Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментально-морфологическое обоснование применения окситоцина для оптимизации репаративных гистогенезов при костной аутопластике дефектов нижней челюсти (экспериментально-гистологическое исследов

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментально-морфологическое обоснование применения окситоцина для оптимизации репаративных гистогенезов при костной аутопластике дефектов нижней челюсти (экспериментально-гистологическое исследов"

На правах рукописи

ВОЛКОВ Юрий Олегович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИТОЦИНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ГИСТОГЕНЕЗОВ ПРИ КОСТНОЙ АУТОПЛАСТИКЕ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03,03.04, -клеточная биология, цитология, гистология 14.01.14,- стоматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург - 2013

005537921

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессии ильного образования «Оренбургская госудтрсгвсш ел медит искал акааем га»

Министерства злравоохрш к»мя Российской Садгршд от. Научные руководшепи: заслуяенньш деятель науки РФ,

доктор биолоп несюк наук, профессор Свдников Александр Абрамович

заслуженный врач РФ,

досгор медицинских наук, профессор

Матчин Александр Артемьеин

Официатьныеоппонеты: доктор медищжктанауклрэфессор

БрюхинГеннащйВасильевич-заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России

доктор медалиста« наук, профессор Зотов Валентин Михайлович -профессор кафедры ортопедической стоматолог™ ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава Роют Ведущая орган: палия: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государствешый медикочломататопиеский }ниверсшетич»ени АЛЕцаоювюва» Минздрава России.

Защита сосгоится < декабря 2013 г. часов на заседании дгссертапионного совета Д

208.066.04 при госузарегвегаюм образовательном учреждении высшего професаюнатьного образования «Оренбургская государственная медицинская акадгмия» Минздрава Росам по адресу: Реши, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, ил заседаний Учёного совета, офиц атьный сайт: Ьйр^/адпат

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России (460000, г.Оренбург, Паркрзый проспект д. 7).

Автореферат разослан «с? » ноября 2013г., автореферат и текст объявления размешены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

Ученья! секретарь л ¡ссершионного совета, доктор биологических наук, профессор

: , ; ; , , •;;; РИЦ^Я WAKIEPHCTIIKA РАБОТЫ

. , ..,.,.,,,, .,.-,. Летуалыюсть

Совершенствование методов лечения и реабилитации больных с дефектами костей лица

.?>-•......

продолжает оставаться актуальной проблемой челюспю-лицевой хирургии (Петренко В Л, 2007; Герасимов А.С, 2011).

Отсутствие челюсти или ее фрагмента нередко приводит к изменению внешнего ввда больного, сопровождается тяжелыми нарушениями артикуляции нижней челюсга, вызывает нарушения акта жевания, глотания, звукопроизношения и речевой ришики и другие расстройства, приводящие к существенному изменению жизненно важных функций

'i " -'>i'V'T

и эстетики лица (Рапекга СИ, (2008). Всё это приводит к тяжелым нарушениям

психосоматического состояния больных (Дударева А Л, 2009; ЛежаваН Л, 2010).

Значимость этой проблемы возрастает в связи с увеличением количества пациентов,

перенесших оперативные вмешательства по поводу новообразований (Цробышев AJO,

2007; Жулев Е.Н.С соавт, 2008; Кулаков А А с соавт, 2009; Bofíano Р. et al, 2012; De Meló W.

M. et al, 2012), производстве! шого и бьгтоюго травматизма (Нестеров А.В, 2011; Tepper О. М

et al, 2011; Chrcanovic В Лц 2012). .

Успешное замещение дефекта нижней челюсти костным трансплантатом во многом

определяют процессы репаративной регенерации в зоне пересаженного костного

аутотронсплангата. Возможности традиционных методов пластики имеют границы, а такие

недостатки, как мно поэтапность, ограниченность пластического материала, малая

устойчивость лоскутов и. трансплантатов к инфекции, зависимость результата операции от

состояния кровоснабжения тканейв зоне дефекта, делают восстановительное лечение

- ' - ------,, .. ,.,-•! .....

малоэффективным, а порой и безрезультатным (Неробеев АЛ, 1988; Перлухин MJI, 2009;

Сысоляттш ПГ. с соавт, 2009).

По данным'1 литературы' (Калакуцкий НБ, 2004; Gonzalez-Garsia R. et al, 2009),

остеопластика нижней челюсти нередко сопровождается воспалительными осложнениями.

Гнойно-воспалительные процессы в1 ране могут вести к расхождению краев раны, некрозу

перемещенных лоскутов слизистой оболочки и кожи. Это приводит к отторжению

пересаженных костных аутотрансплангагов, ведет к образованию свищей, оросгом, к

вторичным деформациям челюсшо-лицевой области и шеи. Кроме того, костная ткань

челюстно-лицевой области обладает низкими потенциями к регенерации вследствие малого содержания кроветворного костного мозга (Перова МД, 2005). Поэтому даже частичное восстановление костной ткани в области послеоперационных дефектов является весьма сложным (Безруков BJV1 с соавг, 2002; Дробышев AJO. с соавг, 2002).

При планировании костно-пластических операций большое значение имеет выбор пластического материала Продолжается поиск новых материалов и препаратов, способствующих ликвидации воспаления и восстановлению структурных элементов костной ткани (Бельченко В А, 2002; Топольницкий ОЗ, 2002; Шишавдая ЕИ, 2009; Яременко АЛ с соавт, 2011).

В последние годы опубликованы работы о положительном влиянии гипоталамических нейропегттцдов, в частности оксигощша, на репаршивные процессы тканей различного генеза (Поленов АЛ, 1994; Спщников АА, 1999,2001; Барков ВН, 2004; Гречихина СБ. с соавт, 2007; Магчин А А. с соавг, 2008; Сгадников АА, Бухарин ОВ, 2012). Исследованиями (Курлаев ПЛ, 1986, 2001; Сивожелеэов КГ, 2005; Вахшов ЭМ, 2011) показана целесообразность местного применения оксигоцина, позитивно влияющего на репарацию тканей при лечении рада заболеваний, в том числе воспалительного характера.

Получены новые сведения о том, что оксигоцин обеспечивает условия для развитая репарапивных потенций клеточных элементов, стимулирует дентиногенез, оптимизирует и коррегируег процессы репаративной регенерации в тканях периодами, цементе зуба и в альвеолярной кости (Безносик В.Н, 2010).

Доказано положительное влияние местного применения оксигоцина в эксперименте при создании модели сквозной раны щеки у крыс, проявляющееся в уменьшении воспаления и оптимизации репаративных гистогенезов, обусловленных стимулирующим воздействием на пролиферативную активность эвдотелиоцигов, фибробласгов, эпигелиоцигов слизистой и кожной части щеки, миосимпластов, на функциональную деятельность макрофагов. Это способствует заживлению раны в целом (Кочкина Н.Н., 2010; Безносик В.Н. с соавг., 2012).

Однако роль гипоталамической нейросекреции в оптимизации репаративных гистогенезов костной ткани челюстно-лицевой области в условиях замещения дефектов нижней челюсти скелетными аутотрансплантатами изучена недостаточно.

4

Цепь и задачи исследования

Целью настоящего исследования является эксперименгалы ю-гисгалогическое обоснование применения окситоцина для оптимизации заживления дефектов нижней челюсти при костной аутопластике на основе оценки оосгояния адаптивной роли гипоталамической нейросекреции.

Д ля достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать модель сквозного дефекта тела нижней челюсти, замещенного ауторебром, у экспериментальных животных.

2. Провести морфофункциональную оценку нонапегтщцергической гипспаламической нейросекреции в условиях раневого повреждения нижней челюсти у экспериментальных животных с последующим замещением моделируемых дефектов реберным аугогрансплангагом (в том числе в сочетании с антибиотиком).

3. Экспериментально изучил. влияние окситоцина на характер морфофункциональных изменений в мягких тканях окалочелюсгной области, нижней челюсти, реберном аукпрансплангаге и гишталамо-гигтофизарной нейросекрегорной системе (ГГНС).

4. В сравнительном аспекте проанализировать влияние цефтриабояа, а также д анного антибиотика и окситоцина на процесс репарашвной регенерации сквозного дефекта костной ткани нижней челюсти в условиях замещения дефекта реберным аутотранспланштом.

