Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности реализации окислительного стресса в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках при различном содержании кислорода

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности реализации окислительного стресса в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках при различном содержании кислорода"

На правах рукописи

ЛОБАНОВА МАРГАРИТА ВАДИМОВНА

ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ПРИ РАЗЛИЧНОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА

03.03.01 - физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой сгепеии кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2015

Москва 2015

005562526

005562526

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН

Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета

Защита диссертации состоится ч^Яд, 2015 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Автореферат разослан Дс-г^гчл^&^О 15 г.

им. М.В. Ломоносова

Калинина Наталья Игоревна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории сравнительной физиологии дыхания Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Вётош Александр Николаевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Южный федеральный университет»

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) или мезенхимапьные стволовые клетки вызывают интерес исследователей с момента их открытия А.Я. Фриденштейном как колониеобразующих единиц фибробластов (Фриденштейн, 1970; Fridenstein, Gorskaja, Kalugina, 1976; Fridenstein, Chailakhjan, Lalikina, 1976). В ходе многочисленных работ было показано, что ММСК присутствуют в организме в качестве тканевого резерва, участвуя в физиологической и репаративной регенерации путем дифференцировки в различные типы клеток мезенхимального происхождения и выработки паракринных факторов, которые способствуют повышению выживаемости поврежденных клеток и активации резидентных прогениторов (Pittenger, Martin, 2004; Dazzi, Ramasamy, Glennie et al., 2006; Буравкова, Андреева, Григорьев, 2012; Wei, Yang, Han, 2013; Buravkova, Andreeva, Gogvadze et. al., 2014). По последним данным клетки со свойствами ММСК могут быть выделены практически из всех органов и тканей, при этом различия между ними невелики (Kolf, Cho, Tuan, 2007; Mafi, Hindocha, Mafi et al., 2011).

Показано, что ММСК являются перспективным инструментом, применимым в регенеративной медицине при лечении заболеваний, связанных с нарушением кровообращения (Al-Khaldi, Al-Sabti, Galipeau et al., 2003; Pittenger, Martin, 2004; Iwase, Nagayaa, Fujii et al., 2005; Nakagami, Maeda, Morishita et al., 2005; Moon, Kim, Kim et al., 2006). Однако эффективность применения клеточной терапии в данном случае зависит от устойчивости клеток к повреждающим воздействиям, среди которых важную роль отводят окислительному стрессу. Известно, что устойчивость клеток к окислительному стрессу определяется большим числом факторов, в том числе содержанием кислорода в среде при культивировании in vitro (Theus, Wei, Cui et al., 2008; Peterson, Aly, Lerman et al., 2011).

Традиционно ММСК культивируют в С02-инкубаторах, где уровень углекислого газа приближен к тканевому (5%), а содержание кислорода соответствует таковому в воздухе (20%), что многократно превышает значения in vivo. Несмотря на это, такие условия обозначают как нормоксические, а снижение содержания кислорода, в том числе до физиологических значений, называют гипоксией. Показано, что в условиях содержания Ог, близких к физиологическим (4-7%) (Fehrer, Brunauer, Laschober et al., 2007; Гринаковская, Андреева, Буравкова и др., 2009; Pattappa, Heywood, de Bruijn et al., 2011), и при его значительном снижении (до 1%) клетки поддерживаются в менее коммитированном состоянии (Basciano, Nemos, Foliguet, 2011). В то же время культивирование при 1% Ог повышает пролиферативную активность (Weijers, Van Den Broek, Waaijman et al., 2011; Рылова, Буравкова, 2013). До сих пор нет единого мнения о том, какую концентрацию

кислорода необходимо использовать при культивировании ММСК (МоЬуеЫт, Оаггоп-Миу(11, Ошпопев-Нто^а, 2010; Вее§1е, Ьакакк, Ка1отот8 е1 а1., 2015).

Особого внимания требует изучение влияния содержания кислорода на функционирование ММСК в условиях окислительного стресса. Перспектива применения ММСК при лечении заболеваний, сопровождающихся ишемией и гипоксией, обусловливает необходимость проведения исследований, посвященных устойчивости ММСК к окислительному стрессу и оптимизации условий культивирования.

Цель и задачи исследования

Цель работы: оценка показателей окислительного стресса и энергетического метаболизма в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСК) из жировой ткани человека при культивировании в среде с различным содержанием кислорода.

Задачи:

1. Исследование устойчивости ММСК к окислительному стрессу при различном содержании кислорода в среде культивирования.

2. Изучение про- и антиоксидантной активности ММСК при культивировании в условиях 20%, 5% и 1% Ог и его кратковременном изменении.

3. Исследование влияния парциального напряжения кислорода в среде культивирования на функциональное состояние митохондрий ММСК.

4. Анализ уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией, в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода от 20% до 1%.

5. Определение динамики уровня экспрессии генов а-субъединиц транскрипционных факторов семейства ЮТ в ММСК при постоянном культивировании в среде с 20%, 5% и 1% кислорода и его кратковременном изменении.

Научная новизна

Получены новые данные, свидетельствующие о меньшей активности ферментов антиоксидантной защиты и концентрации ТБК-активных продуктов в культивируемых ММСК при 5% кислорода по сравнению с 20% и 1% О2.

Впервые показано, что ММСК, постоянно культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода более устойчивы к моделируемому окислительному стрессу (Н2О2) по сравнению с клетками, культивируемыми в условиях, близких к тканевым (5% Ог).

Впервые продемонстрировано, что увеличение экспрессии гена Н1Р-1а в ММСК происходит на ранних этапах снижения содержания О2, а продолжительность его зависит от степени выраженности гипоксии. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК Н1Р-1а сопровождается ростом экспрессии гена Н1р-3а.

Получены новые данные, свидетельствующие о снижении количества потребляемого кислорода, трансмембранного потенциала митохондрий, синтеза АТФ, а также активации гликолиза в ММСК при понижении уровня О2, что сопровождается увеличением экспрессии генов переносчиков глюкозы 5ХС24/, ЗЬС2Л4 и глюкозо-6-фосфат-изомеразы СР1.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование позволило продемонстрировать влияние содержания кислорода в среде культивирования на редокс-статус ММСК, что имеет большое значение для развития фундаментальных и прикладных исследований в области регенеративной медицины.

Полученные в настоящей работе данные показали, что наименее повреждающее действие на культивируемые ММСК оказывает среда с содержанием кислорода 5%, при этом устойчивость к окислительному стрессу возрастает при культивировании в условиях 20% и 1% 02.

