin - Эритропоэтин

FITC - Fluorescein Isothiocyanate - Флюоресцеинизотиоционат

ICAM-1 - Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 - Молекула Клеточной Адгезии

sICAM - soluble Inter-Cellular Adhesion Molecule - растворимая форма Молекулы

Клеточной Адгезии

IL - Interleukin - Интерлейкин

GM-CSF - Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor - Гранулоцитарно-

Макрофагальный Колониестимулирующий Фактор

HIF - Hypoxia-Inducible Factor - Гипоксия-индуцибельный фактор

IFN - Interferon - Интерферон

МСР-1 - Monocyte Chemoattractant (Chemotaxis) Protein-1 -

Моноцитарный Хемоаттрактантный Белок

TNF - Tumor Necrosis Factor - Фактор Некроза Опухолей

VCAM-1 - Vascular Cell Adhesion Molecule 1 - Молекула Клеточной Адгезии Сосудистого Эндотелия 1 типа

sVCAM-1 - soluble Vascular Cell Adhesion Molecule 1 - растворимая форма

Молекулы Клеточной Адгезии Сосудистого Эндотелия 1 типа

VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor - Фактор Роста Эндотелия Сосудов

Подписано в печать 08.02.2010 г.

Заказ № 3250 Тираж: 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жамбалова, Арюна Пурбодоржиевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Стволовые клетки человека

1.1. Типы стволовых клеток (источники, изучение и практическое применение).

1.2. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека

1.2.1. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

1.2.2. Особенности культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

1.3. Гемопоэтические стволовые клетки человека

1.3.1. Характеристика гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови человека.

1.3.2. Особенности культивирования гемопоэтических стволовых клеток.

2. Взаимодействие мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека

2.1. Стимуляция гемопоэза факторами, синтезируемыми мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга человека.

2.2. Молекулы адгезии и фенотип мезенхимальнх стволовых клеток при взаимодействии с гемопоэтическими стволовыми клетками.

2.3. Участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека в активации гемопоэза в условиях пониженного содержания кислорода.

3. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые прогениторные клетки

3.1. Эффекты гипоксии на мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека in vitro.

3.2. Возможные механизмы реализации действия пониженного содержания кислорода на клетки.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Культуры мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и эмбриональных фибробластов человека

2.1.1. Культуральные среды, реактивы, пластик, оборудование.

2.1.2. Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.1.3. Культивирование эмбриональных фибробластов человека.

2.1.4. Криоконсервация клеток.

2.2. Исследование свойств мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека в нормоксии и при пониженном содержании кислорода

2.2.1. Культивирование клеток при пониженном содержании кислорода.

2.2.2. Анализ пролиферативной активности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.2.3. Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток Иммунофенотипирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.2.4. Иммуноферментный анализ продукции цитокинов в среде культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.2.5. Оценка остеогенного дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.2.6. Оценка адипогенного дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

2.2.7. Оценка способности мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов человека образовывать капилляроподобные структуры.

2.2.8. Цитофлюриметрический анализ уровня транскрипционного фактора, индуцируемого при гипоксии (HIF-la) в цитоплазме мезенхимальных стволовых клеток.

2.3. Сокультивирование мезенхимальных клеток -предшественников и гемопоэтических стволовых клеток

2.3.1. Выделение и культивирование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека.

2.3.2. Выявление начальных этапов дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (постановка теста на колониеобразование).

2.3.3. Сокультивирование эмбриональных фибробластов человека и гемопоэтических стволовых клеток.

2.4. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Характеристика культивируемых мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека

3.1.1. Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стволовых клеток in vitro.

3.1.2. Анализ кинетики роста мезенхимальных стволовых клеток в культуре.

3.1.3. Иммунофенотипическая характеристика культивируемых мезенхимальных стволовых клеток.

3.1.4. Оценка дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток in vitro.

3.1.5. Анализ продукции мезенхимальных стволовых клеток в среде культивирования.

3.2. Сравнительная характеристика морфофункциональных и иммунофенотипических особенностей мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в нормоксии (20% Ог) и в условиях пониженного содержания кислорода (1 и 5% О2) 3.2.1. Морфофункциональная характеристика и оценка жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.2.2. Анализ кинетики роста мезенхимальных стволовых клеток в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.2.3. Анализ иммунофенотипа мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.2.4. Оценка дифференцировочного потенциала мезенхимальных стволовых клеток в нормоскии и при пониженном содержании кислорода.

3.2.5. Анализ продукции цитокинов в среде культивирования мезенхимальных стволовых клеток в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.2.6. Цитофлюриметрический анализ уровня транскрипционного фактора, индуцируемого при гипоксии (HIF-la) в мезенхимальных стволовых клетках, культивируемых в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.3. Сокультивирование мезенхимальных клеток-предшественников и гемопоэтических стволовых клеток в пуповинной крови человека

3.3.1. Формирование гемопоэтических островков при совместном культивировании мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода.

3.3.2. Цитофлюориметрический анализ экспрессии поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток при сокультивировании с гемопоэтическими стволовыми клетками в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.3.3. Выявление способности гемопоэтических стволовых клеток к колониеобразованию в нормоксических условиях и при пониженном содержании кислорода после сокультивирования с мезенхимальными стволовыми клетками.

3.3.4. Анализ продукции цитокинов при сокультивировании мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

3.3.5. Сокультивирование эмбриональных фибробластов человека и гемопоэтических стволовых клеток в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода"

Стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению и высоким дифференцировочным потенциалом, заслужили пристальное внимание исследователей в связи с возможным использованием их в терапевтических целях. Мезенхимальные стволовые клетки, входящие в состав стромы костного мозга, главного кроветворного органа в постнатальном периоде онтогенеза, относятся к важным компонентам ниши гемопоэтических клеток, являющихся родоначальными элементами кроветворения (Фриденштейн, Чертков; 1969; Сухих, Малайцев, Богданова и др., 2002; Чертков, Дризе, 2005; Паюшина, Домарацкая, Старостин, 2006; Friedenstein, Gorskaja, Kulagin, 1976; Friedenstein, Ivanov-Smolenski, Chajlakjan et al., 1978). Несмотря на то, что к настоящему времени и мезенхимальные, и гемопоэтические стволовые клетки достаточно подробно охарактеризованы (Андреева, Кадагидзе, Тупицын и др., 1999; Андреева, Тупицьш, 2002; Тепляшин, Коржикова, Шарифулина и др., 2005; Owen, Cave, Joyner, 1987, Owen, 1988; Caplan, 1991; Pittenger, Mackay, Beck et al., 1999; Muraglia, Cancedda, Quarto, 2000; Colter, Class, DiGirolamo, Prockop, 2000; Prockop, Sekiya, Colter, 2001; Sekiya, Larson, Smith et al., 2002; Gronthos, Zannettino, Hay et al., 2003; Dominici, Pritchard, Garlits, 2004; Montgomery, Shivdasani, 2009), исследований, посвященных взаимодействию этих двух типов стволовых клеток, значительно меньше (McNiece, Harrington, Turney, 2004; Muguruma, Yahata, Miyatake et al., 2006; Walenda Т., Bork S., Horn P. et al., 2009). Известно, что комплекс межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий регулируется различными сигнальными молекулами (мембранно-ассоциированными рецепторами, цитокинами, факторами роста) (Пальцев, Иванов, 1995). При нормальном гемопоэзе так же важна непосредственная кооперация гемопоэтических клеток-предшественников с элементами кроветворного микроокружения, межмембранное связывание служит при этом для переноса регуляторной информации, передачи необходимых веществ, миграции, хоминга и представления ростовых факторов в биологически доступной форме (Гольдберг, Дыгай, Жданов, 1999). Следует отметить, что используемые в настоящее время экспериментальные модели дают неполное представление о реальных биологических эффектах от действия сигнальных молекул, поскольку не воспроизводят физиологические особенности происходящих при гемопоэзе процессов. Функциональные и структурные изменения элементов микроокружения под действием различных эндогенных факторов могут быть причиной нарушений кроветворения. Исследования в этой области на уровне клетки 8 немногочисленны. Кроме того, традиционно, культуральные исследования проводят в нормоксических условиях, при 20% Ог, в то время как, например, при эмбриональном развитии человека содержание кислорода в тканях не превышает 3% (Rodesch, Simon, Donner et al., 1992; Burton, Jaunaiux, 2001), в артериальной крови — 12%, венозной -5,3% (Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007), в гипоталамусе - 1,4-2,1% (Silver, Erecinska, 1998), в костном мозге - 3-7% (Ishikava, Ito, 1988; Mostafa, Miller, Papoutsakis, 2000).

Участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в создании микроокружения, способного поддерживать рост и развитие гемопоэтических клеток, показано во многих работах (Clausen, Stockschlader, Fehse et al., 2000; Shimakura, Kawada, Ando et al., 2000; Kusadasi, Koevoet, van Soest et al., 2001; Kadereit, Deeds, Haynesworth et al., 2002; McNiece, Harrington, Tumey, 2004; Muguruma, Yahata, Miyatake et al., 2006; Walenda, Bork, Horn et al., 2009). Однако функциональные особенности и тесные клеточные взаимодействия элементов кроветворного микроокружения с учетом парциального давления кислорода во внеклеточном пространстве костного мозга практически не исследованы. Таким образом, несомненный научный и практический интерес представляет не только изучение некоторых аспектов взаимодействия прогениторных клеток различных типов в условиях максимально приближенных in vivo, но и воссоздание гемопоэзиндуцирующей ниши, позволяющей оптимизировать рост и развитие кроветворных стволовых клеток в культуре.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи исследования:

Научная новизна.

Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (1% и 5%) на совокупность морфофункциональных параметров культивируемых МСК костного мозга человека. Впервые показано, что при культивировании МСК костного мозга человека в условиях пониженного содержания кислорода происходит снижение доли клеток, несущих рецепторы адгезии (VCAM-1), на фоне устойчивости основного иммунофенотипа. Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что при пониженном содержании кислорода на определенных этапах культивирования (96 ч, 5% Ог) МСК костного мозга человека скорость пролиферации возрастает по сравнению с нормоксией и снижается при 1% Ог на всех этапах субкультивирования. Показано, что при культивировании МСК в условиях пониженного содержания кислорода морфология и жизнеспособность клеток не меняется.

Научно-практическая значимость работы.

Представленные результаты являются важным шагом на пути к пониманию механизмов регуляции гемопоэза при пониженном содержании кислорода in vitro. Предложенная и успешно апробированная экспериментальная модель для изучения процессов экспансии и дифференцировки гемопоэтических предшественников дает возможность не только рассмотреть основные функциональные закономерности кроветворения, но и оценить вклад мезенхимальных стволовых клеток в формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

Положения, выносимые на защиту:

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Жамбалова, Арюна Пурбодоржиевна

выводы

1. При культивировании МСК костного мозга человека в условиях пониженного содержания кислорода (5% 02), пролиферация клеток возрастает по сравнению с нормоксией. При 1% 02 скорость роста клеток в культуре снижается.

2. В условиях пониженного содержания кислорода МСК на всех этапах субкультивирования не экспрессируют антигены клеток гематогенного происхождения (CD34, CD38, CD45, CD117) и сохраняют экспрессию основных поверхностных маркеров (CD 13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, HLA-I). При снижении уровня кислорода в среде, доля VCAM-I-положительных клеток уменьшается.

4. Культивируемые МСК способны поддерживать рост и развитие предшественников гемопоэза (ГСК), выражающиеся в активной адгезии двух типов клеток, формировании очагов кроветворения и последующем созревании ГСК. Сокультивирование при 5% 02 приводит к достоверному увеличению количества гемопоэтических островков по сравнению с нормоксией.

5. Показано увеличение доли клеток, положительных по VCAM-1, и. увеличение продукции IL-6 и IL-8 при сокультивировании МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода, по отношению к несокультивированным МСК.

6. В отличие от несокультивированных ГСК, кроветворные предшественники после сокультивирования с МСК при 5 и 20% 02 способны к интенсивному формированию колониеобразующих единиц.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жамбалова, Арюна Пурбодоржиевна, Москва

1. Андреева Л.Ю., Кадагидзе З.Г., Тупицын Н.Н. и др. Стволовые гемопоэтичеекие клетки в крови онкологических больных: экспрессия CD34 и колониеобразование. // Гематология и трансфузиология. 1999. — 44. — 4. — С. 3 — 11.

2. Анохина Е.Б. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс: Автореферат дис. . канд. биол. наук. Москва, 2007. - 25с.

3. Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс. // Цитология. 2007. -Т.49. -№1. - С. 40-47.

4. Вермель А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике. // Клиническая медицина. 2004. - №1. - С. 5-11.

5. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А. и др. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. // М.: ИД Мед. Практика, 2005.-395 с.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего окружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. // Томск: STT, 1999-128 с.

7. Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Паюшина О.В. и др. Повреждение алкилирующим препаратом дипином кроветворных и стромальных клеток костного мозга. // Известия РАН. Серия Биологическая. 2005. - №3. - С. 267 -272.

8. Кадагидзе З.Г. Цитокины. // Практическая онкология. 2003. - Т. 4. - №3. -С. 131-139.

9. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н., 2 Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. //М.: Тверь, Триада, 2005. 168 с.

10. Луговская С.А., Козинец Г.И. Иерархия гемопоэтических клеток: кинетика, структура и функции. // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. -№5.-С. 21 -37.

11. Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1997. Т. 124. - №9. - С. 244 - 254.

12. Лукьянова Л.Д. Сигнальная функция митохондрий при гипоксии и адаптации. // Патогенез. 2008. - №3. - С. 4 - 12.

13. Мусина Р.А., Бекчанова Е.С., Белявский А.В. и др. Мезенхимальные стволовые клетки пуповинной крови. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. - №1. - С. 16 - 20.

14. Науменко О.И. Роль гемопоэтического микроокружения костного мозга в норме и при лейкозе. // Экспериментальная онкология. 1992. - Т. 14. - №1. - С. 11-20.

15. Нормальное кроветворение и его регуляция. / Под ред. Федорова Н.А. // М.: Медицина, 1976. 543 с.

16. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия // М.: Медицина, 1995. 224 с.

17. Пальцев М.А., Смирнов В.Н., Романов Ю.А. и др. Перспективы использования стволовых клеток в медицине. // Вестник Российской Академии Наук. 2006. - Т. 76. - №2. - С. 99 - 111.

18. Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. Мезенхимные стволовые клетки: источники, фенотип и потенции к дифференцировке. // Известия РАН. Серия Биологическая. 2006. - №1. - С. 6 - 25.

19. Старостин В.И. Органные, тканевые и клеточные механизмы регуляции кроветворения. // Стволовые клетки человека. Итоги науки и техники. Морфология человека и животных. М.: ВИНИТИ. 1988. - С. 87 - 150.

20. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Петракова Н.В. и др. Сравнительный анализ цитофенотипов клеток мезенхимального ряда, изолированных тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. - №1. - С. 38 -45.

21. Тепляшин А.С. Коржикова С.В., Шарифулина С.З. и др. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. // Цитология. 2005. - Т. 47. - №2. - С. 130- 135.

22. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Поляризация и ассиметричное деление стволовых клеток. // Цитология. 2007. - Т. 49. - №11. -С. 933-938.

23. Фриденштейн А. Я., Чертков И. Л. Клеточные основы иммунитета. // М.: Медицина. 1969. - 256 с.

24. Чередеев А.Н. Интерлейкины: функциональная роль как медиаторов иммунной системы. // Лабораторное дело. 1990. -№10. - С. 4 - 11.

25. Чертков И.Л., Воробьев А.И. Как обеспечивается поддержание кроветворной системы. // Гематология и трансфузиология. 1998. - 43. - 4. - С. 3 -8.

26. Чертков И.Л., Дризе И.Н. Дифференцировочный потенциал стволовых клеток (проблема пластичности). // Вестник Российской АМН. 2005. - №10. - С. 37.-44.

27. Шахов В.П., Кокарев О.В., Попов С.В. и др. Феномен формирования мезенхимальных островков из клеток костного мозга мышей в системе in vitro. И Бюллетень сибирской медицины. — 2004. №1. — С. 60 - 63.

28. Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н. Регуляция гемопоэза при воздействии на организм экстремальных факторов. // Свердловск, 1988. 152 с.

