Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полипептидных факторов сыворотки крови на репаративный остеогенез

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние полипептидных факторов сыворотки крови на репаративный остеогенез"

На правах рукописи

Гребнева Ольга Леонидовна

ВЛИЯНИЕ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ФАКТОРОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА РЕПАРАТИВНЫЙ ОСТЕОГЕНЕЗ

03.00.04 — биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск—1998

Работа выполнена в Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г. А. Илизарова, г. Курган.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Ларионов Л. А." кандидат медицинский наук Десятниченко К. С,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Суханова Г. А* доктор медицинских наук, профессор Первеев В. Й.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, г. Новосибирск (630000, ул.Фрунзе, 17).

Защита диссертации состоится «_»_1998 г. на заседании диссертационного совета Д 084.28.01 Сибирского медицинского университета (634050, Томск, Московский тракт, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан «_>>__ 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Белобородова Э.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди причин, ведущих к инвалидности и снижению работоспособности, повреждения в опорно-двигательной системе занимают одно из первых мест, конкурируя по частоте с сердечно-сосудистыми и злокачественными заболеваниями. Известно, что 1300 человек на 10000 населения имеют врожденные и приобретенные нарушения в скелете, исправляемые, главным образом, оперативным путем (Г. А. Илизаров, JI. А. Попова, В. И. Шевцов, 1986). Разработка и внедрение способов коррекции врожденных и приобретенных нарушений опорно-двигательного аппарата посредством остеосинтеза аппаратами внешней фиксации совершили переворот в травматологии и ортопедии, сделали доступным лечение больных с практически любыми нозологическими формами повреждения опорно-двигательного аппарата. Однако остается актуальной задача сокращения продолжительности лечения. Поэтому активно ведется поиск фармакологических средств, способных оптимизировать течение репаративного остеогенеза. Одним из его направлений является работа по обоснованию применения сыворотки крови от доноров с активным остеогенезом.

Способностью стимулировать репаративный остеогенез обладает сыворотка крови животных с активным костеобразованием (П. В. Дунаев, Г. С. Соловьев, 1975; Г. С. Соловьев, 1983; В. И. Филимонов, Н. П. Лепехова, В. О. Недоспасов, 1977). Обнаружение связанной с костным матриксом остео-индуктивной активности белковой природы, названной морфогенетическим белком кости (M. R. Urist, В. S. Strates, 1971), послужило началом изучения обширного семейства местных факторов полипептидной природы, способных регулировать остеогенез (Е. Canalis, L. G. Raisz, 1979; L.W.Fisher, J.D.Termin, 1984, 1985; N. Loveridge, C. Farquharson, В. A. A. Scheven, 1990 и др.). С 1976 года в РНЦ «ВТО» проводятся экспериментальные исследования физико-химических свойств и биологических эффектов рострегулирую-щих факторов полипептидной природы, выделяемых из раствора неколлагено-вых белков диссоциативного экстракта костной ткани и обладающих свойствами местных факторов роста (Г. А. Илизаров, К. С. Десятниченко,

Ю. П. Балдин, С.П.Изотова, 1982; К. С. Десятниченко, Ю. П. Балдин, 1984; К. С. Десятничснко и др., 1985, 1989). Полученные результаты позволили предположить, что внеклеточный костный матрикс является биохроматогра-фической системой, способной в зависимости от поступающих сигналов депонировать и высвобождать полипептидные факторы роста (К. С. Десятниченко, Ю. П. Балдин, 1984). В нормальных условиях существования организма равновесие этих процессов обеспечивает состояние физиологического ремодели-рования костной ткани. При стрессовых ситуациях, в том числе при травме, операции, происходит деминерализация скелета, сопровождающаяся усиленным поступлением костных рострегулирующих факторов во внеклеточное пространство и, следовательно, в циркуляторное русло. Обнаруженные экспериментаторами свойства факторов роста костной ткани позволяют предположить, что остеогенный эффект сыворотки крови животных со скелетной травмой обусловлен усиленным выходом в кровь синтезированных костными клетками и десорбированных с внеклеточного костного матрикса полипептидных цитокшюв.

