Оценка влияния низкомолекулярных белков костной ткани различных видов млекопитающих на динамику сращения перелома трубчатой кости

Мельников, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка влияния низкомолекулярных белков костной ткани различных видов млекопитающих на динамику сращения перелома трубчатой кости
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка влияния низкомолекулярных белков костной ткани различных видов млекопитающих на динамику сращения перелома трубчатой кости"

На правах рукописи

■ Д/^ХЛ.

Мельников Сергей Александрович

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ КОСТНОЙ ТКАНИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ДИНАМИКУ СРАЩЕНИЯ ПЕРЕЛОМА ТРУБЧАТОЙ КОСТИ

03.03.01 - физиология

Автореферат 2 3 СЕН 2015

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005562494

Челябинск-2015

005562494

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Лунева Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: Трифонова Елена Борисовна

доктор биологических наук, заведующий клинико-биохимической лабораторией ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени В.Д. Чаклина» (г. Екатеринбург) Цейликман Вадим Эдуардович доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» (г. Челябинск)

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный

университет»

Защита состоится «22» октября 2015 года в 12-00 на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. Ленина, д. 69, ауд. 116.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» и на сайте по адресу: http://www.cspu.ru/nauka/attestatsiya-nauchno-pedagogicheskikh-kadrov/obyavleniya-o-zashchite.

Автореферат разослан 11 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета Г~)

доктор биологических наук / Байгужии П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. На сегодняшний день одним из перспективных направлений при лечении больных с заболеваниями опорно-двигательной системы является применение остеоиндуктивных материалов, полученных из костного матрикса животных (Зайдман A.M., Тихонов В.Н., 2011; Кирилова И.А., 2004). В настоящее время свое применение в качестве материала для трансплантатов и покрытий нашли структурные элементы матрикса костной ткани млекопитающих животных. Наиболее известными подобными материалами являются гидроксиапатит и коллаген костной ткани быка и свиньи (Панин A.M., 2004; Фарзин Н., 2005). Однако, несмотря на широкое распространение подобных материалов, например в стоматологической практике, не раз отмечались их слабые остеоиндуктивные свойства (Григорьян A.C. и соавт., 2000; Гизатуллин P.A., 2007). Как правило, применение деминерализованного матрикса костной ткани более эффективно, чем материалов на основе коллагена и гидроксиапатита, так как он сохраняет в своем составе регуляторные соединения, которые способны стимулировать остеоиндукцию (Омельяненко Н.П. и соавт., 2001; Панкратов A.C. и соавт., 2010; Берченко Г.Н., 2013). На сегодняшний день возможность получения и использования регуляторных соединений костного матрикса млекопитающих животных остается не выясненной. (Кирилов И.А. и соавт., 2007; Лекишвили М.В. и соавт., 2009).

Степень разработанности темы исследования. Известно, что в костной ткани содержится ряд регуляторных соединений, способных влиять на пролиферацию и дифференциацию клеток в процессе костного ремоделирования (Панасюк А.Ф. и соавт., 2004; Павлова Л.А. и соавт., 2010). В костной ткани обнаружены трансформирующие факторы роста, костные морфогенетические белки, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста и факторы роста эндотелия сосудов (Булатов A.A., 2005; Зайцев В.В. и соавт., 2009; Kempen D.H. et al., 2010).Большинство факторов роста оказывают тканеспецифическое действие и не являются

видоспецифичнымн белками (Young M.F., 2003; Leipzig N.D. et al., 2006), что побудило нас исследовать остеоиндуктивные свойства ннзкомолекулярных белков костной ткани млекопитающих животных и определить перспективность их использования в составе препаратов для стимуляции регенерации костной ткани.

Цель исследования - Сравнить состав низкомолекулярных белков костной ткани различных видов млекопитающих и экспериментально установить их влияние на динамику сращения перелома трубчатой кости.

Задачи исследования:

1. Разработать методику препаративного выделения и очистки низкомолекулярных белков костной ткани с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Провести сравнительный анализ состава фракций низкомолекулярных белков, полученных из костной ткани домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus).

3. Оценить биологическое действие на остеогенез выделенных фракций белков костной ткани млекопитающих животных в эксперименте на модели перелома голени у лабораторных мышей линии СВА.

4. Выявить фракции белков костной ткани млекопитающих животных, которые способны оказывать стимулирующее действие на репаративный остеогенез.

5. Изучить влияние внутрибрюшинного введения выделенных фракций белков костной ткани млекопитающих животных на показатели энергетического обмена.

Научная новизна. Впервые выяснен состав и молекулярный вес фракций кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани (КНБКТ) домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus). Используя хроматографические методы исследования доказано, что данные белки

костной ткани вышеперечисленных животных имеют идентичный состав и содержат группы пептидов с молекулярной массой в интервале 1,1 - 3,4 кДа и 4,6 - 6,5 кДа. Исследовано воздействие низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка на процесс сращения перелома голени у лабораторных мышей линии СВА. Показано, что препараты белков костной ткани свиньи и быка обладают идентичным биологическим действием и при внутрибрюшинном введении вызывают угнетение процессов резорбции костной ткани, выражающееся в подавлении активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы (ТрКФ). Полученные данные расширяют область знаний о строении костной ткани млекопитающих животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработан способ получения белков костной ткани с молекулярной массой менее 14 кДа, основанный на применении хроматографической системы LC-20 Prominence Shimadzu (Япония). Используя данный метод, были получены препараты низкомолекулярных белков костной ткани домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus). Хроматографическими методами была доказана идентичность состава полученных препаратов. На модели перелома голени у лабораторных мышей линии СВА было исследовано биологическое действие на репаративный остеогенез препаратов фракций КНБКТ домашнего быка (Bos taurus taurus) и домашней свиньи (Sus scrofa domesticus). Проведенные исследования показали, что данные препараты обладают идентичным биологическим действием и способны оказывать стимулирующее действие на процесс остеогенеза. Полученные данные могут быть применены при разработке способов получения новых биологически активных веществ. Использованные и разработанные в ходе исследования экспериментальные модели могут найти применение при проведении научно-исследовательских работ в области биологии и медицины.

Методология методы исследования. Данная работа выполнена на базе экспериментального и клинико-экспериментального лабораторных отделов ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России». На проведение исследований получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России». Все работы с лабораторными животными проведены согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (2003 г.) и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977 г.).

Эксперимент был выполнен в два этапа. На первом этапе нами были получены препараты КНБКТ домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus). Используя гель-проникающую и ионообменную хроматографию, был установлен состав, молекулярные массы основных фракций полученных препаратов и их сродство к ионообменникам. На основе полученных результатов проведено сравнение состава КНБКТ млекопитающих животных.

Препараты КНБКТ получали из диафизарной части бедренной кости млекопитающих животных, путем деминерализации костной ткани 1,5 М раствором соляной кислоты и диализа с помощью установки с двойной диализной пленкой Cellu Sep (США) (внутренняя пленка - 3,5 кДа, внешняя - 14 кДа). После диализа раствор, находившийся между диализными пленками, высушили с помощью низкотемпературной вакуумной лиофильной сушки Heto Liolab 3000 (Дания). Таким образом, были получены препараты лиофилизированных КНБКТ с молекулярной массой менее 14 kDa.

При получении и исследовании образцов костных белков использовали хроматографическую систему Shimadzu LC-20 Prominence (Япония) для

высокоэффективной жидкостной хроматографии, колонки Shodex (США) Protein KW-2002.5 для гель-проникающей хроматографии, IEC QA-2825 для анионообменной хроматографии и IEC SP-2825 для катионообменной хроматографии.

На втором этапе эксперимента, исследовано влияние полученных фракций КНБКТ млекопитающих животных на процесс костеобразования. Исследование было проведено на 200 самцах белых лабораторных мышей линии СВА с массой тела 25-30 г с моделью перелома голени. Перелом костей голени осуществляли путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности (Патент РФ 72456927).

Экспериментальные животные были поделены на 12 групп (Таблица 1). В первой группе мышам с переломом голени однократно внутрибрюшинно вводили раствор препарата КНБКТ быка в дозе 1 мг/кг. Во второй группе мышам с переломом голени вводили раствор препарата КНБКТ свиньи в дозе 1 мг/кг. Животным третьей н четвертой группы вводили раствор фракции 1 (Mr = 6,5 кДа) полученной из препарата КНБКТ быка в дозе 1 мг/кг и выводили из эксперимента на 3-й и 7-е сутки соответственно. Пятую группу составляли мыши с переломом голени, которым многократно с интервалом в 10 дней вводили раствор фракции 1 полученной из препарата КНБКТ быка в дозе 0,5 мг/кг в течение 30 дней. В шестой и седьмой группе мышам с переломом голени вводили раствор фракции 2 (Mr = 1,3 кДа) полученной из препарата КНБКТ быка в дозе 1 мг/кг и выводили из эксперимента на 3-й и 7-е сутки соответственно. Восьмой группе животных многократно с интервалом в 10 дней вводили раствор фракции 2 полученной из препарата КНБКТ быка в дозе 0,5 мг/кг в течение 30 дней. В девятой, десятой и одиннадцатой группе мышам с переломом голени внутрибрюшинно вводили 0,02 мл физиологического раствора и выводили из эксперимента на 3-й, 7-е и 30-е сутки соответственно. Двенадцатую группу составляли 35 интактных мышей.

Таблица 1 - Экспериментальные группы лабораторных мышей линии СВА

Исследуемое вещевтво Этап эксперимента Группа животных Количество особей Доза

Сравнение биологического действия фракций препаратов кислоторастворимых иеколлагеновых белков костной ткани свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику

Препарат костной ткани быка 3 дня Опытная №1 15 1 мг/кг

Препарат костной ткани свиньи 3 дня Опытная №2 15 1 мг/кг

Изучение биологического действия фракций препарата кислоторастворимых иеколлагеновых белков костной ткани быка, полученных с применением гель-проникающей хроматогоаДии

Фракция 1 КНБКТ быка Мг = 6,5 кДа 3 дня Опытная №3 15 1 мг/кг

7 дней Опытная №4 15 1 мг/кг

Хронический 30 дней Опытная №5 15 0,5 мг/кг

Фракция 2 КНБКТ быка Мг= 1,3 кДа 3 дня Опытная №6 15 1 мг/кг

7 дней Опытная №7 15 1 мг/кг

Хронический 30 дней Опытная №8 15 0,5 мг/кг

Животные с моделью перелома голени

Физиологиче ский раствор 3 дня Контрольная №1 15 0,02 мл

7 дней Контрольная №2 15

Хронический 30 дней Контрольная №3 15

Условно здоровые животные

1 | Интактная | 35 |

Для биохимических исследований отбирали образцы, крови, печени, костной ткани и мышц (камбаловидная мышца) травмированной конечности.

В сыворотке крови изучали содержание общего белка, глюкозы, неорганического фосфата, общего кальция, активность щелочной фосфатазы, тартратрезистентной кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы. Содержание общего кальция, неорганического фосфата определяли на автоматическом

анализаторе Hitachi 902 (США), используя наборы реактивов фирмы «Vital Diagnostics Spb». Содержание общего белка в сыворотке крови определяли биуретовым методом. Для исследования активности щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы и лактатдегидрогеназы использовали наборы фирмы «Vital Diagnostics Spb» и анализатор «Stat Fax 1904 Plus» (США). Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидазным методом наборами реагентов «Глюкоза - ФКД» ООО «Фармацевтика и клиническая диагностика». В озоленом гомогенате костной ткани определяли концентрацию фосфатов по реакции с молибдатом аммония и кальция по реакции с о-крезолфталеином наборами реагентов фирмы «Vital Diagnostics SPb». В печени и мышцах оценивали содержание гликогена по реакции с антроновым реактивом.

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики, применяемым для малых выборок. Значимость различий между выборками оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фракции кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани с молекулярной массой менее 14 кДа домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris) и кролика (Oryctolagus cuniculus) обладают идентичным составом и биологическим действием.

2. Внутрибрюшинное введение фракции белков костной ткани с молекулярной массой 6,5 кДа на ранних этапах сращения перелома голени у лабораторных мышей линии СВА стимулирует активность ТрКФ и способствует резорбции костной ткани. Внутрибрюшинное введение фракции с молекулярной массой 1,3 кДа оказывает стимулирующее действие на синтетическую активность остеобластов и вызывает угнетение активности остеокластов.

Степень достоверности и апробация результатов. Работа выполнена на достаточном по объёму фактическом материале (200 самцов мышей линии СВА с массой тела 25-30 г), с использованием современных хроматографических и биохимических методов исследования. С применением системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии Shimadzu LC-20 Prominence (Япония) и программного пакета Lab Solutions GPC. Анализ полученных результатов проведен адекватными статистическими методами, используя пакет анализа данных приложения Microsoft Excel и программу Attestât 1.0.

Материалы диссертации доложены на Международной молодежной научной конференции «Современное естествознание и охрана окружающей среды», проходившей в Курганском государственном университете 9-13 сентября 2013 г., на Всероссийской научно-практической конференции «Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии» проходившей в ФГБУ «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» 26 апреля 2013 г. и на научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» проходившей в РХТУ им. Менделеева, г. Москва 30-31 мая 2012 г. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем н структура работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы, изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками и 36 таблицами. Список литературы включает 220 источников, из них 164 иностранных. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова», номер государственной регистрации 01201179373 «Ускорение регенерации тканей опорно-двигательной системы с использованием препаратов полипептидной, минеральной и гликопротеинной природы».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Хроматографическое исследование кислоторастворимых неколлагеновых белков костной ткани млекопитающих животных

Из 100 г костной ткани быка, свиньи, собаки и кролика были получены препараты лиофилизированных белков массой 0,981 г, 0,722 г, 0,316 г, 0,612 г соответственно. Используя гель-проникающую хроматографию, мы сравнили состав данных препаратов и установили молекулярные массы присутствовавших в них белков, полученные хроматографические профили, представленны на рисунке 1.

иУ_______

45000-

40000- Собака \ Кролик

35000-

3000»

25000- Свинья

20000- \ И Бык

15000- \

10000- J 1 \\\ 1

5000- и 1А ^

О 10 20 30 40 50 min

Рисунок 1 - Хроматографические профили КНБКТ быка, свиньи, собаки и кролика, полученные с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке Shodex Protein KW-2002.5, скорость потока 2,5 мл/мин, светофильтр 276 нм.

Гель-проникающая хроматография продемонстрировала идентичность качественного состава препаратов КНБКТ исследованных млекопитающих животных. Во всех полученных препаратах костных белков содержится пептид с молекулярной массой в области 0,32 кДа и временем удержания 38,4 мин. Содержание этого пептида в препарате костных белков кролика максимально по сравнению с препаратами других видов животных. Хроматографические профили белков костной ткани кролика, свиньи и собаки имеют одинаковый пик в интервале времени выхода 27,8 - 29,1 мин и

молекулярной массой в области 4,6 - 6,5 кВа. что свидетельствует о наличии общего пептида в этих препаратах. В препарате костной ткани быка подобный пептид содержится в значительно меньшем количестве.

Не смотря на идентичный качественный состав, количествнное содержание пептидов вырьировалось в широком диапазоне. Так высоты двух основных пиков препарата костных белков собаки, обладающих временем выхода 27,8 и 38,4 мин, принадлежащих пептидам с молекулярной массой 6,2 кДа и 0,3 кДа в 1,6 - 2,3 раза больше высот аналогичных пиков, принадлежащих препаратам костных белков свиньи и быка. Это говорит о большем количественном содержании общего белка в препарате костной ткани собаки по сравнению с препаратами этих животных. Наименьшим количественным содержанием белка обладает препарат костной ткани быка.

Исследование состава препаратов КНБКТ собаки, быка свиньи и кролика с помощью ионообменной хроматографии подтвердило идентичность их состава. С помощью анионообменной хроматографии были получены хроматографические профили данных препаратов, представленные на рисунке 2.

кролика, полученные с использованием анионообменной хроматографии на колонке вЬоёех 1ЕС С>А-2825, скорость потока 6 мл/мин, светофильтр 276 нм.

Хроматограммы препаратов костной ткани быка и собаки имеют

одинаковый пик, время выхода которого находится в интервале 42,0 - 42,2

мин. На всех хроматограммах можно увидеть пики, имеющие время выхода в

интервалах 71,5 - 72,3 и 54,1 - 57,5 мин. Это говорит о наличии во всех препаратах близких по строению белков.

свиньи полученный с использованием катионообменной хроматографии на колонке 81тос1ех 1ЕС 8Р-2825, скорость потока 3 мл/мин, светофильтр 276 нм.

На каждом хроматографическом профиле, полученном с помощью катионообменной хроматографии, представленном на рис. 3 располагается одиночный пик имеющий время выхода в интервале 41,6 - 44,1 мин. и элюирующийся при 0,22 М концентрации №С1 в буферном растворе. Что свидетельствует о низком сродстве к катионообменнику пептидов входящих в состав препаратов.

Сравнение биологического действия фракций препаратов КНБКТ свиньи и быка, обладающих сродством к катионообменнику

Так как на данный момент наиболее широкое применение в стоматологии и хирургии находят остеопластические материалы, полученные из костной ткани крупного рогатого скота и свиньи, нами было принято решение сравнить биологическое действие и состав КНБКТ этих животных. Из препаратов КНБКТ быка и свиньи были получены фракции, сорбирующиеся на катионообменнике и с помощью гель-проникающей хроматографии был установлен их состав. Хроматографические профили полученных фракций представлены на рисунке 4.

Бык

15000

-5000-

Свинья

Рисунок 4 - Хроматографические профили фракций, обладающей сродством к катионообменнику, препаратов КНБКТ быка и свиньи, полученные с использованием гель-проникающей хроматографии на колонке Shodex Protein KW-2002.5, скорость потока 2,5 мл/мин, светофильтр 276 нм.

Фракции, обладающие сродством к катионообменнику, препаратов КНБКТ свиньи и быка имеют в своем составе ряд пептидов с близкими значениями молекулярных масс. О чем говорит наличие четырех характерных пиков, имеющих время выхода 24,9 - 25,0 мин., 26,4 - 26,9 мин., 31,1 — 31,4 мин., 33,6 — 36,7 мин. и принадлежащих пептидам с молекулярными массами в области 14,1 — 14,2 кДа, 7,9 — 9,5 кДа, 2,1 — 2,5 кДа и 1,2 - 1,3 кДа соответственно. Для сравнения остеоиндуктивных свойств выделенных фракций был проведен биохимический эксперимент на мышах с моделью перелома голени. В результате проведенного эксперимента были выявлены изменения биохимических показателей сыворотки крови и минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-й сутки после введения полученных фракций дозой 1 мг/кг массы животного, представленные в таблице 2.

Таблица 2 - Биохимические показатели сыворотки крови и содержание минеральных компонентов в костной ткани лабораторных мышей с моделью перелома голени на 3 сутки после внутрибрюшинного введения фракции КНБКТ свиньи и быка, полученные с помощью катионообменной

—......— Интакт Контроль Свинья Бык

Показатели сыворотки крови

1ЦФ. Е/л 109,8 85,5 104,7 97,8

85.6-137,1 76,9-113,3 80,2-115,2 88,9-113,5

ТрКФ, Е/л 5,7 4,97 1,71'* 1,9*'

5,2-6,6 4.10-6.21 1.45-1.87 1,7-2,1

Са2+, ммоль/л 2,12 2,73' 2,24'* 2,15*

1,66-2,31 2.66-2.85 2.18-2.63 1.72-2,29

Р043", ммоль/л 2,15 2,55' 2,31* 2,53*'

1,79-2,48 2.40-3.06 2,14-2,41 2.44-2,65

ОБ, г/л 49,56 59,50 54,84' 57,15'

46,41-55,74 54,3-66,9 52,13-58.20 53,6-62,0

Минеральные компоненты костной ткани

Са2+, мг/г 373,3 309,0' 339,5'* 324,6'*

369,7-394,1 299.8-322.8 326,5-356,3 318,4-345.9

Р04", мг/г 240,3 200,1' 288,3'* 215,9'*

230,8-272,4 182,0-207,9 274,9-298,3 191,9-229,2

Примечание: данные представлены в виде медианы; 25- и 75-процентиль * - достоверные отличия при уровне значимости р < 0,05 в сравнении с контрольным значением

' - достоверные отличия при уровне значимости р < 0,05 в сравнении с интактным значением

Проведенные исследования показали, что внутрибрюшинное введение препарата КНБКТ свиньи вызывало понижение активности ТрКФ -основного маркера резорбции, которое сопровождалось уменьшение содержания кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови и увеличением содержания компонентов гидроксилапатита в костной ткани животных опытной группы относительно контрольных значений. При введении препарата костных белков быка наблюдалось понижение активности ТрКФ, уменьшение содержания кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови и увеличение содержания фосфата и кальция в костной ткани относительно значений контрольной группы.

Опираясь на полученные результаты, можно заключить, что препараты КНБКТ быка и свиньи обладают подобным биологическим действием и способны подавлять активность остеокластов. Однако введение данных препаратов не приводит к стимуляции активности остеобластов, так как достоверных изменений активности щелочной фосфатазы относительно интакных значений не наблюдалось.

Изучение биологического действия фракций препарата кислоторастворимых неколлагеновых белков костной ткани быка Исходя из отсутствия значительных отличий в составе и биологическом действии препаратов КНБКТ свиньи и быка, было принято решение более подробно изучить биологическое действие основных фракций препарата костных белков быка. Используя гель-проникающую хроматографию, из препарата КНБКТ быка нами было получено две фракции: фракция 1, элюирующаяся в интервале времени выхода 28 - 32 мин. и фракция 2, элюирующаяся в интервале времени выхода 33 - 36 мин. В составе фракции 1 присутствуют два пептида с молекулярными массами 6,463 и 0,313 кДа. Состав фракции 2 представлен одним пептидом с молекулярной массой 1,314 кДа.

Биологическое действие данных фракций было исследовано в эксперименте на лабораторных мышах с моделью перелома голени. В результате проведенного эксперимента были выявлены изменения биохимических показателей сыворотки крови, и минеральных компонентов костной ткани лабораторных мышей на 3-й и 7-е сутки после разового введения полученных фракций дозой 1 мг/кг массы животного и при троекратном введении дозой 0,5 мг/кг с интервалом в 10 дней с момента первого введения, представленные на рисунке 5 и 6.

Рисунок 5 - Биохимические показатели сыворотки крови и содержание минеральных компонентов в костной ткани лабораторных мышей с моделью перелома голени при внутрибрюшинном введении фракции 1 КНБКТ быка.

210 180 150 120

8 3 суток

ЩФ ТрКФ Са

Сыворотка крови

¡3023 7 суток ТЭТ 30 суток

Р Са Р

Костная ткань

интакт контроль

Исследование биологического действия фракции 1 дало следующие результаты: на 3-й сутки после внутрибрюшинного введения фракции 1 достоверных изменений активности ТрКФ и ЩФ не было выявлено, но наблюдалась тенденция к увеличению активности ЩФ относительно контрольной группы. Содержание минеральных компонентов костной ткани оставались в пределах контрольных значений.

На 7-е сутки после введения данной фракции наблюдалась стимуляция процесса резорбции костной ткани. О чем свидетельствует значительное и статистически достоверное увеличение активности ТрКФ относительно

контрольных и интактных значений, сопровождавшееся уменьшением содержания кальция и неорганического фосфата в костной ткани и увеличением содержания этих показателей в сыворотке крови.

При длительном воздействии фракции 1 на 30-и сутки после первого введения препарата у животных опытной группы наблюдалось увеличение активности ЩФ на 73% относительно значений контрольной группы, что может свидетельствовать об усилении костеобразования. Однако содержание кальция и неорганического фосфата в костной ткани животных опытной группы не имело статистически значимых отличий от контрольных значений. Также не было выявлено достоверных изменений содержания общего кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови животных опытной группы относительно контрольных и интактных значений.

Рисунок 6 - Биохимические показатели сыворотки крови и содержание минеральных компонентов в костной ткани лабораторных мышей с моделью перелома голени при внутрибрюшинном введении фракции 2 КНБКТ быка.

140

I 120

100

« 80

>я 60

% 40

5 20 о

ОБ ЩФ ТрКФ Са Р Са Р

Сыворотка крови Костная ткань

ШИЗ суток ШШ7 суток ггззо суток -интакт —контроль

Исследование биологического действия фракции 2 выявило значительное снижение активности ТрКФ наступившее на 3-й сутки после внутрибрюшинного введения данной фракции, сопровождавшееся уменьшением содержания кальция и неорганического фосфата в сыворотке крови в среднем на 21% относительно контрольных значений. Наблюдалась

тенденция к росту содержания компонентов гидроксилапатита в костной ткани. Однако активность ЩФ оставалась в пределах значений интактных животных.

Через 7 дней после введения фракции 2 происходило понижение активности ТрКФ сопровождавшееся ростом содержания кальция и неорганического фосфата в костной ткани на 15% по сравнению с контрольными значениями. Достоверных изменений активности фермента остеобластов — ЩФ относительно интактных и контрольных значений не было выявлено.

При троекратном введении фракции 2 в течение 30 дней с момента первой инъекции наблюдалось подавление активности ТрКФ - фермента остеокластов и увеличении активности ЩФ, что сопровождалось увеличением содержания кальция и неорганического фосфата в костной ткани экспериментальных животных.

Таким образом, исследование биологического действия фракций 1 и 2 показало, что внутрибрюшинное введение данных фракций способно стимулировать процесс остеогенеза. Препараты данных фракций вызывают значительное угнетение активности ТрКФ. Однако на 7-е сутки после введения фракция 1 наблюдались признаки активизации процесса резорбции костной ткани. Но при хроническом воздействии препарат фракции 1 вызывает увеличение активности ЩФ. При введении фракции 2 наблюдалось значительное снижение активности ТрКФ, при хроническом воздействии данный препарат вызывает максимальное увеличение активности ЩФ и значительный прирост кальция и неорганического фосфата в костной ткани.

Мы предположили, что в состав выделенных фракций КНБКТ быка могут входить ИПФР, которые при внутрибрюшинном введении способны оказывать влияние на энергетический обмен животных реципиентов (Десятниченко К.С., 1997; Шипицына И.В., 2011). В связи, с чем нами было проведено исследование изменений основных показателей энергетический обмена — активность ЛДГ и содержание глюкозы в сыворотке крови, содержание гликогена в печени и мышцах лабораторных мышей линии СВА с моделью перелома голени после введения фракции 1 и фракции 2 КНБКТ быка (Таблица 3).

Таблица 3 - Показатели энергетического обмена лабораторных мышей линии СВА с моделью перелома голени после введения фракции 1 и фракции 2 КНБКТ быка.

^--Показатель Срок Сыворотка крови Гликоген печени, мг/г ткани Гликоген мышц, мг/г ткани

ЛДГ, Е/л Глюкоза, ммоль/л

Интакт 5598 4891-6077 7,56 6,38-8,29 41,50 38.85-57,90 4,75 4,28-4,85

Контроль

3 суток 5954 5747-6070 8,63 8,07-8,69 45,40 40.61-51,65 4,24' 4,19-4.60

7 суток 5587 5016-5764 9,80' 8,52-10,63 61,12' 59,70-63,53 4,79 4,37-4,84

30 суток 5071 3789-6261 7,62 6,52-9,15 66,81' 64.12-69,55 4,51 4,20-4,65

Фракция 1

3 суток 6443 5237-7489 7,22 6,87-8,54 45,93 38.45-49,42 4,15 3,66-4,44

7 суток 5887 5699-6226 9,16' 8,32-9,41 51,34 47,57-52,80 3,39 3,26-4,19

30 суток 4258' 3802-4861 11,01' 8,98-11,67 59,95' 55.37-60,76 4,13 3,84-4,28

Фракция 2

3 суток 6937*' 6766-7082 8,82' 8,27-9,76 36,86' 33,48-39,18 3,96' 3,68-4,05

7 суток 5778 5436-6441 9,31' 7,79-11,64 47,70 45.76-48,65 4,26 4,02-4,53

30 суток 4552 3774-4810 12,51' 11,12-14,22 68,66' 64,84-75,82 4,36 4,23-4,59

' - достоверные отличия при уровне значимости р < 0,05 в сравнении с интактным значением

Внутрибрюшинное введение полученных фракций КНБКТ быка не приводит к изменениям энергетического обмена. Нами не было выявлено достоверных изменений выбранных показателей относительно контрольных значений при введении фракции 1. Введение фракции 2 так же не вызвало значительных изменений в энергетическом обмене. На 3-й сутки после внутрибрюшинного введения фракции 2 активность ЛДГ животных опытной группы увеличилась на 16% относительно контрольных значений, но

достоверных изменений уровня глюкозы в сыворотке крови и содержания гликогена в мышцах и печени не было выявлено.

Выводы:

1. Разработанный метод получения кислоторастворимых неколлагеновых белков костной ткани, заключающийся в последовательном применении кислотной деминерализации водным раствором соляной кислоты, диализа и гель-проникающей хроматографии, позволяет выделять белки костной ткани с молекулярной массой менее 14 кДа.

2. Состав кислоторастворимых низкомолекулярных белков костной ткани домашнего быка (Bos taurus taurus), домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), собаки (Canis lupus familiaris), кролика (Oryctolagus cuniculus) идентичен и содержит группы пептидов с молекулярной массой в интервале 1,1 - 3,4 кДа и 4,6 - 6,5 кДа.

3. Препараты низкомолекулярных белков костной ткани свиньи и быка имеют идентичное биологическое действие. При внутрибрюшинном введении данных препаратов наблюдается угнетение активности ТрКФ и выявлены признаки формирования новой костной ткани.

4. При внутрибрюшинном введении фракции низкомолекулярных белков костной ткани быка с молекулярной массой 6,5 кДа на ранних этапах сращения перелома наблюдается стимуляция активности ТрКФ, основного маркера синтетической деятельности остеокластов. При хроническом воздействии данной фракции в течение 30 дней наблюдается увеличение активности ЩФ, но при этом отсутствует прирост минеральных компонентов костной ткани.

5. Внутрибрюшинное введение препарата фракции с молекулярной массой 1,3 кДа на всех этапах сращения перелома оказывает стимулирующее действие на синтетическую активность остеобластов и вызывает угнетение активности остеокластов.

6. Внутрибрюшинное введение фракций кислоторастворимых белков костной ткани быка с молекулярной массой 6,5 кДа и 1,3 кДа не оказывает влияния на энергетический обмен.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Сравнительное хроматографичеекое исследование состава неколлагеновых белков костной ткани некоторых млекопитающих [Электронный ресурс] / А.Н. Накоскин, С.Н. Лунева, С.А. Мельников // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 3. - Режим доступа: URL: http://www.science-education.ru/l 13-11468

2) Исследование влияния препарата неколлагеновых белков костной ткани свиньи на изменения биохимических маркеров остеогенеза при сращении перелома голени у лабораторных мышей / С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, С.А. Мельников //Фундаментальные исследования. -2014. № 5.-С. 511-514.

3) Исследование изменений биохимических маркеров остеогенеза при внутрибрюшинном введении препаратов низкомолекулярных белков костной ткани быка на разных этапах сращения перелома голени у лабораторных мышей [Электронный ресурс] / С.А. Мельников, А.Н. Накоскин, С.Н. Лунева // Вестник новых медицинских технологий. - 2014. - №1. - Режим доступа: URL: http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/4940.pdf

4) Биохимические показатели сыворотки крови собак при заживлении внутрисуставных переломов вертлужной впадины / С.Н. Лунева, И.В. Шипицина, А.Н. Накоскин, Л.А. Ваганова, С.А. Мельников // Вестник Курганского государственного университета. - 2012. - №4 - С. 104-107.

5) Комплекс низкомолекулярных белков костной ткани и его влияние на регенерацию кости / С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, И.А. Талашова, A.B. Смирнов, С.А. Мельников // Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии: сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции. -Саратов.-2013.-С. 102-103.

6) Паракринная регуляция дистракционного остеогенеза / М.В. Стогов, A.A. Еманов, Е.А. Ткачук, A.B. Смирнов, С.А. Мельников // Технологии оптимизации процесса репаративной регенерации в травматологии, ортопедии и нейрохирургии: сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов. - 2013. - С. 115-117.

7) Применение хроматографической системы Shimadzu для выделения биологическиактивных веществ из костной ткани/ С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, С.А. Мельников // Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной экономики: мат. II Междунар. форума. - Новосибирск -2013.-С. 238-241.

8) Опыт применения хроматографической системы Shimadzu с препаративными колонками для получения и очистки биологически активных веществ из костной ткани/ С.Н. Лунева, А.Н. Накоскин, С.А. Мельников // Новые химико-фармацевтические технологии: сб. науч. трудов. - Москва - 2012 -С. 263-267.

9) Выделение из костной ткани и исследование биологического действия белков с инсулиноподобными свойствами/ С.А. Мельников, Т.А. Силантьева // материалы областной научно-практической конференции врачей и ученых посвященной 70-летию Курганской области. - Курган. - 2013. - С. 97-98.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИПФР — инсулиноподобный фактор роста

КНБКТ - кислоторастворимые низкомолекулярные белки костной ткани

ТрКФ — тартрат-резистентная кислая фосфатаза

ЛДГ — лактатдегидрогеназа

Мг - относительная молекулярная масса

ОБ — общий белок

ЩФ — щелочная фосфомоноэстераза

МЕЛЬНИКОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать Формат 60x85/16 Объем1,25 усл.печ.л. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ 1156.

Отпечатано в Типографии "Дом Печати" 640000, г. Курган, ул. Гоголя, 103