29. Abedin М., Titut Y., Demer L.L. Mesenchymal stem cells and the artery wall. // Circulation Research. 2004. - 95. - P. 671 - 676.

30. Ademokun I.A., Champan C., Dunn J. et al. Umbilical cord blood collection and separation for haemapoietic progenitor cell banking.// Bone Marrow Transplantation. 1997. - Vol.19. - 10. - P. 1023 - 1028.

31. Almici C., Carbo-Stella C., Wagner J.E. et al. Biologic and phenotypic analisis of early hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood. // Leukemia. 1997. -Vol. 11.-P. 2143-2149.

32. Annabi В., Lee Y.T., Turcotte S. et al. Hypoxia promotes murine bone-marrow-derived stromal cell migration and tube formation. // Stem Cells. 2003. - 21. - P. 337 -347.

33. Aoyama K., Oritani K., Yokota Т., et al. Stromal cell CD9 regulates differentiation of hematopoietic stem/progenitor cells. // Blood. 1999. - Vol. 93. -№8.-P. 2586-2594.

34. Appasamy P.M. Biological and clinical implications of interleukin-7 and lymphopoiesis. // Cytokines, Cellular and Molecular Therapy. 1999. - 5. - P. 25-39.

35. Arcese W., Aversa F., Bandini G. et al. Clinical use of allogeneic hematopoietic stem cells from sources other than bone marrow.// Haematologica. 1998. - Vol. 83. -№2.-P. 159-182.

36. Arkin S., Naprstek В., Guarini L. et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) on hematopoietic progenitors. // Blood. 1991. - Vol. 77. - P. 948 -953.

37. Armitage S., Fehily D., Dickenson A. et al. Cord blood banking: volume reduction of cord blood units using a semi-automated closed system.// Bone Marrow Transplantation. 1999. - Vol. 23. - №5. - P. 505 - 509.

38. Baggiolini M., Clark-Lewis I. Interleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. // FEBS Letters. 1992. - 307. - P. 97 - 101.

39. Baksh D., Davies J.E., Zandstra P.W. Adult human bone marrow derivedmesenchymal progenitor cells are capable of adhesionindependent survival and expansion. // Experimental Hematology. 2003. - Vol. 31. P. 723 - 732.

40. Barry F.P., Murphy M.J. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. // The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2004. - Vol. 36. - P. 568 — 584.

41. Baxter M.A., Wynn R.F., Jowitt S.N. et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. // Stem Cells. 2004. - Vol. 22. - P. 675 - 682.

42. Вeitner-Johnson D., Millhorn D.E. Hypoxia induces phosphorylation of the cyclic AMP response element-binding protein by a novel signaling mechanism. // Journal of Biological Chemistry. 1998. - 273. - 19834 - 19839.

43. Berardi A.C., Meffre E., Pflumio F. et al. Individual CD34+ CD38 low CD 19 CD 10- progenitor cells from human cord blood generate В lymphocytes and granulocytes.// Blood. 1997. - Vol. 89. - №10. - P. 3554 - 3564.

44. Bertolini F., Battaglia M., De Iulio C. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns. // Blood. 1995. - Vol. 85. - P. 3361 - 3362.

45. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S. et al. Bone marrow stromal cells: nature, biology and potential applications. // Stem Cells. 2001. - Vol. 19. - P. 180 - 192.

46. Bieback K., Kern S., Kluter H., Eichler H. Critical parametres for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. // Stem Cells. 2004. - Vol. 22. -P. 625 - 634.

47. Blanpain C., Lowry W.E., Geoghegan A. et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. // Cell. 2004. -Vol. 118.-P. 835-648.

48. Blazsek I., Liu X.H., Anjo A. et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. // Experimental hematology. 1995 - Vol. 23. - №4. - P. 309 - 319.

49. Bosnakovski D., Mizuno M., Kim G. et al. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. // Cell and Tissue Research. 2005. - Vol. 319. - №2. - P. 243 - 253.

50. Bosch P., Pratt S.L., Stice S.L. Isolation, characterization, gene modification, and nuclear reprogramming of porcine mesenchymal stem cells. // Biology of Reproduction. 2006. - Vol. 74. - P. 46 - 57.

51. Briere J.J., Favier J., Benit P. et al. Mitochondrial succinate is instrumental for HIF-1 alpha nuclear translocation in SDHA-mutant fibroblasts under normoxic conditions. // Human Molecular Genetics. 2005. - Vol. 14. - №21. - P. 3263 - 3269.

52. Brooke G., Tong H., Levesque J.P. et al. Molecular trafficking mechanisms of multipotent mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and placenta. // Stem Cells and Development. 2008. - Vol. 17. - P. 929 - 940.

53. Brown R., Xu F.S., Dusing S.K. et al. Serum-free conditions for cells capable of producing long-term survival in lethally irradiated mice. // Stem Cells. 1997. - Vol. 15.-P. 237-245.

54. Broxmeyer H.E., Gordon G.W., Hangoc G. et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1989. - Vol.86. - P. 3828-3832.

55. Bruick R.K. Oxygen sensing in the hypoxic response pathway: regulation of the hypoxia-inducible transcription factor. // Genes and Development. 2003. - Vol. 17. -№21.-P. 2614-2623.

56. Buhring H.J., Battula V.L., Treml S. et al. Novel markers for the prospectiveisolation of human MSC. // Annals of the New York Academy of Sciences. 2007. -Vol. 1106.-P. 262-271.

57. Burton G.J., Jaunaiux E. Maternal vascularisation of the human placenta: does the embryo develop in a hypoxic environment? // Gynecologie, Obstetrique and Fertilite. 2001. - 7 - 8. - P. 503 - 508.

58. Cabrita G.J., Ferreira B.S., da Silva C.L. et al. Hematopoietic stem cells: from the bone to the bioreactor. // Trends in Biotechnology. 2003. - Vol. 21. - P. 233 -240.

59. Cai J., Weiss M.L., Rao M.S. In search of "sternness". // Experimental Hematology. 2004. - Vol. 32. - P. 585 - 598.

60. Caldwell J., Emerson S.G. 11-1 alpha and TNF alpha act synergistically to stimulate producion of mieloid colony-stimulating factors by cultured human bone marrow stromal cells. // Journal of Cellular Physiology. 1994. - Vol. 159. - №2. - P. 221 -228.

61. Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W. et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. // Nature. 2003. - 425. - P. 841 - 846.

62. Campard D., Vasse M., Rose-John S. et al. Multilevel regulation of IL-6R by IL-6-sIL-6R fusion protein according to the primitiveness of peripheral blood-derived CD133+cells.//Stem Cells.-2006.-24.-P. 1302- 1314.

63. Cangul H. Hypoxia upregulates the expression of the NDRG1 gene leading to its overexpression in various human cancers. // BMC Genetics. 2004. - P. — 5 - 27.

64. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. // Journal of Orthopaedic Research. -1991. Vol. 9. -№5. - P. 641 - 650.

65. Cerny J., Quesenberry P.J. Chromatin remodeling and stem cell theory of relativity. // Journal of Cellular Physiology. 2004. - Vol. 201. - P. 1 - 16.

66. Chandel N.S., Trzyna W.C., McClintock D.S. et al. Role of oxidants in NF-kB activation and TNF-a gene transcription induced by hypoxia and endotoxin. // Journal of Immunology. 2000. - 165. - P. 1013 - 1021.

67. Chaudhary L.R, Hofmeister A.M., Hruska K.A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.// Bone. 2004. -Vol. 34.-№3. - P. 402-411.

68. Chen Т., Burke K.A., Zhan Y. et al. IL-12 facilitates both the recovery of endogenous hematopoiesis and the engraftment of stem cells after ionizing radiation. // Experimental Hematology. 2007. - 35. - P. 203 -13.

69. Chen J.L., Hunt P., McElvain M. et al. Osteoblast precursor cells are found in CD34+ cells from human bone marrow.// Stem Cells. 1997. - Vol. 15. - P. 368 - 377.

70. Chunmeng S., Tiamin C. Effects of plastic-adherent dermal multipotent cells on peripheral blood leukocytes and CFU-GM in rats. // Transplantation Proceedings. -2004.-Vol. 36,-№5.-P. 1578-1581.

