Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние биологически активного препарата "Плазмарал" на регенерацию костной ткани в эксперименте

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сигарева, Наталия Александровна, Новосибирск

61-- 99 -3 /¿/о /~ у

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Сигарева Наталия Александровна

ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПРЕПАРАТА «ПЛАЗМАРАЛ» НА РЕГЕНЕРАЦИЮ КОСТНОЙ ТКАНИ В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Докт. биол. наук, проф. Р.И. Айзман Засл. деят. науки РФ, докт. мед. наук,

проф. А.М. Зайдман

Новосибирск -1999

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. РЕГЕНЕРАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБЫ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ (обзор литературы) 12

1.1. Виды регенерации костной ткани 12

1.2. Способы регуляции регенераторных способностей костной ткани 19

1.3. Роль полипептидных факторов роста в регуляции регенераторных способностей костной ткани 27

1.4. Остеоиндуктивные препараты, содержащие

пол и пептидные факторы роста 34

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38

2.1. Материал исследования и экспериментальные модели 38

2.2. Методы исследования 41

2.2.1. Морфометрические методы 41

2.2.2. Биохимические методы 42

2.2.3. Морфогистохимические методы 43 Глава 3. ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «ПЛАЗМАРАЛ»

НА ПРОЦЕСС РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ БЕДРЕННОЙ КОСТИ

(результаты собственных исследований 44

3.1. Характеристика функциональной активности регенерата в области неполного дефекта диафиза бедренной кости при введении препарата «Плазмарал» 44

3.2.Морфогистохимические особенности регенерации неполною дефекта бедренной кости при введении препарата «Плазмарата» 56

3.3. Особенности регенерации при экспериментальных переломах бедренной кости 68 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 85 ВЫВОДЫ 93 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

И РЕКОМЕНДАЦИИ 94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95

СПИСОК АББРЕВИАТУР

аРНК— активаторная рибонуклеиновая кислота

БАВ - биологически активное вещество

ГАГ — гликозаминогликан

ДКМ - деминерализованный костный матрикс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФР — ннсулинподобный фактор роста

КОКф—колониеобразующие фибробластические клетки

МБК — морфогенетический белок кости

ОДА — опорно-двигательный аппарат

ПТГ - паратиреоидный гормон

ПФО - полипептндные факторы остеогенеза

ПФР - полипептцдные факторы роста

РНК — рибонуклеиновая кислота

СБ - связывающие белки

СТГ — соматотропный гормон

ТФР — трансформирующий фактор роста

ФР— факторы роста

ФРТП- фактор роста тромбоцитарного происхождения

ФРФ- фактор роста фибробластов

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭФР - эиидермальный фактор р оста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Проблема регенерации костной ткани после повреждения является одной из древнейших в медико-биологической науке. Несмотря на многовековую историю, она остается далеко не разрешенной и до сих пор достаточно актуальной в связи с тем, что травматические повреждения костей привод яг часто к ин-валидизации пострадавших, у мелких домашних животных - к неоправданной гибели, а у сельскохозяйственных животных - к выбраковке.

Многолетняя практика лечения костных повреждений показала, что кость обладает способностью к регенерации после повреждения с дальнейшим восстановлением формы и функции (Каплан A.B., Чернявский В.А., 1967; Родионова Н.В., 1980; Хэм А., Кормак Д., 1983; Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996).

В течение многих лет учеными и практическими врачами проводится поиск оптимальных условий для осуществления репаративной регенерации. Прежде сущность врачебной медицины сводилась к созданию условий, благоприятных проявлению лишь компенсаторных возможностей кости (Маркс В.О., 1962). Следующим этапом стало применение различных средств фиксации костных фрагментов, широкое использование способов, нормализующих кровоснабжение костной раны (трансплантация богато снабжаемых кровью мышц и др.), кроме того, средств, повышающих общий обмен веществ в организме (анаболические стероиды) (Виноградова Т.П., Лаврищева Г.И., 1974; Илизаров Г.А., Попова Л.А., Шевцов В.И., 1986).

Однако использование этих средств в полной мере не решило проблему оптимизации репаративной регенерации. Данные факты подтверждают то, что лечение повреждений костной ткани остается до настоящего времени одной из важнейших проблем в медико-биологической науке.

В последние десятилетия в связи с ухудшением экологической обстановки, увеличением транспортных средств на дорогах, несбалансированным питанием возросло количество повреждений и патологий опорно-двигательного аппарата (переломы, остеопороз, опухоли кости и др.) (Reed B.Y. et al., 1993; Франке Ю., Рунге Г., 1995). При этом отмечается снижение регенераторных способностей костной ткани и, следовательно, интенсивности регенераторных процессов (Родионова Н.В., 1989; Северин М.В. с соавт., 1993). В связи с этим оправдан поиск фармакологических средств, способных оптимизировать течение репа-ративного остеогенеза.

Одним из перспективных и новых направлений коррекции процесса регенерации является применение биологически активных полипептидных факторов роста (Десягниченко К.С. с соавт., 1989; Новохат-ский A.C., 1994; Lind М., 1998). Накопленный за последние годы материал свидетельствует о том, что полипептидные факторы роста (ПФР) регулируют процессы остеогенеза и резорбции кости (Сумароков Д.Д., Гулкин Д.В., 1987; Щепеткин И.А.,1994; Wergedal I.E. et al., 1990; Trippel S.B. et al., 1997). В настоящее время разработаны способы очистки ПФР из тканей животных, а также методы получения рекомби-нантных аналогов этих белков (Соловьев Г.С., Колпаков В.В., 1973; Suttie Т.М., Fennessy P.F., 1985). Это делает реальным создание компо-

зиционных материалов с остеоиндуктивными свойствами для лечения травм кости и дефектов скелета.

Представителем данной группы препаратов является «ПЛАЗМАРАЛ» (автор препарата - Елыкамов В.А., 1994, г.Барнаул), полученный из плазмы крови маралов в период активного роста пантов (гигиенический сертификат Государственного комитета санитарно-эпидемиологического контроля РФ №1-П/11-178 от 23,02,94). «Плаз-марал» является белковым препаратом и содержит некоторые ПФР, такие как инсулиноподобный фактор роста - 1 (ИФР-1), эпидермальный фактор роста (ЭФР), которые, по экспериментальным и клиническим данным, активизируют процессы регенерации костнй ткани (Десягни-ченко К.С. с соавт., 1990; Rodau G.A., 1991; Lind М., 1998). Однако механизм действия и способ воздействия этого биологически активного препарата на регенерацию костной ткани остается недостаточно выясненным.

В связи с этим перспективным представляется исследование влияния препарата «Плазмарал», содержащего полипептидные факторы роста на остеогенез при экспериментальном моделировании различных повреждений трубчатой кости животных с целью оптимизации процессов репарации и выяснения механизма действия препарата «Плазма-рал».

Цель исследования. Выявить влияние биологически активного препарата «Плазмарал» на морфофункциональное состояние костной ткани при регенерации на экспериментальных моделях различных повреждений трубчатой кости.

Задачи исследования

1. Исследовать влияние препарата «Плазмарал», содержащего полипептидные факторы роста, на регенераторные способности костной ткани: пролиферацию, дифференцировку клеток остеобластического рада и репродукцию компонентов костного матрикса в зоне повреждения.

2. Изучить динамику фосфорно-кальциевого обмена, активность щелочной фосфатазы, содержание гидроксипролина в сыворотке крови экспериментальных животных.

3. Исследовать влияние препарата «Плазмарал» на процесс регенерации костной ткани при неполном дефекте диафиза бедренной кости без пластического замещения в эксперименте.

4. Изучить влияние препарата «Плазмарал» на процесс регенерации костной ткани при экспериментальных переломах бедра.

Новизна исследования. В результате развернутых морфофунк-циональных и биохимических исследований были установлены особенности регенерации при различных повреждениях костной ткани при введении биологически активного препарата «Плазмарал». Было показано, что препарат «Плазмарал» стимулирует процессы репаративной регенерации костной ткани и способствует сокращению сроков заживления на 10-14 дней в эксперименте. Подтверждены остеоиндуктивные свойства препарата «Плазмарал», содержащего ПФР, которые проявлялись в интенсификации митотической и метаболической активности клеток остеобластического рада в зонах повреждений. Обнаруженный феномен согласуется с концепцией о роли полипептидных рострегули-рующих факторов в репаративной регенерации костной ткани. Доказа-

на эффективность использования биологически активного препарата «Плазмарал» в целях оптимизации регенераторных процессов при различных видах костных травм и целесообразность его применения в клинической практике.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты в значительной степени дополняют и уточняют имеющиеся сведения о роли полипептидных факторов роста (ИФР-1; ЭФР) в регенерации костной ткани и раскрывают особенности репаративного остеогенеза при комплексном использовании ИФР-1 и ЭФР в составе препарата «Плазмарал». Выявленная способность «Плазмарала» активизировать костеобразование указывает на целесообразность применения этого биологически активного препарата в целях стимуляции ос-теорепарации в клинической практике. Фактический материал, изложенный в диссертации, может быть использован в учебном процессе на медицинских, ветеринарных, биологических факультетах.

Положения, выносимые на защиту

1. Препарат «Плазмарал», содержащий полипептидные факторы роста, активизирует процессы пролиферации, дифференцировки и синтетическую активность клеток остеобластического ряда в зоне повреждения бедренной кости в эксперименте.

2. При введении биологически активного препарата «Плазмарал» животным с моделями повреждений бедренной кости наблюдается стимуляция регенераторных процессов костной ткани и сокращение сроков заживления по сравнению с контролем.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Проблемы клинической и экперименталь-ной лимфологии», Новосибирск, 1996; на III Международном симпозиуме «Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма», Чолпон-Ата, 1997; на симпозиуме-семинаре «Диагностика, лечение и профилактика осте огтороза в ортопедии и травматологии», Санкт-Петербург, 1998; на II научно-практической конференции « Актуальные вопросы ветеринарии», Новосибирский государственный аграрный университет, 1999; на 60-ой сессии студентов и молодых ученых, Новосибирский медицинский институт, 1999.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику учебной работы кафедры анатомии, физиологии и валеологии естественно-географического факультета Новосибирского государственного педагогического университета, в учебный процесс кафедры патологической анатомии и кафедры топографической анатомии Новосибирского медицинского института, в лекционный курс гистологии, патологической анатомии, фармакологии факультета ветеринарной медицины Новосибирского Государственного Аграрного университета и в лечебную практику ветеринарной клиники при НГАУ.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материала и методов исследования, трех разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 150 работ (из 1шх 76 - отечественных, 74 - зарубежных); изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 6 таблицами.

Данная работа выполнялась в рамках темы 017: «Пути совершенствования репаративного остеогенеза» (номер государственной регистрации 01.9.70001430).

ГЛАВА 1. РЕГЕНЕРАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ И СПОСОБЫ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ (обзор литературы)

1.1. Виды регенерации костной ткани

Процесс регенерации костной ткани издавна является предметом подробных и тщательных исследований. Несмотря на большое количество работ, посвященных регенераторным процессам костной ткани, на соответствующие успехи экспериментальной и клинической медицины, ряд вопросов еще далек от окончательного разрешения. К их числу относятся вопросы, имеющие принципиальное значение для понимания процессов стимуляции регенераторных способностей костной ткани.

Регенерация костной ткани может быть физиологической и репара-тивной.

Физиологическая регенерация предполагает постоянное ремодели-рование костной ткани в течение жизнедеятельности организма. Ремо-делирование костной ткани осуществляется на основе тесной взаимосвязи процессов костеобразования и резорбции (Виноградова Т.П., Лавршцева Г.И., 1974). В норме процессы резорбции и костеобразования уравновешены согласно физиологическим потребностям организма. В ряде патологий (остеопороз, опухоли кости и др.) гармония между этими процессами нарушается в сторону преобладания костеобразования или резорбции костного вещества, что находит свое выражение в характере костных изменений и соответствующих клинических проявлениях (Аврунин Н.В. с соавт., 1998).

Ремоделирование костной ткани - многоуровневый процесс. Ос-теоцитарное ремоделирование обеспечивает перестройку костного

матрикса только в окружающем остеоцит окололакунарном пространстве. Этот вариант ремоделирования не приводит к изменению формы и размеров костного органа, а сказывается только на структуре лаку-нарного костного матрикса (Родионова Н.В., 1989). Остеоцитарное ре-моделирование происходит в том случае, когда изменение условий существования (в том числе нейрогуморальных влияний и физических нагрузок) не приводит остеоцит к гибели, и клетка за счет изменения структуры перелакунарного пространства максимально снижает влияние этих факторов.

Если же остеоцит погибает, в действие вступает остеобластно-остеокластный тип перестройки (Хэм А.,Кормак Д., 1983). Этот тип ремоделирования обеспечивает изменение не только структуры костного органа, но также размеров и формы.

Выделяют следующие этапы остеобластно-остеокластного ремоделирования (по Н.В.Аврунину, 1998):

1. Формирование участков активного ремоделирования.

2. Формирование органического матрикса.

3. Формирование минерального матрикса.

В полость резорбции мигрируют клетки-предшественники, дифференцирующиеся в остеобласты. Последние синтезируют компоненты органического матрикса, из которых складываются надмолекулярные структуры, заполняющие образовавшееся пространство (Aaron S., 1976). Этими компонентами в числе прочих являются коллаген, протеогликаны, неколлагеновые белки (факторы роста, костные морфогенетические белки и др).

Формирование волокнистой основы костной ткани в процессе остеогенеза, по мнению Г.И.Лавршцевой и Г.А.Оноприенко (1996),

можно разделить на два этапа: первый (внутриклеточный) - биосинтез коллагенового белка и протеогликанов и второй, происходящий во внеклеточном пространстве, - агрегация молекул в надмолекулярные структуры. Клетки остеобластной линии секретируют различные гликозаминогликаны, а также палочковидные молекулы коллагена, которые объединяются в протеофибриллы и микрофибриллы, последние - в фибриллы, а фибриллы - в волокна. Агрегация микрофибрилл в коллагеновые фибриллы и затем в волокна осуществляется при участии протеогликанов. Минеральный матрикс откладывается на ранее образованном органическом. Минеральный компонент кости представлен аморфным и кристаллическим фосфатом кальция. Третий компонент минеральной фазы - карбонат кальция. Ведущую роль в процессе минерализации играют ферменты (щелочная фосфатаза, АТФаза, фосфорилаза и др.). Согласно А.Хэму (1983), остеобласты секретируют щелочную фосфатазу, воздействующую на глицерофосфаты, в результате чего образуется избыток свободных фосфат-ионов, что приводит к увеличению соотношения Са и Р до уровня, при котором фосфат кальция осаждается в окружающем новообразованном матриксе. Затем происходит последовательная перестройка аморфного фосфата кальция в кристаллический. Минерализация - конечный этап образования костной ткани.

На основе физиологической регенерации развивается репаративная регенерация кости, которая представляет собой сложный биологический процесс, начинающийся сразу после травмы (Каплан А. В., 1979). Наиболее типичным примером репаративного остеогенеза является ос-теогенез при переломе - частичном или полном нарушении целостно-

сти кости под влиянием каких либо механических факторов (Лавршце-ва Г.И., Оноприенко Г.А., 1996).

Последствиями такого рода травмы являются прямые и непрямые повреждения тканей, как костной, так и связанных с ней мягких тканей (Маркс В.О.,1962; Ревелл П.А., 1993). Происхо