Экспериментальные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов адаптации прогениторных клеток к гипоксии. ММСК быстро адаптируются к уменьшению содержания кислорода в среде: через 24 ч после снижения О2 наблюдается изменение экспрессии большинства генов, функционирующих в условиях гипоксии и участвующих в процессах пролиферации, гликолиза и апоптоза Наиболее активно в ответ на снижение содержания кислорода изменяется экспрессия металлотионеина МТЗ.

Положения, выносимые на защиту

1. ММСК, культивируемые при повышенном (20%) и пониженном (1%) содержании кислорода испытывают слабый окислительный стресс, который сопровождается увеличением активности антиоксидантной системы ММСК, следствием чего является повышение устойчивости клеток к моделируемому окислительному стрессу.

2. В ММСК при 5% и 1% кислорода происходит снижение функциональной активности митохондрий, что проявляется в снижении уровня потребления кислорода, величины трансмембранного потенциала и продукции АТФ, клетки поддерживают нормальный метаболизм и жизнеспособность за счет увеличения вклада гликолиза.

3. В ММСК увеличение экспрессии гена Н1Р-1а происходит только на ранних этапах снижения содержания О2, а его продолжительность зависит от степени выраженности воздействия. Дальнейшее уменьшение содержания мРНК Н1Г-1а сопровождается ростом экспрессии гена ШР-За.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на XI, XII, XIII и XIV Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню Космонавтики (Москва, 2012, 2013, 2014, 2015), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), 7th Fraunhofer Life Science Symposium associated with the 7th Annual Congress of the German Society for Stem Cell Research (GSZ) (Leipzig, Germany, 2012), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013), V Всероссийской научно-практическая конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), 9th Fraunhofer Life Science Symposium (Leipzig, Germany, 2014), Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society EU (Genova, Italy, 2014).

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 7 статей в журналах из перечня ВАК РФ.

Работа выполнена при поддержке программы Отделения физиологии РАН и гранта РФФИ № 14-04-32267 мол_а.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН, протокол № 5 от 19 мая 2015 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 120 страницах машинописного текста, сопровождается 38 рисунками и 14 таблицами. Список литературы содержит 283 источника, из них 35 на русском и 248 на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека. Для получения первичной культуры использовали метод Zuk, Zhu, Mizuno et al. (2001) с модификациями Буравковой, Гринаковской, Андреевой и соавт. (2009). ММСК культивировали в среде а-МЕМ (Gibco, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyCIone, США) и раствор антибиотика пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация в среде составляла 50 ед/мл и 50 мг/мл соответственно) (ПанЭко, Россия). Плотность посадки составляла Зх 103 клеток/см2.

Для проведения экспериментов использовали ММСК 2-6 пассажей со стабильной экспрессией HLA-ABC, CD105, CD73, CD90, CD54, CD106, CD9, не несущие CD45, CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit) и HLA-DR, постоянно культивируемые в стандартных условиях СОг-инкубатора (75% N2, 5% СО2, 20% О2), мультигазового инкубатора (Sanyo, Япония) (90% N2, 5% СОг, 5% Ог) и герметичной камеры (Stem Cell

Technologies, Канада) с кислородным датчиком, в которой воздух замешали газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до достижения концентрации кислорода в среде 1%.

Окислительный стресс моделировали добавлением в ростовую среду раствора перекиси водорода (Sigma, США) в PBS (диапазон конечных концентраций от 0,5 до 30 пМ/кл ). Через 24 ч от начала воздействия изучали жизнеспособность ММСК и вычисляли концентрацию Н2О2, соответствующую LD5, LD15 и LD50.

Параметры функционирования ММСК определяли при постоянном культивировании в условиях 20%, 5%, 1% О2, а также через 3-24 ч после изменения содержания кислорода в изучаемых пределах или действия окислительного стресса, индуцируемого Н2О2.

Характеристика ММСК из жировой ткани человека. Методом проточной цитофлуориметрии (Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США)) оценивали жизнеспособность ММСК по количеству апоптотических и некротических клеток с использованием набора Annexin V-FITC/PI (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя и уровень АФК в клетках с помощью 2'7'-дихлорфлуоресцеин диацетата (H2DCFDA) (Sigma, США) в конечной концентрации 20 цМ.

Для определения содержания ТБК-акгивных продуктов и активности ферментов из ММСК готовили лизаты с помощью M-PER Plus Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit (Thermo Scientific, США) согласно инструкции производителя и методом Бредфорд определяли содержание белка

Определение уровня ТБК-активных продуктов в лизатах проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой в присутствии ТХУ. Концентрацию ТБК-активных продуктов выражали в мкМ МДА/мг белка, используя коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК (1,56*105 М" см" ).

Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли с помощью методики Королюка, Ивановой, Майоровой (1988) и выражали в мкМ НгОг/мин. на 1 мкг клеточного белка, используя коэффициент миллимолярной экстинкции Н2О2 (22,2*103 мМ 'см"1).

Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия (HCT) в неэнзиматической системе феназинметасульфата (ФМС) и НАДН (Матюшин, Логинов, Ткачев, 1991). За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50%-го ингибирования восстановления HCT. Расчет вели по формуле:

Е = (100 - Ео* 100 / Ек) / 50 * мкг белка, где Ео и Et - среднее значение прироста экстинции за 1 мин. в опытной и контрольной пробах соответственно. Активность СОД выражали в усл. ед. на 1 мкг белка.

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9) проводили по методике, описанной Кондрахиным (2004), и выражали в мкМ восстановленного глутатиона / мин мкг белка.

Выявление митохондрий и определение в них трансмембранного потенциала осуществляли методами проточной цитофлуориметрии (Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США)) и конфокальной микроскопии (LSM 780 (Zeiss, Германия)) с помощью митотрекеров JC-1, Mitotracker Red FM (Invitrogen, США) в конечных концентрациях 5 мкМ и 500 нМ соответственно.

Интенсивность клеточного дыхания ММСК анализировали с помощью системы для измерения потребления кислорода OxygraphPlus (Hansatech Instruments, Великобритания). В течение 3-4 мин измеряли уровень базапьного дыхания (4 млн клеток в пробе), затем добавляли 5 мкМ разобщителя окислительного фосфорилирования карбонилцианид-3-хлорфенилгидразона (СССР) (Sigma, США) и оценивали максимальную скорость дыхания ММСК.

Анализатор клеточного метаболизма XFe Seahorse Bioscience (Seahorse Bioscience, США) был использован для более детального изучения процессов дыхания в ММСК. С помощью набора XF Cell Mito Stress Test (Seahorse Bioscience, США) согласно инструкции производителя помимо базального и максимального дыхания исследовали такие параметры

как вклад митохондриального дыхания в синтез АТФ, немитохондриальное потребление кислорода и дыхание, необходимое на поддержание мембранного потенциала, не расходуемого на синтез АТФ.