71. Cipolleschi M., Dello Sbarba P., Olivotto M. The role of hypoxia in the mainetance of hematopoietic stem cells. // Blood. 1993. - Vol. 82. - P. 2031 - 2037.

72. Cipolleschi M., D'Ippolito G., Bernabei P.A. et al. Severe hypoxia enhances the formation of erythroid bursts from human cord blood cells and the maintenance of BFU-E in vitro. И Experimental Hematology. 1997. - Vol. 25. - P. 1187 - 1194.

73. Civin C.I., Strauss L.C., Brovall C., et al. Antigenic analysis of hematopoiesis. III. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG-la cells. // Journal of Immunology. 1984. - 133. - P. 157 - 165.

74. Clausen J., Stockschlader M., Fehse N et al. Blood-derived macrophage layers in the presence of hydrocortisone support myeloid progenitors in long-term cultures of CD34+ cord blood and bone marrow cells. // Annals of Hematology. 2000. - 79. - P. 59-65.

75. Cogle C.R., Guthrie S.M., Sanders R.C. et al. An overview of stem cell research and regulatory issues. // Mayo Clinic Proceedings. 2003. - Vol. 78. - №8. -P.993 -1003.

76. Collins P., Papoutsakis E.T., Miller W.M. Ex vivo culture systems for hematopoietic cells. // Current Opinion in Biotechnology. 1996. - Vol. 7. - P. 223 -230.

77. Comerford K.M., Leonard M.O., Karhausen J. et al. Small ubiquitin-related modifier-1 modification mediates resolution of CREB-dependent responses to hypoxia. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2003. - 100. - P. 986 -991.

78. Conget P.A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. // Journal of Cellular Physiology. 1999. — Vol. 181.-№1.-P. 67-73.

79. Cui Q., Wang G.J., Balian G. Pluripotential marrow cells produce adipocytes when transplanted into steroid-treated mice. // Connective Tissue Research. 2000. -Vol. 41.-№1.-P. 45-56.

80. Delorme В., Charbord P. Culture and characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells. // Methods in Molecular Medicine. 2007. - Vol. 140. - P. 67 -81.

81. Denker A.E., Nicoll S.B., Tuan R.S. Induction and characterization of chondrogenesis in multipotentional mesenchymal cells: Abstr. 5th. Int. Conf. Mol. Biol. And. Pathol. Matrix, Philadelphia, 1994. // Matrix Biology. 1994. - Vol. 14. - №5. - P. 373.

82. Denning-Kendall P., Donaldson C., Nicol A. et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking.// Experimental Hematology. 1996. - Vol. 24. -12.-P. 1394-1401.

83. Dexter T.M., Allen T.D., Lajtha L.G. Conditions controlling the proliferation of haematopoietic stem cells in vivo. II Journal of Cellular Physiology. 1977. - Vol. 91. -P. 335-344.

84. DiGiusto D.L., Lee R., Moon J et al. Hematopoietic potential of cryopreserved and ex vivo manipulated umbilical cord blood progenitor cells evaluated in vitro and in vivo // Blood. 1996. - Vol. 87. - №4. - P. 1261 - 1271.

85. Discher D.J., Bishopric N.H., Wu X. et al. Hypoxia regulates beta-enolase and pyruvate kinase-M promoters by modulating Spl/Sp3 binding to a conserved GC element. // The Journal of Biological Chemistry. 1998. - 273. - P. 26087 - 26093.

86. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for difining multipotent mesenchymal stromal cells. The International society for cellular therapy position statement // Cytotherapy. 2006. - Vol. 8. - №4. - P. 315 - 317.

87. Douay L. Experimental culture conditions are critical for ex vivo expansion of hematopoietic cells. // Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 2001. - Vol. 10.-P. 341 -346.

88. Dvorakova J., Hruba A., Velebny V. et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell population entrapped in bone marrow collection sets. // Cell Biology International 2008. - Vol. 32. - P. 1116 - 1125.

89. Edling C.E., Hallberg B. c-Kit a hematopoietic cell essential receptor tyrosine kinase. // Int. Journal of Biochemistry and Cell Biology. - 2007. - 39. - P. 1995 - 1998.

90. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. // British Journal of Haematology. 2000 - Vol. 109. - P. 235 -242.

91. Euskirchen G., Royce Т.Е., Bertone P. et al. CREB binds to multiple loci on human chromosome 22. // Molecular and Cellular Biology. 2004. - 24. - P. 3804 -3814.

92. Fehrer C., Brunauer R., Laschober G. et al. Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan. // Aging Cell. 2007. - 6. - P. 745 - 757.

93. Feldser D., Agani F., Iyer N.V. et al. Reciprocal positive regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha and insulin-like growth factor 2. // Cancer Research. 1999. -59.-P. 3915-3918.

94. Fink Т., Abildtrup L., Fogd K. et al. Induction of adipocyte-like phenotype in human mesenchymal stem cells by hypoxia. // Stem Cells. 2004. - 22. - P. 1346 -1355.

95. Fischbach G. D., Fischbach R. L. Stem cells: science, policy, and ethics. // The Journal of Clinical Investigation. 2004. - Vol. 114. - №10. - P. 1364 - 1370.

96. Fortunel N., Hatzfeld A., Hatzfeld J.A. Transforming growth factor-B: pleiotropic role in the regulation of hematopoiesis. // Blood. 2000. - Vol. 96. - №6. -P. 2022-2036.

97. Freund D., Bauer N., Boxberger S. et al. Polarization of human hematopoietic progenitors during contact with multipotent mesenchymal stromal cells: effects on proliferation and clonogenicity. // Stem Cells Dev. 2006. - Vol.15. - 6. - P. 815 -829.

98. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. // Experimental Hematology. 1976. - Vol. 4.-№5.-P. 267-274.

99. Friedenstein A.J., Ivanov-Smolenski A.A., Chajlakjan R.K. et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants. // Experimental Hematology. 1978. - Vol. 6. - №5. - P. 440 - 444.

100. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. // Cell and Tissue Kinetics. 1987. - Vol. 20. - №3. - P. 263 - 272.

101. Gangji V., Hauzeur J.P. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with implantation of autologous bone-marrow cells. Surgical technique. // The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 2005. - Vol.87. - №1. - P. 106 - 112.

102. Galinanes M., Loubani M., Davies J. et al. Safety and efficacy of transplantation of autologous bone marrow into scarred myocardium for the enhancement of cardiac function in man. // Circulation. 2002.

103. Gartner S., Kaplan H.S. Long-term culture of human bone marrow cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1980. - Vol. 77. - P. 4756-4759.

104. Gillette J.M., Larochelle A., Dunbar C.E. et al. Intercellular transfer to signalling endosomes regulates an ex vivo bone marrow niche. // Nature Cell Biology. -2009.-11.-P. 303-311.

105. Gimble J.M., Wanker F., Wang C.S. et al. Regulation of bone marrow stromal cell differentiation by cytokines whose receptors share the gpl30 protein. // Journal of Cellular Biochemistry. 1994.-Vol. 543.-№1.-P. 122- 133.

106. Gimble J.M., Morgan C., Kelly K. et al. Bone morphogenetic proteins inhibit adipocyte differentiation by bone marrow stromal cells. // Journal of Cellular Biochemistry. 1995 - Vol. 58. - №3. - P. 393 - 402.

107. Goodwin R.G., Lupton S., Schmierer A. et al. Human interleukin 7: molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 1989. 86. - P. 302 - 306.

108. Goodwin H.S., Bicknese A.R., Chien S.N. et al. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers. // Biology Blood Marrow Transplant. 2001. - Vol. 7. - P. 581 - 588.

109. Gratama J., Sutherland D.R., Keeney M. et al. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. // Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 2001. - Vol. 15. - P. 14 - 22.

110. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R. et al. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs. // Journal of Cellular Physiology. 2006. - 207. - P. 331 - 339.

111. Greijer A.E., van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis. // Journal of Clinical Pathology. 2004. - 57. - P. 1009 -1014.

112. Gronthos S., Graves S.E., Ohta S. et al. The STRO-l+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. // Blood. 1994. - Vol. 84. - №12. -P. 4164-4173.

113. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J. et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. // Journal of Cell Science. 2003. - Vol. 116. - P. 1827 - 1835.