Научная новшна работы

Установлено, что процессы экспериментально вызванного сквозного дефекта нижней челюсти в условиях аугогрансплантации аугоребра и местного введения окситоцина приводят к существенному повышению репарашвных потенций костной ткани за счет осгеоицоукшвной реализации гистоортанспипических свойств. Это позволило обосновать новый методический подход, позволяющий достичь жесткой фиксации реберного аутотрансплангага и тем самым обеспечил, формирование органотепического регенерата. Впервые обоснованы общебиошгические критерии оценки процессов репарагивного остеогенеза костной раны в связи с регуляпорным участием гипоталамических

5

нейропеггпцрв в оптимизации процессов заживления дефектов нижней челюсти в условиях их замещения реберным ауготрансплангагом, что доказывает целесообразность использования оксигоцина для оптимизации репаратвного остеогисгогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.

Научно-практическое значение

Проведенные исследования расширяют представления о характере и динамике заживления сквозных костных дефектов нижней челюсти и обосновывают целесообразность применения одного из гипоталамических нейропегтздов (оксигоцина) для стимуляции репаратвного гистогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.

Полученные новые сведения о роли и значимости оксигоцина в оптимизации репаративных гистогенезов могут быть использованы в качестве методологической основы при разработке новых способов лечения больных с д ефектами костей лицевого скелета.

Экспериментально разработанный и обоснованный новый способ лечения сквозных дефектов нижней челюсти дает возможность его клинической апробации после разрешения Минздрава России.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Замещение сквозюго дефекта нижней челюсти экспериментальных животных (крыс) реберным костным ауготрансплангагом сопровождается резорбцией ауготрансплантагаатакже альвеолярного отростка, с расхождением краев, в области донорских участков, восполняемых фиброзной тканью, что коррелирует с морфофункщюнальной недостаточностью нонапепщдэргической гипсггаламо-лтофткрной нейросекрегорной системы.

2. Регенерация костной ткани после моделирования сквозного дефекта нижней челюсти в существенной сникни зависит от гипоталамических нейроэвдэкринных механизмов регуляции осгеогенеза.

3. Местное применение оксигоцина коррегирует процессы репаратвного осгеогенеза дефоаов нижней челюсш экспериментальных животных, в том числе при использовании реберных фтотрансплангагов, приводя к формированию струкгурно-функщюнального полноценного регенерата.

Внедрение результатов исследования

Материалы д иссертации внедрены в учебном процессе кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2011); XVII Международной конференции челюсшо-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2012 г); XI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Самара, 2012); XVII Мещгународной конференции челюсгно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2013).

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного таяла и состоит га введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием собственных исследований с тремя подплавами, главы обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы, 29 рисунков (фотографий, микрофотографий и алектро!июграмм). Указатель оодержиг 256 источников, из которых 182 отечественных и 74 иностранных.

СОД ЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 90 нелинейных белых половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 г (табл. 1). Все животные одного возраста, содержались в стандартных условиях вивария на полноценной диете.

Под эфирным рауш-наркозом у 75 животных формировали экспериментальную модель

7

сквозного дефекта нижней челюсти. Для этого в асептических условиях, после осуществления типичного подчелюстного доступа, были скелетированы угол и тело нижней челюсти от мягких тканей и слизистой оболочки ротовой полости, с помощью бормашины и кусачек Люэра создавался сквозной костный дефект тела нижней челюсти размером 4 мм в пределах зубного рада. Производился гемостаз. На мягкие ткани и слизистую оболочку ротовой полости производилось наложение швов викриловой ншью.

Группа из 15 животных (без каких-либо экспериментальных воздействий) была контрольной.

При выполнении исследований были соблюдены требования приказа МЗ СССР № 755 от 12.08 1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приложения к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Федерального закона, принятого Государственной Думой 1.12.1999 «О защите животных от жестокого обращения».

В 1-ой серии животные оо сквозным дефектом нижней челюсти наблюдались без дополнительных вмешательств.

Во 2-ой серии наблюдались крысы оо стандартным дефектом нижней челюсти с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом без медикаментозного лечения.

В 3-ей серии подопьпным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом вводился окситоцин (ГЕДЕОН РИХТЕР А. О. Будапешт-Венгрия) во время и на 1,3,5,7 сутки после операц ии один раз в день в разовой дозе 1МЕ в окружающие дефект мягкие ткани.

В 4-ой серии экспериментальным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплангатом внутримышечно вводился раствор цефггриабола (ООО «АБОЛмед», Россия) в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в день.

В 5-ой серии опытов экспериментальным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплашагом на 1,3,5,7 сутки после операции проводилось инъекционное введение оксигоцина (в окружающие дефект мягкие ткани) один раз в день в разовой дозе 1МЕ и инъекционное введение раствора цефтриабсша внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в день.

8

Таблица№1

Объем и структура исследования

Характер экспериментальных воздействий Сроки наблюдений, в сутках

1 3 5 7 15

Количество животных

Контрольная группа 3 3 3 3 3

Серия 1. Создание сквозного дефекта нижней челюсти без дополнительных вмешательств 3 3 3 3 3

Серия 2. Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей первичной косшой пластикой реберным аутотрансплш пятом 3 3 3 3 3

Серия 3. Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей первичной косшой пластикой реберным аутотрансплантагом и инъекционным введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции океигоцина в разовой дозе 1ЕД 1 раз в сутки в окружающие дефект мягкие ткани 3 3 3 3 3

Серия 4. Создание сквозного дефекта нижней челюсти с первичной косшой пластикой реберным ауютранствнгапом и внутримышечным введением раствор цефгриабола в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки 3 3 3 3 3

Серия 5. Создание сквозного дефекта нижней челюсти с первичной косшой пластикой реберным ауготрансплангагом и введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции, в окружающие дефект мягкие ткани, океигоцина один раз в сутки в разовой дозе 1ед и раствора цефгриабола внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки 3 3 3 3 3

Итого: 18 18 18 18 18

Животные выводились из эксперимента путем декагапации под эфирным наркозом на 1,3,5,7,15 сутки после операции, по 3 особи в каждой серии и в те же сроки в контрольной группе.

В последующем с использованием световой и электронной микроскопии, иммуноцигохимии и морфомстрии исследованы фрагмент нижней челюсти в области костных ран с окружающими мягкими тканями и фрагменты гипоталамуса и нейрогипофша с дальнейшим статистическим анализом количественных параметров.

Для светоогтгических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт - формоле, затем проводили декальцинацию костных объектов в 4% растворе ЭДГА (тритона В) в течение 10 суг и дофикеировали вновь в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в целлоидин - парафин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществлялось на ротационном микротоме МПС-2. Депграфинированные срезы были окрашены гематоксилином Майера и эозином. Для выявления гликогена и нейтральных мукополисахарвдов (шикопротевдов) проведена перийодат-Шифф реакция по Мак-Манусу, для определения глюкозаминогликанов проводилась реакция столуидиновым синим при значении рН 2,7-3,0, рибонуклеопротевдов

- метиленовым зеленым и пиронином <<Ж>> по Браше. Гистохимические исследования осуществлялись с использованием энзимагических мэнтролей (Э. Пирс, 1962). Для оценки морфофункционального состояния нейросекрегорных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса применяли окрагку гистологических срезов паральдегвд-фуксином по Гомори-Габу, в модификации АЛ. Поленова (1994) с оценкой экспрессии синтеза протеина р53 и аншапоптошческого бежа bcl-2. При этом объемы фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы инкубировали с соответствующими моноклональными ашшелами (наборы «Кй» фирмы ДАКО, Д ания) в рабочем разведении 1:50. До1фашивание ядер клеток проводили 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетагаом буфере. Для визуализации стругаур использовали стрептавндин-биотиновый гтероксцдазный метод (Кияоов AJL, 2001). Подсчет окрашенных иммунопозигивных клеток (в %) осуществляли при просмотре не менее 1000 клеток в различных полях зрения микроскопа МБИ -15,25мм2, ув. об 90, ок 10.

Для электронной микроскопии фиксация материала осуществлялась в растворе глкпарового альдегида на S-коллединовом буфере (рН 7,2 - 7,4) и последующая постфиксация

- по G. Milbnig (1961). Материал был обезвожен при комнатной температуре в ацетоне

10

возрастающей концентрации и помещён в смолу ЭПОН 812. С каждого блока на ультрагоме LKB-5 (Swaien-Bromma) были получены полутонкие (1мкм) и ультрашнкие (40-60 нм) срезы Полугонкие срезы окрашены метиленовым синим и основным фуксином гю прописи Sato и Shamcto (1973). Полугонкие срезы итользовались при подготовке блоков к заточке перед гатгговлением ультрагонких срезов, а также для анализа тканей и клеточной организации на световом уровне.

Ультратонкие среял приготовлены с предварительным двойным контрастированием в насыщенном спиртовом растворе уранилацегага и цшраге свинца (Reynolds, 1963). Для изучения ультратонких срезов использован электронный микроскоп ЭМВ 100АК Фогографировш ме струюур проводилось при увеличении от х 5400 до х40000. Морфометрия струюур выполнена на препаратах и электронограммах с использованием стандартных окулярных сеток Г.Г. Автацдилова (1999), а также винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15ху4.2

Полученные количественные параметры обрабатывались с помощью компьютерной программы Statistika 6.0 и представлены в вцде: среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между группами проводили с учетом характера распределения параметрических (t -критерий Стьюдеша) и непарамегрических (и - критерий - Манна-Уигаи) методами. Достоверными считались отличия три р<0,05(95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Повреждение костной ткани всегда сопровождается не только местными, но и общими изменениями, регулируемые гипогаламическими нейроовдяфинными механизмами, включающими адаптационные системы, мы провели оценку гатогапамо-гипофизарвой нейросекрегорной нонапатщцергической системы (11 НС) экспериментальных животных, как иазестно играющей ведущую роль в компенсации нарушенного клегочнеш и тканевого гомеостаза Изложение полученных результатов представлено в аспекте сформулированной цели диссертационного исследования, определяющей установление закономерностей гигюталамической нейроэццокринной регуляции репарапшного остшгенеза нижней челюсти экспериментальных животных. Данный аспект явился ключевым, поскольку исследования адаптивной роли гитоталамической нонапапцдергической натросекреции на сегодняшний

11

день являются приоритетными, связанными с широким диагностическим и особенно терапевтическим использованием нонапегтгидов (в частности, оксигоцина), как важнейших регуляторов многих биологических процессов, включая репаративные гистогенезы (Поленов АЛ, 1994; Спщников АА, Бухарин ОБ, 2012).

Основной аспект был сделан на установлении адаптивной роли гипоталамичесюго нонапегтщдергического пути в обеспечении процессов пролиферации, роста и дифферениировки тканевых элементов четосгно-лицевой области и их морфогенегической перестройки, атакже поддержании клеточного и тканевого гомеосгаза

Морфофункииональная оценка реорганизации нонапегггидергаческнх гипоталамических нейросекрегорных центров в условиях моделирования сквозного дефекта нижней челюсти крыс, в том числе при замещении дефектов реберным

ауготрансплантатом

В этом разделе диссертационного исследования мы приводим данные о структурно-функциональной реорганизации нейросекрегорных клеток (НСК) супраоггшческих и паравентрикулярных ядер гипоталамуса у экспериментальных животных с моделированием сквозного дефекта нижней челюсти, включая серии опытов с замещением дефектов реберным аутотрансплангагом, в том числе при местом применении оксигоцина. Следует заметать, что морфофункциональные изменения НСК соответствующих ядер гипоталамуса, носили в основном однотипный характер (по срокам наблюдений), имея отличия в серии опытов с использованием оксигоцина.

Результаты наших исследований (во всех сериях экспериментов) позволили установить интенсивное (гиперсекреция) функционирование НСК изученных ядер гипоталамуса.

Основная группа клеток («светлые-Гомори позитивные»), имели ядра, богатыми эухромаганом и ядрышки нуклеолонемного характера (на стадиях 3-5 сут эксперимента). Их гранулярная эвдогошматическая сел. представлена широкими канальцами. Цистерны пластинчатого комплекса Гольджи расширены, митохондрии аксонов НСК крупные со светлым магриксом. При этом указанные НСК характеризуются усилением выведения секреторных гранул из перикарионов. Последние и все их ультраструктурные компартменгы увеличены в размерах. Рыхлые ядрышки зачастую занимают положение возле кариолеммы.

12

Мы показали, что через 3-7 суток после моделирования костного дефекта в нижней челюсти крысы в составе крупноклеточных ядер гипоталамуса (супраопгических и паравенгрикулярных) появляются свеглоокрашиваемые по Гомори - Габу нейросетфегорные клетки. Для них характерна гипертрофия перикарионов, ядер, ядрышек и шероховатого эндоплазматического ретикулума. Хроматин ядер дековденсирован, ядрышки рыхлые, а иногда вакуолизированы; пластинчатый комплекс Гольджи занимает значительный объем цитоплазмы. Секреторных гранул в перикарионах и аксонах мало, так как они быстро высвобождаются в гемокапилляры нейро гипофиза и срединного возвышения.

Слезет отметить, что через 14 суток экспериментов (1-я и 2-я серии) отмечены нейросекрегорные клетки едлигельной гиперсекреции и истощения». Эш клетки имеют сильно гипертрофированные светлые, «набухшие» перикарионы и округлые ядра, бедные хроматином.

Канальцы эцдогшазмагического репткулума, теряя рибосомы, трансформируются в вакуоли диаметром 300-900 нм. В подобных клетках мало свободных рибосом, а также нарушена ультраструкгура митохондрий и аппарата Гсшьджи. Наиболее характерным для этих нейросекреторных клеток является присутствие значительного числа лиэосом, аутофагических вакуолей и мультиламелярных телец

В эти же сроки в составе супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса увеличивается содержание пикноморфных нейросекреторных клеток с признаками «физиологической дегенерации». Они имеют угловатую, различной степени сжатости форму тела и пикнотические ядра. Канальцы шероховатого эвдоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи расширены, митохондрии набухшие, рибосом крайне мало. Надо полагать, что данные клетки являют собой терминальное состояние нейросекреторных элементов нонапегпидергических ядер гипоталамуса.

В сроки 3-7 сутки • экспериментов на уровне нейрогипофиза отмечаются ультраструюурные признаки, свидетельствующие об активном высвобождении нейросекреторных гранул в общий кровоток. Это подтверждается увеличением количества гранул и синагпических пузырьков, концентрирующихся в активных зонах, нарастанием размеров митохондрий и снижением электронной плотности их матрикса.

На стадии 14 суток после моделирования дефекта нижней челюсти

13

экспериментальных животных мы отметили изменения нейросекреторных клеток супраопгических и парава пршзд гарных ядер гипоталамуса, сввдетельствующие об «истощении» клеточных элементов и в ряде случаев феномен накопления и депонирования нейрошрмональных субстратов на уровне аксовазальных контактов в нейрогипофизе и зоне срединного возвышения (рис 1).

При этом в ИСК депонирование секреторных гранул сопровождается наличием единичных синаптических пузырьков и мелких митохондрий с уплотненным матриксом, имеющих признаки деструктивных изменений. Терминали аксонов подобных клеток, очевидно, принадлежат не только типичным пикноморфным нейросекретарным элементам, но и дегенирирующим функционально активным клеткам. В ряде случаев ИСК крупноклегочных ядер гипоталамуса претерпевали ультраструктурные изменения апошозного характера (рис 2).

Рис. 1 Терминали аксонов нафосекреторных клеток крупноклегочных дар гипоталамуса (переполнены секреторными гранулами). Стадии 14 суг (замените сквозного дефекта нижней челюсти реберным ауклранешашагом). ЭдааронограммаУв.х22600

Рис2 Агопгозно измененное ядро нейросекрегорной клепки супраотического ядра гипоталамуса крысы Стадия: 14 суг (замещение сквозного дефекта нижней челюсти реберным ауклранашашагом). ЭлеиронофаммаУв. х28500

В более поздние сроки эксперимента (15 сут) ИСК крупноклеточных ядер гипоталамуса имели сильно гипертрофические и набухшие перикарионы также округлые пузыревидные ядра, бедные хроматином. Канальцы эвдрплазмаггичекого регикулума, теряя рибосомы,

14

превращались в вакуолеподобные ультраструетуры диаметром 900 нм. В таких клетках мало свободных рибосом (полисом) и существенно нарушена структура аппарата Гсшвджи и митохондрий. Наиболее характерным для данных клеток супраоптических паравенгрикулярных вдер гипоталамуса является большое количество липосом аутофагических вакуолей и мультиламелярных телец. Одновременно значительно возрастает численность пикноморфных ИСК. Вместе с тем, на уровне нейрогишфиза и срединного возвышения подбугорья возрастает чисто аксонов НОС, переполненных секреторными гранулами. Данное обстоятельство, несомненно, свидетельствует о едепонировании» нейросекрета вследствие торможения экетрукции нонапетидов на уровне терминалей аксонов.

В своей совокупности мы сделали заключение о том, что при моделировании сквозного дефекта нижней челюсти крысы, в том числе и при замещении дефекта аутокостным трансплантатом, на уровне нонапепщдергических нейросетфегорных центров гипоталамуса возникает состояние едлигельной гиперсекреции и истощения», что описано ранее при оценке ГТНС в условиях чрезвычайного напряжения организма (Поленов АЛ, 1994; СкщниковАА, 2001). .

Особо следует сделал, акцент на том, что описанные изменения ИСК укладываются в морфологическую картину «физиологический дегенерации», что подтверждается в наших экспериментах резким возрастанием пикноморфных клеток. Возможно, что часть подобных клеток находится в обратимом состоянии (паранекрозе).

При лечебной коррекции раневых дефектов нижней челюсти реберным аутслрансплангатом, включая местное применение оксигоцина (в том числе в сочетании с антбиошкомХ мы отметили иной характер структурно-функциональной реорганизации крупноклеточных адер гипоталамуса Так, ш фоне гипертрофических и гипергшасгических проявлений НСК, мы установили ультраструктурные признаки «репарации» мембранных компартменгов данных клеток. При этом пивным признаком НСК супраоптических и паравенгрикулярных адер являлись исключительное обилие свободных рибооом (шлиоом), адекватное состояние гранулярной эцдоплазмагической сети, аппарата Голвджи и митохондрий. Все это свидетельствовало об интенсивном синтезе структурных протеинов, крайне необход имых для внутриклеточной репарац ии и адекватности нейросекреции.

15

Репаративный остеогенез в нижней челюсти экотерименгальных животных при использовании реберных аутотрансплангатов

Создание нами экспериментальной модели сквозного дефекта нижней челюсти крыс была продиктована необходимостью дальнейшего исследования регенеращюнного осгеогенеза в аспекте его гигогаламической нонапетвдергической регуляции дифферонной и гисгаонной структурно-функциональной организации, что является актуальным для современной гистологии, клеточной биологии и биотехнологии (Данилов РК. с соавт, 2008; Деев РБ, 2008).

Прежде, чем приступить к описанию фактического материала по изучению репаративного осгеогенеза в условиях замещения дефектов нижней челюсти реберным аутотрансплатигом (в том числе и при местом введении окситоцина), мы сочли необходимым представить сведения о гистологической характеристике раневого процесса в моделируемых условиях без лечебной коррекции.

Данная серия в наших исследованиях явилась контрольной. При этом мы преследовали цель установления гистологических критериев репаративного осгеогенеза, в аспекте их дальнейшего сопоставления аналогичными данными, полученными в последующих вариантах эксперимента. Совокупность полученных результатов и их морфофункциональный анализ позволили сделать заключение об этапносги репарашвной регенерации костных структур нижней челюсти крыс.

Первый этап -1-3 сутки после моделирования дефекта. В это время развивается острое воспаление в тканях и выраженная резорбция в резецированных зонах юэсгаых фрагментов нижней челюсти, за счет активизации остеокластов. В динамике стадии альтерации вследствие повреждения костных структур нарастают морфологические изменения в ввде дистрофий, а затем некроза костных балок, надкостницы, костномозговых элементов. Продукты, накапливающиеся в зоне местного нарушения гомеостаза, приводят к существенным изменениям проницаемости стенок сосудов микроциркуляторного русла и эксгравазации плазмы и форменных элементов крови (плазматическая экссудация и клеточная инфильтрация). К нейтрофильной инфильтрации вскоре присоединяется макрофагальная (моноцигарного генеза), что характеризует собой начало отграничения некротических участков от жизнеспособных тканей.

16

Второй этап репараггивного остеогенеза-3-7 сутки с момента моделирования сквозного дефекта нижней челюсти. В этот период дегенераливно-воспалигелъные процессы сменяются продуктивной (пролиферативной) фазой воспаления. Между участками резецированной косга, в том числе и в области возникшей гематомы, происходит врастание малоднфференцированной ткани (грануляционной).

Подобный феномен патологи нередко называют «предварительной соединительнотканной мозолью» (Огруков А.И., 1983). Для нее характерно наличие гемокапиллярных петель, окруженных фибробластами, макрофагами, лимфоцитами и плазмацшами.

Следует особо подчеркнуть то обстоятельство, что формирующаяся грануляционная ткань не уменьшает резорбцию костной ткани в зоне дефекта нижней челюсти, что очевидно связано с активной деятельностью макрофагальных элементов.

Третий этап - 7-14 суток после формирования сквозного дефекта формируется пул остеобластов вокруг микроциркуляторной сети сосудов нижней челюсти. Вдоль них образуются первичные костные балочки, характерные для ретикулофиброзной костной ткани. Формирующаяся сеть трабекул была связана с краями костной раны и включала в свой состав 83 ± 0,6% остеобластов, 5,7 ± 0,7% остеоцигов, 3,9 ± 0,5% остеокластов. Таким образом, между структурами резецированной кости образуется предварительная костная мозоль без признаков ее трансформации в пластинчатую костную ткань. При этом значительная часть остеобластов подвергается атрофии и постепенно исчезает из зоны повреждения нижней челюсти.

Через 7-14 сут эксперимента у животных отмечены (в области дефекта) значительно расширенные гаверсовы каналы без четко идентифицированных кровеносных сосудов. Иногда каналы осгеонов были заполнены небольшим количеством рыхлой соединительной ткани с признаками полиморфноклеточной инфильтрации с преобладанием нейгрофилов и эозинофшюв. Здесь же присутствовали остеокласты, резорбирующие костные структуры.

Со стороны периоста преобладали разрастания плотной волокнистой соединительной ткани, колллагеновые волокна которой не имели упорядочной ориентации. Аргериолы в регенерате имели утолщенную стенку за счет фиброзных изменений их средней оболочки.

17

Формирующаяся регикулофиброзная косшая ткань образует разрозненные островки, зачастую окружая некротизированные костные фрагменты. Последние подвергались лизированию со стороны остеокластов. Признаков органотипического остеогенеза не обнаружено. В краевых участках поврежденной нижней челюсти сохранялись признаки выраженного остеогороза (на стадиях 7-14 сут эксперимента).

Особенно эти явления наблюдались в кортикальной пластинке, которая резко истончилась. Надкостница в данных участках была утолщай в основном за счет фиброзного слоя, тогда как сосудистый ее спой был слабо выражен

В описанных зонах определены участки гиалиновой хрящевой ткани со слабо выраженными участками эвдохоцпрального окостенения. Количество остеобластов было не велико. Напротив остеокласты продолжали бьпь активными, формируя обширные реэорбционные лакуны, в том числе и в кортикальной пластинке нижней челюсти экспериментальных животных.

Таким образом, большая часть раневого дефекта к 15 сут была заполнена плотной волокнистой соединительной тканью с элементами гиатинового хряшз.

Совокупность свегооптаческих, элеиронномикроскопических и

иммудацшохимических исследований показала, что восстановление целостности резецированной косга нижней челюсти происходит тугаи пролиферации клеток камбиального (осгеобласгаческого) слоя надкостницы и малодифференцированных плюрипотшгных костномозговых клеток. Вместе с тем, в данном процессе участвуют адвешициальные (периваскулярные) клетки врастающих 1фовеносных сосудов. С другой стороны в зоне экспериментального дефекта часто регистрируются кровеносные сосуды с признаками тромбоза

Следует особо отметить то обстоятельство, что остеогенез (в условиях отсутствия в раневом ложе аугокосш) протекал по десмальному типу, то есть с формированием к 3-5 суткам эксперимента волокнистой соединительной ткани, трансформирующейся затем к 1014 суткам в плотную соединительную ткань, не обеспечиваюиую эффективную (механическую) фиксацию в зоне дефекта кости нижней челюсти.

В таком сформированном рубцовом соединительнотканном регенерате идентифицированы функционально специализированные фибробласты, атакже фиброциты,

18

лимфоциты, жировые клетки в окружении многочисленных гемокапилляров, проявляющих признаки васкулогенеза При этом клетки фибробластического дифферона и энаотелиоиигы микроциркуляторного русла демонстрировали признаки апогпоза. Так уровень экспрессии синтеза протеина р53 и каспазы 9 был в 2^-3,7 раза выше чем у ингакгаых (контрольных) животных.

Эта фагаы, несомненно, свидетельствуют о том, что раневое повреждение костной ткани у экспериментальных животных, безусловно, сопровождается общими и специфическими особенностями адаптационно-компенсаторных процессов, направленных на выравнивание клеточного и тканевого гомеосгаза поврежденной костной ткани.

Описывая морфологические процессы в раневой области, мы сделали особый акцент на оценке: 1) катаболизма тканевых структур, дифференцировке и пролиферации клеточных элементов, 2) васкулогенеза, 3) новообразовании клеток, 4) минерализации и трансформации первичного регенерата.

В серии экспериментов с дефектами нижней челюсти без аутотрансшвнгации при близком сопоставлении костных фрагментов в зоне дефекта наблюдаются их первично либо вторично задержанные сращения. При этом на них отмечается формирование хрящевой ткани без образования юэсшых балок.

Такой ввд сращения не является достаточно совершенным, так как он сопровождается образованием минимального количества первичных клеточных структур. Тем более что три наличии щели мея^пу прочно фиксированными неподвижными костными участками резецированной нижней челюсти имеет место частичное сращение в зоне оосудастых структур. Данное обстоятельство приводит к лимитированию образования периостальной костной мозоли, что необходимо для обездвиживания сегментов нижней челюсти и их последующего сращения.

В наших исследованиях мы использовали костный аутотрансгтлантаг для целей репаративного остеогенеза в зоне сквозного дефекта нижней челюсти экспериментальных животных.

При этом мы, прежде всего, исходили га того, что в формировании клеточного регенерата (костной мозоли) большое значение имеет соблюдение механических факторов точного сопоставления. Данные условия были реалгаованы нами в э ксперименге, за счет

19

фиксации аутотрансп лантала на стыке резецированных отделов нижней челюсти.

В случае использования реберного аутотранстшангага мы отметили интенсивное врастание микроциркулягорного русла в краевую зону костного дефекта, что привносило в раневую область периваскулярные камбиальные клетки.

Нами было показано, что в зоне оперативного вмешательства развивается (через 1-3 суток эксперимент) выраженная эвдосгальная реакция. Одновременно имеет место активизация остеокластов, осуществляющих резорбщоо костных структур. Реэорбционные полости заполняются рыхлой соединительной тканью, постепенно превращающейся в фиброзную ткань. При выраженной подвижности резецированных участков может образоваться ложный сустав с тканевыми элементами хрящевой ткани.

В наблюдаемых случаях, как правило, диастаз ложного сустава заполняется волокнистой соединительной тканью, образующейся в условиях пролиферации стромы красного костного мозга. Новообразованные костные балки имеют признаки выраженной лакунарной резорбции.

Имплантированная аутокосгь ребра инициирует развитие соединительной ткани в облаян трансплантационного ложа. При этом он претерпевает существенную структурную реорганизшию. Хондроциты, хоцдробласты демонстрируют признаки апопгоза. Д анные клетки характеризуются кариопикнозом и локальным кариорексисом и плазморексисом. При этом происходит дискомплексация хоцдромуковдных и хондроигш ювых волокон.

В этой связи мы обратили внимание на то, что повреждение костной ткани, в том числе при замещении дефекта нижней челюсти реберным аутогрансплангагом, сопровождается морфо генетическими процессами, не всегда реализующими адаптационные и компенсаторные потенции тканей челюстно-лицевой области.

Так, в моделируемых экспериментальных условиях не наблюдалось надежного и постоянного обездвиживания в зоне дефекта нижней челюсти, в том числе при сохранении источников репаршивного остеогенеза. Надо полагать, что регенерация костной ткани, а также сращение костных фрагментов происходило без формирования органотипической хрящевой и костной ткани (без формирования костных балок и периосгальной мозоли).

Тем не менее, мы отмечаем то обстоятельство, что замещение костного дефекта

20

нижней челюсти реберным трансплантатом существенно минимизирует размер щели в зоне дефекта межау прочно фиксированными неподвижными костными фрагментами.

Экспериментально-гистологическая оценка сгруюурно-функииональных изменений при сквозном дефекте нижней челюсти животных с замещением дефектов реберным ауготрансплангатом в условиях лечебной коррекции (местное применение антибиотика, оксигоцина и их комбинации)

В регуляции репаратвной регенерации после моделирования сквозных дефектов нижней челюсти существенное значение имеют нейроэцдокринные факторы, которые на клеточном и тканевом уровнях реализуют механизмы элементарных процессов остеогенеза (регуляции камбиальносш и дифферениировки остеобластов, остеокластов, их взаимоотношений с фибробластическим диффероном и кровеносными сосудами, оценка апотпоза). При нарушениях данных регулягорных факторов происходит неадекватное ремоделирование костной ткани с формированием функционально неполноценного регенерата.

В наших исследованиях мы сделали акцент на установлении роли и значимости одного из важных адалтогенных гипоталамических нонапеггщдов (оксигоцина) на процессы репаративного остеогенеза резецированных структур нижней челюсти крыс в условиях замещения дефектов аугореберным трансплантатом. Для сравнения были использованы объекты (фрагменты костной ткани экспериментальных животных контрольной серии, а также серий опытов с применением антибиотика).

Нами было показано, что местное применение оксигоцина (без замещения костного дефекта использованным трансплантатом) оптимизировало стадии репаративного остеогенеза. Он включал в себя скопления осгеогенных элементов - остеобластов и костных трабекул, ориентированных вдоль пучков каштагеновых волокон (рис 3).

Формирующаяся ретикулофиброзная костная ткань состоит из первичных костных балок, располагающихся вокруг крупных гемокапилгмров. В краевых участках регенерата регистрируются хонпробласты и малодифференцированные хондроциты. К 15 (уткам эксперимента в этих участках формируются типичные иэогенные группы хондроцигов, продуцирующие межклеточный магрикс и выступающие за край костного дефекта нижней челюсти (рис 4).

Рис. 3. Фрагмент осгесрегшерага (7 суг эксперимента с введением окствщша). Фиксация: 10% расявср нейтрального фсрмаяина. Окраска: гмагокшдинМайераиэсвин Ув.об. 40. ок 10

Рис. 4. Участок ховдропжза в эсне осгесршзкрации через 14 суг экеядяшенга Фиксация: спирг-формся. Окраска; гшатогашшМайераиэшвд. Ув. об. 40, ск. 10

Рис. 5. Учаскж осгесрегенерагга Чфез 14 суг эксперимента с ведением оксигоцина Фиксация: епирг-формси. Опаска; гемаюксилшМайфаиэа?ш. Ув. об. 20, ск 10

Рж. 6. Сгруюураосгесрегеиерага через М^экшфтмеягасвведашшоксигощша. Фиксация:

1СР/о разтвор нешрального формалина

Окраска: гемаяшетшшМайераиэсеин. Ув. об. 40, ж 10

В згой связи, можно предоодажть, что оксигоцин, вероятно, создает условия для реализации в зоне раневого дефекта эволюиионно более древних свойств репарации скелетных тканей (по принципу хоцдрогенеза). С другой стороны появление новообразованной хрящевой ткани в зоне репарации можно оценить и как неблагоприятный момент, который может привести к образованию механической несостоятельности регенерата.

Полученные нами данные, безусловно, свидетельствуют о фазном характере пролиферапивного и апоптогического потенциалов остеобластов в регенерате, а также о коррегирующем влиянии оксигоцина на соотношение числа камбиальных клеток с апотозной доминантой.

Мы обратили также внимание на оценку состояния гистологических структур нижней челюсти в области пограничной с зоной ее дефекта Так введение оксигоцти приводило к уменьшению плотности костных балок (рис 5), без признаков ремоделирования остеокластической резорбции. При этом отсутствовали реэорбционные лакуны, как показатели выражега юго остеопороза и деминерализации (рис 6).

Иммуноцигохимические исследования репарэтивного осгеогенеза показали следующие результаты (табл. 23).

В своей совокупноста, полученные^ нами данные свидетельствуют о том, что включение в комплекс лечебных мероприятий оксигоцина оказывает существенное оптимизирующее воздействие на репаративный остеогенез. И механизм этого влияния определяется коррекцией элементарных процесоов гистогенеза на уровне экспрессии про- и аншапоптогшческих генов клеток костной ткани.

Следует особо подчеркнуть то обстоятельство, что сочетанное применение оксигоцина и ангабиоггика (цефтриабола) приводило к потенцированию эффекта оптимизации фаз воспалительного процесса в зоне аутотрансгшшггага. Это проявилось в существенном понижении ашпгозной доминанты остеобластов по показателям экспрессии синтеза протеина р53, подавлении ферментного каскада, реализации программированной гибели этих клеток (по показателю экспрессии белка саэраБа 3). Одновременно в регенерате возрастала активность атиапоптогаческого гена Ьс1-2 и гена К-67, определяющего пролиферашвный компонент репарашвного осгеогенеза

23

Таблица№2

Иммуноцитохимическая характеристика остеобластов в регенерате нижней челюсти крыс в условиях замещения дефектов реберным аутслрансплангаом

(% иммунопозишвных клеток), 3 суг эксперимента

серии эксперимента экспрессия р53 экспрессия Ьс1-2 экспрессия сжразаЗ экспрессия Кз-67

Контрольная оерия животных 1,2*0,03 0,9*0,01 1,7*0,11 0,7*0,06

Созааме сквоиюго дефекта нижней чапости с поакяующей первичной иэспюй пластикой реберным аукпрвнсшапагом и внутримышечным введением раствор ткфгриабэта в разовой две 15 мг вэ время и онэдненю гюсле операции один раз в сутки 1,1±0,07 0,8 ±0,02 1,7±0,13 0,ад),08

Сознание сквозного дефааа нижней челюсти с последующей первичной костной пластикой рёберным аугогражплапагом и иньоаздонным введшем го тремя ина 1,3, 5, 7 сутки после операции окшгощяи в разовой дяе 1ЕД1 развсупсивокружаощие мяпсигткаи 0,8*0,01 2^*0,07 0,9*0,06 8,1*0,13

Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей первичной костной плалиюж рёберным ауплрансппгншом и Еведапкм ю время и на 1,3,5,7 сутки после операции, в окружающие дефект мяпше ткаи, окштошна один раз в суки, в разовой дяе и раствор цефгриабсша внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции од ин раз в сутки 0,7±0,03 3,4*0,13 0,6±0,02 9,8±1,03

Табливд №3

Иммуноцигохимическая характеристика остеобластов в регенерате нижней челюсти крыс в условиях замещения дефектов реберным аутотрансплантагом

(%иммунопозигивных клеток), 15 суг эксперимента

серии эксперимента экспрессия р53 экспрессия bd-2 экспрессия caspasa3 экцихия Ki-67

Контрольная серия животных 0<НД01 0,Ы),01 12ЮДЗ 0

Создание ашшнего дефекта нижней чежхли с последующи первичнэй юсшой пластикой рёберным ауютранагипагом и внугримышгчным введенная распюр иефгриэбши в размой дозе 15 мг ю время и ежедневна посте операции один раз в супси 0,6tí),02 ОДУ),01 0,410,02

СаЗДЕие сквозного дефекта нижней челюеш с последующей первичней костной плаяикой реберным аутспрансплашатом и иньекщюнным введением во время и на 1,3, 5, 7 супси после опграции окаповдна в разовой дозе ЩЦ1 раз в сушт в окружжвде мягкие тклш 0,4±0,01 22±0,М 0Д±0,01 12£tl,01

Создание сквозного дефекта нижней челюеш с последующи ткрвичной костной пласткой рёбфным аугогранспланшом и введением во ^>емя и на 1,3,5,7 супя после операции, в сяфужаошиг дефаа- мятеж ткани, окигоцина один раз в суши, в разовой дозе lea и раствор цгфгриабеша внутримышечно в разовой дояе 15 мг во время и еиеднеяю после операции один раз всупси. 0,2tí),01 3,0tí),07 0,ЬЮ,01 21,шт

выводы

1. Оптимизация регенерации ксхлной ткани при моделировании дефекта нижней челюсти крыс коррелирует с морфофункциональным состоянием крупноклеточных ядер гипоталамуса

2. Замещение сквозного дефекта нижней челюсти экспериментальных животных реберным костным аутшрансплантатом в большинстве случаев сопровождается резорбцией костных структур, заполнением зоны трансплантации фиброзной тканью без выраженной остеорегенеращи. Эти процессы происходят на фоне длительной гиперсекреции и истощения нонапегпвдфгической ГГНС.

3. Результаты свегооптичесюго и ультрасгруктурного анализа вместе с показателями экспрессии про- и антнапогпотического генов клеток являются одним из доказательств оценки эффективности репаративного остеогенеза.

4. Сочетанное применение оксигоцина и антибиотика отимизируег фазы воспалительного процесса в зоне ауготрансплангага, что проявилось в понижении апопгозной доминанты остеобластов и возрастании активности ш ггиагоггготического гена Ьс1-2игена К]-67, определяющего пролиферативный компонент репаративного остеогенеза

5. В условиях сквозного дефекта нижней челюсти у экспериментальных животных с последующим замещением моделируемых дефектов реберным гуготрансплантагом местное применение оксигоцина, в том числе с аншбиотиком, коррегирует процессы репаративного остеогенеза, оказывает существенное оптимизирующее воздействие на репаративный осгеогенез.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные экспериментально-гистолоптческие данные обосновывают целесообразность разработки и внедрения в практику клинической стоматологии нового способа лечения костных дефектов челюстных костей, включающего местное применение гипогаламического нонапептида оксигоцина

Морфологические и ультрасгруктурные данные об изменениях, выявленных в области сквозного дефекта нижней челюсти (с последующим замещением реберным

аутотрансплангагом) и ГТНС углубляют знания о репаративных остеогенезах, роли и значимости гипоташмической нейросекреции, что следует учитывать при лечении пациентов с дефектами нижней челюсти.

Полученные результаты, обосновывающие новый эффективный способ оптимизации репарашвных гистогенезов в области сквозных дефектов нижней челюсти дает возможность его доклинической апробации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1 .Волков, Ю. О. Особенности репарашвных гистогенезов при костной аутопластике дефектов нижней челюсти в эксперименте / Ю. О. Волков, А. А. Сщцников, А. А. Магчин // Информационный архив. - 2011. - Т. 5. - №4. - С.49 - 52.

2Магчин, А. А. Клиническое и экспфиментально-морфсшогическое обоснование новых медицинских технологий в челюешо-лицевой хирургии / А. А. Магчин, А. А. Сщцников, Ю. О. Волков, И. А. Михайлова, С. X Кириакиди // Информационный архив. - 2011. - Т. 5. -№4.-С. 71-76.

ЗЛолков, Ю. О. Применение окситоцина для оптимизации репаративных гистогенезов при травматических повреждениях нижней челюсти крыс / Ю. О. Волков, С X. Кириакиди // Морфология - 2012. -Т. 141. - №3. - С 39.

4.Валков, Ю. О. Оптимизация репаративных гистогенезов челкхлно-лицевой области (ЧЛО) в аспекте гипоталамической нейроэчдокринной регуляции / Ю. О. Волков, И. А Михайлова, В. Л. Петренко, С. X. Кириакиди, А А. Магчин, А. А. Спздников // Медицинский яфрнал Западного Казахстана.- 2012.-№3.(35).-С. 45. 5 Волков, Ю. О. Исследования репарашвных процессов при сквозных дефектах нижней челюсти с местным применением окситоцина / Ю. О. Волков, А. А. Магчин, А.А.Сщпников, С.XКириакиди, Информационный архив.- 2012,- Т.6.- №4.-С.21-23. 6-Волков, Ю. О. Экспериментально-морфоштическое обоснование применения гипоталамических нейропептидов для оптимизации репарашвных гистогенезов при травмах и дефектах нижней челюсти / Ю. О. Волков, В. К Барков, С. X Кириакиди, А. А. Магчин, И. А.Михайлова // XVII Международная конференция челюешо-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии». - СПб, 2012. - С. 40 - 41.

27

7.Волков, Ю. О. Экспфименгально-гисгологические исследования репаративных процессов при повреждениях челюсгно-лицевой области в условиях инфицирования (нейробиологические аспекты) / Ю. О. Волков, А. А. Матчин, А. А. Сгадников, И. А. Михайлова, С X. Кириакцди, R. Н. Барков // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2012. - №1. (137) - С181-184.

8.Матчин, Л. А. Опыт лечения осложнения после пластики послеоперационного дефекта нижней челюсти титановой пластиной, А. А. Матчин, Б.А.Исайчев, В. Н. Барков, Ю. О. Валков // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -2012. - Т. 5. - №3. - С 589-592.

9.Матчин, А. А. Экспериментально-морфологическое обоснование применения оксшоцина в стоматологии и челюстно-лииевой хирургии / А. А. Матчин, А. А. Сгадников, И. А. Михайлова, В. JL Петренко, Ю. О. Волков, С. Б. Северинова, С. В. Гречихина // XVIII Международная конференция челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии».—СПб,2013.-С. 111-112.

10. Матчин, А. А. Экспериментально-гистологическое обоснование постгравматической регенерации нижней челюсти при местном применении окситоцина /А. А. Матчин, Ю.О.Волков, С. X. Кириакщи // Морфология. - 2013. - Т. 144.-№5.- С94-95.

Отпечатано в типографии «ОренПечать» О.Г.Р.Н. 312565810300101 Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Усл. печ. л. 1.6 Тираж 150 экз. Заказ 110 г. Оренбург, ул. Советская, 27, офис 214

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Волков, Юрий Олегович, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201450926 На праваэиэукописи

Волков Юрий Олегович

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИТОЦИНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ГИСТОГЕНЕЗОВ ПРИ КОСТНОЙ АУТОПЛАСТИКЕ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология 14.01.14. - стоматология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор, Стадников Александр Абрамович

заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор,

Матчин Александр Артемьевич

Оренбург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)...................................................

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........... 26

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ... 35

3.1. Морфофункциональная оценка реорганизации нонапептидэргических гипоталамических нейросекреторных центров в условиях моделирования сквозного дефекта нижней челюсти крыс, в том числе при замещении дефекта реберным аутотранспл антатом............................................. 36

3.2. Репаративный остеогенез в нижней челюсти экспериментальных животных при использовании реберных аутотрансплантатов................................ 49

3.3. Экспериментально-гистологическая оценка структурно-функциональных изменений при моделировании сквозных дефектов нижней челюсти животных с замещением дефектов реберным аутотрансплантатом в условиях лечебной коррекции (местное применение антибиотика, окситоцина и их комбинации)...................................................... 65

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ....... 75

ВЫВОДЫ.......................................................................... 91

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ...................................... 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................... 93

ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Совершенствование методов лечения и реабилитации больных с дефектами костей лица продолжает оставаться актуальной проблемой челюстно-лицевой хирургии (Петренко В.А., 2007; Герасимов A.C., 2011).

Отсутствие челюсти или ее фрагмента нередко приводит к изменению внешнего вида больного, сопровождается тяжелыми нарушениями артикуляции нижней челюсти, вызывает нарушения акта жевания, глотания, звукопроизношения и речевой ритмики и другие расстройства, приводящие к существенному изменению жизненно важных функций и эстетики лица (Рапекта С.И., 2008). Всё это приводит к тяжелым нарушениям психосоматического состояния больных (Дударева А.П., 2009; Лежава Н.Л., 2010).

Значимость этой проблемы возрастает в связи с увеличением количества пациентов, перенесших оперативные вмешательства по поводу новообразований (Дробышев А.Ю., 2007; Жулев E.H. с соавт., 2008; Кулаков A.A. с соавт., 2009; Boffano Р. et al., 2012; De Meló W. M. et al., 2012), производственного и бытового травматизма (Нестеров A.B., 2011; Tepper О. М. et al., 2011; Chrcanovic B.R., 2012).

Успешное замещение дефекта нижней челюсти костным трансплантатом во многом определяют процессы репаративной регенерации в зоне пересаженного костного аутотрансплантата. Возможности традиционных методов пластики имеют границы, а такие недостатки, как многоэтапность, ограниченность пластического материала, малая устойчивость лоскутов и трансплантатов к инфекции, зависимость результата операции от состояния кровоснабжения тканей в зоне дефекта, делают восстановительное лечение малоэффективным, а порой и безрезультатным (Неробеев А.И., 1988; Перлухин М.Л., 2009; Сысолятин П.Г. с соавт., 2009).

По данным литературы (Калакуцкий Н.В., 2004; Gonzalez-Garsia R. et al., 2009), остеопластика нижней челюсти нередко сопровождается воспалительными осложнениями. Гнойно-воспалительные процессы в ране могут вести к расхождению краев раны, некрозу перемещенных лоскутов слизистой оболочки и кожи. Это приводит к отторжению пересаженных костных аутотрансплантатов, ведет к образованию свищей, оростом, к вторичным деформациям челюстно-лицевой области и шеи. Кроме того, костная ткань челюстно-лицевой области обладает низкими потенциями к регенерации вследствие малого содержания кроветворного костного мозга (Перова М.Д., 2005). Поэтому даже частичное восстановление костной ткани в области послеоперационных дефектов является весьма сложным (Безруков В.М. с соавт., 2002; Дробышев А.Ю. с соавт., 2002).

При планировании костно-пластических операций большое значение имеет выбор пластического материала. Продолжается поиск новых материалов и препаратов, способствующих ликвидации воспаления и восстановлению структурных элементов костной ткани (Бельченко В.А., 2002; Топольницкий О.З., 2002; Шишацкая Е.И., 2009; Яременко А.И. с соавт., 2011).

В последние годы опубликованы работы о положительном влиянии гипоталамических нейропептидов, в частности окситоцина, на репаративные процессы тканей различного генеза (Поленов А.П., 1994; Стадников A.A., 1999, 2001; Барков В.Н., 2004; Гречихина C.B., 2007; Матчин A.A. с соавт., 2008; Стадников A.A., Бухарин О.В., 2012;). Исследованиями (Курлаев П.П., 1986, 2001; Сивожелезов К.Г., 2005; Вахитов Э.М., 2011) показана целесообразность местного применения окситоцина, позитивно влияющего на репарацию тканей при лечении ряда заболеваний, в том числе воспалительного характера.

Получены новые сведения о том, что окситоцин обеспечивает условия для развития репаративных потенций клеточных элементов, стимулирует дентиногенез, оптимизирует и коррегирует процессы репаративной

регенерации в тканях периодонта, цементе зуба и в альвеолярной кости (Безносик В.Н., 2010).

Доказано положительное влияние местного применения окситоцина в эксперименте при создании модели сквозной раны щеки у крыс, проявляющееся в уменьшении воспаления и оптимизации репаративных гистогенезов, обусловленных стимулирующим воздействием на пролиферативную активность эндотелиоцитов, фибробластов, эпителиоцитов слизистой и кожной части щеки, миосимпластов, на функциональную деятельность макрофагов. Это способствует заживлению раны в целом (Кочкина H.H., 2010; Безносик В.Н., с соавт., 2012).

Однако роль гипоталамической нейросекреции в оптимизации репаративных гистогенезов костной ткани челюстно-лицевой области в условиях замещения дефектов нижней челюсти скелетными аутотрансплантатами изучена недостаточно.

Цель исследования

Целью исследования является экспериментально-морфологическое обоснование применения окситоцина для оптимизации заживления дефектов нижней челюсти при костной аутопластике на основе оценки состояния гипоталамической нонапептидергической нейросекреции.

Задачи исследования

1. Разработать модель сквозного дефекта тела нижней челюсти, замещенного ауторебром, у экспериментальных животных.

2. Провести морфофункциональную оценку нонапептидергической гипоталамической нейросекреции в условиях моделирования сквозного дефекта нижней челюсти у экспериментальных животных с последующим замещением моделируемых дефектов рёберным аутотрансплантатом (в том числе в сочетании с антибиотиками).

3. Изучить влияние окситоцина на характер морфофункциональных

изменений в тканях околочелюстной области, нижней челюсти, реберном аутотрансплантате и гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС).

4. В сравнительном аспекте проанализировать лечебное влияние цефтриабола, а также данного антибиотика и окситоцина на процесс репаративной регенерации сквозного травматического дефекта костной ткани нижней челюсти в условиях замещения дефекта реберным аутотрансплантатом.

Научная новизна работы

Установлено, что процессы экспериментально вызванного сквозного дефекта нижней челюсти в условиях аутотрансплантации ауторебра и местного введения окситоцина приводят к существенному повышению репаративных потенций костной ткани за счет остеоиндуктивной реализации гистоорганотипических свойств. Это позволило обосновать новый методический подход, позволяющий достичь жесткой фиксации приложенного трансплантата и тем самым обеспечить формирование органотипического регенерата.

Впервые обоснованы общебиологические критерии оценки процессов репаративного остеогенеза костной раны в связи с регуляторным участием гипоталамических нейропептидов в оптимизации процессов заживления дефектов нижней челюсти в условиях их замещения рёберным аутотрансплантатом, что доказывает целесообразность и использование окситоцина для оптимизации репаративного остеогистогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.

Научно-практическое значение

Проведенные исследования расширяют представления о характере и динамике заживления сквозных костных дефектов нижней челюсти и

обосновывают целесообразность применения одного из гипоталамических нейропептидов (окситоцина) для стимуляции репаративного гистогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.

Разработанный в экспериментально-гистологической лаборатории способ, включающий в комплекс предполагаемых лечебных мероприятий местное использование окситоцина, существенно повышает их эффективность при лечении больных с дефектами костей лицевого скелета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Замещение раневого дефекта нижней челюсти экспериментальных животных (крыс) реберным костным аутотрансплантатом сопровождается частичной резорбцией аутотрансплантата а также альвеолярного отростка, с расхождением краев, в области донорских участков восполняемых фиброзной тканью, что коррелирует с морфофункциональной недостаточностью нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы.

2. Регенерация костной ткани после моделирования дефекта нижней челюсти в существенной степени зависит от гипоталамических нейроэндокринных механизмов регуляции остеогенеза.

3. Местное применение окситоцина в том числе в сочетании с антибиотиком коррегирует процессы репаративного остеогенеза нижней челюсти экспериментальных животных а также при использовании реберных аутотрансплантатов, приводя к формированию структурно-функционального полноценного регенерата.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертации внедрены в учебном процессе кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, стоматологии и челюстно-лицевой

хирургии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная академия» Минздрава России. Рацпредложение под наименованием «Экспериментальная модель сквозного дефекта нижней челюсти замещенного аутотрансплантатом» принятое Оренбургской государственной медицинской академией 22.06.2010г., №1356.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2011); XVII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2012 г); XI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Самара, 2012); XVII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием собственных исследований с тремя подглавами, главы обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы, 29 рисунков (микрофотографий и электроннограмм). Указатель содержит 256 источников, из которых 182 отечественных и 74 иностранных.

ГЛАВА 1

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПАРАТИВНОГО

ОСТЕОГЕНЕЗА ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ)

Костно-пластические операции лицевого отдела черепа при врожденной и приобретенной патологии по сложности планирования, технике исполнения и возможности достижения стойких отдаленных результатов относятся к числу наиболее важных разделов челюстно-лицевой реконструктивной хирургии. Несомненно, что повышение эффективности комплексного лечения, совершенствование методов лечения и реабилитации больных с дефектами костей лица остается одной из актуальных медико-социальных проблем современной стоматологии (Wei F. С. et al., 2003; Петренко В.А., 2007; Герасимов А.С., 2011; Thorwarth М. et al., 2008; Асташина Н.Б., 2009; Александров А.Б. с соавт., 2010).

Тенденция роста числа пациентов с дефектами и деформациями нижней зоны лица, вследствие неогнестрельного и огнестрельного повреждений, в результате остеомиелита нижней челюсти и после онкологических операций продолжает сохраняться во всем мире (Дацко А.А. с соавт., 2005; Кадыров М.Х., 2005; Кицул И.С. с соавт., 2009; Ogi К. et al., 2010; Никитин Д.А., 2012).

Отсутствие челюсти или ее фрагмента нередко приводит к изменению внешнего вида больного, сопровождается тяжелыми функциональными нарушениями артикуляции нижней челюсти, вызывает нарушения акта жевания, глотания, звукопроизношения и речевой ритмики и другие расстройства, приводящие к существенному изменению жизненно важных функций и эстетики лица (Рапекта С.И., 2008).

По данным Дударевой А.П. (2009), деформации и дефекты открытых частей лица тяжело отражаются на психологическом состоянии пациентов, оказывая существенное влияние на личность, изменяя характер и

поведение людей, приводя к внутри- и межличностным конфликтам, обуславливая возникновение психических расстройств (Лежава Н.Л., 2010).

Проблема травматизма до сих пор чрезвычайно актуальна в челюстно-лицевой хирургии. За последние годы отмечается тенденция не только к увеличению числа больных с переломами костей лицевого скелета, но и к утяжелению характера травмы (Террег О. M. et al., 2011). Происходит это в основном за счёт сочетанных повреждений лица и других областей тела, возникающих в результате дорожнотранспортных происшествий, криминогенной обстановки, стихийных бедствий, локальных войн (Thomas D., Hill С. M., 1999; Швырков М.Б. с соавт., 1999; Лимберг Ал.А., 2000; Синопальников И.В., 2000, Улунов А.Д. с соавт., 2000; Thaller S. R. et al., 2004; Малышев B.A., Кабаков Б.Д., 2005; Брайловская Т.В., 2008; Bener A. et al., 2009; Hardt N., Kuttenberge J., 2010; Chrcanovic B.R., 2012).

Больные с травмами челюстно-лицевой области составляют около 30% всех пациентов, находящихся на лечении в стационарах челюстно-лицевой хирургии. Частота повреждений лица составляет 0,3 случая на 1000 человек, а удельный вес всей челюстно-лицевой травмы среди травм с повреждением костей у городского населения колеблется от 3,2 до 8 %, при этом наиболее часто встречаются переломы костей лица - 88,2%, (Александров Н.М. с соавт., 1986; Вернадский Ю. И., 2006). Наряду с ростом таких пострадавших отмечается увеличение количества тяжелых, множественных и сочетанных повреждений, с возрастанием числа осложнений и неблагоприятных исходов лечения (Петренко В.А., 2002).

Известно, что огнестрельные дефекты в основном характерны для военного времени. В период Великой Отечественной войны количество челюстно-лицевых раненых составляло 1,5% по отношению ко всем раненым. По материалам эвакогоспиталей смертность от этого вида

ранений равнялась 0,9% (Рауэр А. Э. 1947). Тем не менее, в локальных конфликтах, как и в больших войнах, огнестрельные ранения лица составляют 4,5—5,0 % от всех ранений человеческого тела, а удельный вес ранений лица 9% (Лукьяненко A.B., 2003). Огнестрельные переломы нижней челюсти (37,8 %) по численности стоят на первом месте среди ранений лица (Швырков М.Б. с соавт., 2001). Следует особо подчеркнуть, что в последние годы возросло количество огнестрельных ранений и в мирное время (Вернадский Ю.И., 2006).

В мирное время обычно наблюдаются неогнестрельные повреждения нижней челюсти, которые возникают вследствие резекции или экзартикуляции челюсти в связи с доброкачественной или злокачественной опухолью, после перенесенного посттравматического остеомиелита, после случайной травмы и различные оперативные вмешательства на нижней челюсти, выполненные по поводу указанной патологии (Козлов В.А., 2003, Робустова Т.Г., 2003; Гаврилов А.Н., Перова Е.В., 2005; Панкратов A.C., 2003; Вернадский Ю.И., 2006, Иорданишвили А.К., 2007; Ogi К. et al., 2010); посттравматический дефект нижнего отдела лица вследствие электротравмы (Дьякова C.B., 2009); массивный остеолиз вследствие синдрома Горам-Стаута (AggarwalaR. et al., 2010); остеонекроз после лучевого лечения (Chang D. W. et al., 2001; Wang Z. et al., 2005; Curi M. M. et al., 2007; Hirsch D. L. et al., 2008; Baumann D. P. et al., 2011; Chen Wei-liang, 2011).

При хирургическом лечении доброкачественных новообразований нижней челюсти, таких как амелобластома, фиброма, остеобластокластома, хондрома, миксома нередко приходиться осуществлять ее р