Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неколлагеновые белки костной ткани в регуляции скелетного гомеостаза, минерализации и репаративного остеогенеза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Неколлагеновые белки костной ткани в регуляции скелетного гомеостаза, минерализации и репаративного остеогенеза"

ргя од

О 3 СГН "7

На правах рукописи

ДЕСЯТНИЧЕНКО

Константин Степанович

НЕКОЛЛАГЕНОВЫЕ БЕЛКИ КОСТНОЙ ТКАНИ В РЕГУЛЯЦИИ СКЕЛЕТНОГО ГОМЕОСТАЗА, МИНЕРАЛИЗАЦИИ ИРЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА

03.00.04 - биологическая химия 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск - 1997

Работа выполнена в Российском научном центре «Восстановительная травматология л ортопедия» имени академика Г.А.Илизарова, г. Курган

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ В.И. Шевцов

Официальные оппоненты:

1. доктор медицинских наук, профессор В.А. Саломатин.

2. доктор медицинских наук, профессор A.B. Осипенко

3. доктор медицинских наук, профессор A.M. Герасимов

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится «_»_1997 года

на заседании диссертационного ученого совета Д084.04.01 при Челябинской государственной медицинской академии.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотек' Челябинской государственной медицинской академии по адресу:

г. Челябинск, ул. Воровского, б'

Автореферат разослан «.

^ » & 1997

Т7

г.

Ученый секретарь -профессор, доктор медицинских наук

Л.В.Кривохижин:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

V Актуальность проблемы. Разработка и широкое внедрение способов коррекции врожденных и приобретенных нарушении опорно-двигательного аппарата (ОДЛ) посредством чрескостного компрессионно-дистракционного остеосинтеза по Г.А.Илизарову (ЧКДОС) совершили переворот в травматологии и ортопедии, принесли выздоровление, социальную и трудовую реабилитацию десяткам тысяч люден. Вместе с тем, остается ряд проблем, трудно разрешимых или неразрешимых с помощью усовершенствования технологии ЧКДОС. к которым в первую очередь относятся: нарушения кроветворения и клеточного гомеостаза периферической крови, следующие за скелетной Травмой (Ю.П.Балдин, Л.В.Осипенко, Л.А.Палиенко и др.); нарушение иммунного статуса при повреждении ОДЛ (А.А.Аскалонов, В.В.Базарный и др.); деминерализация интактного скелета при лечении переломов и исправлении длины и формы отдельных костей (S.Anderson, A.A.Свешников); значительная продолжительность фазы созревания (минерализации) - периода фиксации - в сравнении с периодом дистракции (А.П.Барабаш, А.В.Попков и др.). Попытки фармакологической коррекции осложнений, сопутствующих скелетной травме или вмешательству на скелете, как и фармакологическое потенцирование репаративных процессов или стимулирование их физическими факторами различной природы до сих пор не дали ощутимых результатов. В плане укрепления теоретической базы разработок по совершенствованию методов лечения травматолого-ортопедических больных, мы полагаем, перспективно детальное изучение физико-химических и биологических свойств неколлагеновых белков (НБК) внеклеточного органического матрнкса костной ткани (ВКМ). Являясь минорной фракцией кости, они обладают разнообразными функциями в процессах, обеспечивающих гистогенез, самоподдержание и репарацию костной ткани (В. de Bernard, L.W.Fisher, M.GIimcher, P.V.Hauschka, G}M.Herring, P.A.Price, J.D.Termine 11 др.). Открытие семейства НБК, ответственных за активность пролиферации камбиальных клеток соединительной ткани, их дифференцировку в остеогенные и регулирующих биосинтетическую активность последних (костные морфогенетические белки, остеогенины, скелетный фактор роста), определяет значение этих белков для физиологической и репаративной регенерации костной ткани (D.J.Baylink, E.Canalis, J.R.Farley, A.H.Reddi, T.K.Sampath, M.R.Urist и др.).

В плане практического применения есть основания предполагать, что биологически активные НБК, учитывая разнообразие их физиологических функций, могут быть использованы для создания (конструирования) фармпрепаратов, которые найдут применение в клинической практике травматологии н ортопедии с целью оптимизации условий для репаративных процессов при лечении больных с

врожденными п приобретенными нарушениями ОДА и коррекции осложнении, сопутствующих травме и оперативному вмешательству на скелете (К.О.РтсеЬпап, М.В. & Б.И. Со1с1пг^ и др.).

Цель работы,- Выяснение роли неколлагеновых белков костной ткани в механизмах поддержания скелетного гомеостаза в физиологических и экстремальных состояниях, регуляции физиологической и репаративной регенерации кости, исследование возможности получения фармпрепаратов на основе композиций компонентов костной ткани для ускорения созревания костного регенерата и коррекции осложнений, сопровождающих вмешательства на скелете.

I Задачи исследовании:

1.!¿Изучить особенности химического состава костного регенерата, в 'частности содержания НБК, при удлинении конечностей и замещении ; дефектов трубчатых костей посредством ЧКДОС.

2. Изучить изменения в химическом составе костной ткани в начальном периоде постиатального развития, интактной костной ткани животных, подвергшихся вмешательству на скелете, и при экстремальных состояниях: иммобилизационном стрессе и воздействии условий космического полета.

3. Разработать лабораторный регламент выделения и фракционирования НБК и изучить их физико-химические свойства: кислотно-основные, относительную молекулярную массу (Мг), растворимость.

4. Оценить аффинность к кальцию отдельных НБК и возможность инициирования ими минерализации новообразованной кости.

5. Путем тестирования на интактных животных и с использованием . биомоделеп репаративного остсогенеза и кроветворения изучить

физиологические свойства выделенных НБК.

6. Изучить характер влияния НБК па показатели внутренней среды организма, контролируемые системой остеотропных гормонов (способность местных рострегулирующих факторов модулировать действие системных гормонов) и зависимость динамики адаптационных процессов от местных условий в очаге повреждения кости.

7. Провести экспериментальные испытания различных композиций компонентов костной ткани, перспективных как препараты стимулирующие костсобразование, кроветворение, иммуногенез.

Научная новизна работы. Установлено, что внеклеточный органический матрикс зрелой компактной костной ткани содержит несколько десятков белков нсколлагеновой природы, различающихся по физико-химическим к биологическим свойствам. Костная ткань в процессе своего гистогенеза, проявляя свойства биохроматографичсской

системы, способна депонировать неколлагеновые белки, синтезируемые не только остсогенпыми клетками, но и в параоссальных тканях. НБК, обладающие свойствами факторов роста, при ремоделировании костной ткани поступают в циркуляторное русло и могут реализовать спои физиологические свойства как дальнедистантные регуляторы клеточных функции. Клетками-мишенями физиологической активности НБ1С-факторов роста являются не только остеогенные клетки, но и клетки кроветворной и иммунной систем. Скелет, таким образом, выполняет роль ауто- и паракрннного органа.. Компонентом стимулирующего влияния растяжения тканей на регенерацию (эффекта Илизаропа) является создание условий для поступление биологически активных НБК в циркуляторное русло.

Супрамолекулярный комплекс, состоящий из коллагена типа I, сналопротеида, обладающего фосфомоноэстеразной и АТФ-азной активностями и липпдов - О-гликопротеин,- обладает высокой Са-связывающей способностью, фиксирование им катионов сопровождается сдвигом рН в окружающей среде в щелочную сторону в степени, достаточной для преципитации ортофосфата кальция -начального этапа биологической минерализации.

Динамика адаптационно-восстановительного процесса - скорость восстановления химического и клеточного гомеостаза, нарушенного скелетной травмой, - зависит от местных условий в очаге повреждения ОДА: срочности и стабильности остеосинтеза правильно сопоставленных отломков кости, глубины расстройств кровообращения и обширности повреждения мягких тканей. Введение экзогенных НБК -факторов роста модулирует изменения состава внутренней среды, вызванные скелетной травмой.

Практическая ценность и внедрение результатов работы. В ходе выполнения работы были разработаны методические подходы для оценки динамики адаптационно-восстановительного процесса после повреждения ОДА, которые могут быть использованы в клинике травматологии и ортопедии для контроля за течением репаративных процессов и прогноза их исхода. Для биохимического анализа костной ткани и дистракционного регенерата были адаптированы известные или предложены новые методики, которые нашли применение в экспериментальной травматологии и ортопедии для оценки результатов испытания новых приемов и средств для лечения больных с повреждением ОДА. Были существенно усовершенствованы лабораторио-препаративные методы выделения НБК, разработаны способы тестирования их биологической активности. Эти разработки могут быть применены для дальнейших исследований состава и функции этих белков, а также положены в основу промышленного регламента получения фармпрепаратов пз зрелой костной ткани.

Результаты исследования физиологической . функции НБК позволили предложить их композиции в качестве- потенциальных' фармакологических препаратов (патент №2050158 на препарат для стимуляции физиологической и репаративной регенерации стнмбои-1; заявка №950108659 на получение патента на препарат, стимулирующий иммуногенез - стимбон-2; заявка №95117043 на получение патента на препарат, восполняющий дефицит фосфата кальция - стимбон-4). Выяснение особенностей остсогенеза при дистракционном остеосинтсзе сделало возможным предложить способ стимулирования созревания дистракционного регенерата (патент № 2018840 на способ моделирования стимуляции репаративного костеобразования в условиях дистракционного остеосинтеза). Результаты исследования, имеющие значение для совершенствования методического обеспечения клинических и экспериментальных работ в отрасли, отражены в методических рекомендациях: «Функциональные биохимические исследования в клинике ортопедии и травматологии» (Курган, 1990. - 28 с;); «Оценка течения репаративного остеогенеза» (Курган, 1991.- 24 е.); «Выделение и биотестирование костных рострегулирующих факторов» (Курган, 1990. - 24 с.) и информационном письме «Методы биохимического исследования костной ткани и дистракционного регенерата кости» (Курган, 1993. - 14 е.).

;'. Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы современной патофизиологии», посвященной 100-летию со дня рождения А.А.Богомольца, Киев, 1981; III Всесоюзном съезде патофизиологов, Тбилиси, 1982; Всесоюзной научно-практической конференции «Лечение ортопедо-травматологических больных в стационаре и поликлинике методом чрескостного остеосинтеза, разработанным в КНИИЭКОТ», Курган, 1982; I Всесоюзном симпозиуме с участием иностранных специалистов «Экспериментально-теоретические и клинические аспекты разрабатываемого в КНИИЭКОТ метода чрескостного остеосинтеза», Курган, 1983; I Всесоюзном симпозиуме «Хроматография в биологии и медицине», Москва, 1983; IV Всероссийском съезде травматологов-ортопедов, Куйбышев, 1984; Региональной конференции «Физиология, фармакология и клиническое применение пептидов», Чита, 1985; I съезде физиологов Сибири, Новосибирск, 1986; Международной конференции «Экспериментально-теоретические и клинические аспекты чрескостного остеосинтеза, разрабатываемого в КНИИЭКОТ», Курган, 1986; Всесоюзном симпозиуме «Препаративная хроматография физиологически активных ;В,сществ на полимерных сорбентах», Ленинград-Ольгино, 1988; .'Всесоюзном совещании «Патогенез и лечение изолированных и ¡фчетанпых травм», Ленинград, 1989; Всесоюзном совещании •'^Актуальные вопросы клеточной биологии», Ленинград 1989; VIII, IX и

X школах по биологии опорно-двигательного аппарата, Киеп, 1990, Кдимептово, 1992, Харьков, 1994; Научно-итоговых сессиях Казанского НИИТО, Казань, 1990, 1991, 1994; Г Международном симпозиуме «Лабораторные животные в медико-биологических и бпотехнологнчеекпх исследованиях», Москва, 1992; Международной конференции «Метод Илизарова - достижения и перспективы», посвященной памяти академика Г\А.Илизарова, Курган, 1993; X конференции по космической биологии и авиакосмической медицине, Москва, 1994; XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX научно-практических конференциях врачей Курганской области, Курган, 1994, 1995, 1996, 1997; Международной конференции «Перспективные направления чрескостного остеосннтеза в реконструктпвно-восстаногттельной хирургии: теория и практика» и Симпозиума «Регенерация и рост тканей в условиях дозированного растяжения», Курган, 1996.

Публикации по теме диссертации. Опубликовано более 100 работ по рассматриваемой в диссертации проблеме, список основных из них приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных данных, общего заключения, выводов и библиографического указателя, который включает 335 литературных источников, проиллюстрирована 70 рисунками и 31 таблицей.

Па защиту выносятся следующие положения:

1, Неколлагеновые белки костной ткани играют важную роль в процессах ее физиологического и репаратпвного гистогенеза, сохранении постоянства костной массы в экстремальных условиях и отправлении присущих ей функций: опорно-двигательной, поддержания электролитного и кислотно-основного баланса во внутренней среде, ауто- и паракринной; обеспечивают осуществление биологической калыднфнкацнп - процесса, определяющего ее таксономическую принадлежность к минерализованным тканям.

2. Костная ткань в процессе своего гистогенеза депонирует, а при ремоделированни и резорбции отдает в циркуляторное русло рострегулирующне вещества полипептидной природы, синтезируемые как остсогсниымм клетками, так и в параоссальных тканях, контролирующие пролиферацию, дифференцнровку и биосиитетическую активность клеток костной и окружающих ее мягких ткано!; системные факторы - адаптогеипые и остеотропныс гормоны - и местные факторы роста, депонируемые костыо, обладают коопсратнвиостыо и взаимно модулирующим влиянием при отправлении своего физиологического действия.

3.'Костная ткань может быть источником для получения " 'фармпрепаратов, стимулирующих репаративный остсогснез,'.

кроветворение, иммуногенез, восполняющих дефицит фосфорно-, кальциевых солсГ[ в организме; основой для конструирования фармпрспатов различного действия является разработанный лабораторным регламент получения и очистки костных неколлагеповых белков.

Материалы н методы исследования

Для выполнения ' поставленных задач проведены исследования химического состава - содержания компонентов минеральной фазы и внеклеточного матрпкеа - интактной костной ткани взрослых беспородных собак и щенков в возрасте 3 сут и 2 недели, дистракцион-ного регенерата (ДР), полученного при удлинении конечности (12 животных) пли возмещении диафпзарного дефекта большеберцовой кости методом монолокальиого ЧКДОС (16 собак) или удлинением проксимального отломка (24 собаки). Схемы операций приведены на рис.1. Изучали возможность управления скоростью созревания дистракцпонного регенерата посредством парэнтерального введения костных рострегулнрующих факторов на 24 кроликах, которым удлиняли конечность, как показано на рис. 1а.

Рис. 1. Основные модели репаративного остеогенеза, использованные в работе: а - удлинение большеберцовой кости,

6 - возмещение диафизарного дефекта большеберцовой кости собаки посредством монолокального ЧКДОС,

в - возмещение диафизарного дефекта большеберцовой кости собаки удлинением одного из отломков билокальным ЧКДОС.

Изучение влияния экстремальных условий на скелетный гомсостаз выполнено на 54 крысах линии Внстар эксперимента «Космос-1129»: три серим - полетная, наземный синхронный эксперимент, впварпып контроль, каждая из которых содержала но три группы, животных, которых эвтаиазировали через: 6-8 ч и 6 сут после приземления биоспутника, животных подвергавшихся до полета (пребывания п макете корабля, виварии) нммобнлпзацнонному стрессу. Этот эксперимент выполнен в сотрудничестве с лабораторией патофизиологии ЦНИИС (зав. проф. A.A.Прохопчуков).

Биологические свойства фракций НБК и их композиций, перспективных как фармпрепараты, изучали посредством тестирования на 65 кроликах, которым создавали дефект малоберцовой кости высотой 4-5 мм в средней трети диафиза и внутривенно вводили испытуемую фракцию па 3-й сутки после его создания. -Рентгенограммы малоберцовой кости кроликов денентометрировалн на микрофотометре н анализировали отношение площади денентограммы исходного дефекта к площади денентограммы дефекта на срок t после создания дефекта.

Влияние фракций НБК на кроветворение изучали посредством анализа изменений в клеточном составе периферической крови и мпзков-отпечатков костного мозга тех же кроликов, а также биотестированием на 560 мышах линии СВА - интактиых, со стимулированным вследствие гемолитической анемии или подавленным под влиянием полицитемии кроветворением. В экспериментах на мышах к указанным гематологическим тестам добавляли анализ спленограмм, измерение индекса массы селезенки, се клсточиости и конго рог-индекса.

Влияние композиций компонентов костной ткани - препаратов стимбон-1 и стимбон-4 изучали на мышатах-отъемышах (с массой тела от 6,5 до 11 г) с измерением массы тела, длины болынеберцовой кости, содержания в последней фосфата кальция после экспозиции препарата в течении 3-4 нед. Влияние композиции фракций НБК стнмбон-2 на иммунный статус изучали после однократной инъекции препарата ннтактпым собакам в дозе 0,5 л»г/кг массы тела м определения через 24, 48 ч и 7 сут содержания в периферической крови Т- н В-розсткообразующнх клеток, доли активных Т-лимфоцитоп, фагоцитарной активности нейтрофилов, фагоцитарного числа. Этот же препарат исследовали на адаптогенные свойства - способность нормализовать показатели белого ряда периферической крови у стрессированпых мышей через 48 ч после введения в той же дозе.

Все эксперименты выполняли с соблюдением требований гуманного обращения с экспериментальными животными, правил асептики, обезболивания, эвтаназии. Все наблюдения осуществляли на репрезентативных выборках, при наличии адекватного контроля, с математической оценкой информативности показателей, достоверное! и различий в результатах контрольных н опытных групп.

Влияние условий в очаге повреждения скелета на рспаративнщй остеогенез, продолжительности фаз последнего, контролируемых системой остсотропных гормонов в кооперации с местными рострегулирующими факторами, оценено путем лабораторного обследования 202 больных с переломами длинных трубчатых костей, которым стабильный остеосинтез правильно сопоставленных отломков осуществляли в 1-е сутки после травмы, на 3-4-е сутки после нее или через 1-2 недели. Анализировали уровни почечной экскреции компонентов минеральной фазы и внеклеточного матрикса костной ткани, клеточный состав периферической крови и сывороточные концентрации электролитов: Са, С1, РО4.

Отпрепарированная, отмытая, измельченная костная ткань

деминерализация диализ против 0,5 н HCl Раствор костных белков, нерастворившипся матрикс

диссоциативное экстрагирование, центрифугирование

SM мочевина 1% 2-меркаппюэтанол

; Нерастворившийся : костный матрикс

Раствор костных белков

обессоливаиие, центрифугирование диализ против воды

Водорастворимые белки костной ткани

высаливание

Gi-

гликопротеин

насыщенный раствор сульфата алшония

1-я фр « 30% CA

Гельпроиишющая хрол штография

П-я фр ~ 50% CA

III-я фр > 75% CA

TSK-гелъ тойперл HW-50

■1,10

1,20

,30

1,40

11,10

11,20

11,30

11,40

Ионообменная хрома п юграфия

ДЭАЭ-сефадекс, А-25 КМ-сефадекс, С-25

I, 10, la I, 10,2а 1,20, 1а I,20,2a I, 10, lk I, 10,2k I, 10, 0a,0k и т.д.

И, 10, la II, 10, 2а 11,20, 1а

И, 20, 2а II, 30, 2а II, 10, lk

II, 10,2k 11,20,2а II, 30,2k

II, 20, 0а, Ok и т.д. _

•1 Рис. 2. Схема выделения и очистки неколлагеновых белков внеклеточного матрикса МКостной ткани

'!■! Выделение и фракционирование НБК усложнялось и ;; совершенствовалось на протяжении всего периода выполнения работы и 10

п конечном варианте приобрело вид представленный на рис.2: очищенную от параоссальных тканей кость днафизов длинных трубчатых костей взрослых собак последовательно подвергали кислотной деминерализации, диссоциативному экстрагированию, диализу против бндистнллнрованной поды, высаливанию сульфатом аммония при 30-, 50- и 75%-ом насыщении им раствора и фракционированию по Мг посредством гельпроникающей хроматографии (ГПХ) и кислотно-основным свойствам с помощью хроматографии на ионообменниках (ИОХ). Принята рабочая индексация полученных фракций ЦБК: римская цифра - высаливаемость при 30 или 50% сульфата аммония, арабские - апроксимиропанное значение молекулярной массы, цифры с буквами - степень сродства к апиопо- (а) или катиоиообмеииику (к).