114. Hamilton J.A., Anderson G.P. GM-CSF Biology. // Growth factors. 2004. -22.-P. 225-231.

115. Hardy C.L., Minguell J.J. Cellular interactions in hemopoietic progenitor cell homing: a review. // Scanning Microscopy. 1993. - 7. - P. 333 - 341.

116. Hermann A., Gastl R., Liebau S. et al. Efficient generation of neural stem celllike from adult human bone marrow stromal cells. // Journal of Cell Science. 2004. -117.-P. 4411-4422.

117. Hernigou P., Beaujean F. Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting. II Clinical Orthopaedics and Related Research. 2002. - Vol. 405. - P. 14-23.

118. Highfill J., Haley S.D., Kompala D.S. Large-scale production of murine bone marrow cells in an airlift packed bed bioreactor. // Biotechnology and Bioengineering. -1996.-Vol. 50.-P. 514-520.

119. Hitchon C., Wong K., Ma G. et al. Hypoxia-induced production of stromal cell-derived factor 1 (CXCL12) and vascular endothelial growth factor by synovial fibroblasts. // Arthritis and Rheumatism. 2002. - 46. - 10. - P. 2587 - 2597.

120. Hoffmann A., Gloe Т., Pohl U. Hypoxia-induced upregulation of eNOS gene expression is redox-sensitive: a comparison between hypoxia and inhibitors of cell metabolism. // Journal of Cellular Physiology. 2001. - 188. - P. 33 - 44.

121. Hollander A.P., Corke K.P., Freemont A. J., Lewis C.E. Expression of hypoxia-inducible factor la by macrophages in the rheumatoid synovium. // Arthritis and Rheumatism. 2001. - 44. - 7. - P. 1540 - 1544.

122. Horwitz, Blanc, Dominici et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy. 2005. -Vol. 7.-P. 393-395.

123. Hu Y., Liao L., Wang Q. et al. Isolation and identification of mesenchymal stem cells from human fetal pancreas. // The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 2003. - Vol. 141. - №5. - P. 342 - 349.

124. Hu C.J., Wang L.Y., Chodosh L.A. et al. Differential roles of hypoxia-inducible factor la (HIF-la) and HIF-2a in hypoxic gene regulation. // Molecular and Cellular Biology. 2003. - Vol. 23. - №24. - P. 9361 - 9374.

125. Hu C.J., Iyer S., Sataur A. et al. Differential regulation of the transcriptional activities of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1 alpha) and HIF-2alpha in stem cells. // Molecular and Cell Biology. 2006. - Vol. 26. - №9. - P. 3514 - 3526.

126. Hung S.C., Chen N.J., Hsieh S.L. et al. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow. // Stem Cells. 2002 - Vol. 20. - P. 249 -258.

127. D'Ippolito G., Diabira S., Howard G.A. et al. Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances sternness of human MIAMI cells. // Bone. -2006.-39.-P. 513 -522.

128. Ishikawa Y., Ito T. Kinetics of hemopoietic stem cells in a hypoxic culture. // European Journal of Haematology. 1988 - Vol. 40. - P. 126 - 129.

129. Isoyama K., Yamada K., Hirota Y. et al. Study of the collection and separation of umbilical cord blood for use in hematopoietic progenitor cell transplantation. // International Journal of Hematology. 1996. - Vol. 63. - №2. - P. 95 - 102.

130. Ivanovic Z., Belloc F., Faucher J.L. et al. Hypoxia maintains and interleukin-3 reduces the pre-colony-forming cell potential of dividing CD34(+) murine bone marrow cells. // Experimental Hematology. 2002. - 30. - P. 67 - 73.

131. Janderova L., McNeil M., Murrell A.N. et al. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. // Obesity Research. 2003. — №1 - P. 65 -73.

132. Jiang B.H., Rue E., Wang G.L. et al. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. // The Journal of Biological Chemistry. 1996. - 30. - P. 17771 - 17778.

133. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. // Nature. 2002. - Vol. 4. - P. 41 - 49.

134. Johnstone В., Hering T.M., Caplan A.I., et al. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. // Experimental Cell Research. 1998. -Vol. 238. - №1. - P. 265 - 272.

135. Kadereit S., Deeds L.S., Haynesworth S.E. et al. Expansion of LTC-ICs and maintenance of p21 and BCL-2 expression in cord blood CD34(+)/CD38(-) early progenitors cultured over human MSCs as a feeder layer. // Stem Cells. 2002 - Vol. 20.-P. 573-582.

136. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A. et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. // Cell Transplantation. 1997. - Vol. 6. - №2. - P. 125 - 134.

137. Kadowaki A., Tsukazaki Т., Hirata K. et al. Isolation and characterization of a mesenchymal cell line that differentiates into osteoblasts in response to BMP-2 from calvariae of GFP transgenic mice. // Bone. 2004. Vol. 34. - №6. - P. 993 - 1003.

138. Kaelin W.G. How oxygen makes its presence felt. // Genes & development. -2002.-16.-P. 1441 -1445.

139. Kanai M., Hirayama F., Yamaguchi M. et al. Stromal cell-dependent ex vivo expansion of human cord blood and augmentation of transplantable stem cell activity. // Bone Marrow Transplantation. 2000. - Vol. 26. - №8. - P. 837 - 844.

140. Kernan N.A., Bartsch G., Ash R.C. et al. Analysis of 462 transplantations from unrelated donors facilitated by the national marrow donor program// The New England Journal of Medicine. 1993. - Vol.328. - P. 593 - 602.

141. Kishimoto Т., Akira S., Narazaki M. et al. Interleukin-6 .family of cytokines and gpl30. // Blood. 1995. - 86. - P. 1243 - 1254.

142. Klees R.F., Salasznyk R.M., Kingsley K. et al. Laminin-5 induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERK-dependent pathway. // Molecular Biology of the Cell. 2005. - Vol. 16. - №2. - P. 881 - 890.

143. Kogler G., Sensken S., Airey J.A. et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. // The Journal of Experimental Medicine. 2004. - Vol. 200. - P. 123 - 135.

144. Kolf C.M, Cho E., Tuan R.S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. // Arthritis Research and Therapy. 2007. - Vol. 9. - №204. - P. 1 - 10.

145. Koller M.R., BenderJ.G., Papoutsakis E.T. et al. Effects of synergistic cytokine combinations, low oxygen, and irradiated stroma on the expansion of human cord blood progenitors. // Blood. 1992. - 15. - 403 - 411.

146. Koller M., Emerson S.G., Palsson B.O. Large-scale expansion of human stem and progenitor cells from bone marrow mononuclear cells in continuous perfusion cultures. // Blood. 1993. - Vol. 82. - №2. - P. 378 - 384.

147. Krangel M.S. Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway. // The Journal of Experimental Medicine. 1986. - Vol. 163. - P. 1173- 1190.

148. Kraus D., Fackler M., Civin C. et al. CD 34: structure, biology and clinical utility // Blood. 1996. - Vol. 87. - P. 1 - 15.

149. Krystal G., Lanm V., Dragowska W. et al. Transforming growth factor beta 1 is an inducer of erythroid differentiation. // Journal of Experimental Medicine. 1994. -Vol. 180.-P. 851 -860.

150. Kusadasi N., Koevoet J.L., van Soest P.L. et al. Stromal support augments extended long-term ex vivo expansion of hemopoietic progenitor cells. // Leukemia. -2001.- 15.-P. 1347- 1358.

151. Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Gronthos S. et al. Circulating skeletal stem cells.//Journal Cell Biology.-2001.-Vol. 153.-№5.-P. 1133- 1140.

152. La Ferla К., Reimann С., Jelkmann W. et al. Inhibition of erythropoietin gene expression signaling involves the transcription factors GATA-2 and NF-kappaB. // FASEB Journal. 2002. - 16. - P. 1811 - 1813.

153. Larrick J.W. Native interleukin 1 inhibitors. // Immunology Today. 1989 -Vol. 10.-№2.-P. 61-6.

154. Lee M., Bikram M., Oh S. et al. Spl-dependent regulation of the RTP801 promoter and its application to hypoxia-inducible VEGF plasmid for ischemic disease. // Pharmaceutical Research. 2004. - 21. - P. 736 - 741.