Ввиду перспективы сокращения сроков лечения ортопедо-травмато-логических больных с помощью фармакологической коррекции посредством компонентов, выделяемых из сыворотки крови, представляется достаточно актуальной работа, имевшая следующую цель исследования.

Цель исследования. Изучить влияние гуморальных полипептидных компонентов, идентичных по физико-химическим свойствам костным ростре-гулирующим факторам, на репаративный остеогенсз.

Задачи исследования

1. Выделить из плазмы крови белковые фракции с физико химическими свойствами костных рострегулирующих факторов и изучить динамику их концентраций в плазме крови на этапах дистракционного остеосин геза.

2. Исследовать влияние белковых фракций из плазмы крови животных с активным остеогенезом на процесс возмещения костных дырчатых дефектов у реципиентов этих фракций.

3. Изучить влияние фракций из плазмы крови и костной ткани на биохимические и гематологические показатели интактных реципиентов.

4. Исследовать возможность стимуляции минерализации дистракцион-ного регенерата посредством выделенного из плазмы крови материала.

Новизна исследования. Доказано, что остеогенная активность сыворотки крови животных и человека, появляющаяся в период активного остеоге-неза, связана с веществами белковой природы, которые обладают физико-химическими и физиологическими свойствами рострегулирующих факторов, депонируемых костной тканью. Доказана возможность стимуляции процессов созревания новообразующейся костной ткани посредством гуморальных регуляторов. Обнаруженный феномен согласуется с концепцией о поступлении рострегулирующих факторов, депонируемых костной тканью, в циркулятор-ное русло.

Практическая значимость работы и внедрение результатов исследования. Выявленное свойство плазмы крови и ее отдельных фракций активировать костеобразование указывает на целесообразность применения этих средств в целях стимуляции остеорепарации у их реципиентов, в частности, для ускорения созревания дистракционного регенерата.

В ходе выполнения работы разработаны приемы выделения и тестирования биологически активных белковых фракций из костной ткани и сыворотки крови, приведенные в методических рекомендациях «Выделение и биотестирование костных рострегулирующих факторов» (Курган, 1990), в отчетах по научно-исследовательским работам № 01.90.30005861 «Исследование механизмов регуляции и способов управления костеобразованием при удлинении костей по Илизарову» и № 08190082312 «Разработка способа удлинения трубчатой кости, препарата, ускоряющего созревание дистракционного регенерата, функциональных биохимических исследований для оценки репаративного ос-теогенеза», выполняемой по договору, заключенному с МЗ РФ.

Предложен способ стимуляции репаративного остеогенеза. Заявка №98105940/20 (005978); приоритетная справка от 26.03.98 (в соавторстве с К. С. Десятниченко, Л. А. Ларионовым, С. А. Ерофеевым, М. А. Ковинька).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Метод Илизарова — достижения и перспективы», посвященной памяти академика Г. А. Илизарова, Курган, 1993; VIII, X школах по биологии опорно-двигательного аппарата, Киев, 1990, Харьков, 1994; научно-итоговых сессиях Казанского НИИТО, Казань, 1990, 1994; Международной конференции «Перспективные направления чрескостного остеосшггеза в ре-конструктивно-восстановительной хирургии: теория и практика» и Симпозиума «Регенерация и рост тканей в условиях дозированного растяжения», Курган, 1996; XXVII, XXVIII, XXVIV научно-практических конференциях врачей Курганской области, Курган, 1994, 1995, 1996, 1997; заседаниях научного общества ортопедов-травматологов, Курган, 1992, 1996, 1998.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы. Изложена на 90 страницах машинописного текста, вкшочает 20 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 153 работы, в том числе 54 — отечественные.

Диссертационная работа выполнена по плану НИР Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г. А. Илизарова (№ государственной регистрации 01.09.30005861).

Положения, выносимые на защиту

1. В период активного репаративного остеогенеза, стимулированного дистракцией, в сыворотке крови появляются вещества полипептндной природы, способные стимулировать остеогенез и кроветворение, модулирующие состав внутренней среды у их реципиентов.

2. Белки сыворотки крови, стимулирующие репаративный остеогенез, по ряду физико-химических и физиологических свойств аналогичны рострегули-рующим факторам, депонируемым костной тканыо.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положен анализ результатов исследований, выполненных на 51 беспородной собаке в возрасте от 1 года до 3 лет с массой 10—30 кг и 130 мышах линии СВА. Исходя из задач исследования, материал был распределен па четыре серии.

В первой серии опытов, состоящей из двух групп, были выделены и охарактеризованы белковые фракции из костной ткани интактных собак и плазмы крови собак на этапах чрескостного дистракционного остеосинтеза (ЧДО) по Илизарову. В средней трети голени проводили остеотомию берцовых костей. Дозированную дистракцию костных фрагментов начинали на 8 сутки после операции темпом 0,25 мм 3 раза в сутки. Дистракпия длилась 42 суток. Величина удлинения составляла 30 мм. Период фиксации длился до 84 суток (рис. 1). Исследование выделенных фракций проводилось с помощью гель-проникающей и ионообменной хроматографии. Содержание белка во фракциях, выделенных из венозной крови собак, определяли биуретовым методом.

I 2

Рис. 1. Схемы: 1 — удлинения трубчатой кости посредством чрескостного дистракционного остеосинтеза, 2 — создания дырчатых дефектов в метафизе

трубчатой кости

Во второй серии экспериментов изучали влияние белковых фракций, выделенных из плазмы крови собак-доноров, на репаративный остеогенез при замещении дырчатых дефектов у 34 собак-реципиентов (5 групп опытов). Во время операции по формированию дырчатых дефектов на медиальной поверхности проксимального метафиза болыиеберцовой кости собак создавали три дефекта корковой пластинки путем ее просверливания спицей при помощи электродрели. Для получения стандартных дефектов корковой пластинки с однотипным их расположением в метафизе использовался специальный кондуктор, представляющий собой металлическую пластинку с тремя отверстиями (рис. 1). На 3-й сутки после операции внутривенно вводили: физиологический раствор (1-я группа), плазму крови интактной собаки (2-я группа), плазму крови собаки в период удлинения кости (3-я группа), стерильные растворы фракции С1 и С2, выделенные из плазмы крови собаки в период удлинения кости (4-я и 5-я группы соответственно). Наблюдение за животными производилось до 84 суток. Оценка активности остеогенеза осуществлялась гистологическими и рентгенологическими методами исследования с количественной денситометрией рентгеновских снимков.

В третьей серии опытов на 130 мышах линии СВА изучали влияние белковых фракций, выделенных из плазмы крови собак в период дистракции на биохимические (5 групп опытов по 20 животных в группе) и гематологические показатели (5 групп опытов по 6 животных). Контрольной группе животных подкожно производилась инъекция 0,15 М раствора NaCl; экспериментальным группам — инъекции костных фракций и фракций из плазмы крови. До инъецирования и 48 ч спустя у животных исследовали периферическую кровь на количество ретикулоцитов, эритроцитов, лейкоцитов в единице объема и формулу белой крови. После эвтаназии через 2 суток после введения готовили и окрашивали по Паппенгейму мазки-отпечатки селезенки и костного мозга метафизов бедренной кости животных. Водородный показатель и со-

держание ионизированного кальция крови из хвостовой вены животных определяли до инъецирования и 24 ч спустя. Остальные биохимические показатели определяли в сыворотке крови, собранной после декашггации животных, которую проводили через 24 ч после инъекции. Общее содержание кальция, магния, активности щелочной и кислой фосфатаз в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов ЬаСЬета (Чехия). Определение активности термолабильной щелочной фосфатазы проводили после инактивации при 56 °С. Концентрацию ионизированного кальция и рН определяли с помощью микроанализатора ОР-270 фирмы Кас1е11а5, Венгрия. Определяли концентрацию неорганических фосфатов (Г. А. Грибанов, Г. А. Базанов, 1976), фракций гидро-ксипролина (1. Вегтоап, II. Ьох1у, 1963) в модификации (Р. И. Лифшиц, И. А. Волчегорский, В. Е. Рябинин и др., 1988).

В четвертой серии опытов изучали влияние местной инъекции композиции аутологичных белковых фракций из сыворотки крови на скорость созревания дистракщюнного регенерата в костный при удлинении голени по Илизарову у 9 беспородных собак (2 группы опытов). Контрольной (5 собак) и опытной (4 собаки) группам животных на 1-е - 3-й сутки периода фиксации в срединную соединительнотканную прослойку костного регенерата вводили стерильные растворы изотонического хлорида натрия и композиции белковых фракций соответственно. Проводили экспертизу рентгеновских снимков по 5-балльной шкале (А. А. Шрейнер, 1997), — включавшей характеристику величины поперечника регенерата, высоты соединительнотканной прослойки, ее пересечения и замещения трабекулярными тенями, формирования корковой пластинки и костномозговой полости и оптической плотности регенерата, — в сроки 28 суток дистракции и 3 недели фиксации.

Выделение белковых фракций из диссоциативного экстракта неколлаге-новых белков костной ткани интактных собак и фракций из плазмы крови собак с удлинением конечности по Илизарову проводили по методике получения

Диссоциативный экстракт неколлагеновых белков костной ткани I.-

Плазма крови

Осадок IICA

осаждение сульфатом аммония

Осадок ПСА

Белки с Mr 20-30 кД 1 гель-проникающая хроматография Ьелкн с Mr 20-30 кД

К1 (кислой природы) К2 (нейтральной и основной природы) анионообмеиная хроматография С1 (кислой природы) С2 (нейтральной и основной природы)

Рис. 2. Схема выделения белковых фракций костных рострегулиругощих факторов, описанной ранее (К. С. Десятниченко и др., 1990), в модификации (рис. 2). Растворы белков, высаливаемые сульфатом аммония в диапазоне насыщения от 33 до 50% с относительной молекулярной массой 20-30 кД, определяемой с помощью гель-проникающей хроматографии на колонке с носителем Toyopearl HW-55 (Toyosoda, Япония), подвергали анионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (Pharmacia, Швеция), после чего выделяли две фракции: адсорбирующуюся к анионообменнику (фракции: из костной ткани — К1 и из плазмы крови — С1) и не адсорбирующуюся (соответственно К2 и С2). Композицию фракций С1 и С2, тестируемую в экспериментах по возможности стимулирования созревания дистракционного регенерата, получали посредством той же последовательности процедур без этапа ионообменной хроматографии. После диализа и лиофилыюго высушивания фракции стерилизовали с использованием гамма-излучения.

Полученные компоненты плазмы крови растворяли в стерильном физиологическом растворе и вводили в срединную соединительнотканную прослойку костного регенерата в 1-е - 3-й сутки периода фиксации.

Полученные данные обрабатывали математическими методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ранее проведенных экспериментах было обнаружено, что ряд костных ростриулирующнх факторов проявлял стимулирующий эффект на репаратив-ный остеогенез. Поэтому для выделения фракций из плазмы крови с предполагаемой остеопоэтической активностью мы применили те же этапы фракционирования, которые были использованы для очистки активных в отношении остеогенеза костных фракций (К. С. Десятниченко и др., 1990). Таким образом, были получены сывороточные фракции С1 и С2, являющиеся аналогами фракций К1 и К2 из диссоциативного экстракта костной ткани соответственно. Фракции К1 и К2 представляли собой композицию костных рострегу-лирукмцих факторов, стимулировавших репаративный остеогенез в ранее проведенных экспериментах по возмещению дефекта малоберцовой кости кролика (К. С. Десятниченко и др., 1989).

Данные, полученные нами в первой серии опытов, показали, что в сыворотке крови содержатся биологически активные вещества, которые по ряду физико-химических свойств — высаливаемости, относительной молекулярной массе, способности адсорбироваться на ионообменниках, — аналогичны не-коллагеновым белкам зрелой костной ткани. Чрескостный днстракпионный остеосинтез влияет на количественные характеристики белка, содержащегося во фракциях С1 и С2, отличающихся сродством к анионообменнику (рис. 3). Максимальная концентрация фракщш С1 в сыворотке крови наблюдалась во второй половине дистракции и первого месяца фиксации. Фракция С2 была максимальной в первой половине дистракции. К концу эксперимента (3 месяца фиксации) концентрация фракции С1 оставалась повышенной, тогда как С2 — пониженной по отношению к доопсрационному периоду.

Данные, полученные во второй серии опытов, — по возмещению костных дырчатых дефектов у собак, — показали, что фракция С1 из плазмы крови стимулирует процессы репаративного остеогенеза (рис. 4) с выраженной стадией резорбции (рис. 5), как и тестированные ранее идентичные ей по физико-химическим свойствам фракции, выделенные из диссоциативного экстракта костной ткани.

5 4

и2 1 О

Рис.З. Содержание фращий С1 и С2 в сыворотке крови собак на этапах ЧДО. Д/о - до операции; Д1 - 1-я половина дистракции (Д); Д2 - 2-я половина Д; Ф1 - 1-й месяц фиксации (Ф); Ф2 - 2-й месяц Ф; ФЗ - 3-й месяц Ф. * отмечены значения, отличающиеся от исходных с уровнем достоверности не менее 95%.

Фракция С2 также обладает стимулирующим влиянием на репаративное костеобразоваиие (рис. 4), но регенерация после инъекции этой фракции выраженной фазой резорбции ие обладает (рис. 5), Такое же действие на репа-ративный остеогенез в ранее проведенных экспериментах оказали фракции из костной ткани с аналогичными физико-химическими свойствами (К. С. Десят-ниченко и др., 1989). Эффект от введения цельной плазмы крови от животных-доноров, взятой в период удлинения кости, подтвердил появление остеогенной активности в такой сыворотке крови, обнаруженное ранее рядом исследователей (Н. П. Лепсхова, 1977; В.И.Филимонов, Н. П. Лепехова, В. О. Недо-спасов, 1977).

С целью выяснения характера влияния фракций из костной ткани (К1 и К2) и плазмы крови (С1 и С2) на показатели обмена компонентов минеральной и органической фаз костной ткани в третьей серии экспериментов анализировали содержание фракций гидроксипролина, электролитов (общего и ионизированного кальция, магния, фосфата, хлорида), активность щелочной и кислой фосфатаз и значение водородного показателя в сыворотке крови ин-тактных мышей через 24 ч после инъекций тестируемых фракций.

Рис.4. Оптическая плотность цешралыюй часш сгощевого дефекта у животных после инъекции: 0,15 М №С1 (А), плазмы интактного животного (Б), плазмы животного на этапе дистракции (В), фракции С1 (Г), фракции С2 (Д): 1 - в день операции; 2-14 сут после операдпи; 3-28 сут после операции; 4-42 сут после операции; 5-56 сут после операции; 6-70 сут после операции; 7-84 сут поме операщш.

-♦Л

еч Г

Ь

-&-В

-ж-д

1 2 3 4 5 6 7 Рнс.5. Диаметр спицевого дефекта у животных после инъекции: 0,15 М №С1 (А), плазмы интактного животного (Б), плазмы животного на этапе дистракции (В), фракции С1 (Г), фракции С2 (Д): 1 - в день операции; 2-14 сут после операции; 3 -28 сут после операции; 4 - 42 сут после операции; 5-56 сут после операции; 6-70 сут после операции; 7-84 сут после операции.

К1 и С1 повышали содержание общего, белкового и свободного гидро-ксипролина в сыворотке крови мышей через 24 ч после инъекции (рис. 6), что свидетельствует о повышении скорости коллагенолиза (П. Н. Шарасв и др., 1997). Мы полагаем, что коллагенолиз происходит именно в костной ткани, в которой активируются процессы резорбции иод действием этих фракций.

мкм оль/л

120 1001 80 60 40-1 20 0

/Г

□ сг шпг

□ БГ

1

5

Рис.С. Содержание фракций шдроксипролина: свободного (СГ), пептидносвязашюго (Г1Г) и бслковосвязанного (БГ) в сыворотке крови мышей после инъекций 0,15 М №С1 (1), фракций К1 (2), К2 (3), С1 (4) и С2 (5).

* Результаты отличаются от контрольных с р„ < 0,05.

К2 и С2 (не сорбируемые на анионообменнике), напротив, снижали концентрацию свободного гидроксипролина, но при этом наблюдалось увеличение отношения «пептидносвязанный гидроксипролин / свободный гидрокси-пролин» в сыворотке крови мышей, что свидетельствует об угнетении коллагенолиза и активации фибриллогенеза в соединительной ткани (П. Н. Шараев и др., 1997). После инъекции С1 было обнаружено увеличение активности щелочной фосфатазы за счет ее термолабильной фракции (ТЛЩФ) (рис. 7). Известно, что ТЛЩФ является маркером активности остеобластов. Однако обнаруженное повышение активности этого изоэнзима, скорее всего, обусловлено

не интенсификацией его синтеза или секреции, а его выходом из компартмен-тов костного матрикса вследствие резорбции.

1501

100

% от контрольных значений

1 2 3

Рис.7. Влияние фракций С1 и С2 на активность ферментов в сыворотке крови мышей: 1 - щелочная фосфатаза; 2 -термолабильная щелочная фосфатаза; 3 - тартрат-резистентная кислая фосфатаза. * Результаты отличаются от контрольных с ри < 0,05.

Таким образом, К1 и С1 повышали скорость коллагенолиза, тогда как К2 и С2, напротив, угнетали деградацию коллагена и вызывали активацию фибриллогенеза в соединительной ткани.

Было обнаружено сходство во влиянии фракций из костной ткани и плазмы крови, обладающих общими физико-химическими свойствами, на эри-тропоэз (рис. 8). Фракции К1 и С1 снижали число ретикулоцитов в периферической крови, в то время как фракции С2 и К2, напротив, увеличивали количество ретикулоцитов в периферической крови и эритроидных клеток в селезенке. Эти данные согласуются с результатами проведенных в РНЦ «ВТО» экспериментов, в которых было обнаружено, что фракция белка из крови людей с интактным скелетом, обладающая физико-химическими свойствами стимуляторов остеогенеза и кроветворения из костной ткани, стимулирует ретикуло-цитоз при парэнтеральном введении белым мышам существенно меньше, чем фракция, выделенная из крови больных с переломами в первые 3 недели после травмы. Этот тест был рекомендован вследствие высокой информативности для оценки активности репаративного остеогенеза (Ю. П. Балдин, К. С. Десят-ниченко, 1991).

% от контрольных значений

□ ЭЦПК

Рис.8. Влияние инъекции 0,15 МКаС1 (1), фракции К1(2), К2 (3), С1 (4) и С2 (5) на показатели кроветворения у мышей: ЭЦПК - эршроциты периферической крови, РЦПК - ретикулоцигы периферической крови, ЭКС - эритроидные клетки селезенки. * Резукьтагы отличаются от контрольных с рц < 0,05.

Результаты, полученные в первых трех сериях экспериментов, таким образом, показали, что фракции, выделенные из различных источников: плазмы крови и диссоциативного экстракта костной ткани, — но обладающие одинаковыми физико-химическими свойствами, аналогичны по ряду эффектов на репаративный остеогенез и гемопоэз. С1 и К1 стимулировали репаративный остсогенез после фазы резорбции и ингибировали эритропоэз; С2 и К2 стимулировали остеогенез без фазы резорбции и стимулировали эритропоэз. В совокупности эти данные подтверждают гипотезу о роли десорбированных с мат-рикса и минеральной фазы костной ткани неколлагеновых белков в появлении остеогенной активности в гуморальном русле человека и животных со скелетной травмой.