Уровень АТФ в клетках оценивали с использованием набора ATP bioluminescent somatic cell assay kit (Sigma, США) согласно инструкции производителя.

Данные конфокальной микроскопии получены совместно с д.м.н. C.B. Буравковым (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова). Результаты экспериментов по определению уровня АТФ и параметров клеточного дыхания получены совместно с д.б.н. В.Г. Гогвадае (ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова).

Определение уровня экспрессии генов в ММСК. Выделение тотальной РНК проводили с использованием лизирующего реагента QIAzol (Qiagen, США) согласно инструкции производителя. Получение кДНК на основе выделенной РНК в реакции обратной транскрипции осуществляли с помощью набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, США). Реакция обратной транскрипции производилась в течение 30 мин при 42°С, после чего обратную транскриптазу QuantyScript Reverse Transcriptase инактивировали 4 минуты при 95°С.

Для определения уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией, в ММСК использовали набор RT2 Profiler™ PCR Array Human Hypoxia Signaling Pathway (Qiagen, США). Для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени использовали RT2 - Real Time SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen, США). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл, количество кДНК в пересчете на одну реакцию - 500 нг. Для нормализации результатов исследования использовались хаускиппинг-гены (АСТВ, В2М, HPRT1, RPLP0), входящие в состав набора.

Для определения уровня экспрессии генов HlF-la и HIF-За использовали набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green 1 (Синтол, Россия). Ген гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) был использован в качестве хаускиппинг-гена. Специфичность проводимой реакции определялась с помощью анализа кривой плавления продуктов амплификации в диапазоне от 55°С до 95°С с шагом в 1 градус.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 7.0. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего. Для оценки относительного уровня экспрессии HIF-la использовали метод 2~iiCt. Достоверность различий между группами оценивали на основе критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р < 0,05. Обработка данных, полученных в экспериментах с использованием наборов RT2 Profiler™ PCR Array, осуществлялась с помощью программного обеспечения, доступного на сайте производителя (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php).

Результаты исследования и их обсуждение Характеристика ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%)

Исследуемый диапазон содержания кислорода не влиял на жизнеспособность ММСК из жировой ткани человека, доля неповрежденных клеток при постоянном культивировании в среде с 20%, 5% и 1% 02 превышала 90%.

Определение содержания активных форм кислорода (АФК) в ММСК не выявило достоверных различий между клетками, постоянно культивируемыми в условиях 20%, 5% и 1% Ог, однако наблюдалась тенденция к увеличению их содержания при повышенном и пониженном Ог по сравнению с условиями, близкими к физиологическим (5% Ог) (Рис. 1).

Рис. 1. Уровень АФК в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. Данные репрезентативного эксперимента, п=6.

Интенсивность флуоресценции Определение содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 20%, 5% и 1% 02 выявило их наименьшую концентрацию при культивировании клеток в условиях 5% содержания кислорода (рис. 2). В клетках при 20% О2 данный показатель составлял 0,57±0,14 мкМ МДА/мг белка.

X

а 2 -I----------------

! И «8

! и ; 1,5

« ^ р 1

а о °

^ I й 0,5

й с о

I г 1-

га ьг и

1 § а

а. £•

ш

20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 2. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. * - р<0,01 относительно величины содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 20% 02.

Полученные данные не противоречат результатам по изучению содержания АФК в ММСК, представленным выше, и указывают на сниженный уровень окислительного стресса при культивировании клеток в условиях 5% кислорода. В ММСК при данных условиях выявлены отличия в функционировании антиоксидантной системы по сравнению с клетками при 20% Ог и 1% 02 (табл. 1): обнаружено снижение уровня активности СОД и ГП, активность каталазы достоверно не изменялась, однако, в целом сохранялась тенденция к ее уменьшению.

Таблица 1.

Активность ферментов антиоксидантной системы в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода.

Фермент 20% 02 5% 02 1%02

Каталаза (КФ 1.11.1.6), мкМ Н2Оз/мин-мкг белка 5,86±0,92 4,65±0,79 5,97±0,99

СОД(КФ 1.15.1.1), у.е./мкг белка 0,077±0,004 0,057±0,001 * 0,065±0,002

ГП(КФ 1.11.1.9), мкМ восстановленного глутатиона/ мин-мкг белка 0,0038±0,0001 0,0026±0,0003* 0,003 7±0,0001

* - р<0,01 относительно активности ферментов в ММСК при 20% и 1% 02.

При изучении трансмембранного потенциала ММСК методами проточной цитофлуориметрии с помощью Mitotracker Red FM было показано уменьшение величины данного показателя при снижении содержания 02 в среде культивирования (рис. 3).

20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 3. Трансмембранный потенциал митохондрий ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. * - р<0,01 относительно величины трансмембранного потенциала митохондрий ММСК при 20% 02.

Как видно на рис. 4, ММСК в условиях атмосферного содержания кислорода содержат большее количество активных митохондрий по сравнению с клетками, постоянно культивирующимися при 5% СЬ, что соответствует результатам, полученным с помощью проточной цитофлуориметрии.

'i.'-tfZ;-

Рис. 4. Трансмембранный потенциал митохондрий ММСК при постоянном культивировании в среде с содержанием кислорода 20% (А) и 5% (Б). Клетки окрашены .1С-1. Длина масштабного отрезка 20 мкм.

Полученные результаты по снижению трансмембранного потенциала митохондрий в ММСК при 5% и 1% 02 подтверждают выявленное ранее уменьшение потребления глюкозы и увеличение соотношения между количеством продукции лактата и потребленной глюкозы (Буравкова, Рылова, Гальчук и др., 2011).

Оценка потребления кислорода митохондриями показала заметное подавление дыхания при низких концентрациях 02. Наиболее активное снижение поглощения кислорода ММСК

наблюдалось в условиях 1% кислорода (рис. 5). Очевидно, что в результате этого в ММСК при 5% и 1% Ог наблюдалось снижение трансмембранного потенциала митохондрий, показанное нами ранее.

Рис. 5. Базапьная и максимальная (после добавления разобщителя окислительного фосфорилирования СССР) интенсивность потребления Ог ММСК в среде с различным содержанием кислорода.

20% 5% 1% Содержание кислорода в среде культивирования

i Базальное дыхание ЕЭ +СССР

Как следствие подавления активности митохондрий в условиях пониженного содержания кислорода снизился и уровень АТФ (рис. б, А). Оценка вклада гликолиза в процесс образования АТФ показала, что по сравнению с 20% в условиях 5% Ог данный показатель несколько увеличивается, а при 1% кислорода вырастает почти в два раза (рис. 6, Б). Также показано, что условия содержания кислорода, близкие к физиологическим (5%), способствуют некоторому снижению доли АТФ, образующейся в результате окислительного фосфорилирования, в то время как при пониженном содержании Ог действие ингибитора АТФ-синтазы олигомицина практически не влияет на общий уровень АТФ в клетках (рис. 6, В), что свидетельствует о значительном уменьшении вклада окислительного фосфорилирования в синтез АТФ.

S 15

£ m <

S 5 1

О M

О

S 0

m

! g 80 | I 60

I 1 40

° S 20 |■ в В

« I °

© i

f- 2 <

1 Û *

20% 5% 1%

Содержание кислорода в среде культивирования

В S о ою

20% 5%

1%

20%

5%

1%

Содержание кислорода в среде культивирования

В

Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 6. АТФ в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода. А - общее содержание АТФ; Б - доля АТФ, образующейся в результате гликолиза; В - уровень АТФ, образующейся в результате окислительного фосфорилирования. * - р<0,01 относительно уровня АТФ в ММСК при 20% 02.

Анализ экспрессии ряда апоптоз-ассоциированных генов не выявил отличий от контроля (20% 02) в ММСК при культивировании в среде с содержанием кислорода 5% (табл. 2), а при

1% Oj было обнаружено снижение экспрессии индукторов апоптоза (ВАХ, DAPK3), что согласуется с данными о высоком уровне жизнеспособности клеток при достаточно низком содержании О2 (табл. 3).

В среде культивирования с пониженным содержанием кислорода в ММСК наблюдается увеличение экспрессии гена глюкозного транспортера 1 (SLC2A1), с чем, вероятно, связана стимуляция поглощения глюкозы клетками (Dos Santos, Andrade, Boura et al., 2010). Помимо этого при 5% Ог увеличивается экспрессия другой изоформы данного транспортера -SLC2A4, а в условиях 1% Ог возрастает экспрессия гена глюкозо-6-фосфат изомеразы, что хорошо согласуется выявленным переключением энергетического матаболизма с окислительного на гликолитический.

Нами было показано, что при пониженном содержании кислорода для ММСК, как и для некоторых других типов клеток (Yamasaki, Nomura, Sato et al., 2007), характерно увеличение экспрессии гена МТЗ, продукт которого вовлечен в процессы хелатирования металлов, клеточной пролиферации и апоптоза. Наиболее значительно (в 9,95 раза) количество мРНК МТЗ возрастало при культивировании клеток в условиях гипоксии (1% Ог).

Особое внимание следует обратить на то, что при 1% Ог в ММСК в 2 раза повышается экспрессия гена VEGFA, продукт которого не только активирует ангиогенез, но и способствует пролиферации, а также оказывает антиапоптотическое действие, что делает ММСК применимыми в клеточной терапии (Pons, Huang, Arakawa-Hoyt et al., 2008). Помимо этого в данных условиях для ММСК показано увеличение экспрессии лептина. Как известно, лептин стимулирует пролиферацию, в том числе и стволовых клеток, и участвует в регуляции процессов дифференцировки и секреции цитокинов (Gainsford, Willson, Metcalf et al., 1996).

Таблица 2.

Изменение экспрессии генов в ММСК при постоянном культивировании в среде с 5% Ог*.

RefSeq Символ гена Название продукта Экспрессия гена относительно клеток в 20% 02, кратность различий

NM 001042 SLC2A4 Глюкозный транспортер 4 2,90

NM 005954 МТЗ Металлотионеин 3 2,39

NM 006516 SLC2A1 Глюкозный транспортер 1 2,15

NM 000575 ILIA Интерлейкин 1, альфа 1,72

NM_003670 BHLHE40 Белок е40 семейства транскрипционных факторов с основным доменом типа спираль-петля-спираль 1,61

NM_441047 ADM Адреномедуллин -1,80

'Представлены гены, экспрессия которых достоверно (р<0,05) изменилась более чем в 1,5 раза.

Таблица 3.

Изменение экспрессии генов в ММСК при постоянном культивировании в среде с 1% Ог*.

Refseq Символ гена Продукт гена Экспрессия гена относительно клеток в 20% Ог, кратность различий

NM 005954 МТЗ Металлотионеин 3 9,95

NM 000612 IGF2 Инсулиноподобный фактор роста 2 7,81

NM_152794 HIF3A Гипоксия-индуцируемый фактор 3, а-субъединица 4,07

NM 000230 LEP Лептин 3,16

NM 006516 SLC2A1 Глюкозный транспортер 1 2,22

NM_003376 VEGFA Сосудистый эндотелиальный фактор роста А 2,07

NM_003670 BHLHE40 Белок е40 семейства транскрипционных факторов с основным доменом типа спираль-петля-спираль 2,01

NM 000575 ILIA Интерлейкин 1, а 1,93

NM 000088 GPI Глюкоза-6-фосфат изомераза 1,59

NM 033292 CASP1 Каспаза 1 -2,79

NM 001430 EPAS1 Эндотелиальный белок-1, -2,41

содержащий PAS-домен (HlF-2a)

NM 001168 BIRC5 Сурвивин -2,11

NM 002133 HMOX1 Гемоксигеназа 1 -1,97

NM 000581 GPXl Глютатионпероксидаза 1 -1,89

NM 017617 NOTCH1 Notch 1 -1,88

NM_001348 DAPK3 Гибель-ассоциированная протеинкиназа 3 -1,76

NM_441047 ADM Адреномедуллин -1,52

'Представлены некоторые гены, экспрессия которых достоверно (р<0,05) изменилась более чем в 1,5 раза.

Таким образом, в условиях 5% 02 по уровню экспрессии исследуемых генов клетки незначительно отличались от таковых при 20% О2, несмотря на выраженные изменения морфологии и пролиферативной активности (Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б., 2013). При культивировании в среде с низким содержанием 02 (1%) помимо изменения экспрессии генов, кодирующих проапоптотические белки, регуляторы метаболизма и пролиферации, повышается уровень экспрессии генов ряда паракринных факторов, благодаря чему ММСК могут более эффективно поддерживать жизнеспособность в условиях гипоксии и участвовать в регенеративных процессах.

Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода При изучении краткосрочных эффектов изменения содержания кислорода в среде культивирования использовали как понижение процентного содержания кислорода в газовой фазе с 20% и 5% до 1% (моделирование гипоксии), так и повышение - с 1% до 5% и 20% Ог (моделирование реоксигенации). Ни один из вариантов 24-часового изменения содержания

кислорода в среде культивирования не оказывал влияния на жизнеспособность ММСК из жировой ткани человека.

В отличие от клеток, постоянно культивируемых при разном Ог, кратковременное изменение его содержания повлияло на содержание АФК в ММСК. Наиболее восприимчивыми к изменению уровня кислорода оказались клетки, постоянно культивируемые при 5% Ог. Как повышение уровня Ог до 20%, так и снижение до 1% сопровождались возрастанием количества АФК (рис. 7). Кратковременное снижение кислорода с 20% до 5% приводило к уменьшению АФК в клетках на 40%.

Рис. 7. Содержание АФК в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%. * - р<0,01 относительно содержания АФК в ММСК при 5% 02.

Как в экспериментах по изучению постоянного культивирования ММСК в условиях разного содержании кислорода, так и при кратковременном его изменении было показано, что наиболее низкий уровень ТБК-активных продуктов наблюдался в среде с 5% О2. Через 24 ч после перемещения клеток из указанных условий в 20% и 1% Ог в обоих случаях этот показатель достоверно увеличивался в 1,75-2 раза (рис. 8).

Рис. 8. Содержание ТБК-активных продуктов в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%.

* - р<0,01 относительно величины содержания ТБК-активных продуктов в ММСК при 5% Ог.

Кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования ни в одном из случаев не приводило к достоверным изменениям активности каталазы.

Снижение содержания кислорода с 20% до 5% в течение 24 ч и до 1% на 3 ч и 6 ч сопровождалось уменьшением активности СОД на 20-40%. Наиболее выраженным было

14

5 !«Г>: н о ;

^ 2 !

* I!

& В- !

3

5% 5%-20% 5%-1% 24ч 24ч

Содержание кислорода в среде культивирования

изменение уровня этого фермента при уменьшении содержания кислорода до 5% в течение 24 ч. Напротив, выраженная гипоксия (1%) через 24 ч вызывала восстановление активности СОД до контрольных значений. Клетки, постоянно культивируемые в условиях, близких к физиологическим (5% Ог), при увеличении и уменьшении значений данного показателя в большинстве случаев характеризовались повышенной активностью СОД (рис. 9).

и

lige 1 " е °'5

р о

° I 0

| g- 5% 5%-20% 5%-20% 5%-20% 5%-Г/. 5%-1% 5%-1%

Ц Зч 6ч 24ч Зч 6ч 24ч

<

Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 9. Активность СОД в ММСК при кратковременном

изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%.

* - р<0,01 относительно величины активности СОД в ММСК при 5% 02.

Кратковременное изменение содержания кислорода в среде культивирования также способствовало значительному изменению активности глугатионпероксидазы. Снижение данного показателя наблюдалось во всех случаях кратковременного уменьшения содержания кислорода в среде с 20%. Кратковременное увеличение или уменьшение содержания кислорода с 5%, напротив, практически на всех рассматриваемых временных промежутках сопровождалось увеличением активности ГП. При этом можно отметить тенденцию к максимальному возрастанию данного показателя (на 25%) при атмосферном содержании кислорода (рис. 10).

1.5

и

I! «-• ?

С S 0,5 ■

m

ш

% 5%-20% 5%-2С% 5%-20% 5%-1% 5%-1% 5%-1'/. Зч 6ч 24ч Зч 6ч 24ч Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 10. Активность ГП в ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 5% до 20% и 1%. * - р<0,01 относительно величины активности ГП в ММСК при 5% Ог.

Изучение трансмембранного потенциала митохондрий в условиях кратковременного снижения содержания кислорода показало, что уменьшение данного показателя на 25-30% наблюдается уже через 6 часов после воздействия на ММСК, культивируемые при атмосферном О2 (рис. 11). Достоверных различий в степени снижения трансмембранного потенциала митохондрий при действии на клетки 5% и 1% 02 не обнаружено. Судя по

трансмембранному потенциалу, функциональное состояние митохондрий существенно не изменяется при увеличении и уменьшении содержания кислорода в клетках, постоянно культивируемых в условиях 5% и 1%.

я ^ 13: 1

о я |

ё о.б

? 8 н

Ни Й 0,4

Ж.

20% 20%-5%, 20%-5%, 20%-1%, 20%-]%, 6 ч 24 ч 6 ч 24 ч Содержание кислорода в среде культивирования

Рис. 11. Величина трансмембранного потенциала митохондрий ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода с 20% до 5% и 1%. * - р<0,01 относительно величины трансмембранного потенциала при 20% Ог.

Далее в нашей работе изучались параметры дыхания клеток, которые постоянно культивировали в условиях 20%, 5% и 1% Ог, а затем переносили в среду с 5% или атмосферным содержанием кислорода.

Результаты показали, что даже через 48 ч пребывания в условиях атмосферного содержания кислорода дыхание в ММСК, ранее культивируемых при 5% и 1% О2, отличалось от такового в клетках при 20% Ог (рис. 12). Для клеток, культивируемых при 5% О2, скорость максимального дыхания увеличилась по сравнению с исходной и даже несколько превышала потребление кислорода после воздействия разобщителя окислительного фосфорилирования СССР клетками при атмосферном Ог. Однако, в случае клеток, культивируемых ранее в условиях 1% 02, скорость максимального потребления кислорода оставалась пониженной. Параметры АТФ-связанного и немитохондриального дыхания, изучаемые при действии ингибитора АТФ-синтазы олигомицина и блокировании дыхательной цепи смесью ротенона и антимицина, не изменялась.

Рис. 12. Интенсивность потребления О2 ММСК при кратковременном изменении содержания кислорода

с 5% и 1% до 20%. * - р<0,01 - относительно скорости потребления кислорода при 20% Ог.

20% 5%-20%, 48 ч 1% - 20%, 48 ч

Содержание кислорода в среде культивирования

И Базальное дыхание И СССР

О Олигомицин В Ротенон+антимицин

Для анализа ранних (до 24 ч) эффектов пониженного содержания кислорода в ММСК была определена временная динамика уровня мРНК Н1Р-1а и Н1Р-За в ММСК. Снижение кислорода с 20% до 5% вызывало достоверное увеличение экспрессии Н1Р-1а (рис. 13).

Рис. 13. Динамика изменения экспрессии Н1Р-1а в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода с 20% до 5% и 1%. ■-р< 0,01 относительно экспрессии Я/А/а в ММСК при 20% 02.

Условия культивирования

снижение содержания кислорода с 20% до 5% снижение содержания кислорода с 20% до 1 %

Эффект нарастал с 15 до 30 минуты (1,52±0,15 - 1,31±0,13), затем стабилизировался до 8 часов, после чего снижался, достигая минимума (0,6±0,02 по отношению к уровню экспрессии HIF-la в контроле). Снижение кислорода с 20% до 1% приводило к аналогичному по величине (1,5±0,04), но более быстрому увеличению экспрессии HIF-la в ММСК. Однако, уже через 30 мин началось уменьшение экспрессии, в результате чего через час исследуемый показатель не отличался от контроля (20% 02), а к 4 часам уровень мРНК HIF-la достоверно снизился. Таким образом, мы показали, что максимальное увеличение транскрипции HIF-la в ММСК наблюдалось на разных временных отрезках в зависимости от степени выраженности гипоксического воздействия. Наиболее быстрая, но непродолжительная (до 1 ч) реакция была выявлена в клетках при снижении содержания кислорода с 20% до 1%. При воздействии менее жесткой гипоксии (5% 02) обнаружено более продолжительное возрастание транскрипции HIF-la, достигающее максимума к 8 ч от воздействия. При этом выраженность увеличения количества мРНК не зависела от степени гипоксии, по крайне мере в пределах 1-5% 02.

Необходимо отметить, что во всех экспериментах после 24-часовой экспозиции ММСК в гипоксической среде экспрессия HIF-la характеризовалась пониженным уровнем по сравнению с исходным. Эти данные совпадают с результатами Bohan Wang и соавт., также обнаружившими четырехкратное снижение уровня мРНК субъединицы 1а данного транскрипционного фактора в адипоцитах после аналогичного воздействия. Стоит отметить, что такое же снижение было зарегистрировано и при постоянном культивировании ММСК в 1% 02. Тот факт, что экспрессия HIF-la после 24 ч экспозиции при 5% 02 и при постоянном культивировании в условиях «физиологической гипоксии» различалась, может указывать на

медленный процесс нормализации экспрессии данной субъединицы транскрипционного фактора при увеличении длительности воздействия гипоксии.

Изучение временной динамики экспрессии т!ША Н!Р-За выявило стабильный рост при кратковременном снижении содержания кислорода как до 5%, так и до 1% (рис. 14). При этом в первом случае наблюдался более ранний, но менее выраженный ответ (максимум в 2,2 раза). В ММСК, кратковременно помещенных в условия с низким содержанием кислорода (1%), экспрессия гена Н1Р-За интенсивно нарастала со временем, начиная с 4 часа (максимум в 17 раз).

а 25 "

1*. 'з

£ 20 "

1 и Е=

5 у О 15

6 о

ю -

а ■ Е

1 <ч в- 5 "

£ Г) 0

^ Условия культивирования

-•- снижение содержания кислорода с 20% до 5% снижение содержания кислорода с 20% до 1%

Рис. 14. Динамика изменения экспрессии Н1Р-За в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода

с 20% до 5% и 1%. *-р<0,01 относительно экспрессии НШ-За в ММСК при 20% 02.

Таким образом, Н1Р-1а, являясь одним из наиболее чувствительных компонентов механизма клеточного ответа, обеспечивает приспособление ММСК к гипоксии, быстрота которого зависит от степени снижения содержания кислорода в среде. Вероятно, после активации генов-мишеней экспрессия Н1Р-1а подвергается негативной регуляции Н1Р-За, что способствует поддержанию транскрипции данного гена на уровне ниже конституциональной экспрессии при 20% 02 в 1,5-2 раза.

Для сравнения эффектов длительного и кратковременного воздействия пониженного содержания 02 были проанализированы транскриптомные изменения 84 гипоксия-ассоциированных генов. Кратковременное снижение содержания кислорода в среде культивирования с 20% до 1% на 24 часа вызывало изменение экспрессии 29,7% исследуемых генов. Большая их часть перекрывается с генами, функционирование которых в ММСК изменилось при постоянном культивировании в условиях содержания 02 1% (табл. 3), что свидетельствует о быстрой адаптации исследуемых клеток к гипоксии. При этом значительно (более чем в 2 раза) изменялась экспрессия 7 генов, что составляет 8,3% от общего количества (табл. 4).

В отличие от клеток, постоянно культивируемых в условиях 1% 02, в данном случае происходит изменение экспрессии меньшего числа генов, продукты которых участвуют в

апоптозе. После 24-часового воздействия пониженного содержания кислорода наблюдалось снижение количества мРНК гена индуктора апоптоза ОАРКЗ, что соотносится с высоким уровнем жизнеспособности ММСК. Одновременно наблюдается активация генов, продукты которых участвуют в процессе гликолиза. Так, практически в 2 раза увеличивается экспрессия альфа-енолазы ЕЫО! и глюкоза-6-фосфат изомеразы С1Р1. Также необходимо отметить обнаруженное увеличение экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы вАРИН - гена, экспрессия которого зачастую используется для нормализации результатов ПЦР. В отличие от клеток, постоянно культивируемых при 1% кислорода, краткосрочное снижение значения данного параметра до аналогичного уровня привело к более значительным изменениям экспрессии генов ЬЕР и МТЗ. Стоит отметить отрицательную регуляцию гена субъединицы гипоксия-индуцируемого фактора Н1Р-2а. Вероятно, как и в случае с уровнем /ЯГ-/а, экспрессия Н1Р-2а подвергается негативной регуляции ШГ-За, что способствует поддержанию необходимого уровня транскрипции данного гена.

Таблица 4.

Изменение экспрессии генов в ММСК при снижении содержания кислорода в среде

с 20% до 1% на 24 ч - положительная и отрицательная регуляция*.

Refseq Символ гена Продукт гена Экспрессия гена относительно клеток в 20% 02, кратность различий

NM 005954 МТЗ Металлотионеин 3 38,73

NM 000230 LEP Лептин 7,09

NM_152794 HIF3A Гипоксия-индуцируемый фактор 3, а-субъединица 4,30

NM 001428 ENOl Енолаза 1 (альфа) 2,06

NM 000088 GPI Глюкоза-6-фосфат изомераза 1,90

NM 002046 GAPDH Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа 1,86

NM_002067 GNA11 Гуанин нуклеотид-связывающий белок (G-белок), альфа 11 (Gq класс) -2,35

NM 033292 CASP1 Каспаза 1 -2,29

NM 003685 KHSRP Регуляторный белок сплайсинга КН типа -2,23

NM_001430 EPAS1 Эндотелиальный белок-1, содержащий PAS-домен (HIF-2a) -1,80

NM 017617 NOTCH1 Notch 1 -1,76

NM 003128 SPTBNl Неэритроидный бета-спектрин 1 -1,70

NM 001348 DAPK3 Гибель-ассоциированная протеинкиназа 3 -1,63

NM 001530 HIFIA Гипоксия-индуцируемый фактор 1, а-субъединица -1,55

♦Представлены некоторые гены, экспрессия которых достоверно (р < 0,05) изменилась более чем в 1,5 раза.