155. Lee H.S., Huang G.T., Chiang H., et al. Multipotential mesenchymal stem cells from femoral bone marrow near the site of osteonecrosis. // Stem Cells. 2003. - Vol. 21.-P. 190-199.

156. Lee O.K., Kuo Т.К., Chen W.M. et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. // Blood. 2004. - Vol. 103 - №5. - P. 1669 -1675.

157. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. // Journal of Cellular Physiology. 2001. - Vol. 187. - №3. - P. 345-355.

158. Leon E.R., Iwasaki K., Komaki M. et al. Osteogenic effect of interleukin-11 and synergism with ascorbic acid in human periodontal ligament cells. // Journal of Periodontal Research. 2007. - 42. - P. 527 - 35.

159. Lin J.R., Guo K.Y., Li J.Q., Yan D.A. In vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cell clones and induced differentiation into neuron-like cells. // Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2003. - Vol. 23. - №3. - P. 251 - 253, 264.

160. Lodolce J.P., Burkett P.R., Koka R.M. et al. Regulation of lymphoid homeostasis by interleukin-15. // Cytokyne Growth Factor Rev. 2002. - 13. - P. 429 -439.

161. Lopez-Lazaro M. HIF-1: hypoxia-inducible factor or dysoxia-inducible factor? // FASEB Journal. 2006. - 20. - P. 828 - 832.

162. Maeda S., Nobukuni Т., Shimo-Onoda K. et al. Sortilin is upregulated during osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells and promotes extracellular matrix mineralization. // Journal of Cellular Physiology. 2002. - Vol. 193. - P. 73 - 79.

163. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D.et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. // Journal of Cellular Physiology. 1998. - Vol. 176. -№1. - P. 57 - 66.

164. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyander D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells. // Journal of Biomedical Science. 2003. - Vol. 10 - №2. - P. 228 - 241.

165. Martin D.R., Cox N.R., Hathcock T.L., Niemeyer G.P., Baker H.J. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. // Experimental Hematology. 2002. - Vol. 30. - P. 879 - 886.

166. Martin-Rendon E., Hale S.J., Ryan D. et al. Transcriptional profiling of human cord blood CD133+ and cultured bone marrow mesenchymal stem cells in response to hypoxia. // Stem Cells. 2007. - Vol. 25. - P. 1003 - 1012.

167. Mayani H. Composition and function of hemopoietic microenvironment in human myeloid leukemia. // Leukemia. 1996. - Vol. 10. - №6. - P. 1041 - 1047.

168. McNiece I., Harrington J., Turney J. et al. Ex vivo expansion of cord blood mononuclear cells on mesenchymal stem cells. // Cytotherapy. 2004. - Vol. 6. - P. 311 -317.

169. Metcalf D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factors. // Cell. -1985.-43.-P. 5-6.

170. Miki N., Ikuta M., Matsui T. Hypoxia-induced activation of the retinoic acid receptor-related orphan receptor a4 gene by an interaction between hypoxia-inducible factor-1 and Spl. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. - 279. - P. 15025 -15031.

171. Millhorn D.E., Raymond R., Conforti L. et al. Regulation of gene expression for tyrosine hydroxylase in oxygen sensitive cells by hypoxia. // Kidney International. -1997.-51.-P. 527-535.

172. Minet E., Michel G., Mottet D. et al. c-JUN gene induction and AP-1 activity is regulated by a JNK-dependent pathway in hypoxic HepG2 cells. // Experimental Cell Research.-2001.-265.-P. 114-124.

173. Minguell J.J., Conget P., Erices A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells. // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. -2000.-Vol. 33.-P. 881 -887.

174. Minguell J.J., Eriees A., Conget P. Mesenchymal Stem Cells. // Experimental Biology and Medicine. 2001. - Vol. 226. - №6. - P. 507 - 520.

175. Montgomery R.K., Shivdasani R.A. Promininl (CD133) as an intestinal stem cell marker: promise and nuance. // Gastroenterology. 2009. - Vol. 136. - P. 2051 -2054.

176. Moore M.A.S., Williams N., Metcalf D. In vitro colony formation by normal and leukemic human hemopoietic cells: Interaction between colony-forming and colony-stimulating cells. // Journal of the National Cancer Inst. 50. - P. 59 — 61.

177. Moore K.A., Lemischka I.R. Stem Cells and Their Niches. // Science. 2006. -P. 1880- 1885.

178. Mostafa S.S., Miller W.M., Papoutsakis E.T. Oxygen tension influences the differentiation, maturation and apoptosis of human megakaryocytes. // British Journal of Haematology. 2000. - Vol. 111. - P. 879 - 889.

179. Muguruma Y., Yahata Т., Miyatake H. et al. Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment. // Blood. 2006. - Vol. 107. - P. 1878 -1887.

180. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. // Journal of Cell Science. 2000. - Vol. 113. - Pt. 7. - P. 1161 - 1166.

181. Naldini A., Carraro F., Silvestri S., et al. Hypoxia affects cytokine production and proliferation responses by human peripheral mononuclear cells. // Journal of Cellular Physiology. 1997. - Vol. 173. - P. 335 - 342.

182. Nathan S., Das De S., Thambyah A. et al. Cell-based therapy in the repair of osteochondral defects: a novel use for adipose tissue. // Tissue Engineering. 2003. -Vol. 9.-№4.-P. 733-744.

183. Naveiras О., Nardi V., Wenzel P.L. et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. // Nature. — 2009. — 460. — P. 259 — 63.

184. Noll Т., Jelinek N., Schmid S. et al. Cultivation of hematopoietic stem and progenitor cells: biochemical engineering aspects. // Advances in Biochemical Engineering. 2002. - Vol. 74. - P. 111 - 128.

185. Noth U., Osyczka A.M., Tuli R. et al. Multilineage mesenchymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells. // Journal of Orthopaedic Research. 2002. - Vol. 20. - №5. - P. 1060 - 1069.

186. Novak A., Hsu S.C., Leung-Hagesteijn C. et al. Cell adhesion and the integrin-linked kinase regulate the LEF-1 and beta-catenin signaling pathways. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1998. - Vol. 95. - P.4374 - 4379.

187. Owen M.E., Cave J., Joyner C.J. Clonal analysis in vitro of osteogenic differentiation of marrow CFU-F. // Journal of Cell Science. 1987. - Vol. 87. - Pt. 5. -P. 731 -738.

188. Owen M. Marrow stromal stem cells. // Journal of Cell Science. 1988. - Supl. 10.-P. 63-76.

189. Pandit J., Bohm A., Jancarik J. et al. Three-dimensional structure of dimeric human recombinant macrophage colony-stimulating factor. // Science. 1992. - 258. -P. 1358- 1362.

190. Palsson B.O., Paek S-H., Schwartz R.M. et al. Expansion of human bone marrow progenitor cells in a high cell density continuous perfusion system. // Bio/Technology. 1993. - Vol. 11. - P. 368 - 372.

191. Parcells B.M. Ikeda A.K., Simms-Waldrip T. et al. FMS-Like tyrosine kinase 3 in normal hematopoiesis and acute myeloid leukemia. // Stem Cells. 2006. - Vol. 24. -5.-P. 1174-1184.

192. Paul S.R., Bennett F., Calvetti J.A. et al. Molecular cloning of a cDNA encoding interleukin 11, a stromal cell-derived lymphopoietic and hematopoietic cytokine. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 1990. -87.-P. 7512-7516.

193. Pettengell R., Luft Т., Henschler R. et al. Direct comparison by limiting dilution analysis of long-term culture initiating cells in human bone marrow, umbilical cord blood, and blood stem cells.// Blood. - 1994. - Vol. 84. - P. 3652 - 3659.

194. Piacibello W., Sanavio F., Garetto L. et al. Extensive amplification and self-renewal of human primitive hematopoietic stem cells from cord blood.// Blood. 1997. -Vol. 89. - №8. - P.2644 - 2653.

195. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science. 1999. - Vol. 284. - P. 143 - 147.

196. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. // Circulation Research. 2004. - Vol. 95. - P. 9 - 20.

197. Poliard A., Nifuji A., Lamblin D. et al. Controlled conversion of an immortalized mesodermal progenitor cell towards osteogenic, chondrogenic, or adipogenic pathways. // The Journal of Cell Biology. 1995. - Vol. 130. - №6. - P. 1461 - 1472.

198. Ponta H., Sherman L., Herrlich P.A. CD44: from adhesion moleculaes to signaling regulators. // Nature reviews. Molecular cell biology. 2003. - 4. - P. 33 - 45.

199. Preston D.J., Alison M.R., Forbes S.J. et al. The new stem cell biology: something for everyone. // Molecular Pathology. 2003. Vol. 56. - P. 86 - 96.

200. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. // Science. 1997. - Vol. 276. - P. 71 - 74.

201. Prockop D.J., Sekiya I., Colter D.C. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells. // Cytotherapy. — 2001.-Vol.3.-P. 393-396.

202. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. // The Journal of Cell Biology. 2003. - Vol.160. - №6. P. 807 - 809.

203. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.-2003.-Vol. 100.-P. 11917-11923.

204. Provot S., Zinyk D., Gunes Y. et al. HIF-la regulates differentiation of limb bud mesenchyme and joint development. // Journal of Cell Biology. 2007. - 177. - P. 451 -464.

205. Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. // Nature Medicine. 2003. - Vol. 9. - №6. - P. 677 - 684.

206. Raff M. Adult stem cell plasticity: fact or artifact? // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2003. - Vol. 19. - P. 1 - 22.

207. Ren H., Cao Y., Zhao Q. et al. Proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells under hypoxic conditions. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - 347. - P. 12 - 21.

208. Reyes M., Verfaillie C.M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells. // Annals of the New York Academy of Sciences. 2001. - Vol. 938. - P. 231 - 235.

209. Rhodes N.P., Srivastava J.K. Smith R.F. et al. Heterogeneity in proliferative potential of ovine mesenchymal stem cell colonies. // Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 2004. - Vol. 15. -№4. - P. 397 - 402.

210. Rich I.N., Kubanek B. The effect of reduced oxygen tension on colony formation of erythropoietic cells in vitro. // British Journal of Haematology 1982. -52.-P. 579-588.

211. Rochefort G.Y., Delorme В., Lopez A.et al. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia. // Stem Cells. 2006. - 24. - P. 2202-2208.

212. Rodesch F., Simon P., Donner C. et al. Oxygen measurements in endometrial and trophoblastic tissues during early pregnancy. // Obstetrics and Gynecology. — 1992. -2.-P. 283-285.

213. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., Smirnov V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord. // Stem Cells. 2003. - Vol. 21. - P. 105 - 110.

214. Roufosse C. A., Direkze N. C., Otto W. R. et al. Circulating mesenchymal stem cells. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. - Vol. 36. - P. 585 - 597.

215. Rothlein R., Dustin M.L., Marlin S.D., Springer T.A. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1. // Journal of Immunology. 1986. -Vol. 137.-P. 1270- 1274.

216. Rubinstein P., Taylor P.E., Searadavou A. et al. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution: Organization of the placental blood program.// Blood Cells. 1994. - Vol.20. - №2. - P. 587 - 600.

217. Salasznyk R.M., Williams W.A., Boskey A. et al. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. // Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2004. - №1. - P: 24 - 34.

218. Salim A., Nacamuli R.P., Morgan E.F. et al. Transient changes in oxygen tension inhibit osteogenic differentiation and Runx2 expression in osteoblasts. // The Journal of Biological Chemistry. 2004. - 279. - P. 40007 - 40016.

219. Salnikow K., Kluz Т., Costa M. et al. The regulation of hypoxic genes by calcium involves c-Jun/AP-1, which cooperates with hypoxia-inducible factor-1 in response to hypoxia. // Molecular and Cellular Biology. 2002. - 22. - P. 1734 - 1741.

220. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. // Experimental Neurology. — 2000. -Vol. 164. №2. P. 247 - 256.

221. Sandstrom C.E., Bender J.G., Papoutsakis E.T. et al. Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells. // Blood. 1995. - Vol. 86. - №3. - P. 958 - 970.

222. Sardonini C.A, Wu Y.J. Expansion and differentiation of human hematopoietic cells from staticcultures through small-scale bioreactors. // Biotechnology Progress. -1993.-Vol. 9.-P. 131-137.

223. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. // Blood. -2005.-Vol. 106.-№2.-P. 756-763.

224. Schecrcoun N., Delloe C. Bone like nodules formed by human bone marrow stromal cells: comparative study and characterization. // Bone. 2003. - Vol. 32. - №3. -P. 252-260.

225. Scherer K., Schunke M., Sellckau R. et al. The influence of oxygen and hydrostatic pressure on articular chondrocytes and adherent bone marrow cells in vitro. // Biorheology. 2004. - 41. - P. 323 - 333.

226. Schmedtje J.F. Jr., Ji Y.S., Liu W.L. et al. Hypoxia induces cyclooxygenase-2 via the NF-кВ p65 transcription factor in human vascular endothelial cells. // Journal of Biological Chemistry. 1997. - 272. - P. 601 - 608.

227. Shmelkov S.V., St. Clair R., Lyden D. et al. AC133/CD133/Prominin-l. // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2005. - Vol. 37. - P. 15 - 19.

228. Schumacker P.T. Hypoxia, anoxia, and O2 sensing: the search continues. // American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 2002. -Vol. 283. - P. L 918 — L921.

229. Semenza G.L. HIF-1 and human disease: one highly involved factor. // Genes and Development.-2000.-Vol. 14.-P. 1983- 1991.

230. Semenza G.L. HIF-1, O2 and 3 PHDs. How animal cells signal hypoxia to the nucleus.//Cell.-2001.-Vol. 107.-№1.-P. 1 -3.

231. Semenza G.L. Involvement of hypoxia-inducible factor 1 in pulmonary pathophysiology. // Chest. 2005. - 6 - P. 592S - 594S.

232. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R., et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. // Stem Cells. 2002. - Vol. 20. - №6. - P. 530 - 541.

233. Seko Y., Tobe K., Ueki К et al. Hypoxia and hypoxia/reoxygenation activate Raf-1, mitogen-activated protein kinase, mitogen-activated proteinkinase and S6 kinase in cultured rat cardiac myocytes. // Circulation Research. 1996. - Vol. 78. - P. 82 — 90.

234. Siczkowski M., Andrew Т., Amos S. et al. Hialuronic acid regulates the function and distribution of sulfated glycosaminoglycans in bone marrow stromal cultures. //Experimental Hematology. 1993. - Vol. 21. -№1. - P. 126 - 130.

235. Silver I., Ericinska M. Oxygen and ion concentrations in normoxic and hypoxic brain cells. // Advances in Experimental Medicine and Biology. 1998. - 454. - P. 7 -16.

236. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai T. Stem Cells find their niche. // Nature. 2001. - Vol. 414. - P. 98 - 104.

237. Srinivas V., Leshchinsky I., Sang N. et al. Oxygen sensing and HIF-1 activation does not require an active mitochondrial respiratory chain electron-transfer pathway. // Journal of Biological Chemistry. 2001. - Vol. 276. - №25. - P. 21995 -21998.

238. Stanley E.R., Berg K.L., Einstein D.B. et al.The biology and action of colony stimulating factor-1. // Stem Cells. 1994. - 12. - Suppl. 1. - P. 15 - 24.

239. Stamm C., Westphal В., Kleine H-D. et al. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. // The Lancet. — 2003. Vol. 361. - P. 45 -46.

240. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. // Circulation. -2002. Vol. 106. - P. 1913 - 1918.

241. Stroka D.M., Burkhardt Т., Desbaillets I. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia. // The FASEB Journal. 2001. - 15. - P. 2445 - 2453.

242. Taipale J., Keski-Oja J. Growth factors in the extracellular matrix. // The FASEB Journal. 1997. - 11. - 1. - P. 51 - 59.

243. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. // Cell. 2006. - Vol. 126. -P. 663 - 676.

244. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. 2007. - Vol. 131. - P. 861 -872.

245. Taylor C.T. Mitochondria and cellular oxygen sensing in the HIF pathway. // The Biochemical Journal. 2008. - 409. - P. 19 - 26.

246. Traineau R., Dal Cortivo L. Cord blood banks- unrelated transplants. // Transfus. Clin. Biol. 1998. - Vol. 5. -№.1. - P. 56-63.