Результаты исследования и их обсуждение

Химический состав зрелой костной ткани и дистракционного регенерата. Исследование состава минеральной фазы и ВКМ зрелой компактной костной ткани (ЗКК) собак, интактной костной ткани (ИКК) тех же животных после возмещения днафизарпого дефекта посредством монолокального ЧКДОС на 28-ой день дистракцин, осснфнцпрованных зон (03) и соединительнотканной прослойки (СТГ1) ДР, полученного в результате возмещения дефекта, выявило существенные различия в их составе. Эти различия визиалнзирует рис. 3, где в полярных координатах отложены в процентах от показателей ЗКК 6 индексов, рассчитанных на основании определения в образцах кальция, неорганического фосфата, карбоната, цитрата, гидрокеппролина, сиаловых и уроновых кислот. Процесс минерализации, активно протекающий в 03 ДР, происходит на фоне значительного увеличения содержания НБК с преобладанием спалопротепдоп над протеогликанами и большим, чем в ЗКК, уровнем карбоната. Торможение минерализации в СТП ДР осуществляется примерно при том же содержании в ВКМ НБК, однако в составе последних преобладают протеогликаны. Частичная потеря минерала ИКК сопровождается пропорциональным уменьшением в ее ВКМ нротеогликанов и сиалопротеидов. Убыль карбоната в составе минеральной фазы этой модификации костной ткани позволяет предположить, что в механизме деминерализации играет роль местный тканевой ацидоз. Отсутствие корреляции между уровнями цитрата и функциональным состоянием минеральной фазы было объяснено в эксперименте in vitro, показавшем, что при рН ниже 6,0 это соединение выполняет роль деминерализующего фактора, а при рН выше 7,0 -способствует фиксации минерала.

стп

икк

показатель минерализации

200 т

карбонаг / коляаге.

цитрат / коллаген1

показатель кристаллизации

некол. белки I коллаген

уронооые / сиаловые к-ты

показатель минерализации 200 п

карбонлт / коллэго

цитр,от! коллаген

показатель кристаллизации

иккол белки / коллаген

уронооые / сиаловые к-ты

показатель минерализации

200 т

карбонат (келлаге!

цитрат I коллаген

показатель кристаллизации

некол белки/ коллаген

уронооые / сиаловые к-ты

Рис, 3. Особенности химического состава различных модификаций костной ткани:

В эксперименте по возмещению диафизарного дефекта посредством билокальиого ЧКДОС помимо ЗКК и ДР, полученного в сроки 7, 14, 28 сут дистракции, 14 и 30 с-ут фиксации, анализировали новообразованную губчатую кость (НГК), замещающую с периостальной и эндостальнои поверхностней перемещаемый фрагмент диафиза большеберцовой кости. Параллельно проведен анализ компактной костной ткани щенков (КЩ). Все модификации костной ткани подвергали фракционированию по степени зрелости - содержанию минерала - посредством центрифугирования пульверизированных проб в смесях трпбромметана и толуола с плотностями от 1,3 до 2,2 г/см3. Характерные гистограммы распределения по плотности трех образцов приведены на рис.4.

% 60 50 40 30 20 10 0

гГЮШ1^0ОСПСМт-СМ «-" -г-" т—~ т-' г— см" О!

г I см3

Рис. 4. Гистограммы распределения по плотности дериватов костной ткани

Каждая из новообразованных тканей показала трехмодальныи характер этого распределения. Соотношение Са/Р04 в модальных разрядах соответствовало трем формам фосфата кальция: однозамещенпому и трехзамещенному аморфному фосфату кальция (АФК) п кристаллической форме - гидрокспапатиту (ГОЛ). Образцы ПГК и К1Ц обнаружили значительное сходство н распределении структур различном степени зрелости, тогда как в ДР трансформация АФК в ГОЛ была

существенно подавленной. Химический состав, средне- и высокомпнерализоианных фракций (с плотностью >1,7 г/см') в этих трех модификациях был значительно схож, тогда как ппзкомпнерали-зованная фракция ДР (1-й модальный класс) отличалась по составу от той же фракции НГК и КЩ (рис. 5). На этом основании сделан вывод о том, что срединная прослойка ДР, его так называемая зона роста, является результатом экспрессии клеток фенотнпичсски отличающихся от остсогенных.

Сульфаты х 10

Уроновые к-ты X 10'

ДНК х 10"'

Коллаген х 10г

Силлопые к-ты X 10

Сульфаты X 10

Уронопые и-ты х 102

ДНК х 10'1

H KG

Сиапопые к-ты

X 10

Сульфаты х 10

Урановые Х-ТЫ х 10г

РНКх 10г

1 | ylc:м1

ДНК х 10л

Коллаген х

ю-

Сиэловые к-ты х 10

В

Рис. 5. Различия в химическом составе низкоминерализованного ВКМ дистракци-онного регенерата и новообразованной костной ткани. а-ДР, б-НГК, в-ЩК

Исследования костной ткани крыс эксперимента «Космос-1129» показали, что деминерализация костной ткани под влиянием гипогравптацни, гипокинезии и иммобплизационного стресса имеет существенно общие черты с развивающейся при ортопедических вмешательствах на скелете: потеря минерала происходит преимущественно за счет АФК, сопровождается снижением содержания НБК и тканевым ацидозом - увеличением концентраций пировинограднон и молочной кислот при уменьшении содержания карбоната. Инкубирование пульверизированной кости в растворе протеолнтичсского фермента выявило сходные изменения в нерастворившемся осадке и выход АФК в раствор.

Физико-химические и биологические свойства НБК. На рис.6 приведены данные об общем количестве НБК в ЗКК собак, их экстрагируемостп в указанных выше условиях, и распределении водорастворимых НБК при высаливании сульфатом аммония. Примеры фракционирования водорастворимых НБК посредством ГПХ и ИОХ демонстрирует рис.7. Как оказалось, при использовании предложенного 14

нами лабораторного регламента выделения НЬК можно получить не менее 40 фракции, гомогенных при -электрофорезе в присутствии анионного детергента на ацетат целлюлозной мембране. Инкубированием диссоциативного экстракта НБК и отдельных его фракции с жслатинизпрованным коллагеном, ДФК и ГОЛ и последующими ГПХ и ИОХ, была установлена аффинности фракций с относительном молекулярной массой Мг~30 кД и значительной части белков с Мг ~20 кД к коллагену, кислых белков - к ЛФК, а основных и нейтральных - к ГОЛ.

Лип 5% НБК 3%

Вода 12%

Апроксимированный состав зрелой компактной костной ткани (%).

МФ - минеральная фаза Кол- коллаген типа I НБК- неколлагеновые белки ГАГ- гликозаминогликаны Лип- липиды

ВНБК 24%

ННБК

56%

Распределение НБК при диссоциативном экстрагировании и диализе против дистиллированной воды

ННБК - неэкстрагируемые НБК С1 - С1-гликопротеин ВНБК - водорастворимые НБК

Распределение водорастворимого НБК между фракциями при высаливаниии сульфатом аммония

Рис. 6. Общее количество, экстрагируемость и растворимость НБК зрелой костной ткани

Участие НБК в механизме биологической минерализации. В этом аспекте наиболее интересны исследования супрамолекулярного комплекса коллагена, НБК и лниидов, осаждающегося при диализе против

поды диссоциативного экстракта пли обессоливания посредством

а б

Рис. 7. Примеры хроматографического фракционирования НБК: а - ГПХ фракции II (TSK - гель тойоперл HW-50, 100x2 см), б - ИОХ фракции II, 30 (ДЭАЭ-сефадекс А-25, 20x2 см).

Таблица 1. Химический состао и ферментативная активность С1-гликопротеина диссоциативных экстрактов костной ткани собак

- Показа!ель Содержание, активность Единица измерения

Коллаген 32,6 ± 1,8 г / 100 г

Неколлагеповыс белки 36,2 ± 2,4 г / 100 г

Кальции 0,37 ± 0.04 г / 100 г

Общее содержание фосфора 0,17 ± 0.02 г/ 100 г

Сиаловые кислоты тотального препарата 1,28 + 0,08 г/ 100 г

Общее содержание лплпдов 22,1 ± 1,6 г / 100 г

Сиаловые кислоты лппидпого экстракта 4,59 + 0,23 мг / г липидов

Липидныи фосфор 5,82 ±0.3 мг/глипидов

Активность фосфомопоэстсразы I 13,6 + 0,8 ммоль ПНФ / ч / г

Активность адснозпнтрифосфатазы 5,4 ±0.2 ммоль РО< / ч/г

Его состав, приведенный в табл.1, позволил идентифицировать его с фракцией ВКМ, ранее полученной G.M.Herring ct al. (1974), названной ими G1 -гликопротенном. Нами установлено, что переход G1-пшкопротеипа в твердую фазу начинается при рН<5,8, кривая титрования щелочыо его кислого раствора имеет характерный для слабых кислот S-образнып характер с pl~4,5, иадосадочная жидкость

J 6

при многократном промывании его осадка дистиллированной водой сохраняет рП>8,0. Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия С1-глпкопротс1ша выявили в его структуре зельца, сходные с описанными как везикулы кальцифицирующегося матрпкеа (Н.С.Апс1егеоп; 5.У.АН а1.). Наличие фосфомоноэстеразнои и АТФ-азной активностей у 01-гликопротеина подтверждает наше убеждение в том, что везикулы кальцифицирующегося матрпкеа являются продуктом самосборки в ВКМ экскретнруемого остеогениой клеткой супрамолекулярпого комплекса - 01-гликопротеина. Его роль в минерализации, вероятно, определяют свойства важнейшего компонента - ;Са-связывающего НБК, который подобно солям слабых кислот и сильных оснований при гидролизе подщелачивает среду, в силу чего преципнтирует трикальцинфосфат, кластеры которого

трансформируются в ГОА. Ферментативные свойства комплекса обеспечивают этот процесс фосфатными группами и подавляют ингибирующпп эффект полифосфатов.

НБК - регуляторы остсогенеза и кроветворения. Уже в первых экспериментах по биотестированшо фракционированных только по Мг НБК было показано, что при введении ннтактным животным они воздействуют на уровень синтеза ДНК в костной ткани и кроветворных органах, при этом высокомолекулярная фракция (ВМФ) стимулирует, а нпзкомолекулярная - ппгпбнрует включение в них 'Н-тимидина - рис. 8.

180

100

кость костный сепезенка печень скелетная мозг мышца

Рис.8. Влияние фракций НБК на синтез ДНК в различных тканях

* отмечено включение "'Н-тимидина, отличающееся от контроля с уровнем достоверности не менее 95%

Введение ВМФ кроликам в преддпетракционный период после остеоклазии костей голени стимулировало у них созревание дпет-ракционного регенерата, красное кроветворение и способствовало нормализации лейкоцитарного индекса. 9 хроматографически чистых фракций НБК диссоциативных экстрактов были тестированы на способность влиять па костеобрпзоваиие. Количественная оценка тестирования путем денситометрпп Я-тенп дефектов малоберцовои кости (рис. 9) выявила, что фракции 1,20,2к, П.20.()к, 11,20,2а, П,30,2к

ускоряли возмещение дефекта, фракции II, 10,2а и II,40,0а,Ок его замедляли, фракции П,30,0а,0к и II,30,2а проявляли 2-фазный характер влияния - стимулирование резорбции в начальном периоде, сменяющееся стимулированием новообразования костной ткани через 2 нед 1юсле введения препарата. Действие фракции И,20,0а,0к не отличалось от контроля - введения 0,15 М NaCl. Фракция П,30,2к испытана при введении в период фиксации кроликам с удлинением конечности после остеотомии костей голени. Путем экспертной оценки дельфийским методом (Kendall) с точностью 71,7% установлено, что эта фракция ускоряет созревание ДР в 83,1 % случаев.

Рис. 9. Скорости возмещения диафизарного дефекта под влиянием различных НБК: а -II,30,2k; 6 - II,30,2а; в - II,10,2а, г - 0,15М NaCl

15 фракций диссоциативного экстракта костной ткани были тестированы па способность контролировать кроветворение. Некоторые из них влияли на костеобразование и кроветворение в одном направлении (стимулировали или ингибировали), другие разнонаправленно, третьи - проявляя активность в отношении морфогенеза одной ткани, были индифферентны для роста другой. Факторы, активные в отношении гемопоэза, проявляли различный спектр своего физиологического действия: от общсстимулиругощсго на все ростки кроветворения до действия только на один, например, стимулирование роста красного ряда или преимущественно моноцитарно-макрофагального ростка белого кроветворения. Характер влияния этих фракций НБК на кроветворение в селезенке и костном мозге интактных мышей демонстрируют табл. 2 и 3. Кроме того показано, что при введении фракции П,20,2к, П,20,0а,0к п П,30,2к увеличиваются, а при введении фракций 1.20,2к II,10,2а уменьшаются содержание ретикулоцнтов в периферической крови, клеточность и индекс массы селезенки. Фракции П,30,0а,0к и II,30,2а обнаружили спо-

собность существенно увеличивать конго рот-нндскс и содержание клеток моноцитарного ростка в костном мозге и селезенке.

Таблица 2. Клеточный состав селезенки мышей через 48 ч после введения фракций НКБ костной ткани

Фракция ИКС Покататель

РКС ОЛК ДМЛ КГР ОЭК

0,15М ЫаС1 6,7+0.4 74.3+0,8 1 5,610,5 6,410,6 11,810,9

1.10.2а 5,6+0,6 77,1+0,9 18,2+0,9* 6,310,4 10,3+1.0

11,10,0а,0к 5,7+0,4 73,9+0,8 , 19,8+1,2* 5,7+0,4 14,0+0,8*

11,10,1а 3,9±0,4* 76,510,3 17,7+0,4 7.3+0,6 11,3±0,4

11,10,2а 5,0±0,6* 77,9+1,1 6,5+0.7* 11,4+0,8* 5,8+0,5*

П,10,2к 5,810,5 75,9+1,2 18,7+0,8* 6,1+0,4 11,5+0,7

1,20,1 к 4.5±0,2* 75,3+0,4 19.4+0.8* 7,2+0,7 12,3+0,6

1,20,21ч 3,2+0,4* 79,1+0,9* 13,3+0,7 7,3+0,7 10,0+0,9

И,20,0л,Ок 7,3+0,4 73,5+1,5 12,1+0,9* 11,7+1,2* 6,7+0,8*

П.20,2а 5,3+0,7 78,910,7* 18,6±0,8* 3,8+0,2* 11,411,2

11,20,2к 5.1+0.7 75,0±1,3 20,6+1,6* 5.410,4 13,9+0.8*

П,30,0аД)к 5,0+0,3* 77,6+0,3* 17,4+0,6 6.3+0,4 10.7+0,6

11.30,] а 4,1+0.4* 74.8+0.9 17,7+0,6* 8.3+0,6* 12.8+0.7

11,30,2а 7.3+0,4 80,2±1,7* 9,3+0,6* 1,2+0,1* 9.010,9*

lf.30.2k 6,3±0,7 74.8+1,2 19,410.7* 3,8+0.2* 14,5+0.8*

1 (.40,0а.Ок 3,0+0,2* 79,310.6* 17.0+0,4* 7.210,7 9.710,6*

Таблица 3. Клеточный состав костного мозга мышей через 48 ч после введения фрак-

Фракция НКБ Поката гель

НДБ РКС ОЭК КБР ЛЭС

0,15М ЫаС1 2,6+0.5 4,5±0,6 12,3+0,6 80,710.8 6,60+0,40

1,10.2а 4, НО,5* |_ 3,3+0.5* 12,1+0,5 80,6+0,7 6,72+0,38

11,10,0а,0к 1,6+0,4* 4,9+0,5 15,(,±0.6* 77,910.8 4,9710,30*

11,10,1а 4,2+1.3 3,2+0,7* 11,5+1.0 80.5+1.7 7,0310.41

11,10.2а 3,2+0,4 3,2+0,5* ! 0,4+0.9* 83.0+1.6 8.6010,32*

11,10,2к 3,0+0,5 3.8+0,4 13,Ш,1 80.211.9 6,28+0,68

1,20,1 к 5,0+0,4* 4,0±0,4 15,1+0,6* 75,9+0.8* 5,05+0,22*

1,20,2к 1,8+0,4 3,7+0,4 10,4+0,6* 82,4+0,6 8,45+0,64*

11,20,0а,0к 3,60,5 3.7+0,6 10,0+1,1* 82,7+0,3* 9,00+0,80*

11,20,2п 2,1+0,5 5,3+0,5 12,3±1,2 80,3+1.2 7,13+0,67

ll.20.2k 0,8±0,1 * 4,9+0,5 12,510.5 79,5+0,7 6,8210,64

П.ЗО.Оа.Ок 3.3+0,6 3,8+0,3 12,1+0,7 80,8±0,7 7,2610,82

11,30,1а 3,5±0.5 3,5+0,4 12,71.0,8 77,6+0,7 6.36+0,44

11,30,2а 3,6+0,4 4,6+0,4 10,9+0.9* 80,9+0,7 8,1210,48*

П,30,2к 1,0+0,1* 5,4±0,3* 16,4+0,6* 77,3+0,5 5.1010.40*

11,40.0а.Ок 6,6+0.5 4,2+0,4 11,310,9 79,6+1.0 8.0610,49*

ОЭК - общее количество клеток красного ряда, КБР - общее количество клеток белого ряда, ЛЭС -леикоцитарно-эритробластическое соотношение, ОЛК - общее количество лимфоидных клеток, ДМЛ - доля малых лимфоцитов 8 % от ОЛК, КГР - общее количество клеток гранулоцитарного ряда, ОЭК -общее количество клеток красного ряда;

" - отмечены результаты, отличающиеся от контроля с уровнем не менее 95% по критерию Ц (Вилкоксонэ-Манна-Уитни)

Взаимодействие системных и местных рострегулирующих факторов при репаратпвном остеогснезс. В развитии общей реакции организма на скелетную травму и вмешательство на ОДА, течении адаптационного процесса после них отчетливо различаются две дискретные фазы - катаболнческая (резорбтивная, пролнфератпвная) и анаболическая (биосиптетическая, фаза минерализации), что совпадает с большим числом ранее сделанных наблюдений (А.М.Герасимов, Л.Н. Фурцева; А.А.Корж, А.М;Белоус, Е.Я.Панков; Я.Н.Е§с1аЫ й а!.; Б.К.Ьа! е1 а1. и др.). Прямое радиоиммунологическое определение сывороточных концентраций паратирина и кальцитонина и функциональная оценка активности систем адаптогенных и остеотропных гормонов позволяют заключить, что первая их них контролируется катехоламинами, кортикостероидами и паратирином, вторая - преимущественно кальцнтонпном и гормоном роста. Продолжительность катаболнческоп фазы находится в зависимости от того, как срочно выполнен стабильный остсосинтез правильно сопоставленных отломков кости, степени нарушения местного кровообращения и повреждения параоссальных тканей. Дистракция костного регенерата отсрочивает наступление второй, анаболической фазы. Структуру адаптационного процесса - продолжительность фаз срочной и долговременной адаптации и периода перехода от первой ко второй - позволяет сделать предложенный нами показатель состояния (ПС), равный отношению количества клеток белого ряда без нейтрофилов (в % от общего количества лейкоцитов) к произведению общего количества лейкоцитов на количество нейтрофилов (в % от общего количества лейкоцитов) (рис.10). Для оценки активности в сыворотке крови местных рострегулирующих факторов, депонируемых костной тканыо, предложен биотсст, заключающийся в подсчете ретикулоцитов периферической крови мышей-реципиентов фракции белков сыворотки крови больных, имеющей тс же высаливаемость и кислотно-основные свойства НБК, регулирующих остеогенез и кроветворение (рис.11). Величина биотеста показала тесную корреляцию на значимом уровне с клинико-рентгенологической оценкой активности репаративного остеогенеза, активностью костного изоэнзима фосфомоноэстеразы I (КФ 3.1.3.1) и величиной системного индекса электролитов сыворотки (Са?\^С1/Р04)- показателя функционального состояния системы остеотропных гормонов. Введение экзогенных НБК, обладающих рострегуяирующпми свойствами, животным с ЧКДОС способствует более быстрой нормализации ПС и нормохромной анемии, развивающейся в ответ на вмешательство на скелете.

ПС

контроль 16

16 24 32 40 48 56 64 72

Рис. 10. Изменение лейкоцитарного индекса - ПС - в динамике заживления переломов трубчатых костей в зависимости от срочности стабильного остеосинтеза

Больные оперированы:

1 - в 1-е сутки после травмы,

2 - через 3-4 дня после травмы,

3 - через 1-2 недели после травмы,

4 - не оперированы

I сут.

0

1

ч

о х

300

250

200

1

150

100 ■

50

14

21

28

35

Время после травмы, сут.

Рис. 11. Результаты биотестирования белков сыворотки крови больных с переломами костей голени на интактных мышах

Конструирование_и_экспериментальная_ад1Шба_Ш1я

фармпрепаратов из зрелой костной ткани. Приступая к конструированию фармпрепаратов из костной ткани мы постулировали для себя несколько положении:

1) лабораторный регламент их получения должен быть в достаточной мере технологичен;

2) создание на его основе промышленного производства должно достигаться простым масштабированием лабораторных приемов;

3) костная ткань в процессе приготовления серии препаратов различного назначения должна использоваться полностью, без отходов;

4) для извлечения, фракционирования, очистки ингредиентов костной ткани, входящих в состав препаратов, не должны применяться вещества I-II класса вредности;

5) все используемые реагенты должны возвращаться в технологически)! цикл или утилизироваться.

Используемая нами схема выделения и очистки костных неколлагеновых белков позволяет решить все эти задачи. Зная биологические и физико-химические свойства отдельных продуктов, получаемых на этапах этой процедуры, можно, внося минимальные изменения в эту схему, получать композиции веществ с планируемыми свойствами, т.е. конструировать новые фармпрепараты с различным терапевтическим эффектом. Различные композиции ингредиентов зрелой костной ткани с общим названием стимбон (от Stimulator from Bone) апробированы в экспериментах на ннтактных животных и различных моделях регшративного остсогенеза и нарушенного кроветворения. В настоящей работе приведены результаты трех из них.

Стимулятор кроветворения и остсогенеза стимбон-!. Препарат представляет собой композицию НБК с молекулярной массой 20-30 кД, осаждающихся сульфатом аммония в интервале насыщения >30<50%, не " проявляющих сродства к анионообменннку. Предназначен для парэнтерального введения в дозе 0,5-1,0 мг/кг массы тела. При испытании в эксперименте при однократном введении ускоряет прирост массы тела у растущих животных и заполнение дефекта малоберцовон кости скелетогенной тканыо, созревание дистракционного регенерата большеберцовон кости при местном введении в СТП ДР и внутривенно (табл. 4); стимулирует эрнтроноэз у ннтактных животных и уменьшает анемизирующее влияние подострой дробной кровопотери (табл.5).

Таблица 4. Влияние препарата стимбон-1 на минерализацию дистракционного регенерата большеберцовой кости собаки__

Показатель Ткань

Интактная кость Дистракц. контроль регенерат опыт

Содержание кальция (г / ЮОг сухой обезжиренной ткани) 24,62 ± 0,84 18,37 ±0,7! 21,02 + 0,81

Содержание фосфора (г / ЮОг сухой обезжиренной ткани) 13,20 + 0,41 12,05 + 0,32 12,83 ± 0,81*

Показатель кристаллизации минеральной фазы 1,49 + 0,10 1,18 + 0,04 1,31 +0,07*

Показатель минерализации (г, Са + ЗР) 63,9+ 1,8 54,5+1,6 59,4+ 1,3*

* показатели, отличающиеся от соответствующих в группе «контроль» с уровнем >95% по критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни

Таблица 5. Профилактическое влияние препарата стимбон-1 на развитие анемии после подострой кровопотери

Показатель 1 руппа животных

Пнтакгпые Кровопотср я Препарат+ кровопо геря

1 сма гокрпт (%) 46,1+2,5* 30,9+2,1 37,8+1,К*

1'сшкулоип гы периферическом крови"(на 1000 эритроцитов) 29,1+3,2* 91,0+10,2 44,4+4,4*

Лсикоцитарно- эрптробластпчсскос соотношение костного мозга 6,12+0.86* 1,98+0,09 1,28+0,12*

Распределение костно-мозговых клеток красного ряда (% общего числа пормопптов):

оазофнльлыс 18,2+1,3 17,1+2,7 ^Ь+ГД^

полихроматофпльпые 68,й+3,4 76,1+0,6 56,5+4,0*

окенфпльные '13,2+2,2*' '/,/+0,6 35,5+4,4*

Количество эритропдпых клеток (на 1000 сшюнопитов) - 51,0+14,0* 201,0+11,0 262,0+24,0*

* результаты, отличающиеся от одноименных в группе «кровопотеря» с уровнем достоверности <95% по критерию и Вилкоксона-Манна Уитни

Плшуиомодуляшор и адаптогеи спишбои-2. Композиция костных неколлагсновых белков, отличающихся от компонентов стимбопа-1 тем, что не проявляют сродства к катионообменнпку - кислые и нейтральные белки. Апробация на животных при однократном парэптеральном введении в дозе 0,5-1,0 мг/кг массы тела выявила следующие свойства: у интактных животных увеличивать число нейтрофпльных грапулоцптоп и. моноцитов в периферической крови и их предшественников в костном мозге; увеличивать число Т- и В-лимфоцитов крови и их функциональную активность; повышать фагоцитарную активность лейкоцитов крови (табл.6); у стрессированпых животных изменят!, клеточный состав периферической крови по направлению к физиологическому уровню (табл.7).

Таблица 6. Влияние паронтерального введения препарата стимбон-2 на иммунный статус собак__ ____

11окачатсл1, Срок после введения

До ввел. 24 часа 48 часов 7 су гок

1 -СОК (ог общего числа лнмфошггоп п %) 22,6±3,1 30.4+7,0* 33.2+7,7* 22.3+5.6

Количество '('-лимфоцитов (клеток х 10'^ 0,20±0.05 0,47+0,01* 0/10+0,07* 0.21+0,05

Н-1'ОК (от общего числа лимфопитоп 11 "/«) 7,5+1,1 К,3+1,0 10,4+2,1* 7,4 + 0,8

Количество В-лимфошпоп (клеток х 10') 0,08±0,02 0,1 1 + 0.04 0,14+0,01* 0,0710,1

Активные Г-лнмфошпы (% о г их общ. чпепа^ 11,3+1.7 17.1 +2.0* 17.8+1.4* 11.6+1,6

< 1' а го ш 11 а р и а я п к 1п в а о сп, пейтрофнлов (/«) 84,3+2,5 91.4+2,2* 92.7+1,4* 89,7+1.6

Фагоцитарное число 8,9+0.7 10.3+0.4* 10,4+0.6* 9,2±0.5

* отмечены показатели, отличающиеся от тех же до введения препарата, с уровнем не менее 95% по критерию и Вилкоксона - Манна-Уитни

Таблица 7. Влияние препарата стимбон-2 на показатели кроветворения у «стрессированных» мышей_

.; Показатель Группа животных

Иигактныс мыши (кл. х 109/ л) Исходный уровень «стрсс.» мышеи (кл.х 10'/л) 0,15М ЫаС1 (% от исходного уровня) Стимбон-2 (% от исходного уровня)

Общее содержание лейкоцитов 10,6 ±0,6 40,2+ 5,6* 125,7 ± 14,8 66,5 ±5,8*

Общее содержание нейтрофилов 0,45 + 0,04 1,59 ±0,27* 135,4+ 17,6 194,6+14,6*

Юные формы нейтрофилов 2,81 +0,22 12,04+1,69* 142,8+ 12,7 66,1+5,7*

Содержание лимфоцитов 7,11 ±0,48 25,391-3,28* 1 15,4 ± 14,6 68,4 ±5,8*

Содержание моноцитов 0,36 ±0,03 ' 1,15 + 0,16* 167,3 ±21,3 111,9 ±9,6*

* показатели, отличающиеся от соответствующих колонка слева с уровнем >95% по кри терто и Вилкоксопа-Манна-Уптпп

Препарат, восполняющий дефицит фосфата кальция, спишбои-4 ¡Предназначенный для перорального применения препарат, приготовлю 'смешиванием минерала и гидролизата нерастворимого матрнкса полученных при деминерализации костной ткани, и экстрагированш .. ВКМ содержащий в 100 г 32 г кальция, 19,5 г фосфора, 2,2 г магния, 23 I ^аминокислот. В 12 раз более растворим в дистиллированной воде, чел !;. минерал, использованный для приготовления; при этом раствор в 16 ра-содержит больше Са и в 8 раз - больше Р. Испытан путем скармливаши '1з течение месяца растущим мышам, находящимся па рационе с ннзкт содержанием фосфата кальция. Получавшие его животные имел! . большую, чем контроль, массу и длину тела, более высокое содержанш : минерала в высушенной и обезжиренной ткани трубчатых костей (табл 8).

Таблица 8. Влияние препарата стимбон-4 на рост и состав костной ткани мышей

Группа Контроль Опыт

животных

Показатель

Масса тела (г) 14,73+1,00 17,41+0,89*

■Длина тела (мм) 76,6+1,4 84,9+1,4*

Длина большеберцовои кости (мм) 15,9+0,2 16,9+0,34*

Содержание в костной ткани (г/100г)

Кальции 16,5+0,9 18,6+1,7*

Фосфор 10,6+0,5 12,4+0,3

Магнии 1,58+0,07 1,53+0,08

*см. примечснпе к табл.4

11одподп 1П0П1 многолетних исследований структуры н (функции пеколлагеповых белков кости мы можем скатать, что при относительно невысоком содержании этого класса соединении в зрелой ткани он содержит не менее четырех десятков полипептидов, отличающихся по молекулярной массе и другим физико-химическим свойствам. Важнейшие биологические процессы, связанные с гистогенезом, самоподдержанием на протяжении жизни и репаративиой регенерацией кости протекают при активном участии этих веществ. Функция скелета в поддержании постоянства химического и клеточного состава внутренней среды организма, в реакции которой организм отвечает па экстремальное внешнее воздействие также осуществляется при участии биологически активных неколлагеповых белков либо синтезированных остеогенными клетками, либо депонированных костной тканью в процессе созревания.

При физиологическом рсмодслировании костной ткани и ропаративном остеогенезе может иметь место представленным па рис.12 каскад поступления во внутреннюю среду и специфической активности депонированных костной тканыо рострегулирующнх факторов с различными физиологическими функциями. Деминерализующий сигнал (низкий уровень Са в крови, ацидемня, высокий уровень веществ со свойствами хелатов и др.) мобилизует вместе с АФК монокин, стимулирующий пролиферацию предшественников макрофагов и остеокластов, и контролирующий процесс резорбции костной ткани. Освобождающиеся вследствие резорбции ГОА п ВКМ и продуцируемые макрофагами факторы роста стимулируют пролиферацию и днфференцировку остеогенных, кроветворных п пммунокомпетентных клеток. В результате экспрессии дифференцированных остеогенных клеток формируется ВКМ, ткаиеспецифичиость которого обеспечивает преципитацию АФК и трансформацию последнего в ГОЛ - процесс биологической минерализации. В процессе новообразования костной ткани и последующего созревания ее происходит связывание биологически активных ЦБК с различными компартментами ВКМ и минеральной фазы, депонирование их в скелете. Связывание избытка цитокинов по завершении остеогенеза приводит всю систему местной регуляции в стационарное состояние до получения полого сигнала, вызывающего деминерализацию костной ткани, извне.

Рис. 12. Регуляция костного ремоделирования и репаративного остеогенеза на уровне действия местных факторов роста

Матрнкс, продуцируемый при новообразовании костной ткани на месте резорбируемого фрагмента кости, морфогенез которой, по всей вероятности, инициируется освобождаемыми при резорбции факторами роста, практически идентичен таковому при онтогенетическом остсогс-незе, тогда как матрнкс, синтезируемый менее дифференцированными клетками соединительно-тканной прослойки дистракционного регенерата, значительно от него отличается. В частности, он содержит большие количества несульфатпрованпых гликозампногликанов, ингибн-рующих процесс минерализации. Широко распространенное убеждение, что дозированное растяжение стимулирует остеогенез, следует понимать лишь в клиническом аспекте - как возможность получать костную массу в результате нескольких последовательных процедур, одной из которых является дистракция. Следует считать во благо, что дистракция подавляет остеогенез - образование высокоминсрализованной ткани, -именно это обстоятельство делает возможным возмещение дефектов костей, изменение их формы.

Свойства неколлагеновых белков внеклеточного матрикса кости, роль которую они играют в морфогенезе костной и других тканей делает возможным создание новых препаратов, предназначенных для фармакологической] коррекции осложнений, сопровождающих скелетную травму пли ортопедические вмешательства на скелете.

Определение в крови больных- белков, идентичных но физико-химическим и биологическим свойствам 11БК, может быть использовано н клинической практике травматологии и ортопедии как диагностический и прогностический тест.

ВЫВОДЫ:

1. Зрелая компактная кость млекопитающих содержит около 3 г неколлагеновых белков в 100 г сухой обезжиренной ткани, представленных не менее, чем четырьмя десятками индивидуальных полипептидов, отличающихся по молекулярной массе, растворимости, заряду, сродству к коллагену, аморфному фосфату кальция и гидрок-сиапатнту, имеющих различные биологические свойства.

2. (Лабораторный регламент препаративного выделения костных неколлагеновых белков, включающий кислотную декальцинацию кости, диссоциативное экстрагирование деминерализованного матрнкса обратимо денатурирующим белки реагентом, осаждение водонерастворимых белков посредством диализа, высаливание водорастворимых белков при различной концентрации сульфата аммония, фракционирование сульфатаммонийных осадков по молекулярной массе посредством гельпроникающей хроматографии и по заряду - анионо- и катионообменной, позволяет получить элсктрофоретически гомогенные индивидуальные белки.

3. В процессе физиологического и репаративного остеогенеза общее содержание неколлагеновых белков внеклеточного матрнкса немннералнзованпого предшественника костной ткани уменьшается, изменяется соотношение между индивидуальными полнпептндами с различной физиологической функцией; остающиеся в зрелой костной ткани неколлагеновые белки распределяются между ее компартментами в соответствии со своим сродством к каждому из них.

4. Не менее десяти из числа неколлагеновых белков костной ткани способны воздействовать на остеогенез в одной из трех манер: стимулировать, ингибировать или иметь двухфазный характер воздействия - стимулировать после предварительной резорбции; композиция из нескольких полипептидов, стимулирующих остеогенез, обладает большей активностью, чем составляющие ее индивидуальные белки.

5. Не менее пятнадцати индивидуальных белков, выделенных из костной ткани, способны воздействовать на кроветворение, проявляя активность от общестимулирующего действия до влияния на один росток: стимулирования или ннгибировання эритропоэза, гранулопоэза, моноцитопоэза; композиция, преимущественно содержащая ноли-лрпгиды, активирующие моноцитопоэз, стимулирует клеточный н гуморальный иммунитет.

6. Са-связывающий сиалопротсид костной ткани, обладающий фосфомоноэстеразной и аденозннтрнфосфатазной активностями, имеет 'свойства полпосновной слабодиссоциирующей кислоты: его кальциевая соль при гидролизе изменяет рН среды инкубирования в щелочную сторону до величины, достаточной для преципитации трикаль-цийфосфата, инициируя тем процесс биологической минерализации новообразующейся кости.

7. Частичная деминерализация костной ткани от различных внешних причин - скелетная, травма, гипогравитация и гипокинезия, иммобилизацпонный стресс - имеет общие черты: потеря минерала происходит за счет аморфного фосфата кальция (лабильного фонд? минерала) и карбоната, сопровождается уменьшением содержание неколлагеновых белков с изменением соотношения между сналоп-ротеидами и протеогликанами и накоплением органических кислот сходные изменения в костной! ткани вызывает ее инкубирование 1 растворе протеолнтичсского фермента.

8. В развитии общей реакции организма на скелетную травму, в течеши приспособительно-восстановительного процесса после нее кооператива с контролирующими их факторами центральной нейрогуморально!

■ системы проявляют свое действие и играют важную роль I восстановлении гомеостаза и репарации повреждений местньк рострегулируюище факторы, депонируемые костной тканыо поступающие в результате се резорбции в циркуляторпое русло 1 ; выполняющие функции длнннодистантных регуляторов.

9. Внеклеточный матрикс фиброзпо-грануляционной ткани, образующсйс: при дозированном растяжении костного регенерата, отличается су

:'низкомннералнзованных структур неонатальной костной ткани I новообразованной кости, замещающей резорбирующийся фрагмен' диафиза, соотношением между неколлагеновыми белками инициирующими и ингибиругощими кальцификацию, что обеспечнвас возможность изменения размеров и формы костей посредство? дистракционного остеосинтеза.

10. Различные композиции ингредиентов, составляющих зрелуь компактную кость, перспективны в качестве фармпрепаратог потенцирующих репаративный остеогенез, корригирующи анемизпрующее, иммуноугнетагощее и деминерализующее влияни скелетной травмы и ортопедических вмешательств на опорис двигательном аппарате.

I

i j

Список основных работ по теме диссертации

1. Способ моделирования стимуляции репаративного костеобразования в условиях дпетракцпонного остеосннтеза // Патент РФ № 2018840. -Приоритет 11.12.89 г. - Опубликовано 30.08.94 г. - Бюлл.№ 16 (с Ю.П. Балдпным).

2. Препарат, стимулирующий физиологическую и репаративную регенерацию, стпмбон-1 // Патент РФ № 2050158 - Приоритет 23.1 2.91 г. - Опубликовано 10.12.95 г. - Бюлл.№ 35.

3.' О гуморальной регуляции репаративного остеогенеза // Бюлл.оксп.биол.мед. - 1977. - № 12. - с.725-727 (с В.И.Филимоновым, Н.П.ЛепсховоП, В.О.Недоспасовым, В.Л.Тетериным).

4. Обеззараживающая активность кожи у больных с закрытыми переломами костей голени // Ортопед, травматол.протезир. - 1980. -№ 2. - С. 19-22 (с Г.Л. Илизаровым, С.Д. Паевскнм, П.П. Смелышсвым, В.Г1. Котельннковым)

5. Приспособительное формообразование костей при неравенстве конечностей у щенков // Там же - 1982. -№ 3. - С.32-35. - (Г.Л. Илизаровым, Р.Г. Саксом, С.Я. Зевенко. П.В. Петровской).

6. Состояние минеральной фазы и белкового матрикса костной ткани крыс после длительного космического полета II Косм. биол. - 1982, № 2, с.61-64 (с Л.Л. Прохончуковым, Р.Л. Тнграняном, П.Л. Комиссаровой).

7. Образование органических кислот и содержание карбоната в костной ткани крыс после космического полета //Там же, 1983. - № 1. - С.60-62 (с Л.Л.Прохончуковым, JI.C. Кузнецовой).

8. О роли неколлагеновых белков в минерализации дистракционного регенерата кости // Вопр.мед. хим. - 1985 - № 6. - С. 107-111 (с В.К. Камсрнным, Ю.С. Кочетковым, Л.С.Кузнецовой).

9. Стимуляция остеогенеза высокомолекулярной фракцией неколлагенового белка костной ткани на репаратнвый остеогенез и кроветворение // Там же, 1987. - № I. - С.79-84 (с Ю.П. Балдиным, А.А. Шрейнером, Ю.П.Бахлыковым, СЛ. Изотовой).

10. Влияние белковых рострегулиругощих факторов внеклеточного матрикса костной ткани на остсогенез и кроветворение: Тез. докл. Всесоюзн. сов. // Цитология,- 1989. - Т.31 - № 9. - С.92 (с Ю.П. Балдиным, Л.II. Дьячковым, С.И. Ширалневой, С.П. Изотовой, С.П. Луневой).

11. Моделирование на животных процесса управления остеогенезом и кроветворением факторами роста, депонируемыми костной тканыо: Тез. докл. I Междунар. снмпоз. РАЛЛИ//Ланималогия. - 1993,-№ 1. -С. 52-53 (с Ю.П. Балдиным, Л.П. Дьячковым, С.П. Изотовой, С.Л. Ларионовым, О.Л. Гребневой, С.И. Луневой, С.И. Алиевой).

12. Пути повышения информативности лабораторного контроля за течением репаративного процесса в клинике травматологии и ортопедии // Травмагол., ортопедия России - 1994. - № 2, с. 106-109 (с Ю.П.Балдиным, О.Л. Гребневой, С.П. Изотовой, Л.С. Кузнецовой, СЛ. Луневой, Е.Л. Матвеевой, С.И. Алиевой)

13.Системная реакция организма при полилокальном автоматическом удлинении конечности // Там же. - 1996. - №5 - С. 11-14 (с A.B. "Попковым, Л .С. Кузнецовой). 14.0 возможности ускорения созревания дистракционного регенерата кости фармакологическими средствами: Тез.докл. IX школы по биол. опори.-двиг. апп. И Ортопедия, травматол., протезир. - 1994. - № 4. -С.73 (с Ю.П. Балдиным, А.Н. Дьячковым, A.A. Шрейнером, О .Л. Гребневой, С.П. Изотовой, С.Н. Луневой, Е.Л. Матвеевой).

15. Гематологические и биохимические методы прогнозирования течения репаратпвного процесса у больных с хроническим остеомиелитом костей нижних конечностей // Гений ортопедии. - 1995. - № 1. - С. 2932 (с Ю.П. Балдиным, A.M. Аранович, Л.С. Кузнецовой, С.П. Изотовой, Н.М. Клюшиным)

16. Экспериментально-теоретические исследования, подтверждающие концепцию Г.А.Илизарова о единстве генеза костной и кроветворной • тканей // Там же. - С.32-38 (с Ю.П. Балдиным)

17.0 связи между остеогенезом и кроветворением на основе местной гуморальной регуляции //Там же. - 1996. - №2-3. - С.129-130 (с Ю.П. ' Балдиным, С.И. Алиевой, С.П. Изотовой).

18.Конструирование и экспериментальная апробация фармпрепаратов , из костной ткани // Там же. - 1997. - № 4. - С.6-12 (с В.И. Шевцовым,

О.Б. Устюжаниной, С.Н. Луневой, О.Л. Гребневой)

19. Development and experimental evaluation of pharmpreparations from mature bone tissue // Skeletal Reconstruction and Bioimplantation (ed. T.S. LmdhoSm). - Landes Bioscicns, Georgetown, Texas, USA. - 1997 (c

B.И. Шевцовым). - 16 с.

20.0 регуляции костеобразования при заживлении переломов (экспериментальное исследование) //Лечение переломов и их последствий: Матер. Вссросс. научно-практ.коиф. - Курган, 1979. -

C. 243-245 (с Р.Г. Саксом, А.П. Барабашом, В.К. Камериным).

21.0 механизме минерализации регенерата кости в условиях чрескостного остеосинтеза по Илизарову // Лечение переломов по Илизарову: Сб. научн. труд. КНИИЭКОТ. - Вып. 5 - Л. - 1979. - С. 1416 (с А.Н. Гайдамак, В.К. Камериным).

22.Показатели экскреции электролитов и компонентов органического матрикса у здоровых лиц и при переломах // Там же. - С.71-76 (с А.Н. Гайдамак).

23. Биохимические аспекты регенерации костной ткани при компрессионно-дистракционном остеосинтезе // Вопросы чрескостного остеосинтеза по Илизарову: Сб. научи. КНИИЭКОТ. -Вып. 7. - Курган. - 1981. - С. 80-89 (с В.И. Матвеенко, А.Н. Гайдамак, Л.С. Кузнецовой, И.Г1. Лепсховой).

24. Механизм изменений метаболизма костной ткани животных и человека под влиянием факторов космических полетов // Актуальные проблемы современной патофизиологии: Тез.докл.Всесоюз. конф.,посвящ. 100- лстиго со дня рождения A.A. Богомольца. - Киев, Наукова думка - 1981. - С.294-295 (с A.A. Прохончуковым, P.A. Тнграняном, H.A. Жижиной, В.К. Леонтьевым, H.A. Комиссаровой).

25.0 нсирогуморальных механизмах контроля за репаративньш остеогенезом //Лечение ортопсдо-травматологпчсских больных

методами чрескостного остеосннтеза в стационаре н поликлинике, разработанными в КНИИЭКОТ: Тез.докл. Всесоюз. паучно-практ.конф,- Курган. - 1982. - Т.2 - С. 152-154

26. Молекулярные аспект),i активирующего влияния на осгеогенез дистракцнопиого остеосннтеза // Проблемы чрескостного остеосннтеза в ортопедии и травматологии: Сб. научи, трудов КНИИЭКОТ. - Вып. 8. - Курган, 1982. - С. 103-110 (с Г.Л. Илизаровым, Ю.П. Балдиным, С.II. Изотовой).

27.Роль изменений органического матрнкса в механизме нарушений метаболизма скелета животных в космических полетах // Тез.докл. Всеюзн.съезда патофизиол.(Тбилиси 16-18.11.82 г.) - М. - 1982.

С.372- 373 (с А.А.Прохончуковым, P.A. Тиграняном, H.A. Жижнной,

B.К. Леонтьевым, B.C. Песчанским, H.A. Комиссаровой).

28.Реакция организма при сочетанной травме в условиях чрескоетиого остеосннтеза по Илнзарову I( Матер. III съезда травм.-ортоп. Ср.Азии и Казахстана. - Ташкент. - 1982. - С.87-90 (с Р.Г. Саксом,

C.И. Шведом).

29. Биохимическая характеристика регенерации костной ткани, управляемой методом чрескостного остеосннтеза по Илнзарову // Экспериментально-теоретические н клинические аспекты разрабатываемого в КНИИЭКОТ: Тез. докл. Всесоюз. симп.с участ. иностр. спец. - Курган. - 1983. - С.34-36 (с В.II. Матвеенко, Л.С. Кузнецовой)

30.Динамика биохимических показателен у больных ахондроплазией в процессе лечения методом чрескостного остеосннтеза // Там же. -С.72-74 (с Н.П. Лспеховой, Л.С. Кузнецовой, В.И. Грачевой).

31. Применение хроматографичсских методов разделения белков и нуклеотпдов в изучении механизмов регенерации костной ткани // Тез. докл. I Всесоюзн. конф. «Хроматография в биологии и медицине». - М., 1983. - С. 52 (с В.II. Матвеенко).

32. Физико-химические свойства неколлагеновых белков органического матрикса костной ткани // Тез. докл. V съеда травматол,- ортопед. Закавказья. - Ереван. - 1984. - С.153-155 (с Ю.П. Балдиным).

33. Биохимическая характеристика регенерации костной ткани, управляемой методом чрескостного остеосннтеза по Илнзарову // Экспериментально-теоретические п клинические аспекты разрабатываемого в КНИИЭКОТ метода чрескостного остеосннтеза: Труды Всесоюз. симп.с участ. иностр. спец. - Курган. - 1984. - С. 100104 (сВ.Н. Матвеенко, Л.С. Кузнецовой)

34. О роли стабильного остеосннтеза в развитии адаптационной реакции организма на травму // Чрескостный остеосиитез в ортопедии и травматологии: Сб. иаучн. тр. КНИИЭКОТ. - Вып.9. - Курпан. - 1984. - С.164-169 (с B.C. Богомягковым, Ю.П. Балдиным, С.И. Шведом).

35.Оптимизация условий управления репаративпым процессом при замещении дефектов трубчатых костей Н Тез. докл. IV Всесоюзн. ii съезда травматол-ортопед. - Куйбышев. - Í 984. С. 167-169 (с А.П. || Барабашом, A.A. Ларионовым, А.Д. Наумовым, Ю.П. Балдиным, ¡J Т.А. Чепеленко).

36. Caratteritiche bicliimiche délia rigencraxionc guidata del lessulo osseo col !; metodo dcl,osteosintesi transosseo secondo Ilizarov // L,osteosintcs¡ tran-

sossea secondo G.A.Ilizarov/Aspetti sperimentalli, teorici с clinici Milano. - 1985. - P. 136-138 (cum V.N. Matveenco, L.S. Kuznecova).

37. La dinamika dcgli indici biochimici ncl nanismo acondroplasico durante il trattamento col método dell,osteosintesi transossea di distrazione // Ibidem. - P. 148-150 (cum N.P.Lcpekhova, L.S. Kuznecova, V.l. Gvacheva).

38.Оптимизация условий управления репаративным процессом при замещении дефектов трубчатых костей // Матер. IV Всесоюзн. съезда травматол,- ортопед. - Л. - 1985. - С.190- 194 (с А.П. Барабашом, A.A. Ларионовым, А.Д. Наумовым, Ю.П. Балдиным, Т.А. Чепеленко).

39. Центральные и местные механизмы, реализующие на кдеточно-молекулярном уровне стимулирующее влияние чрескостного" остеосинтсза // Тез. докл. Междунар. конф. «Экспериментальные, теоретические и клинические аспекты чрескостного остеосинтсза, разрабатываемого в КНИИЭКОТ». - Курган. - 1986. - С. 16-17 (с Г.А. Илнзаровым, Ю.М. Ирьяновым, Ю.П. Балдиным, Н.П. Лепеховой, Л.С. Кузнецовой).

40.0 роли чрескостного остеосннтеза по Илизарову в восстановлении гомеостаза, нарушенного скелетной травмой // Тез. докл. I регион, съезда физиологов Сибири. - Новосибирск. - 1986. - С.78 (с Г.А. Илнзаровым, Ю.П. Балдиным, С.И. Шведом, Л.С. Кузнецовой, С.И. Мальцевой).

41. Морфофункцнональные особенности кальцитониноцитов на различных этапах удлинения конечности // Чрескостный комлрессионно-дистракционный остеосиытез в травматологии и ортопедии: Сб. научн. тр. КНИИЭКОТ. - Вып.П. - Курган. - ¡986. -С.47-55 (с Г.А. Илнзаровым, Ю.М. Ирьяновым, Н.В. Петровской).

42.Реакция красной крови на скелетную травму, значение стабильной фиксации правильно сопоставленных отломков // Актуальные проблемы чрескостного остеосннтеза по Илизарову: Сб. научн. тр. КНИИЭКОТ. - Вып. 12. - Курган. - 1987. - С. 41-47 (с Ю.П. Балдиным, С.И. Шведом, В .Я. Шурша).

43. Кислотно-щелочной баланс и электролитный состав, крови при ■ двойном переломе в эксперименте в зависимости от местных условий

// Значение открытых Г.А. Илнзаровым закономерностей в регенерации тканей: Сб. научн. тр. КНИИЭКОТ. - Вып. 13. - Курган. -1988. - С.31-41 (с В.И. Кустуровым, В.К. Кавериным).

44. Кость как орган аутокриннон и паракриннон регуляции репаративного процесса: Адаптационно-компенсаторные и восстановительные процессы в тканях опорно-двигательного аппарата // Тез. докл. VIII Всесоюзн. школы по биологии оп.-двигат. аппарата. -Киев. - 1990. - С.58-59 (с Ю.П. Балдиным, А.Н. Дьячковым, С.Н. Луневой).

45.Ауто- и паракринная регуляция остеогенеза и кроветворения // Тез.докл. II съезда физиол. Уральского per., Свердловск. - 1990, с.137-138 (с Ю.П. Балдиным, А.Н. Дьячковым).

46. Полипептидная регуляция клеточного гомеостаза костной и кроветворной тканей // Эпителий и соединительная ткань в нормальных, экстремальных и патологических условиях: Матер, зон. конф. морфологов. - Тюмень. - 1990. - С. 187-188 (с Ю.П. Балдиным, С.И. Шнралиевой, С.П. Изотовой).

47.0 механизме сопряжения резорбции и новообразования кастой ткани на уровне действия местных рострегулнрутощпх факторов: Современные аспекты чрескостиого остсосиитеза по Илизарову // Матер, научи, конф. - Казань. - 1991. - С.158-159 (с Ю.П. Балдиным, А.II. Дьячковым, С.П. Изотовой, С.II. Луневой, О.Л. Гребневой, С.II. Ширалиевой).

48. Регуляция остеогснеза и кроветворения депонируемыми в костной ткани ростовыми факторами // Материалы IX школы стран СНГ по биологии оп.-двигат.аппарата. - Харьков. - 1992. - С.81-86 (с Ю.П. Балдиным, А.Н. Дьячковым, С.Я. Зевенко, С.П. Изотовой, С.Н. Луневой, О.Л. Гребневой).

49. Влияние рострегулнрующего фактора костной ткани на созревание дистракцноиного регенерата при удлинении голепи в эксперименте II Лечение повреждений и заболеваний опорно-двигательного аппарата методом чрескостиого остеосинтеза по Илпзарову. 4.2. - Казань. -

¡IJ1992. - С. 147-149 (с Л.Н. Дьячковым, Ю.П. Балдиным, А.Л. I Ларионовым, Г.К. Архиповым).

50. Влияние эритропоэтииподобпого фактора роста из костной ткани на биосинтез ДНК и белков в культивируемых фибробластах п зависимости от дозы //Там же. - С.149-152 (сО.П. Березовской).

51. Динамика изменений белкового и фосфорно-кальциевого обмена при возмещении дефектов костей голени по Илпзарову //Там же. - С. 152156 (с В.К. Камериным).

52. Особенности реакции системы крови и содружественные изменения ее в удлиняемой и интактной конечностях в эксперименте: Метод Илизарова - достижения и перспективы // Тез.докл.Междунар. конф., посвящ. памяти акад. Г.А. Илизарова. - Курган. - 1993. - С.325-327 (с Ю.П. Балдиным, С.П. Изотовой, С.И. Ширалиевой).

53.0 роли чрескостиого остестеосинтеза в реализации эффекта центрального и местного звена регуляции репаративного остеогенеза //Там же. - С.335-337 (сЮ.П. Балдиным).

54.0 механизме потерн минерала скелетом в экстремальных условиях: : Космическая биология и авиакосмическая медицина // Тсз.докл. X конф. - Москва. - 1994. - С.34 (с Ю.П.Балдиным, А.Н. Дьячковым, , А.А. Ларионовым, О.Л. Гребневой, Е.Л. Матвеевой)

55.Testing of pharmpreparations from bony tissue to treat complications ac-companyng scelctal intervenions II Bone morphogenetic proteins: expérimental and clinical aspects today: Abstr. Int. symp, 96 Tampere, Finland.

■ 1996 (cumV.I. Shevcov).

56.0 роли Gl-гликопротенна костной ткани в механизме биологической ! кальцифпкацни //Тез. докл. научнк. НИТЦ «ВТО». - Ч. 2. - Казань. -1994. С. 27-28. ( с Ю.М. Ирьяновым, О.П. Березовской, С.Н. Луневой, Л.С. Кузнецовой, О.Л. Гребневой).

57. Фснотипические особенности дистракцноиного регенерата, зрелой и новообразованной костной ткани: Актуаяый питания бюлогн опорно-рухового аппарата // Матер. VIII школы стран СИГ. - Киев. -

■ 1996. - С.35.

58.Особенности минерального обмена у больных с закрытыми перело-I мами и сопутствующим сахарным диабетом // Матер. XXVIJI юбил. обл. научно-практ. конф., посвящ. 50-лстию Курганской обл. клип, б-

i"; цы. - Курган. - 1996. - С. 1 16-118 (с С.И. Шведом, Л.С. Кузнецовой, Г;1 С.И. Новичковым).

': Рукописи, депонированные ВИНИТИ

|59Л4селедование биосинтеза нуклеиновых кислот, коллагена и ; ; неколлагеновых белков в костной ткани и его особенности при за-iживленпн переломов // Заключительный отчет о НИР № гос.рег.-77035125. Инв. № Б 891583. - 43 с. - Дсп. 2.12.80 (с А.Н. Гайдамак, В.Н. Матвеенко, Н.П.Лепеховой). 160.Течение репаративного процесса при чрескостном остеосинтезе в ; зависимости от тяжести региональных ишемических расстройств кости // Закл.отчет о НИР N гос. per. 78073748. - Инв. N - 72 с. (с '.: А.Н.Гайдамак, В.К. Камериным, В.И. Куетуровым, А.Д.Наумовым, . A.A. Свешниковым, Е.Б. Смирновым, Л.А. Смотровой). 61. Изучение роли остеогенных клеток-предшественников в процессе регенерации костной ткани //Закл. отчет о НИР N гос.per. 79000672. -Hhb.N 0283.00715118 - 92 с. (с Л.А. Палиенко, A.A. Шрейнером, И.А. Имердишвили, Ю.ГТ. Балдиным, А.Н.Гайдамак, Н.П. Лепеховой). 62.Чрсскостныи остеосинтез аппаратом Илнзарова при лечении переломов длинных трубчатых костей // Закл. отчет о НИР N гос. per. . 78073744. - Инв. N 0282.0069182. - 254 с. (с С.И. Шведом,

B.М.Дякиным, Э.Х. Закировым, В.Д. Голиковым, Г.Е. Карагоднпым, В.А.Шигаревым).

63. Информативность радионзотопных и биохимических показателен минерального обмена в динамике репаративного остеогенеза // Закл.рукопись отчет о НИР N гос. per. 80043628. - Инв. N - 49 с. (с

• B.C. Богомягковым, Л.С. Кузнецовой, Мальцевой, Н.В. ! Офнцсровой, А.А.Свешниковым, В.Я. Шуршой).

64. Исследование роли Са-связывающего белка костной ткани в

, • репаративном остеогенсзе// Закл. отчет о НИР N гос.рсг.81095656-■ ' Инв.М 0284.0089641. - 47 с. (с Ю.С.Кочетковым, Л.С. Кузнецовой). .65. Исследование роли факторов поддержания тканевого гомеостаза системы кости и крови в репаративной регенерации при удлинении конечности по Илизарову // Закл. отчет по НИР N гос. per. - Инв. N

• 02.89.0 035417. - 79 с. (с Г.К. Архпповым, Ю.П. Балдиным, Ю.Н. Бахлыковым, А.Н. Дьячковым, С.Я. Зевенко, С.И. Изотовой, Ю.М.Ирьяновым, В.И. Калякиной, Л.С. Кузнецовой).

66. Разработка способа удлинения трубчатой кости, препарата, ускоряющего созревание дистракционного регенерата, функциональных биохимических исследований для оценки репаративного остеогенеза // Закл.отчет по НИР N гос.рсг. 08190082312. - Инв. N 02.9.20 008760. - 34 с. (с О.Л. Гребневой, С.Н. Луневой, Ю.П. Балдиным,

C.П.Изотовой, С.И. Ширалиевой, А.Н. Дьячковым).

67.Клннико-экспериментальная разработка способов регуляции роста по Илизарову // Закл. отчет о НИР N гос.рег.81095656. - Инв. N

0285.055649. - 81 с. (с В.И. Грачевой, В.И. Шевцовым. В.А. Щуровым. Н.П. Лепеховой, A.A. Свешниковым, C.B. Макаровым).

68. Влияние острой кровопотерн и действие эритропоэтическом сыворотки на репаративный остеогенез II Закл.отчет о НИР N гос.per. 01820075216. - Инв. N 0285.0055651. - 121 с. (с Ю.П.Балдиным, Т.А. Чепеленко, A.M. Чирковой. Ю.М. Ирьяновым, Ю.С. Кочеткйвым, С.П. Изотовой).

69. Математическое моделирование процессов, происходящих в организме детей с врожденными заболеваниями нижних конечностей при лечении их по Илизарову II Закл.отчет о НИР N гос.рег.0183006822. - Инв. N 0286.001085. (с Г.К. Архиповым, В.И. Грачевой, С.Г.Шерстневой, A.A. Чиппзубовым, Н.П. Лспсхобой. В.А. Щуровым. Т.А. Сколковой, И.В. Ивановой, АлМ. Пугачевым).