Таким образом, изучение экспрессии гипоксия-ассоциированных генов в ММСК при кратковременном снижении содержания кислорода с 20% до 1% свидетельствует о быстрой адаптации клеток к гипоксии. Увеличение экспрессии генов, продукты которых принимают участие в процессах гликолиза, а также активация экспрессии металлотионеина и лептина могут обуславливать повышенные адаптивные возможности и терапевтический потенциал ММСК при гипоксическом прекондиционировании.

Влияние Н202 на ММСК При исследовании чувствительности ММСК к окислительному стрессу, вызванному широким диапазоном концентраций Н202, было выявлено, что для клеток, культивируемых при 20% 02, LD15 и LD50 составляют 10,7±1,45 и 13,3±0,83 пмоль/кл„ для ММСК при 1% 02 - 11,2±0,73 и 13,7±0,33 пмоль/кл. соответственно. При 5% 02 чувствительность к действию Н202 возрастала, показатель LD15 зарегистрирован на уровне 8±1 пмоль/кл., что достоверно ниже, чем в ММСК при 1% 02, а удельная концентрация Н202, соответствующая LD50, имела достоверно более низкое значение (11,3±0,33 пмоль/кл.) по сравнению с клетками при 20% и 1% 02. Значения LD5 во всех трех группах регистрировались на уровне 6-8 пмоль/кл. (рис. 15).

— \\А Л------------- и\_____________

— ----- lBl\____________ v 4V

20 25 30 35 Н202, пмоль/кл.

Рис. 15. Жизнеспособность ММСК, культивируемых при 20% 02 (А), 5% 02 (Б)

и 1% 02 (В), после 24-часового окислительного стресса в зависимости от удельного количества Н202 в среде. Данные репрезентативного эксперимента, п=3.

При исследовании путей клеточной гибели было показано, что перекись водорода индуцирует гибель клеток преимущественно путем апоптоза.

В ходе сравнения ММСК, культивируемых при 20%, 5% и 1% 02, было выявлено, что наиболее интенсивный ответ на действие пероксида водорода в дозах 1^5 и 1Л)15 наблюдался при уровне кислорода, близком к физиологическому. При этом наблюдались максимальная концентрация ТБК-активных продуктов и увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты (рис. 16).

и

I а в-

20%

5%

1%

Условия культивирования

3 '1 4

4 *

я 5 ,

н » с; 3 -

3 « 5

* о °

Л ^ Л

^ ё н 2

Ё <

5 1

6

о

□ 1ЛЭ5 ЕЭ Ь015

20% 5% 1% Условия культивирования

1* 2

■ I 1,5

,

& <

0,5 0

□ 1ЛЭ5

□ 1ЛЭ15

20% 5% 1%

Условия культивирования

В

о «

с и

я я

I & <

2 т

1,5 -

0,5

1

И

. ЕЛ.05 Й1ЛЭ15

20% 5% 1%

Условия культивирования

Рис. 16. Концентрация ТБК-активных продуктов (А), активность каталазы (Б), СОД (В) и ГП (Г) в ММСК при постоянном культивировании в среде с различным содержанием кислорода через 24 ч после воздействия Н2О2 в дозах ЬО; и ЬОц. * - р<0,01 относительно показателя в интактных ММСК при соответствующих условиях культивирования; # - р<0,01 относительно изменений СОД в ММСК при 20% и 1% О2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность ММСК участвовать в физиологической и репаративной регенерации путем дифференцировки в различные типы клеток мезенхимального происхождения и выработки паракринных факторов, которые способствуют повышению выживаемости поврежденных клеток и активации резидентных прогениторов, определяет повышенный интерес к ним со стороны клеточной терапии. Тем не менее, успешное применение данных клеток зачастую зависит от устойчивости к неблагоприятным факторам микроокружения, среди которых одним из главных является окислительный стресс.

В данной работе проанализированы особенности окислительно-восстановительного и энергетического метаболизма ММСК в зависимости от содержания кислорода в среде

культивирования, а также проведена оценка влияния уровня О2 in vitro на устойчивость клеток к моделируемому окислительному стрессу.

Результаты показали, что наименее повреждающее действие на клетки оказывает среда с 5% кислорода (рис. 17). Условия повышенного (20%) и пониженного (1%) содержания кислорода вызывают в клетках слабый окислительный стресс, адаптация к которому, вероятно, приводит к повышению устойчивости клеток к моделируемому окислительному стрессу, поскольку данные условия способствуют повышению активности ферментов антиоксидантой системы.

Кроме того, при физиологической (5%) и пониженной (1%) концентрации кислорода в среде культивирования по сравнению с клетками в 20% О2 происходит уменьшение поглощения кислорода клетками, снижение величины трансмембранного потенциала и продукции АТФ, а также активация гликолиза, что сопровождается увеличением экспрессии генов глюкозных транспортеров и ферментов гликолитического пути. Данные изменения могут быть обусловлены обратимым повышением экспрессии гена HIF-la, наблюдаемым при уменьшении концентрации кислорода в среде культивирования.

Таким образом, проведенное исследование демонстрирует роль кислорода не только как фактора, модулирующего свойства ММСК, но и как важного компонента микроокружения клеток, позволяющего понять принципы их функционирования.

Жизнеспособность ~ Прооксидантная система 1 Антиоксндантная система |

Дыхание t

Жизнеспособность = Прооксидантная система [ Антиоксндантная система J, АVi Дыхание 1

ММСК 20% gl

Жизнеспособность ~ Прооксидантная система Т Антиоксндантная система |

ДуТ

Дыхание | ММСК АТФ 1 20% О, Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов I Экспрессия Н1Г1А ~ Экспрессия Н1ГЗА ~ Устойчивость к Н202 Т

Жизнеспособность ~ Прооксидантная система Т Антиоксндантная система t Avp: Дыхание j,

АТФ | Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов | Экспрессия HIFI А j Экспрессия HIF3A t Устойчивость к Н202 Т

Жизнеспособность ~ Прооксидантная система | Антиоксндантная система f Д\у ~

Жизнеспособность ~ Прооксидантная система ~ Антиоксндантная система ~ |

Рис. 17. Функционирование ММСК в условиях различного содержания кислорода.

выводы

1. Уровень содержания кислорода в диапазоне от 20% до 1% не оказывает существенного влияния на жизнеспособность ММСК как при постоянном культивировании, так и при коротких экспозициях (24 ч).

2. Постоянное культивирование ММСК в условиях содержания Ог, близких к физиологическим (5%), вызывает в них достоверное уменьшение количества ТБК-активных продуктов, активности супероксиддисмугазы и глутатионпероксидазы по сравнению с клетками в 20% и 1% Ог, при этом устойчивость к окислительному стрессу, вызванному Н2О2, снижается.