247. Traynor A., Burt R.K. Haemotopoietie stem cells transplantation for active systemic lupus erythematosus. // Rheumatology (Oxford). 1999. - Vol. 38. - №8. - P. 767 - 772.

248. Trentin J.J. Determination of bone marrow stem cell differentiation by stromal hemopoietic inductive microenvironments (HIM). // American Journal of Pathology. -1971. Vol. 65. - №3. - P. 621 -. 628.

249. Tropel P., Noel D., Platet N. et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow. // Experimental Cell Research. 2004. Vol. 295. - №2. - P. 395 - 406.

250. Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering. // Arthritis Research and Therapy. 2003. Vol. 5. - №1. - P. 32 -45.

251. De Ugarte D.A., Alfonso Z., Zuk P. A. et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. // Immunology letters. 2003. - Vol. 89. - №2-3. - P. 267 - 270.

252. Valenick L.V., Hsia H.C., Schwarzbauer J.E. Fibronectin fragmentation promotes alpha4betal integrin-mediated contraction of a fibrin-fibronectin provisional matrix. // Experimental cell research. 2005. - Vol. 309. - P. 48 - 55.

253. Vaux E.C., Metzen E., Yeates K.M. et al. Regulation of hypoxia-inducible factor is preserved in the absence of a functioning mitochondrial respiratory chain. // Blood. 2001. - Vol. 98. - №2. - P. 296 - 302.

254. Verfaillie C.M. Direct contact between human primitive hematopoietic progenitors and bone marrow stroma is not required for long-term in vitro hematopoiesis. // Blood. 1992. - 79. - P. 2821 - 2826.

255. Verfaillie C.M. Soluble factor(s) produced by human bone marrow stroma increase cytokine-induced proliferation and maturation of primitive hematopoietic progenitors while preventing their terminal differentiation. // Blood. 1993. - 82. -2045-2053.

256. Villarruel S.M., Boehm C.A., Pennington M. et al. The effect of oxygen tension on the in vitro assay of human osteoblastic connective tissue progenitor cells. // Journal of Orthopaedic Research. 2008. - Vol. 26. - P. 1390 - 1397.

257. Vogel W., Griinebach F., Messam C.A., et al. Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells. // Haematologica. 2003. - Vol. 88. - №2. - P. 126 - 133.

258. Wagner J.E. Umbilical cord transplantation.// Lukemia. 1998. - Vol. 12. -Suppl. l.-P. S30-S32.

259. Wagner W., Saffrich R., Wirkner U. et al. Hematopoietic progenitor cells and cellular microenvironment: behavioral and molecular changes upon interaction. // Stem Cells.-2005.-Vol. 23.-8.-P. 1180-1191.

260. Wagner W., Wein F., Seckinger A. et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. // Experimental Hematology. 2005. - Vol. 33. - P. 1402 - 1416.

261. Wagner W., Roderburg C., Wein F., et al. Molecular and secretory profiles of human mesenchymal stromal cells and their abilities to maintain primitive hematopoietic progenitors. // Stem Cells. 2007. - Vol. 25. - P. 2638 - 2647.

262. Wagner W., Wein F., Roderburg C. et al. Adhesion of human hematopoietic progenitor cells to mesenchymal stromal cells involves CD44. // Cells Tissues Organs. -2008.-Vol. 188.-P. 160-169.

263. Wang G.L., Semenza G.L. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993. - 9. - P. 4304 - 4308.

264. Wang P.P., Wang J.H., Yan Z.P. et al. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004. - Vol. 320. - P. 712 - 716.

265. Walenda Т., Bork S., Horn P. et al. Co-culture with mesenchymal stromal cells increases proliferation and maintenance of hematopoietic progenitor cells. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2009. Published Online: 11 may 2009.

266. Wallace S.R., Oken M.M., Lunetta K.L. et al. Abnormalities of bone marrow mesenchymal cells in multiple myeloma patients. // Cancer. 2001. - Vol. 91. - P. 1219 - 1230.

267. Warejcka D.J., Harvey R., Taylor B.J. et al. A population of cells isolated from rat heart capable of differentiating into several mesodermal phenotypes. // The Journal of Surgical Research. 1996. - Vol. 62. - №2. - P. 233 - 242.

268. Watt S., Contreras M. Stem cell medicine: Umbilical cord blood and its stem cell potential. // Seminars in Fetal and Neonatal medicine. 2005. - Vol. 10. - P. 209 -220.

269. Wedekind C., Seebeck Т., Bettens F. et al. МНС-dependent mate preferences in humans. // Proceedings Biological Sciences. 1995. - Vol. 260. - P. 245 - 249.

270. Welte K., Gabrilove J., Bronchud M.H. et al. Filgrastim (r-metHuG-CSF): the first 10 years.//Blood. 1996.-Vol. 88.-P. 1907- 1929.

271. Wenger R.H., Gassmann M. Oxygen(es) and the hypoxia-inducible factor-1. // Biological Chemistry. 1997. - 7. - P. 609 - 616.

272. Wenger R.H. Cellular adaptation to hypoxia: Ог-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and Ог-regulated gene expression. // The FASEB Journal.-2002.-Vol. 16.-№10.-P. 1151-1162.

273. Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P. et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. // British Journal of Haematology. 2003. - Vol. 121. - P. 368 - 374.

274. Whetton A.D., Graham G.J. Homing and mobilization in the stem cell niche. // Trends Cell Biology. 1999 - Vol. 9. - P. 233 - 238.

275. Willam C., Schindler R., Frei U., Eckardt K.U. Increases in oxygen tension stimulate expression of ICAM-1 and VCAM-1 on human endothelial cells. // The American journal of physiology. 1999. - 276. - P. H2044 - 2052.

276. Wislet-Gendebien S., Hans G., Leprince P. et al. Plasticity of cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype. // Stem cells. 2005. - Vol. 23. - P. 392 - 402.

277. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J. et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. // Journal of Neuroscience Research. -2000. Vol. 61. - №4. - P. 364 - 370.

278. Woodbury D., Reynolds K., Black I.B. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. // Journal of Neuroscience Research. 2002. - Vol. 69. - P. 908 - 917.

279. Wu T.C. The role of vascular cell adhesion molecule-1 in tumor immune evasion. // Cancer Research. 2007. - Vol. 67. - P. 6003 - 6006.

280. De Wynter E.A., Buck D., Hart C. et al. CD34+AC133+ cells isolated from cord blood are highly enriched in long-term culture-initiating cells, NOD/SCID-repopulating cells and dendritic cell progenitors. // Stem Cells. 1998. - Vol. 16. - P. 387-396.

281. Xu W., Zhang X., Qian H. et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. // Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.) 2004. - Vol. 229. - №7. - P. 623 - 631.

282. Yamada M., Suzu S., Tanaka-Douzono M. et al. Effect of cytokines on the proliferation/differentiation of stroma-initiating cells. // Journal of Cellular Physiology. -2000.-Vol. 184.-№3.-P. 351 -355.

283. Yang L., Froio R.M., Sciuto Т.Е. et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. // Blood. 2005. - Vol. 106. - P. 584 - 592.

284. Yasuda M., Nakano K., Yasumoto K. et al. CD44: functional relevance to inflammation and malignancy. // Histology and Histopathology. 2002. - 17. - P. 945 -950.

285. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. - Vol. 318. - P. 1917 - 1920.

286. Zandstra P.W., Eaves C.J., Piret J.M. Expansion of hematopoietic progenitor cell populations in stirred suspension bioreactors of normal human bone marrow cells. // Bio/Technology. 1994. - Vol. 12.-909-914.

287. Zola H., Swart В., Banham A. et al. CD molecules 2006-human cell differentiation molecules. // Journal of Immunological Method. — 2007. Vol. 319. - P. 1-5.

288. Zscharnack M., Poesel C., Galle J. et al. Low oxygen expansion improves subsequent chondrogenesis of ovine bone-marrow-derived mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogel. // Cells Tissues Organs. 2009. - 2. - P. 81 - 93.

289. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A., Maini R.N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. // Arthritis Research. 2000. - 6. - P. 477 - 488.

Информация о работе

Жамбалова, Арюна Пурбодоржиевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Особенности взаимодействия культивируемых мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клеток человека в условиях пониженного содержания кислорода - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы