Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Научное обоснование применения клеточных технологий и методов при репаративном остеогенезе в торакальной хирургии у животных

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Научное обоснование применения клеточных технологий и методов при репаративном остеогенезе в торакальной хирургии у животных"

На правах рукописи.

ЛУЦАЙ ВАДИМИР ИВАНОВИЧ

Научное обоснование применения клеточных технологий и методов при репаративном остеогенезе в торакальной хирургии у животных.

(ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Специальность 06. 02. 01. -Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных.

Автореферат диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

3 ОКТ 2013

Москва-2013

005533870

Работа выполнена на кафедре «Незаразные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский

государственный университет пищевых производств»

Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ, академик

РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор Уша Борис Вениаминович. Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Вишневский Александр Александрович._

Официальные оппоненты: Ватников Юрий Анатольевич,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», заведующий кафедрой « Клиническая ветеринария».

Кудряшов Анатолий Алексеевич,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», заведующий кафедры «Патологической анатомии и судебной ветеринарной медицины»,

Борисов Михаил Семенович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина».

Ведущая организация: «Всероссийский ветеринарный научно-исследовательский институт патологии, фармакологии и терапии» ГСЦ Россельхозакадемии (г. Воронеж).

Защита диссертации состоится Л » /л 2013 в часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.148.09 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, д.ЗЗ, в конференц-зале.

С диссертацией можнд ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «МГУПП»

Автореферат разослан » _2013 г.

Автореферат размещен на сайте Министерства образования и науки РФ http://vak.ed.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор ветеринарных наук, профессор Андрианова Т.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Особенности технологического содержания животных в условиях специализированных комплексов в определенной степени увеличили уровень травматизма. По данным Ю.А. Ватникова (2004), количественный показатель травм в 2000-2003 г.г. составил от 18 до 26 % всей хирургической патологии. По данным И.И. Логинова (2011) частота травм, среди животных в ветеринарной хирургической патологии, составляет от 15% до 20%. Большая часть, приходится на травмы конечностей и составляет 65-70 %, травмы головы составляют 17-20 % и травмы груди 8-13 %.

Закрытые травмы груди в ветеринарной медицине занимают 3-е место после повреждения конечностей, и травм в области головы. Статистические данные свидетельствуют, что от 60 до 70%. при закрытых травмах груди составляют переломы ребер. Нужно отметить, что повреждение грудной клетки и органов груди принадлежат к категории особенно тяжелых травм, так как гибель часто наступает не ог разрушения органа, а от вызванных травмой нарушений дыхания и кровообращения (Плечев В. В., 2003). Поэтому, разработка новых способов оптимизации репаративной регенерации пластинчатой костной ткани с целью снижения нежелательных последствий остается актуальной проблемой, для ветерннарной хирургии.

Наибольший интерес для стимуляции репаративного остеогенеза, при различных костных патологиях представляют мультнпотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга, для

которых показана способность к направленной дифференцировке в остеогенном и хондрогенном направлении (ВВ. Ступак, В.В. Останин, М.Ю. Сизов, Е.Р. Черных 2006г., D.C. handa 2010 г.)

Трансплантационный репаративный остеосинтез, по мнению многих исследователей, является наиболее перспективным и находится на стыке науки так, как введенные в область повреждения (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки) под действием микроокружения вырабатывают все необходимые факторы регуляции остеогенеза, могут дифференцироваться в остеобласта и вырабатывать вещества внеклеточного костного матрикса. ( А.С Теилягин, H.H. Чупикова, С.З. Шарифуллииа и др. 2006; С.З. Шарифуллина 2006; C.B. Тимофеев 2006; A.C. Тепляшин 2007; Т.Х. Файхундинов, Д.В. Голыштейн, A.A. Кулаков и др. 2005; В.П. Селедцов, С.С. Рабинович, Э.А. Кыщенко 2006; P.A. Мусина, Е.С. Бекчанова, Г.Т. Сухих 2005; С.П. Миронов, Денисов-Никольский и др. 2005; Р.В. Деев 2006; Р.В. Деев, A.A. Исаев, А.Ю. Кочиш, P.M. Тихилов 2007; A.C. Григорян, Р.В. Деев, П.В. Кругляков и др. 2010; И.П. Савченкова, Л.Н.Эрнст, М.И. Гулюкин 2010; Б.В. Уша и др. 2012).

Таким образом, актуальность рассмотренной выше проблемы, по выявлению наименее реактивного способа фиксации при остеосинтезе ребер

и воздействию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на репаративный остеогенез, представляется нам важным и перспективным направлением, а отсутствие доступной как зарубежной так отечественной литературы по данной теме в ветеринарной медицине, побудили нас выполнить настоящее исследование.

Цель исследования - изучить морфофункциональные изменения в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов. Выявить закономерности структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза при

трансплантации алогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга в области дефекта ребер грудной клетки в эксперименте и провести сравнительную оценку их репаративного потенциала.

Задачи исследования.

1. Изучить морфофункциональные изменения в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов и провести сравнительный анализ по выявлению наименее реактивного способа фиксации.

2. Изучить морфофункциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

3. Изучить морфофункциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения пунктата аутогенного костного мозга.

4. Изучить закономерности структурной и функциональной организации репаративного остеогенеза при трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга.

Научная новизна.

Впервые в ветеринарной практике проведен сравнительный анализ процесса остеогенеза остеосинтеза ребер с помощью различных хирургических методов и дано научное обоснование для выбора наименее реактивного способа фиксации. Показано, что остеосинтез обуславливает необходимость постоянного лабораторного контроля над послеоперационным течением процесса у животных. Разработаны алгоритмы лабораторного контроля над остеогенезом и показано, что оценка посттравматических сдвигов, активности и стадий остеогенеза может быть осуществлена при помощи лабораторных тестов.

Впервые в ветеринарии было проведено исследование репаративного потенциала аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеосинтезе ребер у экспериментальных животных. Изучен регенерационный остеогистогенез при внесении аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Впервые в ветеринарии было проведено исследование репаративного потенциала пунктата аутогенного костного мозга, при остеогенезе ребер у экспериментальных животных.

Впервые на основании системного исследования описаны изменения гематологических и биохимических показателей крови при использоавании аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга при репаративной регенерации в области дефекта ребер. Показано, что трансплантация аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток не вызывает осложнений и местных реакций отторжения трансплантанта.

Впервые ветеринарной практике выявлены закономерности изменения основных костных маркеров при репаративной регенерации в области дефекта ребер с использованием аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и пунктата аутогенного костного мозга.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе разработанных данных теоретических положений и экспериментальных исследований, подтвержденных морфологическими материалами, разработан способ введения аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в области дефекта ребер грудной стенки, которые вызывают ускорения репаративного остеогенеза и достоверное сокращения сроков восстановления ее органотопической архитектоники.

Важное значение для практической деятельности имеет то, что после введения аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ускоряется репаративная регенерация костной ткани, что особенно актуально при замедлении стадийности репаративного процесса, когда пролнфиративная активность пула остеогенных клеточных элементов н зоне консолидации недостаточна.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, для ускорения репаративных процессов в костных тканях.

Научные разработки положения и выводы вошли в методические рекомендации:

«Экспериментальные применения клеточных технологий для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки», одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым A.M. 19.11.2012 г. протокол №5 от 15 ноября 2012.) М. 2012-50 с.

«Экспериментальные применения аутогенного костного мозга для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки», одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым A.M. 13.02.2013 г. протокол №1 от 1 февраля 2013.) М. 2013 -40 с. Патент РФ № 122575 зарегистрировано в Государственном реестре полезных моделей Российской Федерации от 10 декабря 2012 г.

Исследования по структурно-функциональному остеогенезу представлены в учебном пособие «Алгоритмы лабораторного контроля остеогенеза» -М.000 «Франтера», 2011-100 с.

В монографии «Морфофункциональные изменения периферической крови в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов». М.ООО «Франтера», - 2013.-130 с. В монографии «Влияние клеточных технологий на репаративный остеогенез при дефектах ребер грудной клетки» М.ООО «Франтера», - 2013,- 110 с. Материалы диссертации используются в цикле лекций по курсу «Ветеринарная хирургия» МГУПП

Связь исследований с научной программой. Диссертационная работа является частью комплексных исследований по использованию клеточных технологий в ветеринарной медицине, проводимая на кафедре «Незаразные болезни» ФГБО и ВПО МГУПП под руководством заслуженного деятеля РФ академика РАСХН доктора ветеринарных наук профессора Уша Б.В., договор № 124 от. 20.10. 2010г., совместно с доктором медицинских наук профессором A.A. Вишневским ФГУ «Института хирургии им. A.B. Вишневского Росмедтехнологий».

Апробация. Результаты научных и клинических исследований представлены на; международной научно-практической конференции по вопросам ветеринарной хирургии «Внедрение новых технологий в профилактику и лечения хирургической патологии у животных», Санкт-Петербург,-2009 г.; первой Всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии МГАВМиБ,2010г.; в Анестезиологическом ветеринарном обществе «Институт развития ветеринарной терапии, анестезиологии и реаниматологии»- ВИТАР; клинике экспериментальной терапии НИИ КО РОНУ имени И.И. Блохина РАМН-М,2010 г.; второй всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии МГАВиБ, 2011 г.; международной научной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной хирургии»,- Ульяновск 2011 г.; международном конгрессе Биотехнология и перспективы развития Москва.,2013 г. По материалам собственных исследований разработан и внедрен Патента РФ на полезную модель № 122575 от 10.12.2012 г. при лечении осложненных ран.

Публикации результатов исследований. По материалам собственных исследований опубликовано 26 печатных работ, в которых отражено

основное содержание диссертации, из них ВАК 12 работ.

Основные положения, н выносимые на защиту.

• структурные и функциональные изменения в организме животных периферической крови при остеосинтезе ребер грудной клетки различными материалами.

• Структурные изменения репаративного остеогенеза в поврежденном участке ребра грудной клетки при введении клеточного трансплантата аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

6

• структурные изменения репаративиого остеогенеза в поврежденном участке ребра грудной клетки при введении пунктата аутогенного костного мозга.

• морфологические и биохимические изменения в периферической крови экспериментальных животных при использовании аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и аутогенного костного мозга.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 350 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, собственных исследований (экспериментальная часть включает 3 раздела), обсуждению полученных результатов, выводов, практических предложений. Работа включает 20 таблиц и 100 рисунков. Список литературы включает в себя 520 источников, в том числе 290 - зарубежных авторов .

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Работа выполнялась на базе кафедры «Незаразные болезни» ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пшцевых производств».

Данная работа, является частью комплексных исследований по использованию клеточных технологий в ветеринарной медицине, проводимая кафедрой «Незаразные болезни», под руководством заслуженного деятеля РФ академика РАСХН, доктора ветеринарных наук, профессора Уша Б.В., совместно с доктором медицинских наук профессором A.A. Вишневским (ФГУ «Институт хирургии им. A.B. Вишневского Росмедтехнологий», договор № 124 от. 20.10. 2010г).

В экспериментальной части задействованы два вида клинически здоровых животных, козы (п=60) и кролики (п=120). Все животные содержались в стандартных условиях вивария (12-ти часовой световой день, свободный доступ к воде и корму, температура в помещении 23-25 °С).

Экспериментальные группы формировались по принципу аналогов (по породе, возрасту, полу и массе). В опыте использовались козы русской породы - в возрасте 1,5 года самки, масса - 35-40 кг, кролики породы шиншилла, в возрасте 1,5 года, массой 2,5-3,5 кг.

Уход за экспериментальными животными проводили в соотвествии с этичнекими нормами, работы с лабараторными животными( правила проведение работы с экспериментальными животными, 1977 12. 08 пр-№753M3)

Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и анализ костного мозга производились в «Центре биологических методов лечения» (научным консультантом которого является профессор Туманов В.П., член научно-координационного Совета при президиуме РАМН по клеточным технологиям). Фрагменты лабораторных и клинических исследований выполнялись в клинике при кафедре «Незаразные болезни» МГУПП, Академии Медицинских наук (Российский научный центр хирургии им академика Б.В. Петровского).

Экспериментальное исследование состояло из трех этапов, каждое из которых направлено на решение определенных задач, поставленных в работе.

I этап. Изучение влияния различных способов фиксации, на репаративный процесс в области грудной клетки после остеотомии ребер.

Изучение динамики показателей белой и красной крови, при различных способах фиксации ребер грудной клетки и выявление наиболее физиологичного метода, при котором происходят наименьшие реактивные сдвиги в системе крови и деструктивные процессы в живом организме.

Исследования проводили на козах (п=60), которым делали однотипную операцию - резекцию пятого ребра, а затем проводили остеосинтез с помощью; лигатуры, серкляжа и металлических скоб.

II этап. Изучение влияния аллогенных мультнпотентных мезенхимальных стромальных клеток на репаративный остеогенез в зоне дефекта ребра. Исследования проводились на кроликах (п=60), всем кроликам (опытной и контрольной группы) делали однотипные операции -дефект в области пятого ребра длиной 8 мм и шириной 1,5 мм (рис. 1).

Рис. 1 Компьютерная томограмма скелета кролика: 1 - костный дефект в области 5-го ребра.

В область дефекта с помощью инсулинового шприца кроликам опытной группы вводили клеточный трансплантат, представляющий собой взвесь - 1x10 аллогенных мультнпотентных мезенхимальных стромальных клеток в 0,1 мл физиологического раствора, затем дефект закрывали деминерализованным костным аллотрансплантатом. Аллотрансплантат представляет собой брефкость (кость, изготовленная из плодов кролика по методике Г.II. Котельникова, Л.Т. Воловой, 2006). Контрольной группе область дефекта ребра закрывали только брефкостыо без введения ММСК.

Для изучения влияния мультнпотентных мезенхимальных стромальных клеток на структурные изменения в процессе репаративного остеогенеза, а также для стандартизации эксперимента и правильной интерпретации получаемых результатов животных выводили из эксперимента в строго определенные сроки: на 15, 30, 60, 90 сутки.

8

III этап. Изучение влияния пунктата аутогенного костного мозга на репаративпый остеогенез в зоне дефекта ребра. Исследования проводились на кроликах (п=60). Всем кроликам (опытной и контрольной группы) делали однотипные операции (дефект в области пятого ребра, длиной 8 мм и шириной 1,5 мм).(рис1.) В область дефекта с помощью инсулинового шприца кроликам опытной группы вводили 0,3 - 0,5 мл взвеси пунктата костного мозга. Далее эксперимент проводили как с ММСК.

Все эксперименты проводились под общим наркозом в соответствии с международными требованиями Европейской конвенции по гуманному отношению к экспериментальным животным.

Клиническое исследование животных производили по общепринятыми методами. Определяли Status praesens, габитус, исследовали видимые слизистые оболочки, кожный покровов, шерстного покрова, наружный и внутренний осмотр ушной раковины, ротовой полости, глотки. Поверхностная пальпация слизистой ротовой полости, языка, слюнных желез и глотки. Поверхностная и глубокая пальпация органов брюшной полости. Определение граииц легких, сердца, печени. Осмотр и пальпация костного каркаса ірудной клетки. Болезненность, ее характер и локализация. Осмотр и пальпация лимфатических узлов.

Методы клинического исследования крови Определение скорости оседания эритроцитов проводили унифицированным методом Панченкова. Экспозиция в течение часа. Нормальные величины 2,0 - 3,5 мм/ч.

Определение гематокрита проводили унифицированным методом с помощью микроцеитрифуги.

Определение гемоглобина - унифицированным колориметрическим методом с применением набора реактивов серии "Ольвекс-FL", скомпонованным в соответствии с международными требованиями.

Принцип метода: под действием феррицианида калия и цианида гемоглобин трансформируется в ннанометгемоглобин, определяемый фотометрически.

Подсчет количества эритроцитов с использованием

унифицированного метода подсчета в счетной камере Горяева.

Подсчет количества лейкоцитов проводили унифицированным методом в счетной камере Горяева.

Определение лейкоцитарной формулы - использовали унифицированный метод морфологического исследования форменных элементов крови с дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы. Микроскопию нативных преператов периферической крови проводили на фазово-контрастном световом микроскопе производства австрийской фирмы «Лейц» с увеличением X 1000 и Leica DM 1000 с увеличением X 1000.

Подсчет числа лейкоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН); среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (МСКС); анизоцитоз эритроцитов (RDW), а также лейкограмму и эрнтрограмму производили на гематологическом анализаторе РСЕ-90 (ERMAINC Япония), наряду с общепринятыми методами. Собранный объем крови переливали во флакон, содержащий антикоагулянт

TDTA-2K (двукапиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в 1 мл крови. Фагоцитарную активность нейтрофилов - по Клеченковой Л.З. (1967) рассчитывали фагоцитарный индекс(ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ) ( Плященко С.И., Сидоров В.Т.1979).

Для морфологического исследования крови использовали окраску препаратов по Романовскому-Гимза. Определение активности аланинаминотрапсферазы (Ал А Т) в сыворотке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. Использовали реактивы "Ольвекс-FL-E" ALT-11 Кат.№: 001.011 определений при конечном объеме пробы 6,1 мл.

Определение активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови проводили унифицированным методом Райтмана-Френкеля. С использованием реактивов AST-11 Кат. №: 002.011 определений при конечном объеме пробы 6,1 мл.

Определение активности Галша-Глутамилтрасферазы (гамма-глутамилтранспептидазы) (ГГТ) в сыворотке крови проводили кинетическим фотометрическим методом Зейца-Персиджина (1974). Тест стандартизирован по методу в соответствии с 1FCC. Использовали реактивы Gamma-GT FS (Szasz mod/IFCC stand) Диакон диагностик. Определение общей активности кретиниикиназы (КФК) в сыворотке крови проводили кинетическим фотометрическим методом с использованием реактивов Gamma-GT FS (Szasz mod/IFCC stand) Диакон диагностик. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови проводили унифицированным оптимизированным кинетическим методом с использованием набора реактивов «Витал-Европа», скомпанованными в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови проводили унифицированным ; энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Ольвекс-В», скомпонованными в соответствии с международными требованиями CHOLESTEROL Кат. Кг. 013.012. Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови проводили унифицированным энзиматическим колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Витал-Европа», скомпонованным в соответствии с международными требованиями Триглицериды-22-ВИТАЛ Кат. №: В 17.22. Определение концентрации креатина в сыворотке крови проводили унифицированным псевдокинетическим двухточечным методом с использованием реактивов CREATININES Кат. № 004.007. Набор реактивов относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованными в соответствии с международными требованиями. Определение

концентрации мочевины в сыворотке крови проводили унифицированным ферментативным кинетическим методом с использованием реактивов фирмы «Lachema» производства Чехии, скомпонованными в соответствии с международными требованиями. Определение активности а-амилазы в сыворотке крови проводили унифицированным оптимизированным энзимотическим кинетическим методом с использованием реактивов а-Амилаза-Витал, скомпонованными в соответствии с международными

требованиями. Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови проводили унифицированным методом Ендрассика-Грофа с использованием реактивов B1LIRUBIN-TD Кат.№ 003.012. Метод, использованный в наборе реактивов, относится к серии «Ольвекс-FL-E», отличается от методов, используемых в ряде зарубежных стран, но является унифицированным в России. Определение концентрации гл/окош в сыворотке крови проводили унифицированным энзиматическим колориметрическим методом с использованием реактивов GLUCOSE-2 Кат. № 005.002, GLUCOSE-12, Кат. № 005.012 "Ольвекс-Европа", скомпонованных в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации кальция в сыворотке крови проводили унифицированным колориметрическим методом, с использованием реактивов CALCIUM Кат.№ 018.001. Набор реактивов относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованных в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации неорганического фосфора в сыворотке крови проводили унифицированным спектрофотометрическим методом, с использованием реактивов Кат.№ 016.001. Набор реактивов относится к сери "Ольвекс-FL-E", скомпонованной в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации общего белка в сыворотке крови проводили унифицированным биуретовым методом. Набор реактивов относится к серии "Ольвекс-FL-E", скомпонованных в соответствии с международными требованиями. Определение концентрации альбумина в сыворотке крови проводили унифицированным колориметрическим методом с бромкрезоловым зеленым при использовании реактивов ДИАКОН-ДС, скомпонованными в соответствии с международными требованиями.

Гистологическое исследование костной ткани проводили по обще принятой методике, фиксировали в 10% -ном водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов ваозрастающей концентрации, заливали в парафин. Срезы после депарафинации окрашивали гематоксилином Майера и эозином по Романовскому-Гимза, Ван-Гизону по общепринятым методам.

Изучение морфометрических показателей и анализ полученных данных производили оценнвая величины площадей: всего регенерата, костного компонента регенерата, костного матрикса, соединительной и кроветворной тканей. Эти исследования проводили с помощью микроскопа-анализатора «Axio imager А-2» фирмы Карл Цейсе.

Методика получения мультипотептных мезенхнмальных строгальных клеток. Материалом для получения мультипотептных мезенхнмальных стромальных клеток служили клинически здоровые животные (крольчихи), у которых при помощи кссаревого сечения извлекались плоды па середине срока сукрольности и вместе с рогами матки помещались в стерильный термос для транспортировки в «Центр биологических методов лечения». Время транспортировки не более 3-х часов. Там плоды измельчались и суспензия переносилась в стерильный контейнер с раствором Хенкса и добавлением гентамицина. Дальнейшую работу проводили в стерильных

условиях ламинарного бокса (режим GMR). Мультипотентные мезенхнмальные стромальные клетки получали строго в соответствии с паспортом клеточного трансплантата (A.A. Ржаникова; С.И. Горностаева; Д.В. Гольдштейн, 2005). За 2-3 часа до трансплантации, клетки снимали с пластика 0,25% раствором трипсина («ПанЭко»). Готовили суспензионный клеточный трансплантат в физиологическом растворе, подсчитывали количество клеток и их жизнеспособность при окраске трипановым синим. Количество клеток в трансплантате доводили до концентрации ! х 10' клеток в 1/мл с содержанием жизнеспособных клеток не менее 96%. Методика получения пунктата аутогенного костного мозга. Для получения пунктата костного мозга использовалась большеберцовая кость кролика. Для взятия пунктата костного мозга использовались инъекционные иглы с плотно подогнанным мандреном и одноразовые десятиграммовые шприцы. Операцию выполняли под местной анестезией, и строго в асептических условиях. После того как игла оказывалась в костномозговом канале, из аспирационной иглы извлекали стилет и присоединяли к игле шприц на 10 мл и создавали отрицательное давление, после этого внутри цилиндра шприца появлялся пунктат, в количестве 0,3-0,5 мл из костномозгового канала. Пунктат костного мозга у кролика брали за 20-30 минут перед экспериментальной операцией по изучению влияния его на репаративный остеогенез в области дефекта ребра грудной клетки. Определение клеток предшественников в костном мозге по А.Я. Фридштейну (1988) выполняли в «Центре биологических методов лечения». Исследование производили по стандартной схеме протокола.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики по Стьюденту (Урбах В.Ю., 1975)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЛ.Экспериментальный остеосинтез поврежденных ребер грудной клетки у коз с помощью различных материалов.

Нами была поставлена задача по выявлению наиболее щадящего или физиологического метода при остеосинтезе ребер поврежденной грудной клетки. Для выполнения поставленной задачи было сформировано три опытные группы по (п=20) и подобраны, по принципу аналогов (по породе, возрасту, полу и массе), клинических здоровых коз содержащихся в стандартных условиях вивария. Перед началом операции, каждое животное проходило клинический осмотр по общепринятой схеме. Полученные результаты сравнивались с физиологической нормой животных. Кровь брали на исследования до оперативного вмешательства, за трое суток (исходные показатели) и после наложения швов; через одни, трое, семь, десять, четырнадцать, двадцать пять, тридцать, сорок, шестьдесят суток наблюдения.

В современной гематологии накоплен значительный материал о реакциях системы крови на оперативное вмешательство. Выявлена

зависимость количественных изменений состава периферической крови в послеоперационный период (С.Ю. Концевая, 2000, М.А. Дерхо 2000,2004.).

Нашими исследованиями установлены общие закономерности изменений красной крови при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз, во всех трех группах.

Анализ изменений, возникающих в организме после оперативного вмешательства, дает возможность выделить в послеоперационном периоде три фазы: 1- срочную длящуюся 3-7 суток после окончания операции; 2-катаболнческую долгосрочная (обратного развития), длящуюся от 7 до 20 -и суток после операции. Длительность этой фазы зависит от объема выполненного оперативного вмешательства. 3-анаболическую отдаленную, длящуюся от момента операции до восстановления функции органа, (таб.1)

Таблица 1. Общие закономерности изменений красной крови при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз.

Показатели Стадии адаптации

Срочная фаза от 3 до 7 суток Долгосрочная

Катаболическая фаза (7-21 сутки) Анаболическая фаза (от операции до восстановления)

Эритроциты ш и норма или і

НЬ (НОВ) г/л и 1 нома

Среднее содержание НЬ в эритроците(МСН) 1 1 норма или|

Средняя концентрацияНЬ в эритроците(МСНС) тт 1 норма или!

Цветовой показатель т 1 норма или!

СОЭ мм/ч тт тт Т

Примечание: ТТ-сильно увеличено; |-умеренно увеличено; Щ-сильно снижено; умеренно снижено; слабо снижено.

Сравнительный анализ динамики показателей красной крови коз при различных соединениях ребер через сутки после операции выявил следующие закономерности. У животных при лигатурном соединении ребер отмечали уменьшение количества эритроцитов в 1,23 раза, (ИД 12,5±0,29х1012) гемоглобина - в 1,15 раза, гематокрита - в 1,03, среднего содержания гемоглобина - в 1,18 и средней концентрации гемоглобина в эритроците - в 1,11 раза.

У коз при серкляжном соединении ребер отмечали уменьшение количества эритроцитов в 1,23 раза (ИД 12,6±0,28х1012), гемоглобина в 1,15, гематокрита 1,03 раза, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах - в 1,18 (МСН), средней концентрации гемоглобина в эритроците (МСНС) - в 1,11 раза.

При остеосинтезе ребер металлическими скобами произошло уменьшение количества эритроцитов в 1,06 раза (ИД 12,2±0,26х1013), гемоглобина в 1,08, гематокрита 1,03 раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах в 1,03 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС)-1,06 раза (рис.2.)

«эритроциты -гемоглобина -гематокрита £ мене имен

Рис.2. Динамика изменения показателей красной крови через сутки после операции у коз.

Сопоставляя полученные" результаты животных опытных групп, следует отметить, что через трое суток наблюдения отмечалось еще большое снижение количества эритроцитов. При лигатурном соединении количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,32 раза и составил (9,5 ±0,23х1012 г/л), гемоглобина в 1,21 раза, гематокрита - в 1,23 раза. Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) уменьшилось в 1,18 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - в 1,11 раза.

При серкляжном соединении количественный показатель

эритроцитов уменьшился в 1,32 раза и составил (9,4±0,22х 1012 г/л), гемоглобина в - в 1,21, гематокрита - в 1,23 раза. Среднее содержание

гемоглобина в эритроцитах (МСН) снизилось в в 1,18 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - в 1,11 раза.

При соединении металлическими скобами количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,06 раза и составил (11,2±0,28х1012 г/л), гемоглобина - в 1,08, гематокрита - в 1,03 раза. Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) снизилось в 1,06 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - в 1,03 раза

На 7-е сутки эксперимента гематологические показатели оперированных животных продолжали снижаться. При лигатурном соединении количественный показатель эритроцитов снизился в 1,4 раза и составил (9,2 ±0,25x1012 г/л), гемоглобина в 1,48раза, уровень гематокрита снизился в 1,04 раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН) -в 1,03 раза, средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - 1,28 раза. При серкляжном соединении количественный показатель эритроцитов уменьшился в 1,37 и составил (9,3 ±0,24х1012 г/л), гемоглобина в 1,35, гематокрита снизился в 1,12 раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах в 1,02 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) - 1,16 раза. При соединении металлическими скобами количественный показатель эритроцитов снизился в 1,11 раза и составил (10,9±0,27х1012 г/л ), гемоглобина в 1,17, гематокрита 1,08 раза, среднее содержание гемоглобина в эритроцитах в 1,04 (МСН), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) -1,10 раза

Изменения кроветворных органов в организме коз связано с поступлением в кровяное русло незрелых эритроцитов с меньшим содержанием гемоглобина, что обусловлено различным травматическим воздействием при остеосинтезе ребер грудной клетки и реактивностью используемого материала.

Таким образом, можно отметить, что в первые семь суток после остеосинтеза различными способами фиксации ребер наблюдается незначительная анемия, которая наиболее отчетливо проявляется у животных при соединении ребер лигатурным и серкляжном способом.

В период с 15-и по 40-е сутки, во всех трех экспериментальных группах происходило постепенное восстановление показателей красной крови до уровня физиологических значений. Это связано по нашему мнению с усилением потребления регенерирующей тканью кислорода и биологически активных веществ, так как в этот период осуществляется активный процесс васкуляции зоны перелома и начинает формироваться костный регенерат.

При лигатурном соединении на 30-е сутки отмечали постепенное увеличение количества эритроцитов до 11,1±0,14х10'2 г/л, хотя по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,9 раза. Отмечали восстановление и других гематологических показателей: гемоглобина, гематокрита, среднего содержания гемоглобина в эритроците, средней концентрации гемоглобина в эритроците. Цветовой показатель крови незначительно снизился.

Количественные изменения со стороны красной крови при репозиции ребер с помощью лигатуры мы расцениваем как создание адаптационного буфера в ответ на травму, а так же, как компенсацию ацидотического состояния, возникшего вслед за повреждением.

На (40-е - 60-е) сутки эксперимента показатели красной периферической крови достигают физиологических значений. Посттравматический период, сопровождаемый развитием воспалительной реакции, документирован характерными изменениями скорости оседания эритроцитов. На 15-е сутки после травмы скорость оседания эритроцитов по сравнению с исходными данными выросла в 5,6 раз. Далее ми отмечали постепенное уменьшение этого показателя, характеризующее ослабление воспалительной реакции.

При серкляжном соединении на 30-е сутки отмечали увеличение количества эритроцитов до 11,4±0,33х10'" г/л, хотя по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,8 раза. Отмечали восстановление таких показателей крови, как гемоглобин, гематокрит, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, и снижение цветового показателя.

На (40-е - 60-е) сутки эксперимента показатели эритроцитарного звена периферической крови постепенно достигали физиологических значений. Посттравматический период, сопровождаемый развитием воспалительной реакции, документирован характерными изменениями скорости оседания эритроцитов. На 15-е сутки после травмы скорость оседания эритроцитов по сравнению с исходными данными была выше в 4,34 раз. Далее мы отмечали постепенное уменьшение этого показателя, характеризующее ослабление воспалительной реакции.

При соединении ребер металлическими скобами на 30-е сутки отмечали увеличение количества эритроцитов до П^О.ЗШО1" г/л, хотя по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,03 раза. Также восстанавливались и другие показатели: гемоглобина, гематокрита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, а цветовой показатель незначительно снизился.

На (40-е - 60-е) сутки эксперимента показатели эритроцитарного звена периферической крови достигали физиологических значений. Посттравматический период, сопровождаемый развитием воспалительной реакции, документирован характерными изменениями скорости оседания эритроцитов. На 15-е сутки после травмы скорость оседания эритроцитов по сравнению с исходными данными выросла в 2,0 раз. Далее мы отмечали постепенное уменьшение этого показателя, характеризующее ослабление воспалительной реакции.

Результаты наших исследований показали, что отмеченная динамика гематологических показателей носит благоприятный характер и свидетельствует об отсутствии послеоперационных осложнений инфекционного характера.

Динамика количественных показателей белой крови коз при фиксации ребер различными материалами

Нами установлена общая закономерность, изменений белой крови, после оперативного вмешательства, на ребрах грудной клетки. Выделяют в послеоперационном периоде три фазы: 1- срочную длящуюся 3-7 суток после окончания операции; 2- катаболическуго долгосрочная (обратного развития), длящуюся от 7 до 20 суток после операции. Длительность этой фазы зависит от объема выполненного оперативного вмешательства. 3 -анаболическую отдаленную, длящуюся от момента операции до восстановления функции органа, (таб.2)

Лейкограмма периферической крови у коз при репозиции ребер различными материалами, выявила выраженную лейкоцитарную реакцию, проявившую увеличением количества лейкоцитов в первый день после остеосинтеза ребер. При этом установлена зависимость повышения уровня лейкоцитов в зависимости от способа фиксации: при лигатурном соединении в 1,79 раза, при серкляжном соединении в 1,49 раза, при соединении металлическими скобами в ¡,26 раза по отношению к исходным показателям.

Высокий уровень лейкоцитов в крови свидетельствует о развитии защитных реакций, связанных с развитием воспалительного процесса, направленного на компенсацию дефицита клеточных и гуморальных факторов защиты организма (И.Ф Калимуллин, 2010).

Таблица 2. Общие закономерности изменений белой крови при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз._

Показатели Стадии адаптации

Срочная фаза от 3 до 7 суток Долгосрочная

Катаболическая фаза (7-21 сутки) Анаболическая фаза (от операции до восстановления)

Лейкоциты TT Т норма

Эозинофилы 11 1 Т

Базофилы 1 1 |или норма

Ю+П нейтрофилы TT TT Т

Сегментоядерные нейтрофилы TT т норма

Лимфоциты ш Ii 1

Моноциты TT т т

Примечание: | -сильно увеличено; |-умеренно увеличено; Щ-сильно

снижено; умеренно снижено; слабо снижено.

К третьим суткам количество лейкоцитов в крови коз снижалось, но достоверно превосходило исходные значения. Постепенное снижение лейкоцитов отмечали до 30-ых суток, после чего во всех трех экспериментальных группах при соединении различными материалами

показатели лейкоцитов периферической крови были близки к физиологическим нормам данного вида животных (рис.3 ).

ИД і ; на 3 сутки на 7 сутки на 14 сутки наЗОсутки

V

лигатурное серкляніное соед. соец.

«¡¡.ч

-II

II

I

II

металл скобами

Рис. 3. Динамика изменения лейкоцитов при соединении ребер различными материалами у коз.

Нами так же задокументировано достоверное снижение уровня лимфоцитов в 1 и 3-е сутки при оперативном вмешательстве на ребрах грудной клетки у коз:

- при лигатурном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отношению к ИД (4б,б±0,5б).

- при серкляжном соединении в 1,21 и 1,23 раза соответственно по отношению к ИД (48.3±1,26).

- при соединении металлическими скобами в 1,10 и 1,14 раза соответственно по отношению к ИД (47,8± 1,39).

Начиная с 10-х суток послеоперационного периода, у животных при всех способах фиксации ребер отмечали тенденцию к увеличению данного показателя. Нами достоверно установлено у животных при фиксации ребер с помощью лигатурного и серкляжного соединения уровень лимфоцитов достиг исходного уровня к 60-и суткам наблюдения, а при соединении металлическими скобами к 40-а суткам наблюдения. Полученные нами данные позволяют предположить активное участие лимфоцитов в процессе репаративного остеогенеза, они способны вступать в межклеточную кооперацию с остеогенными, макрофагальными и фибробластическими клетками. Подтверждением служит пик лимфоцитарной активности во второй половине посттравматического периода, совпадающего с формированием зрелых костных балок, что согласуется с данными ( С.Ю. Концевой 2004, Ю.А. Ватников, 2004).

Со стороны лейкограммы в постоперационный период отмечали увеличение палочкоядерных нейтрофилов у животных всех опытных групп, начиная с первых суток после операции до 14-и суток наблюдения. В дальнейшем мы наблюдали снижения уровня палочкоядерных нейтрофилов до исходного уровня.

У животных, при фиксации ребер с помощью лигатуры, количество палочкоядерных нейтрофилов на 10-е сутки постоперационного периода было выше исходных данных в 2,01 раза. При серкляжном соединении ребер количество палочкоядерных нейтрофилов превышало исходные значения в 1,81 раза, соединениями скобами - 1,61 раза.

Увеличение палочкоядерных форм нейтрофилов и уменьшение числа моноцитов свидетельствуют об интоксикации организма продуктами распада тканей, в ответ на травмирующий фактор после оперативного вмешательства.

Изучение динамики моноцитов при репозиции ребер различными материалам выявили следующие закономерности. Так при лигатурном соединении количество моноцитов у коз на 1-е сутки увеличилось, в 1,83 раза по сравнению с исходными данными (2,8±0,10). К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и приближалось к исходным данным до начала эксперимента, но была достоверно ниже в 1.5 раза. К 14-и суткам произошло увеличение их в 1,14 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-и суткам уровень их достиг физиологического значения. При серкляжном соединении количество моноцитов у коз на 1-е сутки увеличилось, в 2,31 раза по сравнению с исходными данными (3,2±0,05). К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и приближалось к исходным данным до начала эксперимента, но достоверно ниже в 1.4 раза. К 14-и суткам произошло увеличение их в 1,19 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-и суткам уровень их достиг физиологического значения. При соединении металлическими скобами количество моноцитов у коз на 1-е сутки увеличилось, в 1,58 раза по сравнению с исходными данными (3,5±0,08). К 7-м суткам содержание моноцитов снизилось и

приближалось к исходным данным начала эксперимента, но достоверно была ниже в 1.2 раза. К 14-и суткам произошло увеличение их в 1,12 раза по сравнению с исходными данными, а к 60-и суткам уровень их достиг физиологического значения

Фагоцитарная активность нейтрофилов при остеосинтезе ребер с помощью различных материалов

При анализе фагоцитарной активности нейтрофилов in vitro при различных способах фиксации ребер грудной клетки нами были выявлены следующие закономерности.

Так фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остеосинтезе ребер с помощью лигатуры характеризовалась следующими показателями. Фагоцитарный индекс после оперативного вмешательства был ниже в 1,85 раза (ИД 75,00 ± 5.01%), фагоцитарное число было ниже в 3,41 раза. (ИД 8,08 ± 0.04у.е ), индекс фагоцитарной завершенности был ниже в 1,7 раза (ИД1,62±0,31 у.е)

Фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остеосинтезе с помощью серкляжа, характеризовалась следующими показателями. Фагоцитарный индекс после оперативного вмешательства был ниже в 1,42 раза (ИД 74,09 ± 1.78%), фагоцитарное число было ниже в 1,09 раза. (ИД 7,68 ± 0.24у.е ), индекс фагоцитарной завершенности был ниже в 1,46 раза (ИД 1,64±0,05 у.е)

Фагоцитарная активность нейтрофилов у коз на 7-е сутки при остеосинтезе с помощью металлических скоб, следующими показателями. Фагоцитарный индекс после оперативного вмешательства был выше в 1,02 раза (ИД 74,01 ± 4,32%), фагоцитарное число было несколько выше в 1,14 раза. (ИД 7,08 ± 0,54у.е ), индекс фагоцитарной завершенности был ниже в 1,03 раза (ИД 1,57±0,04 у.е)(рис.5)

Биохимическими исследованиями было достоверно установлено, что лучшие показатели фагоцитарной активности были в группе животных при остеосинтезе ребер металлическими скобами.

Определение активности щелочной фосфатазы является одним из маркеров в оценки активности реларативного остеогенеза(рис.б)

Серкляж

ное соедине

ние 1080,11

обы 3,43

/І ІІ ШііВІ;

ЩФ до . операции 264,17

Рис. 6. Изменение ЩФ при различных способах фиксации ребер у коз.

Нами проведено исследование по одному из маркеров травматичности операции лактатдегидрогеназа (ЛДГ), которая обнаруживается во всех клетках организма: в сердечной и скелетной мускулатуре, в печени, в легких и в клетках крови. Особенно много ЛДГ в мышцах. В связи с тем, что концентрация ЛДГ в тканях в 500 раз выше, чем в сыворотке, повреждение даже небольшого объёма ткани может сопровождаться существенным повышением активности ЛДГ в сыворотке крови.(рис 7)

Серкляж

ное соедине ние

\

509,21

. . *' металли

металли ческие | о, скобы |

лигат/р

ное соедине ние

320,15

673,:

Рис. 7 Изменение ЛДГ при различных способах фиксации ребер у коз.

Для диагностики и оценки тяжести поражения сердца и мышечной системы, а так же возможном развитии аутоинтоксикации после оперативного вмешательства, мы сочли необходимым исследовать динамику активности креатининфосфокиназы КФК. (рис 8)

Изучение распределения КФК внутри мышечных и миокардиальных клеток показало, что фермент присутствует практически во всех клеточных структурах. Фермент локализован как в цитоплазме, где он частично связан с миофибриллярным аппаратом, так и в митохондриях. Исследования показали, что креатинкиназные системы, кроме обеспечения энергетических запасов клетки, осуществляют внутриклеточный транспорт энергии по фосфокреатиновому пути от мест ее выработки к местам использования скелетной мышцы и миокарда. Так, изофермент КФК, который локализован на внутренней мембране митохондрий, осуществляет перенос фосфатной группы из митохондриальной АТФ, синтезированной в процессе окислительного фосфорилирования, на креатин, локализованный в цитоплазме, с образованием креатинфосфата. Такое направление реакция принимает вследствие функционального сопряжения митохондриального изофермента с аденин-нуклеотид-транслоказой. Цитоплазматический изофермент КФК участвует в дальнейшем превращении энергии и частично сопряжен стаиколитическими и другими процессами в цитоплазме. Исходя из выше изложенного, мы считаем, что фермент КФК является одним из маркеров репаративных энергоемких процессов.

Фагоцитарная активность нейтрофилов с использованием различных материалов в %

¿3 ФАГОЦИТАРНЫЙ ИНДЕКС В ФАГОЦИТАРНОЕ ЧИСЛО а ИНДЕКС ЗАВЕРШЕННОСТИ

ДО ОПЕРАЦИИ

Лигатурное соединение

» НА 7 ДЕНЬ лигатурное соединение

до операции серкляжное соединение

до операции металлические скобы

на 7 день металлические скобы

на 7 день серкляжное соединение

Серил ян;

ное

соедине

ние

476,26

I с - ' 1 кфк до

ШЁШЁ ' метал л и операци

лигатур ческие и

"°е ЙЩ скобы 115,07

соедине ЩЩ 257,09 ! ■

ние jgipF

1738,12 в®*""

Plie. 8. Изменение КФК при различных способах фиксации ребер у коз.

3.2. Морфофуикциональные и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введения аллогенных мультнпотентных мезенхнмальных стромальных клеток.

Для изучения влияния мультнпотентных мезенхнмальных стромальных клеток на структурные изменения в процессе реларативного остеогенеза, а также для стандартизации эксперимента и правильном интерпретации получаемых результатов, животных опытной и контрольной группы выводили из эксперимента на 15, 30, 60, 90 сутки материал брали из области дефекта ребра. Экспериментальные исследования по изучению влияния ММСК на репаративный остеогенез показали, что ММСК, заселенные в костный дефект ребер, закрытый брефоостематриксом достоверно ускоряют репаративный остеогенез. (таб.2)

Стимулирующее действие на репаративный остеогенез ММСК оказывают на 15-е сутки, которое выражается достоверным уменьшением соединительной ткани 8% у опытной группы, против 10% контрольной группы.

Стимулирующее действие на репаративный остеогенез ММСК оказывают на 30-е сутки, которое выразилось активностью процессов по компактизации и увеличению доли зрелого костного матрикса, у опытной группы и составило 42 %, против 40% контрольной группы, а так же дальнейшем уменьшением соединительной ткани (7% у опытной и 8% у контрольной группы).

Наиболее выраженное стимулирующее действие на репаративный остеогенез ММСК оказывают, на 60-е сутки которое выразилось достоверно большим в процентном соотношении созревшего костного матрикса у опытной группы и составило 48% против 44% контрольной группы. Соединительная ткань у опытной группы не обнаруживается, а у контрольной группы она составила 3%.

Гистоморфологических различий в костных дефектах ребер грудной клетки между контрольными и опытными группами на 90-е сутки нами не обнаружено.

Таблица. 3 Морфометрнческие показатели репаративиого остеогенеза у кроликов с применением ММСК(М±ш%)

Группа Костная часть регенерата Костный матрикс Соединительная ткань Кроветворная ткань

15-е сутки наблюдения

п=30 контроль 82,2*3,19 63,9±4,91 24,4*2,16 16,4±1,03

п=30 опыт 89,5*2,41* 69,3±3,59* 15,9±1,91** 16,9±1,15*

30-е сутки наблюдения

п=30 контроль 85,8±0,32 75,9±1,52 15,1±0,50 13,7±0,13

п=30опыт 92,7±0,12* 88,5±1,03*** 13,2±0,31** 9,1±0,49*ф*

60-е сутки наблюдения

п=30 96,7±0,71 85,2±3,33 4,8±0,08 5,9±0,21

контроль

п=30опыт 99,9±0,29** 99,3±3,57** 0,6±0,02*** 5,1±0,03***

90- е сутки наблюдения

п=30 99,8±0,59 94,1±3,36 0,4±0,01 4,9±0,09

контроль

п=30опыт 99,7±0,31* 93,9±0,01 0,3+0,02 4,7±0,07

Примечание*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к

контрольной группе

3.3. Морфофункционльпые и структурные изменения в организме животных при репаративном остеогенезе ребер в различные сроки после введении пунктата аутогенного костного мозга.

Для изучения влияния пунктата аутогенного костного мозга, на структурные изменения в процессе репаративиого остеогенеза, а также для стандартизации эксперимента и правильной интерпретации получаемых результатов животных опытной и контрольной группы выводили из эксперимента на 15, 30, 60, 90 сутки, материал брали из области дефекта ребра. Экспериментальные исследования по изучению влияния пунктата аутогенного костного мозга, достоверно подтверждают стимулирующее действие на репаративный остеогенез при его введении в костный дефект ребер, (таб.4 )

24

Стимулирующее действие на репаративный остеогенез пунктат аутогенного костного мозга оказывают на 15-е сутки, которое выявляется достоверным уменьшением соединительной ткани 8% у опытной группы, против 9% контрольной группы.

Таблица 4. Морфометрические показатели репаратнвного остеогенеза у кроликов с применением пунктата аутогенного костного мозга (М±ш%)

Группа Костная Костный Соединительная Кроветворная

часть матрикс ткань ткань

регенерата

15-е сутки наблюдения

п=30 онтроль 84,6± 1,17 69,5±0,16 16,4±1,04 17,1 ±0,87

п=30опыт 90,9± 1,11* 64,1±1,]2*** 14,3±0,03* 17,6±0,34*

30-е сутки наблюдения

п=30контроль 87,6± 1,03 91,1±0,15 15,9±0,44 15,7±0,17

п=30опыт 91,1±1,12* 96,2±0,12*** 15,1±0,11* 8,9±0,25***

60-е сутки наблюдения

п==30контроль 97,3±0,03 93,6±0,21 3,1 ±0,09 5,1±0,11

п=30опыт 98,1±0,02*** 97,2±0,33*** 0,9±0,02*** 4,9±0,02*

90- е сутки наблюдения

п=30контроль 99,1 ±2,41 94,3±2,99 0,7±0,01 5,1 ±0,03

п=30опыт 99,4± 1,17 95,3±2,36 0,6±0,01 4,9±0,04*

Примечание*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к

контрольной группе

На 30-е сутки пунктат аутогенного костного мозга, так же оказывает стимулирующее действие, которое выявляется достоверным уменьшением соединительной ткани 7% у опытной группы, против 8% у контрольной группы и костной частью регенерата у опытной группы он составил 42% а у контрольной 41 %.

Выраженное стимулирующее действие на репаративный остеогенез пунктат аутогенного костного мозга оказывает на 60-е сутки, так соединительная ткань у опытных не обнаруживается, а у контрольной группы составляет 1%, зрелый костный матрикс составляет 49% у опытной группы , а у контрольной 47%.

Гистоморфологических различий в костных дефектах ребер грудной клетки между контрольными и опытными группами на 90-е сутки нами не обнаружено.

3.4. Морфологические п биохимические изменения в периферической крови экспериментальных животных при использовании мультипотеитиых мезенхимальных стромальных клеток и аутогенного костного мозга.

Для выявления всестороннего воздействия на организм в сравнительном аспекте, нами был проведен лабораторный мониторинг репаративного остеогенеза при использовании аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и аутогенного костного мозга. Объектом исследования были эритроциты с нарушением структурно-функциональных свойств. Структурно-функциональные свойства эритроцитов входят в цепь приспособительных механизмов, поддерживающих постоянство внутренней среды как в норме, так и в условиях патологии. Учитывая, что реология крови определяется совокупностью функционального состояния форменных элементов крови, где ключевая роль принадлежит красным клеткам крови, мы в первую очередь уделяли внимание подвижности, деформируемости, агрегационной активности эритроцитов. Так же важно отметить, что модификация вязко-эластических свойств эритроцитов зависят не только от функционального состояния целого ряда органов, но и сами эритроциты оказывают влияние на жизнедеятельность отдельных органов. Поэтому детальное изучение морфологии эритроцитов при репаративном остеогенезе при дефекте ребер грудной стенки с применением ММСК и аутогенного костного мозга представляется нам весьма важным. Данные изменения эритроцитов представлены в (таб.4.)

Исследования показали, что на 4-е постоперационные сутки нами документально во всех группах регистрировали умеренную гиперсегментацию сегментоядерных нейтрофилов. Эти нарушения связаны с эндогенной интоксикацией. Так же в течение всего постоперационного периода у всех животных нами достоверно задокументированно наличие ретикулоцитов, что характеризует активность репаративного процесса.

Таблица 4. Структурно-функциональные изменения свойств эритроцитов у кроликов.

Морфология эритроцитов, % ИД п=120 После операции на 4-е сутки После операции на 15-е сутки

Контрол ьная п=60 Аутог енный костн ый мозг п=30 ММСК 11=30 Конт роль ная п=60 аутоген ный костны й мозг п=30 ММСК п=30

Полихроматоф плы ретикулоциты) 5,01± 0,11 17,08± 0,44 *** 4,12± 0,33 ** 18,14±0, 37 *** 15,13 ±0,28 *** 15,46± 0,30 *** 1б,08± 0,33 ***

Макроциты 0,01 ±0,0 01 4,03±0,1 6 3,23± 0,13 1,0± 0,04 0,23± 0,01 0,26± 0,01 0,01±

Макроовалоц иты Микросфероц ыты 0 ],00±0,0, 01 2,01± 0,08 0,7± 0,03 0,08± 0,01 1,09± 0,04 0

Сфероциты 0 1,5± 0,06 21,7± 0,37 0,8±0,03 1,0± 0,01 13,55± 0,25 0,2± 0,01

Эхиноциты 5,09±0,0 15 39,87±0, 44 *** 31,09± 0,41 *** 23,06±0, 35 30,62 ±0,49 *** 30,44± 0,43 *** 7,14± 0,23

Акантоциты 0,2±0,01 21,06±0, 78 *** 35,11± 0,6 *** 3,09±0,0 8 12,54 ±0,25 *** 20,90± 0,36 *** 0,5±0,0 1 *

Дегматоциты 0 15,94±0, 29 21,07± 0,68 6,02±0,1 1 5,13± 0,09 10,3±0, 19 0

Эллиптоцнты 0 1,04±0,0 2 0,9±0, 02 0,2±0,01 0,02± 0 0

Стоматоциты 0,2±0,01 17,3±0,2 3 15,0±0 ,27 6,36±0,1 1 11,31 ±0,18 12,43± 0,22 2, !± 0,05

Кодоциты 0,27±0,0 1 13,92±0, 24 *** 19,04 ± 0,35(6 7% у погиб ших) *** 10,6±0,1 9 *** 11,12 ±0,18 13,99± 0,2 1,09± 0,02 *

Шистоциты 1,08±0,0 2 21,00±0, 35 *** 28,51± 0,4 *** 11,03±0, 2 *** 11,67 ±0,23 *** 21,13±0 ,34 *** 2,12±0, 04 *

Дрепаноциты 0 7,13±0,1 3 11,5±0 ,18 3,04±0,0 4 1,01± 0,02 3,81±0, 07 0

Дакриоциты 0 2,37±0,0 5 2,98±0 ,06 0 0,1 ±0 ,01 1,48± 0,03 0

Примечание*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к ИД

Нашими исследованиями достоверно установлено влияние пунктата аутогенного костного мозга и ММСК на морфологические изменения ретикулоцитов. Так на 4-е сутки после операции у животных где применяли аутогенный костный мозг, мы наблюдали уменьшение количества ретикулоцитов в среднем до 4,12 %, в то время как в контрольной группе - 17,08% ив группе где вводили ММСК - 18,14%. Значительная разница в 4,4 раза, свидетельствует доказательством, что введение костного мозга (в первые сутки) угнетает •зритропоэз. Однако на 15-е сутки количество ретикулоцитов восстанавливается до 15,46 %. В контрольной группе - 15,13 % и группе где вводили ММСК -16,08%. (рис.9)

шконтрольная группа ыстволовые клетки

к аутогенный костный мозг

Рис.9. Динамика ретикулоцитов кроликов.

Фагоцитарная активность нейтрофилов при репаративном остеогенезе

Изучения динамики неспецифической резистентности организма является важным звеном в комплексной оценки влияния на организм аутогенного костного мозга и ММСК, так как нейтрофилы обладая мощным цитотоксическим потенциалом, исключительной реактивностью и высокой мобилизационной готовностью, выступают в первой линии эффекторных механизмов иммунологического гомеостаза.

Так же нейтрофилы, являются ключевыми клетками в реализации неспецифической защиты организма, что особенно важно в постоперационном периоде. Поэтому мы в своих исследованиях, уделили внимание изучению фагоцитарной активности нейтрофилов in vitro с использованием тест объекта -латекс и оценкой эффективность фагоцитоза у кроликов.

Исследование неспецифического иммунитета кроликов с использованием тест-объекга - латекса проводили до оперативного вмешательства, на 4-и и на 15-е сутки после проведенных операций на ребрах грудной клетки с применением аутогенного костного мозга и ММСК.

Нами достоверно установлено, что аутогенный костный мозг значительно угнетает продуктивность фагоцитоза, особенно в первые сутки после операции, чем ММСК. Это проявляется снижением таких показателей фагоцитарной активности клеток крови, как фагоцитарный индекс в 1,86 раз, фагоцитарное число в 2,12 раза и индекс завершенности фагоцитоза в 1,88 раз (таб.6)

Таблица. 6 - Показатели фагоцитоза у кроликов на 3-й сутки после оперативного вмешательства.

Показатели Ед. измер ения ид п=120 С применением

Контроль п=120= аутогенного костного мозга п=30 ММСК п=30

Фагоцитарный Индекс % 58,79± 1,64 31,76± 0,92** 31,57 ±0,75** 40,16± 1,44**

Фагоцитарное Число У.Е 7,13 ±0,17 3,05± 0,05*** 3,37 ±0,04*** 5,34± 0,09**

Индекс завершенности У.Е. 1,45± 0,02 0,80±0,02*** 0,77 ±0,02*** 0,86± 0,03**

Примечание*р<0,05 ** р<0,01 *** р<0,001 достоверно по отношению к ИД

В группе животных, где применяли ММСК, параметры фагоцитоза также снижались, но были достоверно выше, чем в группе где применяли пулктат аутогенного костного мозга и соответствовали: ФИ - 40,16 против 58,79 ИД; ФЧ - 5,34, что меньше в 1,34 раза и ИФЗ 0,86, что ниже в 1,68 раз чем показатели до операции.

Биохимические изменения крови при репаративном остеогепезе.

Для биохимического мониторинга репаративного остеогенеза на фоне применения стволовых клеток и аутогенного костного мозга определяли динамику основных костных маркеров - общего белка, щелочной фосфатазы, неорганического фосфора и общего кальция.

Из таблицы 7 видно, что оперативное вмешательство в области ребра, вызывал стандартную ответную реакцию организма, характеризующуюся определенными биохимическими изменениями в крови.

Так, на седьмые сутки, мы отмечали повышение уровня щелочной фосфатазы, общего кальция и неорганического фосфора и незначительное понижение уровня белка в опытных и контрольных группах.

Уровень щелочной фосфатазы на протяжении всего эксперимента был выше исходных данных , что указывает на высокую активность остеобластов. Известно, что этот фермент находится на поверхности цитоплазме клеток остеобластов и при их разрушении выходит в кровяное русло.

Таблица 7. Динамика основных биохимических маркеров репаративиого остеогенеза на фоне применения ММСК и аутогенного костного мозга.

Показатель, Единицы измерения Норма ИД п=120 Контрольная группа п=60 Применение аутогенного костного мозга п=30

7 суток после остеосинтеза

Общий белок, г/л 54-83 58,69±1,29 47,52±1,13 ** 50,71±1,24 ** 52,44±1,03 **

Альбумин, г/л 24-46 З9,88±0,03 33,05-НШ * 33,22±!,18 *** 33,32±1,02 ***

Глобулин, г/л 15-28 18,81±0,04 14,47± 1,12 *** 17,49±0,06 *** 19,12±0,01 ***

Щелочная фосфатаза, ИВ/л 19-173 118,9±3,06 270,7±5,4 *** 250,2±5,45 *** 240,3±5,62 **

Общий кальций, ммоль/л 3,2-3,7 3,42±0,05 5,14±0,06 * 4,94±0,07 * 4,34±0,07 *

фосфор, ммоль/л 1,3-2,2 1,91 ±0,04 4,41±0,03 * 4,12±0,04 * 3,75±0,05 *

Примечанне*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к ИД.

Более низкие показатели щелочной фосфатазы в опытных группах на 15-е сутки свидетельствует о том, что формирование костного регенерата в опытных группах идет более интенсивнее чем в контрольных. Об этом же свидетельствуют и более низкое значения фосфора и высокое кальция, а также восстановление уровня общего белка в опытных группах (таб.8.).

Дооперационный уровень макроэлементов в крови не выходил за рамки физиологической нормы. Концентрация фосфора составила 1,9 ммоль/л, уровень общего кальция 3,4 моль/л. Активность щелочной фосфатазы соответствовала диапазону референсных значений для данного вида животных и составила 118,90 ИЕ/л.

Нельзя не отметить, что практически все показатели, маркеров репаративиого остеогенеза достоверно лучше после применения ММСК. Таким образом репаративный потенциал ММСК достоверно выше, чем у аутогенного костного мозга.

Таблица 8. Динамики основных биохимических маркеров репаративного остеогенеза на фоне применеппя ММСК и аутогенного костного мозга.

Показатель, Единицы измерения Норма ИД п=120 Контрольная группа п=60 Применение аутогенного костного мозга п=30 Применение ММСК п=30

15 суток после остеосинтеза

Общий белок, г/л 54-83 58,69±1,29 50,52±3,15 ** 52,71 ±0,24 ** 55,12±0,04 **

Альбумин, г/л 24-46 39,88±0,03 З8,05±1,03 ** 35,22± 0,13 * З7,02±0,03 ***

Глобулин, г/л 15-28 18,81 ±0,04 14,47±2,12 * 17,49±0,11 * 18,10±0,01 ***

Щелочная фосфатаза, ИЕ/л 19-173 118,9 ±3,06 240,8±3,26 *** 220,4±3,19 ** 210,8±2,76 ***

Общий кальций, ммоль/л 3,2-3,7 3,42±0,05 4,12±0,03 * 3,95±0,04 * 3,85±0,05 *

фосфор, ммоль/л 1,3-2,2 1,91 ±0,04 4,12±0,05 * 1,62±0,03 * 2,01±0,04

Примечание*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к ИД.

При измерении этих показателей на 30-е сутки выявили существенную разницу в регеиераторно-репаративных свойствах костной ткани в группах животных где исследовали условия для активной регенерации, а так же в контрольной группе.

Так уровень фосфора был достоверно ниже в 1,11 раз, общей сывороточный кальций превышал в 1,21 раз у животных, где применяли пунктат аутогенного костного мозга, в то время как изменения кальция и фосфора в группе с применением ММСК были незначительные, по сравнению с до операционным уровнем и составили по фосфору в 0,95 раз, а по кальцию 0,89 раз.(таб.9)

В контрольной группе уровень фосфора значительно превышал до операционный уровень в 2,3 раза, а уровень кальция в 2 раза.

Таблица № 9 Динамика основных биохимических маркеров репаративиого остеогенеза на фоне применения ММСК и аутогенного костного мозга.

Показатель, Единицы измерения Норма ид п=120 Контрольная группа п=60 Применение аутогенного костного мозга п=30 Применение ММСК п=30

30 суток после остеосинтеза

Общий белок, г/л 54-83 58,69±1,29 55,28±0,08 5б,49±0,23 57,52±0,36

Альбумин, г/л 24-46 З9,88±0.03 38,14±0,05 *** 39,22+0,12 *** З9,21±0,13 ***

Глобулин, г/л 15-28 18,81+0,04 17,14±0,03 *** 17,29±0,11 *** 18,31 ±0,23 *

Щелочная фосфатаза, ИЕ/л 19-173 118,9 ±3,06 140,8±3,26 *** 124,0±3,19 *** 90,59±2,76 ***

Общий кальций, ммол ь/л 3,2-3,7 3,42±0,05 4,01 ±0,27 * 3,91 ±0,01 *** 3.62±0,11 **

фосфор, мм о л ь/л 1,3-2,2 1,91 ±0,04 3,89±0,05 * 1,72±0,03 * 2,01 ±0,04

Примечание*р<0,05 ** р<0,01*** р<0,001 достоверно по отношению к ИД

Характерно, что и активность щелочной фосфатазы у этой группы животных превышала дооперационный статус в 2,10 раз и составила 140,1 ИЕ/л, что выше, чем референсные показатели. У кроликов экспериментальных групп имелась активная тенденция к снижению уровня ЩФ. На 30-е сутки после проводимых операций у животных с применением аутогенного костного мозга активность щелочной фосфатазы соответствовала 124,01 ИЕ/л, а у кроликов где применяли ММСК составила 90,59 ИЕ/л.

Согласно результатам наших клинических исследований активное снижение активности щелочной фосфатазы свидетельствуют о долгосрочной активации остеобластов и ускоренной минерализации костного матрикса у

животных с использованием в качестве стимуляторов регенераторпо-репаративных процессов - ММСК и аутогенного костного мозга.

Нашими исследованиями достоверно установлено нарушение белкового обмена в постоперационный период (особенно в острой фазе), что коррелирует с данными других исследователей. В данном случае к 30-и суткам мы отмечали компенсацию диспротеинемин. Маркеры белкового обмена не выходили за рамки рефереисных значений, так до операции уровень общего белка составил 58,7! г/л. В экспериментальных группах с применением аутогенного костного мозга -56,49 г/л и ММСК - 57,52 г/л, В контрольной группе незначительно ниже -55,28 г/л.

ВЫВОДЫ

1. Динамика структурных и функциональных изменений периферической .красной крови, при фиксации ребер грудной клетки, у всех прооперированных экспериментальных животных имела следующие временные тенденции: (1-14-е сутки) происходило снижение показателей эритроцитов.

1 -е сутки

- при лигатурном соединении; через сутки после репаративного процесса произошло уменьшение количеств эритроцитов в 1,23 раза.

- при серклпжном соединении; через сутки после репаративного процесса произошло уменьшение количеств эритроцитов в 1,29 раза

- при соединении металлическими скобами; через сутки после репаративного процесса произошло уменьшение количеств эритроцитов в 1,06 раза

(25-30-е сутки) прослеживалась тенденция постепенному увеличению

30-е сутки - при лигатурном соединении; отмечали постепенное увеличение количества эритроцитов, но по отношению к исходным данным их уровень был достоверно ниже в 1,1 раза

- при серкляжном соединении; отмечали увеличение количества эритроцитов,но по отношению к исходным данным, их уровень был достоверно ниже в 1,1 раза.

при соединении металлическими скобами; отмечали постепенное увеличение количества эритроцитов, но по отношению к исходным данным пх уровень был достоверно ниже в 1,07 раза.

(40-60-е) показатели эритроцитов приближались к физиологическим нормам

2.Динамнка структурных и функциональных изменений лейкограммы периферической белой крови, при фиксации ребер грудной клетки, у всех прооперированных экспериментальных животных, выявили выраженную лейкоцитарную реакцию, проявившую увеличением количества лейкоцитов до 14-и суток. Постепенное снижение лейкоцитов отмечали до 30-исуток, после чего

33

наступал период подъема количественного показателя лейкоцитов в периферической крови экспериментальных животных.

В 1-есутки

- при лигатурном соединении в 1,79 раза

- при серкляжном соединении в 1,49 раза

- при соединении металлическими скобами в 1,46 раза

3 Динамика палочкоядерных нейтрофилов (ПЯН) при фиксации ребер различными материалами выглядит следующим образом: в первые дни отмечено увеличение начиная с 7-го дня отмечали стойкую тенденцию к снижению. В заключительные дни эксперимента, количество палочкоядерных нейтрофилов приближалось к референтным значениям.

1-е сутки

- при лигатурном соединении в 2,41 раза

- при серкляжном соединении в 2,07 раза

- при соединении металлическими скобами в 1,08 раза

4. Динамика сегментоядерных нейтрофилов (СЯН) при фиксации ребер различными материалами экспериментальных животных отмечена стойким увеличением сначала эксперимента до 30-и суток, и постепенным уменьшением после 30-ти суток до конца эксперимента.но достоверно выше по отношению исходным данным.

60-е сутки

- при лигатурном соединении в 1,06 раза

- при серкляжном соединении в 1,03 раза

- при соединении металлическими скобами в 1,0 раза

5. Динамика лимфоцитов при фиксации ребер различными материалами экспериментальных животных отмечена стойким уменьшением в 1 и 3-е сутки, аж до 7-ми суток, после чего идет тенденция к накоплению лимфоцитов. Начиная с 10-ти суток идет незначительное понижение вплоть до 30-и суток, а затем постепенное увеличение и к концу эксперимента приближается к исходным значениям.

в 1 -3-й сутки

- при лигатурном соединении в 1,21 и 1,23 раза

- при серкляжном соедмнениив 1,21 и 1,23 раза

- при соединении металлическими скобамив 1,10 и 1,14 раза

6. Биохимическими исследованиями крови установлен один из маркеров травматичности операции лактатдегидрогеназа (ЛДГ). Активность ЛДГ в на 7-е сутки с применением лигатуры составила 673,34 ИЕ/л, при серкляжном шве 509,0 ИЕ/л, а при использовании скоб 320 ИЕ/л.

7. Биохимическими исследованиями крови установлен один из маркеров репаративных энергоемких процессов КФК (креатининфосфокиназа) Активность КФК на 7-е сутки с применением лигатуры составила 1738,12 ИЕ/л, при серкляжном шве 476,26 ИЕ/л, а при использовании скоб 257,09 ИЕ/л.

8. Нами достоверно установлено, что наименьшие структурно-функциональные изменения белой и красной периферической крови, происходят при фиксации ребер металлическими скобами.

9. Стимулирующее действие на репаративный остеогенез аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оказывают, на 15-е сутки, которое выявляется достоверным уменьшением соединительной ткани 8% у опытной группы, против 10% контрольной группы.

10 .Выраженное стимулирующее действие на репаративный остеогенез аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

оказывают на 30-е сутки, так у опытной группы более высоким оказалось' значение параметров, свидетельствующих об активности процессов компакгизации характеризующееся увеличение доли зрелого костного матрикса, который составляет 42% у опытной группы, против 40% контрольной группы, а так же дальнейшем уменьшением соединительной ткани ( 7% у опытной группы и 8% у контрольной группы).

11. Наиболее выраженное стимулирующее действие на репаративный остеогенез аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оказывают, на 60-е сутки, которое выразилось достоверно большим в процентном соотношении созревшегося костного матрикса у опытной группы и составило 48% против 44% контрольной группы. Соединительная ткань у опытной группы не обнаруживается, а у контрольной группы составляет 3%.

12. Гистоморфологических различий в костных дефектах ребер грудной клетки между контрольными и опытными группами на 90-е сутки нами не обнаружено.

13. Стимулирующее действие на репаративный остеогенез биотрасплантата аутологичного костного мозга оказывает на 15-е сутки, которые выражаются достоверным уменьшением соединительной ткани 8 % в опытной, и 9 % в контрольной.

14. Выраженное стимулирующее действие на репаративный остеогенез биотрансплантат аутологичного костного мозга оказывает на 30-е сутки, достоверным уменьшением соединительной ткани 7% у опытной против 8%

35

контрольной группы, а так же увеличением костного матрикса 45% у опытной группы, против 43% контрольной группы.

15. Так же отмечалось стимулирующее действие на репаративный остеогенез биотрансплантат аутологичного костного мозга на 60-е сутки, которое выразилось достоверно большим п процентном соотношении созревшего костного матрикса 49% у опытной группы против 47% контрольной группы.

16. Гистоморфологических различий в костных дефектах ребер грудной клетки между контрольными и опытными группами на 90-е сутки нами не обнаружено.

17. Лабораторным мониторингом было достоверно установлено, влияние на морфологические изменения ретнкулоцитов, при использовании аутогенного костного мозга и аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Так на 4-е сутки после операции у животных где применяли аутогенный костный мозг, мы наблюдали уменьшение количества ретнкулоцитов в среднем до 4,12 %, в то время как в контрольной группе - 17,08% и группе где вводили стволовые клетки - 18,14%. Значительная разница в 4,4 раза, свидетельствует доказательством, что введение костного мозга (в первые сутки) угнетает эритропоэз. Однако на 14-е сутки количество ретикулоцитов восстанавливается до 15,46 %. В контрольной группе - 15,13 % и группе где вводили стволовые клетки- 16,08%.

18. Применении аутогенного костного мозга у кроликов для ускорения репаративного остегенеза достоверно больше (угнетает) фагоцитарную активность нейтрофнлов, чем мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, так на 3-й сутки после операции, это проявляется снижением таких показателей фагоцитарной активности клеток крови, как фагоцитарный индекс в 1,86 раз, против -1,43 раза , фагоцитарное число в 2,12 раза, против -1,13 раза и индекс завершенности фагоцитоза в 1,88 раз, против -1,57раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научные разработки положения и выводы вошли в методические рекомендации «Экспериментальные применения клеточных технологий для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки»,одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии. (утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым А.М. 19.11.2012 г. протокол №5 от 15 ноября 2012.) М. 2012 -50 с.

«Экспериментальные применения аутогенного костного мозга для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки», одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

(утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым А.М. 13.02.2013 г. протокол №1 от 1 февраля 2013.) М. 2013 -40 с.

Патент РФ на полезную модель № 122575 от 10.12.2012 г. для личения длительно незаживающих ран.

Исследования по структурнофункционалыюму остеогенезу представлены в учебном пособие «Алгоритмы лабораторного контроля остеогенеза» - М.000 «Франтера», 2011-100 с.

В монографиях: «Морфофункциональные изменения периферической крови в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов». М.000 «Франтер», - 2013.- 130 с.

«Влияние клеточных технологий на репаративный остеогенез при дефектах ребер грудной клетки» М.ООО «Франтер», - 2013,- 110 с.

Материалы диссертации используются в цикле лекций по курсу «Ветеринарная хирургия» в МГУПП.

Список работ опубликованных но теме диссертации.

1. Луцай В. И. Стимуляция стволовыми клетками остеогенеза / Луцай.В. И., Дерхо.М А., Концевая С.Ю., Матвеева М.В., Крюковская Г,М.// Ж.: «Ветеринарная практика», -2009. -№4,- С.47-51.

2. Луцай В.И. Особенности остеогенеза оскольчатых переломов трубчатых костей / Луцай В.И,. Тимофеев C.B., Дерхо. M А., Концевая С.Ю.// Ж.: «Международный вестник ветеринарии», -2009. - №-4.- С. 16-18.

3. Луцай В.И. Фагоцитарная активность нейтрофилов при транспортном стрессе у коз/ Луцай В.И., Матвеева М.В., Крюковская Г.М.// Ж.: «Ветеринарная практика», 2010. - № 2,- С. 30-34.

4. Луцай В.И. Изменение морфологии эритроцитов коз после торакального вмешательства// Ж.: «Ветеринарная практика», 2011. - № 3. - С. 20-26.

5. Луцай В.И. Нарушение кальций - фосфорного обмена у щенков крупных пород собак и методы коррекции их лечения/ Луцай В.И., Марюшнна Т.О., Матвеева М.В, Крюковская Г.М.// Ж.: «Ветеринарная практика», 2010. - № 4. - С. 42-46.

6. Луцай В.И. Динамика лейкоцитов при репозиции ребер у коз различными способами// Ж.: «Ветеринарная практика», 20! 1. - № 4,- С. 34-37.

7. Луцай В.И. Основы теории общей ветеринарной хирургии. /Курс лекций (учебное пособие)// Уша Б.В., Луцай В.И., Концевая С.Ю.// М., - МГУПБ. -2009.-148с.

8. Луцай В.И. Динамика лейкограммы коз при различных способах фиксации поврежденного реберного каркаса/ Вишневский A.A., Луцай В.И.// Тезисы международной хирургической конференции. Ульяновск 2011г.

9. Луцай В.И. Нарушения кольциево-фосфорного обмена у щенков / Луцай В.И.,

Марюшина Т.О.// Тезисы первой всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии 19-20 марта,-М., -2010. - С. 55-59.

10. Луцай В.И. Изменение показателей периферической крови у коз при различных способах фиксации поврежденного реберного каркаса/ Уша Б.В., Луцай В.И. и др. /АГезисы второй всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной хирургии 19-20 марта,- М., -2011.-С. 65-68.

11. Луцай В.И. Ометопластика в хирургической реабилитации больных с хроническим послеоперационным стерномедиастинитом./Вишневский A.A., Луцай В.И., и др.// Ж.: Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии №1 2011. -С. 56-62.

12. Луцай В.И. Стимуляция репаративного остеогенеза мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками при замещении костных дефектов реберного каркаса в эксперименте/ Уша Б. В., Вишневский A.A., Луцай В.И.// Ж. : «Аграрная наука» №10 2012 С. 20-23.

13. Луцай В.И. Алгоритмы лабораторного контроля остеосинтеза /Концевая С.Ю., Дерхо М.А., Луцай В.И //Учебное пособие рекомендовано УМО вузов России по образованию в области технологии сырья и продуктов животного происхождения М., - МГУПБ. - 2011. - 94 с.

14. Луцай В.И. Динамика количественных показателей красной крови коз при фиксации ребер различными материалами/ Луцай В.И., Матвеева М.В. // Ж.: «Ветеринарная практика», 2012. - № 4,- С. 38-43.

15. Луцай В.И. Вторичный гиперпаратнреоз при хронической почечной недостаточности у собак /Уша Б.В., Луцай В.И., Марюшина Т.О.// Ж.:»Российский ветеринарный журнал», 2011 -№3 -С. 19-21.

16. Луцай В.И. Исследования содержания ионизированного кальция паратиреотропного гормона, витамина Д и костной щелочной фосфатазы в крови молодых собак с синдромом мальабсорбции/ Марюшина Т.О. Луцай В.И.// Ж. «Ветеринарная клиника» 2012.-№5 -С. 9-11.

17. Луцай В. И. Экспериментальные применения клеточных технологий для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки (учебно-методическое пособие) / Уша Б.В., Луцай В.И., Вишневский A.A.// одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым А.М. 19.11.2012 г. протокол №5 от 15 ноября 2012.) М. 2012 -50 с.

18. Луцай В.И. Патент РФ па полезную модель № 122575 зарегистрировано в Государственном реестре полезных моделей Российской Федерации от 10 декабря 2012 г. Мембранная диализируюшая повязка для животных, при гнойных и длительно незаживающих ран./ Безрук Е.Л., Концевая С.Ю., Луцай В.И.

19. Луцай В.И. Экспериментальные применения аутогенного костного мозга для стимуляции репаративного остеогенеза при дефекте ребер грудной клетки(учебно-методическое пособие) / Уша Б.В., Луцай В.И., Вишневский A.A.//

одобрены отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (утверждены Академиком - секретарем РАСХН Смирновым A.M. 13.02.2013 г. протокол №1 от 1 февраля 2013.) М. 2013 -40 с.

20. Луцай В.И. Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов у кроликов при использовании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и аутогенного костного мозга . / Луцай В.И., Матвеева М.В.// Ж.: «Ветеринарная практика», 2013 - № 3. - С. 42-46.

21. Луцай В.И. Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в ветеринарной медицине/ Уша Б.В., Луцай В.И., Вишневский A.A.// Тезисы международного конгресса Биотехнологии и перспективы развития Москва.,2013.-С. 467.

22. Луцай В.И. Влияние клеточных технологий на репаративный остеогенез при дефектах ребер грудной клетки//Монография М., -МГУПП. - 2013,- 100 с

23. Луцай В.И. Морфофункциональные изменения периферической крови в организме животных при остеосинтезе ребер с помощью различных хирургических методов.//Монография М., - МГУПП,- 2013,- 130с.

24. Луцай В.И. Фагоцитарная активность нейтрофилов у коз при остеосинтезе ребер различными материалами /ОК. Био. 2013.

25. Луцай В.И. Морфо-функциональные изменения эритроцитов при использовании аутогенного костного мозга и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток у кроликов//Ж. «Ветеринарная клиника» 2013.

26. Луцай В.И. Динамика изменения белой крови коз при остесинтезе ребер различными материалами.//Ж. Био. 2013 -№ 9 -С 21-23.

Список сокращений и обозначений

Ид

ММСК ЩФ ЛДГ КФК

Печать трафаретная. Усл.печ.л. 2,44. Тираж 100. Заказ 626. WWW.FRANTERA.COM

- исходные данные

- мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

- щелочная фосфотаза

- лактатдегидрогеназа креатининфосфокиназа

Отпечатано в типографии ООО "Франтера" Подписано к печати 20.09.2013 г. Формат 60x84/16. Бумага "Офсетная №1" 80г/м3.