Исходя из характерных признаков влияния фракций С1 и С2 из плазмы крови на эти процессы, был поставлен эксперимент по исследованию воздействия композиции этих фракций на скорость созревания дистракциониого регенерата при удлинении голени по Илизарову у собак.

Экспертиза рентгеновских снимков с использованием балльной оценки активности остеогенеза показала, что введение в соединительнотканную прослойку дистракционного регенерата композиции из белковых фракций С1 и С2 из плазмы крови, взятой в период дистракции, стимулирует минерализацию регенерата, что позволяет уменьшить срок фиксации при удлинении конечности по Илизарову у экспериментальных животных (рис. 9).

Рис.9. Оценка состояния дистракционного регенерата в конце дистракции (1) и после 3 недель фиксации (2). * Результат отличается от контрольного с ри<0,05.

Таким образом, анализ результатов проведенных экспериментов доказывает, что в период активного репаративного остеогенеза, стимулированного дистракцией, в сыворотке крови животных появляются биологически активные вещества, способные стимулировать остеогенез и кроветворение и модулировать состав внутренней среды у ее реципиентов, что подтверждает гипотезу о природе остеогешюго начала в сыворотке крови. Эти вещества по ряду физико-химических и биологических свойств аналогичны костным рострегу-лирующим факторам и могут быть использованы для оптимизации репаративного процесса при лечении больных со скелетной травмой.

ВЫВОДЫ

1. Во время репаративного остеогенеза, стимулированного дистракцией при осуществлении чрескостного остеосингеза по Илизарову, в сыворотке крови появляются биологически активные вещества, по ряду физико-химических свойств - высаливаемости, относительной молекулярной массе, сорби-руемости на ионообменниках, — а также способности модулировать костеоб-разование и гемопоэз, аналогичные неколлагеновым белкам зрелой костной ткани.

2. Выделены две фракции белков из сыворотки крови — С1 и С2, — обладающие высаливаемостыо при 33—50%-ной концентрации сульфата аммония и относительной молекулярной массой 20—30 кД; из них С1 адсорбируется на ДЭАЭ-сефадексе А-25, С2 — не адсорбируется. Эти белки по указанным физико-химическим свойствам аналогичны фракциям К1 и К2 диссоциативного экстракта костной ткани.

3. Белки сыворотки крови и костной ткани, идентичные по кислотно-основным свойствам, проявляют сходство в своем биологическом действии: стимулировать репаративный остеогенез после предварительной фазы резорбции (С1 и К1) или без нее (С2 и К2), стимулировать (С2 и К2) или ингибиро-вать эритропоэз (С1 и К1).

4. Действие фракции С1 проявляется в активации коллагенолиза и повышении активности термолабильной щелочной фосфатазы, а фракции С2 — в стимуляции коллагенообразования и снижении активности тартрат-резис-тентпой кислой фосфатазы — маркерного фермента остеокластов.

5. Совокупное влияние фракций С1 и С2 при их введении в соединительнотканную прослойку дистракционного регенерата в период фиксации чрескостного дистракционного остеосинтеза реализуется в стимуляции минерализации и может быть использовано для сокращения сроков лечения при удлинении трубчатых костей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О механизме сопряжения резорбции и новообразования костной ткани на уровне действия местных рострегуляирующих факторов: Современные аспекты чрескостного остеосинтеза по Илизарову // Матер, науч. конф. — Казань. — 1991. — С. 158-159 (с К. С. Десятниченко, Ю. П. Балдиным, А. Н. Дьячковым, С. П. Изотовой, С. Н. Луневой, С. И. Ширалиевой).

2. Моделирование на животных процесса управления остеогенезом и кроветворением факторами роста, депонируемыми костной тканью: Тез. докл. I Междунар. симп. РАЛАН «Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях». — Москва, 1992 //Ланималогия. — 1993. — № 1. — С. 52-53 (с К. С. Десятниченко, Ю. П. Балдиным, А. Н. Дьячковым, С. Г1. Изотовой, А. А. Ларионовым, С. Н. Луневой, С. И. Ширалиевой).

3. О возможности ускорения созревания дистракционного регенерата кости фармакологическими средствами: Тез. докл. IX школы по биологии опорно-двиг. аппарата // Ортопедия, травматология, протезир. — 1994. — № 4. — С. 73 (с К. С. Десятниченко, 10. П. Балдиным, А. Н. Дьячковым, А. А. Шрейнером, С. П. Изотовой, С. Н. Луневой, Е. Л. Матвеевой).

4. Пути повышения информативности лабораторного контроля за течением репаративного процесса в клинике травматологии и ортопедии // Трав-матол., ортопедия России — 1994. — № 2. — С. 106-109 (с К. С. Десятниченко, Ю. П. Балдиным, С. П. Изотовой, Л. С. Кузнецовой, С. Н. Луневой, Е. Л. Матвеевой, С. И. Алиевой).

5. Конструирование и экспериментальная апробация фармпрепаратов из костной ткани / Гений ортопедии. — 1995. — № 4. — С. 6-12 (с В. И. Шевцовым, К. С. Десятниченко, О. Б. Устюжаниной, А. Н. Дьячковым, А. А. Ла-

рионовым, С. Н. Луневой, С. Н. Изотовой, Н. К. Махниной, С. И. Алиевой, О. Н. Фадеевой).

6. Влияние гуморальных факторов, высвобождающихся при удлинении кости, на репаративный остеогенез / Материалы XXVIII юбилейной областной научпо-пракгической конференции, посвященной 50-летию Курганской областной клинической больницы. — Курган, 1996. — С. 183-185 (с К. С. Десят-ниченко, А. А. Ларионовым).

7. Выделение из сыворотки крови фракций, стимулирующих остеогенез: Актуальш питания бюлогп опорно-рухового аппарата // Материалы VIII школы стран СНГ. — Киев, 1996. — С. 29. (с К. С. Десятниченко, А. А. Ларионовым, М. А. Ковинька).

8. Конструирование фармпрепаратов из костной ткапи для коррекции осложнений при вмешательствах на скелете / Тезисы докладов международной юбилейной научно-практической конференции и симпозиума. // Гений ортопедии. — 1996. — № 2-3. — С. 130 (с К. С. Десятниченко, О. Б. Устюжа-ниной, С. Н. Луневой).

9. Некоторые итоги биохимических исследований в РНЦ «ВТО» за 20 лет / Тезисы докладов международной юбилейной научно-практической конференции и симпозиума. // Гений ортопедии. — 1996. — № 2-3. — С. 25-26 (с К. С. Десятниченко, Л. С. Кузнецовой, Л. И. Грачевой, С. Н. Луневой, Е. JI. Матвеевой, Т. В. Русовой, О. Н. Мокеевой, М. А. Ковинька).

10. Костные рострегулирующие факторы — длиннодистаитные гуморальные регуляторы остсогснеза и кроветворения // Актуальные вопросы травматологии и ортопедии. Сборник научных работ. — Уральская гос. мед. академия. — Екатеринбург, 1997. — С. 230-236 (с А.А.Ларионовым, К. С. Десятниченко, С. П. Изотовой, С. И. Алиевой, С. Н. Луневой, М. А. Ковинька).

11. Костные рострегулирующие факторы — гуморальные регуляторы остеогенеза и кроветворен™ // Гений ортопедии. — 1997. — № 4. — С. 15-19 (с К. С. Десятниченко, А. А. Ларионовым, С. П. Изотовой, С. И. Алиевой, М. А. Ковинька, М. А. Кузнецовой, О. Б. Устюжаниной)-