3. Содержание внутриклеточных АФК уменьшается при кратковременном снижении содержания О2 до 5% и увеличивается при изменении его уровня с 5% до 20% и 1%, при этом количество ТБК-активных продуктов возрастает в 1,75-2,5 раза в условиях снижения О2 до 1%, активность СОД и ГП в ММСК уменьшается на 5-35% при кратковременном снижении содержания кислорода до 5% и 1% и увеличивается при экспозиции из 5% в 20% и 1%02.

4. Постоянное культивирование и кратковременные экспозиции в условиях пониженного 02 приводят к достоверному уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий ММСК на 20-30%, количества потребляемого кислорода в 1,5-5,5 раз и синтеза АТФ, который происходит преимущественно за счет гликолиза, на 10-50%.

5. При постоянном культивировании в условиях 1% Ог наблюдается пониженная экспрессия гена а-субъединицы гипоксия-индуцируемого транскрипционного фактора HIF-1а и повышенная экспрессия гена HIF-За по сравнению с клетками, культивируемыми при 20% и 5% Ог. При кратковременном снижении содержания Ог наблюдается кислород-зависимое транзиторное увеличение уровня HlF-la в 1,5 раза, последующее снижение которого сопровождается возрастанием экспрессии HIF-За в 17 раз.

6. Пониженное содержание 02 (5%, 1%) способствует увеличению в 1,5-10 раз экспрессии гипоксия-ассоциированных генов, принимающих участие в пролиферации (ILIA, LEP, МТЗ, VEGFA), метаболизме глюкозы (GPI, SLC2A1, SLC2A4) и ангиогенезе (VEGFA).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Buravkova L.B., Rylova Y.V., Andreeva E.R., Kulikov A.V., Pogodina (Lobanova) M.V., Zhivotovsky В., Gogvadze V. Low ATP level is sufficient to maintain the uncommitted state of multipotent mesenchymal stem cells // Biochimica et Biophysica Acta. - 2013.- V. 1830. - № 10. -P. 4418-25.

2. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Экспрессия генов, ассоциированных с гипоксией, в ММСК при постоянном культивировании в условиях пониженного содержания кислорода. // Доклады Академии Наук. - 2014. - Т. 458. - № 2. - С. 233-235.

3. Буравков С.В., Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Сравнительная оценка флуоресцентных красителей митохондрий в стромальных клетках. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - № 2. - С. 71-76.

4. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Устойчивость к окислительному стрессу мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивируемых при разном содержании кислорода. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2014. - Т. 48. -№ 6. -С. 34-38.

5. Андреева Е.Р., Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Гипоксический стресс как индуктор активации потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. // Физиология человека. - 2015. - Т. 41. - № 2. - С. 123-129.

6. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Особенности экспрессии HIF-la в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках при гипоксии. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159. - № 3. - С. 333-335.

7. Andreeva Е., Lobanova М., Udartseva О., Buravkova L. Response of adipose-derived stromal cells under tissue-related O2 on short-term hypoxic stress. // Cells Tissues Organs. - 2015. - DOI: 10.1159/000438921.

Тезисы докладов:

1. Погодина (Лобанова) М.В., Ударцева О.О. Оценка уровня АФК и функционального состояния митохондрий ММСК в условиях различного парциального напряжения кислорода и отсутствия ростовых факторов. // XI Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная Дню Космонавтики, г. Москва, 2012. С. 38-39.

2. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Влияние концентрации кислорода и наличия ростовых факторов в среде культивирования на уровень АФК и функциональное состояние митохондрий ММСК. // III Съезд Общества клеточной биологии, г. Санкт-Петербург, 2012. Цитология. - 2012. - Т. 54. - Ks 9. - С. 698-699.

3. Pogodina (Lobanova) M.V., Rylova J.V., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Simulated hypoxia and ischemia differently affect MMSC redox State. // The 7th Fraunhofer Life Science Symposium associated with the 7th Annual Congress of the German Society for Stern Cell Research (GSZ). Leipzig, Germany, 2012. Р. 110-111.

4. Погодина (Лобанова) M.B. Динамика экспрессии HIF-la в ММСК при культивировании в условиях различного процентного содержания кислорода. // XII Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная 50-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. г. Москва, 2013. С. 41-42.

5. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Экспрессия генов, регулирующих апоптоз в ММСК при культивировании в условиях гипоксии. // VI Всероссийский с международным участием Конгресс молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». г. Иркутск, 2013. С. 358-360.

6. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Экспрессия HIF-la и HIF-3a в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода. // XIV Конференция по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященная 50-летию создания ИМБП. г. Москва, 2013. Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2013. - Т. 47. - № 4. -С. 118-119.

7. Погодина (Лобанова) М.В., Буравкова Л.Б. Влияние содержания кислорода на ММСК в условиях окислительного стресса, вызываемого перекисью водорода. // V Всероссийская научно-практическая конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Москва, 2013. С. 59.

8. Погодина (Лобанова) М.В. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом, в ММСК при культивировании в условиях различного процентного содержания кислорода. //

XIII Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. г. Москва, 2014. С. 39-40.

9. Ударцева О.О., Погодина (Лобанова) М.В. Чувствительность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток к окислительному стрессу, вызванному эндогенными и экзогенными АФК. // XIII Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. г. Москва, 2014. С. 49-50.

10. Pogodina (Lobanova) M.V., Buravkova L.B. Features of MMSC response to oxidative stress at different O2 level. // 9th Fraunhofer Life Science Symposium. Leipzig, Germany, 2014. P. 64.

11. Buravkova L.B., Pogodina (Lobanova) M.V., Rylova Y.V., Andreeva E.R. Microenvironmental Hypoxia Modulates Functional State and Energy Metabolism of Mesenchymal Stromal Cells. // Termis EU. Genova, Italy, 2014. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - V. 8. - Suppl. l.-P. 76.

12. Погодина (Лобанова) M.B. Функционирование мультипотентныхмезенхимальных стромальных клеток (ММСК) при кратковременном гипоксическом воздействии. // XIII Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная 65-летию со дня рождения врача-космонавта Морукова Б.В. г. Москва, 2015. С. 40-41.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГП - глугатионпероксидаза МДА - малоновый диальдегид

ММСК - мультипотенгные мезенхимальные стромальные клетки

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмугаза

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

АСТВ - бета-актин

В2М- бета-2-микроглобулин

СССР - карбонилцианид-3-хлорфенилгидразон

HIF - гипоксия-индуцируемый фактор

HPRT1 - гипоксантинфосфорибозшггрансфераза

RPLP0 - рибосомный фосфопротеин Р0

Подписано в печать:

18.06.2015

Заказ № 10903 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru