Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта"

На правах рукописи

Бухарова Татьяна Борисовна

РАЗРАБОТКА ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ, ПОЛИЛАКТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕЛЯ ДЛЯ ВОСПОЛНЕНИЯ КОСТНОГО ДЕФЕКТА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПЗ Ли? 2014

Москва 2014

005546731

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «МГНЦ» РАМН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Гольдштейн Дмитрий Вадимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Романов Юрий Аскольдович

Институт экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ, в.н.с. научно-практической лаборатории стволовых клеток человека

доктор биологических наук Александрова Мария Анатольевна ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН, г.н.с. лаборатории проблем регенерации, зав. группой экспериментальной нейробиологии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «24» апреля 2014 года в 12 часов на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан «¿^■> года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.П. Михайлова

Актуальность проблемы

Лечение травматических повреждений и дегенеративных заболеваний кости, таких как неконсолидирующиеся переломы, обширные костные дефекты, возникающие в результате травмы или резекции ткани в случае онкологических заболеваний, пороки развития, является актуальной медико-биологической проблемой. Потребность в костных графтах (graft (англ.) — трансплантат) в мире составляет более 800 ООО в год, наращиванию костной ткани у дентальных хирургов подвергаются 27 млн европейцев в год. Более 44 млн американцев и столько же жителей Европы подвержены остеопорозу [Иванов, 2009]. Традиционно для восполнения дефицита костной ткани при данных заболеваниях используют следующие методы - пересадку собственных тканей пациента (аутопластику), трансплантацию аллогенной костной ткани и введение различных остеопластических материалов на основе ксеногенного костного матрикса, синтетических кальций-фосфатных соединений, полимерных композиций и различных гибридных материалов [Chatteijea, 2010]. Аутотрансплантация на сегодняшний день является «золотым стандартом» в лечении костных дефектов, обеспечивая высокий уровень остеоинтеграции, отсутствие иммунологических реакций, немедленное закрытие дефекта. Однако при аутопластике возникают проблемы, связанные с ограниченной возможностью использования собственной костной ткани для пересадки и резорбцией трансплантатов. Забор материала из донорской зоны - это дополнительное хирургическое вмешательство, сопровождающееся болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования и развития других осложнений [Laurie, 1984; Arlington, 1996; Fröhlich, 2008]. Использование аллогенных трансплантатов связано с риском отторжения графта и инфицирования пациента. Для снижения иммуногенности аллогенных графтов проводят их децеллюляризацию, что существенно уменьшает остеоиндуктивность, а, следовательно, и эффективность их применения в сравнении с аутографтами. Остеопластические материалы в большинстве случаев выполняют остеокондуктивную функцию, поддерживая распространение костного регенерата, но не обладают достаточными остеоиндуцирующими свойствами [Finkemeier, 2002; Fellah, 2008; Bueno, 2009].

Одним из альтернативных подходов для регенерации костной ткани является трансплантация в область костного дефекта собственных остеопрогениторных клеток пациента после предварительного процессинга, позволяющего масштабировать количество первоначально полученных клеток и индуцировать их остеогенные потенции. Для адресной доставки, стабильной локализации в реципиентном ложе, обеспечения высокой выживаемости при трансплантации клетки иммобилизуют на матрицах-носителях из биосовместимых материалов. Важным фактором успешной регенерации является создание оптимального микроокружения для клеток при трансплантации, что достигается введением в состав конструкции ростовых и дифференцировочных факторов, направленных в первую очередь на стимуляцию неоангиогенеза, а также привлечение и

3

дифференцировку резидентных мезенхимальных предшественников. Таким образом, применение тканеинженерных эквиваленты костной ткани, с одной стороны, обеспечивает органотипическую регенерацию за счет участия остеопрогениторных клеток и действия биологически активных факторов, а с другой стороны, они могут быть получены практически любого требуемого объема из небольшого количества первичного материала, т.е. их использование лишено недостатков аутопластики. Это позволяет считать тканевую инженерию наиболее перспективным направлением при лечении травматических и дегенеративных заболеваний костной ткани в настоящее время [Деев, 2007; Howard, 2008; Murphy, 2013].

Цель исследования

Целью исследования является разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, трехмерных пористых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта.

Задачи исследования

1. Получить культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям;

2. Провести иммунофенотипический анализ и оценку дифференцировочного потенциала культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

3. Оптимизировать время и условия дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на основании динамики экспресии остеогенных маркеров и минерализации матрикса;

4. Изучить цитотоксический эффект трехмерных пористых полилактидных матриц-носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, в отношении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

5. Оценить адгезионные свойства и пролиферативную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на поверхности полилактидных носителей;

6. Разработать методику сборки тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани и полилактидных носителей с помощью тромбоцитарного геля;

7. Изучить формирование костной ткани на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечной трансплантации крысам тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля.

4

Научная новизна исследования

Впервые получена тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, дифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта.

Впервые показано, что матрицы-носители на основе полиэфиров молочной кислоты, полученные методом поверхностно-селективного лазерного спекания, не оказывают цитотоксического действия на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, обеспечивают прикрепление и пролиферацию клеток данных культур.

Установлено, что на 14 сутки культивирования 1а,25-дигидроксивитамин D3 оказывает выраженное остеогенное действие на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека в отличие от дексаметазона, повышая минерализацию внеклеточного матрикса и уровень экспрессии генов белков остеокальцина и остеопонтина.

Впервые с помощью ПЦР в режиме реального времени показано, что при действии 1а,25-дигидроксивитамина D3 на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, максимальная экспрессия белков коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина, формирующих органический костный матрикс, выявляется на 7-14 сутки, а на 14-21 сутки наблюдается увеличение уровня экспрессии генов щелочной фосфатазы и костного морфогенетического белка ВМР-2.

Разработан протокол сборки тканеинженерной конструкции на основе дифференцированных в остеогенном направлении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и полилактидных носителей путем полимеризации в тромбоцитарном геле. Установлено, что концентрация клеток 4 млн на 1см3 конструкции обеспечивает высокую выживаемость клеток при in vitro культивировании и формирование костной ткани в условиях in vivo.

Впервые показано, что внутримышечная трансплантация крысам тканеинженерной конструкции, содержащей дифференцированные в остеогенном направлении аутологичные ММСК жировой ткани, трехмерные пористые полилактидные носители и тромбоцитарный гель, приводит к гетеротопическому формированию грубоволокнистой костной ткани на 30 сутки.

Научно-практическая значимость исследования

Способ получения культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека соответствует требованиям, предъявляемым к медицинским технологиям. Получено разрешение на применение новой медицинской технологии «Способ получения и хранения культуры мультипотентных стромальных

клеток жировой ткани человека», авторы Гольдштейн Д.В., Ржанинова A.A., Бухарова Т.Б., Макаров A.B. (Разрешение на применение ФС № 2010/287 от 05.08.2010).

Апробация работы

Основные результаты работы изложены на Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Ялта-Гурзуф, 2009); World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийских школах-конференциях «Стволовые клетки и регенеративная медицина (Москва, 2010, 2011), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011), Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013), Межлабораторном научном семинаре ФГБУ «МГНЦ» РАМН (2013).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях, входящих в Перечень ВАК МОИ РФ.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в лекционные курсы для студентов и ординаторов в ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России и ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, включающего в себя 205 российских и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 26 рисунками, 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) человека выделяли из липоаспирата, полученного у 16 доноров (10 женщин и 6 мужчин, возраст от 33 до 57 лет) без воспалительных и опухолевых заболеваний после подписания добровольного информированного согласия, по модифицированному протоколу Zuk [Zuk, 2001]. Липоаспирацию проводили под местной инфильтрационной анастезией 0,25% раствором новокаина («Химфарм») в области передней брюшной стенки. Биоптаты доставляли в лабораторию в стерильном флаконе с транспортной средой: F12 («ПанЭко») с 0,5 мг/мл амикацина («Синтез») и 10

6

Ед/мл гепарина («Braun»). Липоаспират промывали раствором Версена («ПанЭко») и дезагрегировали путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина («ПанЭко») при 37°С в течение 1,5 часов. Клеточную суспензию центрифугировали, разводили осадок ростовой средой: DMEM/F12 («ПанЭко»), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («РАА») и 0,1 мг/мл амикацина, и инкубировали в чашках Петри при стандартных культуральных условиях (37°С, 5% СО2). По достижении 80% конфлюентности клетки рассаживали в плотности 1,5-2 тыс. клеток на см2. Ростовую среду меняли каждые 3 суток. Для получения колоний клетки пассировали в плотности 10 клеток на 1 см2. Для изучения морфологических особенностей ММСК ЖТ проводили окрашивание клеток по Паппенгейму.

Илшунофенотипический анализ культур ММСК ЖТ. Клетки, культивируемые на 3-4 пассаже, снимали с культурального пластика, фиксировали 4% параформальдегидом («Merck»), промывали ФСБ и инкубировали с первичными антителами 40 минут при 4°С. Затем клетки снова промывали ФСБ и инкубировали со вторыми антителами, меченными флуорохромами, в течение 40 минут при 4°С в темноте. В работе использовали моноклональные антитела к CD 13 (аминопептидаза N), CD29 (ßl -субъединица интегринов), CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты), CD73 (экто-5'-нуклеотидаза), CD90 (Thy-1), CD 105 (эндоглин), CD34 (лиганд L-селектина), CD45 (LCA) и CD31 (РЕСАМ-1), меченные флуорохромами FITC, TRITC, APC («BD Biosciences», «Abcam», «Santa Cruz»), В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические IgG тех же животных и немеченные клетки. Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре "CyFlow space" ("Partee"). Оценку результатов проводили с помощью программы "FlowMax" ("Partee").

Хондрогенная дифференцировка культур ММСК ЖТ. Клетки снимали с культурального пластика, центрифугировали в полипропиленовых пробирках по 200 тыс. клеток на пробирку. К осадку добавляли хондрогенную среду: DMEM («ПанЭко») с 10% ЭТС, 100 мкг/мл амикацина, 10 нг/мл TGF-ß («Prospec»), 100 пМ дексаметазона («KRKA»), 25 мМ глюкозы («Биосинтез»), 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты («Sigma») и инкубировали 21 сутки в пластиковой посуде со сниженной адгезией. Для выявления кислых гликозаминогликанов внеклеточного матрикса проводили фиксацию 4% параформальдегидом и инкубировали в 1% растворе альцианового синего (рН=1,0; «Biomedicals»).

Адипогенная дифференцировка культур ММСК ЖТ. Культуры, достигшие 70-80% конфлюентности монослоя, инкубировали в адипогенной среде DMEM/F12 с 10% ЭТС, 0,5 мкМ гидрокортизона («Фармак»), 100 нМ дексаметазона и 100 мкг/мл амикацина 21 сутки. Для выявления липидных включений клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали Oil Red О ("BioOptica").

Остеогенная дифференцирован культур ММСК ЖТ. Культуры ММСК ЖТ на 3-4 пассаже в состоянии 70-80% конфлюентного монослоя инкубировали в остеогенной среде: DMEM с 10% ЭТС, 100 мкг/мл амикацина, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты, 10 мМ ß-глицерофосфата натрия («Sigma»), 100 нМ дексаметазона и/или 10 нМ 1а,25-дигидроксивитамина D3 (кальцитриола, «Roshe»). Культуральную среду меняли каждые 3-е суток.

Для выявления очагов минерализации клетки фиксировали 70% этанолом («Ферейн») и обрабатывали 40 мМ водным раствором ализаринового красного S (рН=4.1, «ПанЭко»), Для оценки количества связавшегося красителя минеральные отложения растворяли уксусной кислотой и измеряли оптическую плотность при длине волны 405 нм за вычетом фонового значения при 620 нм с помощью планшетного фотометра "Anthos Reader 2020" («Anthos Labtec»),

ПЦР в режиме реального времени. Для анализа экспрессии генов применяли ПЦР-анализ с использованием интеркалирующего красителя Eva Green («Синтол»). Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью набора «RNeasy Miny kit» («Qiagen») в соответствии с рекомендациями производителя. Синтез кДНК по матрице РНК проводили согласно протоколу фирмы «Fermentas» с использованием олиго-ёТ-праймеров. В реакции использовали геноспецифические праймеры к генам маркеров остеогенной дифференцировки - коллагена 1 типа, остеопонтина, остеокальцина, щелочной фосфатазы и ВМР-2. Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации референсных генов GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и ß-actin (ß-актин).

Получение культур ММСК ЖТ крыс. У животных забирали фрагменты жировой ткани, промывали в растворе Хэнкса и перед ферментной обработкой измельчали ножницами. Дальнейшее выделение и культивирование проводили по методике для культур человека. Остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ крыс проводили в присутствии 10 нМ 1а,25-дигидроксивитамина D3.

Получение матриц-носителей. Матрицы-носители были изготовлены из полилактида (Poly(D,L)-lactic acid, PDL04, Purac, Нидерланды) методом поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС) [Антонов 2006]. Гранулы полилактида размером ~200 мкм спекали послойно по заданной программе на установке селективного лазерного спекания CJIC-100 (ФГБУН «Институт проблем лазерных и информационных технологий» РАН (ИПЛИТ РАН), Шатура). В качестве источника излучения использовали одномодовый волоконный лазер с длиной волны Х=1,06 мкм и мощностью до 10 Вт ("ИРЭ-Полюс"). В качестве сенсибилизатора излучения к порошку полилактида добавляли 0,1 весовых % сферических кварцевых наночастиц размером ~ 100 нм. Скорость сканирования пучка лазерного излучения по поверхности порошка составляла 20 см/сек. Диаметр пучка лазерного излучения 125 мкм. Ширины спеченных треков — 0,2 - 0,8 мм.

8

Заселение матриц-носителей клетками ММСК ЖТ. Матрицы-носители стерилизовали у-облучением в дозе 2,5 мРад и промывали физиологическим раствором («ПанЭко»). Готовили клеточную суспензию ММСК ЖТ с концентрацией 2x106 клеток на мл среды, наносили по 100 мкл на образец и инкубировали в течение 1 часа для инициации прикрепления клеток к носителям, затем добавляли культуральную среду. Клетки на носителях инкубировали при стандартных культуральных условиях, меняя ростовую среду каждые 2 суток [Бухарова, 2010; 2013].

MTT-mecm. Для изучения цитотоксического действия материала носителей ММСК ЖТ инкубировали в лунках 96 - луночных планшетов ("Nunc") в присутствии образцов в течение 1 и 7 суток. Для оценки динамики пролиферации ММСК ЖТ на поверхности носителей образцы заселяли клетками и инкубировали в 24-луночных планшетах ("Nunc") в течение 1, 4, и 7 суток. Затем проводили МТТ-тест по стандартному протоколу [Mosmann, 1983]. Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность при длине волны 570 нм за вычетом фонового значения при 620 нм на планшетном ридере "Anthos Reader 2020" («Anthos Labtec»),

Витальное мечение клеток. Клетки метили с помощью мембранной флуоресцентной метки РКН26 (red fluorescent cell linker kit, «Sigma») согласно инструкции производителя. Анализ образцов проводили с помощью инвертированного светового микроскопа Olympus СК 40 с аппаратно-программным комплексом Olympus camedia С-5050 («Olympus»),

Сканирующая электронная микроскопия. Для морфологической характеристики клеток, прикрепленных к гранулам носителей, образцы заселяли клетками, культивировали и готовили препараты для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) [Гусев С.А, 2005]. Образцы напыляли слоем золота (10 нм) в аппарате Eiko IB 3 («Eiko») и анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа S-570 («Hitachi») при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови. Для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma, PRP), кровь доноров и животных собирали в пробирки с ЭДТА, центрифугировали при 1100 об/мин. в течение 10 мин. Тромбоциты, содержащиеся в супернатанте, осаждали центрифугированием при 3600 об/мин в течение 15 мин и ресуспензировали в половине объема супернатанта.

Получение тканеинженерной конструкции. ММСК ЖТ предварительно дифференцировали в осгеогенном направлении в течение 14 суток, снимали с культурального пластика и осаждали центрифугированием. Клетки ресуспензировали в требуемом объеме PRP и наносили на матрицы из расчета 0,5 мл на 1 см3 образца. Для образования фибрина из содержащегося в PRP фибриногена в систему добавляли по каплям тромбин ("Согшау"), растворенный в 10% растворе хлорида кальция («ДальХимФарм») и инкубировали 3-5 мин.

Оценка жизнеспособности клеток в условиях in vitro. Получали конструкции, содержащие 1, 4 и 7 млн клеток на 1 см3 ТИК, и инкубировали в культуральной среде при стандартных условиях в течение 7 суток, меняя среду каждые 2 суток. Фибрин деполимеризовали с помощью фибринолизина («Биофарма»). Прикрепившиеся к носителю клетки снимали с помощью раствора Версена с добавлением 0,25% трипсина. Клетки в суспензии окрашивали 0,4% раствором трипанового синего («ДиаМ»). Долю жизнеспособных клеток определяли путем подсчета количества неокрашенных клеток в камере Горяева («МиниМед»).

Трансплантация тканеинженерных конструкций в толщу мышечной ткани бедра крыс. Экспериментальное исследование на животных проводили в лаборатории биологических испытаний ФИБХ РАН в соответствии с рекомендациями локального этического комитета и приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. Оценку эффективности ТИК проводили на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечном введении крысам. В работе использовали половозрелых самцов крыс аутбредной линии Sprague-Dawley (CD) массой тела 500-600 г. Конструкции изготавливали на основе аугологичных клеток животных, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля. В качестве контроля использовали носители с тромбоцитарным гелем без клеток. Операции проводили под внутримышечным комбинированным медикаментозным наркозом (золетил/рометар). Конструкции/носители вводили в межфасциальное пространство сгибательной группы бедренных мышц. На задней поверхности бедра крысы выбривали шерсть, производили продольный разрез длиной 1 см и в толще мышц сгибательной группы формировали карман, куда помещали образец. Рану послойно ушивали. Наркоз и операцию, длившуюся 10-12 минут, все животные переносили удовлетворительно, без ранних и поздних осложнений. Животных выводили из эксперимента на 30 сутки (п=6) наблюдения путем передозировки диэтилового эфира.

Выделенные образцы ткани помещали в 10% раствор забуференного формалина («БиоВитрум»), промывали в проточной воде и декальцинировали в смеси 4% растворов муравьиной и соляной кислот («ХимМед»). Заливку фрагментов полученных тканей в парафин («Биовитрум») и изготовление серийных срезов проводили по общепринятой методике. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Массону-Голднеру ("BioOptica"). Препараты исследовали с помощью микроскопа Leica DM 2500 с фотокамерой Leica DTC 295.

Статистический анализ данных проводили с помощью программ Microsoft Excel 2007 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft) и Sigma Plot 9.0 (Systat). Поскольку распределение отличалось от нормального, использовали непараметрический ¿/-критерий Манна-Уитни. Данные представляли как медиану и квартальный размах. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и крыс

Выделенные из липоаспирата человека культуры представлены преимущественно мелкими веретеновидными клетками, способными адгезироваться на пластике и формировать колонии при культивировании в низкой плотности (рис. 1А. Б). Показано, что большинство клеток полученных культур позитивны по маркерам мезенхимальных клеток СО 13, С029, С044, С073, С090, СО 105, негативны по маркерам гемопоэтических и эндотелиальных клеток С034, С045 и СШ1 (рис. 1В) и способны к остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировке в индуктивных средах (рис. 2). Согласно описанным свойствам выделенные культуры соответствуют критериям ММСК [ОоггншЫ, 2006].

г :"ч "А

ч 'С'н

Рис. 1. Характеристика ММСК ЖТ человека. А - морфология клеток, окрашивание по

Паппенгейму, ув. 100. Б - общий вид колоний. В - частота встречаемости маркеров

Рис. 2. Направленная дифференцировка ММСК ЖТ человека. А - остеогенная (окрашивание ализариновым красным, ув. 200); Б - адипогенная (окрашивание масляным красным, ув. 200); В - хондрогенная (окрашивание альциановым синим, ув. 100)

Для проведения экспериментального исследования были выделены культуры ММСК ЖТ крыс. Клетки полученных культур способны адгезироваться на пластике, клоногенны, имеют характерную фибробластоподобную форму, позитивны по маркерам С073 и СОЮ5 и негативны по маркеру С045. При инкубации культур ММСК ЖТ крыс в остеогенной среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин 03, формируются минеральные отложения, окрашиваемые ализариновым красным (рис. 3).

11

Рис. 3. Характеристика ММСК ЖТ крыс. А - морфология клеток, окрашивание по Паппенгейму, ув. 100. Б - общий вид колоний. В - остеогенная дифференцировка, 21 сутки, окрашивание ализариновым красным, Ув. 100

Оптимизация условий остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека

Ранее было показано, что для успешной регенерации костной ткани с помощью ММСК ЖТ необходима их предварительная дифференцировка in vitro в остеогенном направлении [Lee, 2003; Conejero, 2006; Yoon, 2007; Niemeyer, 2010]. В качестве индукторов остеогенеза в разных работах применяют дексаметазон, 1а,25-дигидроксивитамин D3, ретиноевую кислоту, костный морфогенетический белок 2 (ВМР-2) и другие факторы [Jorgensen, 2004; Malladi 2006; Song, 2011]. Как показывают экспериментальные данные, влияние этих веществ на ММСК из разных источников неодинаково. В ряде случаев эти вещества входят в состав разных дифференцировочных сред, и их действие не является строго специфичным. Мы сравнили действие двух наиболее часто применяемых индукторов остеогенеза - дексаметазона и 1а,25-дигидроксивитамина D3 путем оценки минерализации матрикса и уровня экспрессии остеогенных маркеров.

Рис. 4. Дифференцировка ММСК ЖТ человека в присутствии различных индукторов: А -1а,25-дигидроксивитамина 03; Б - 1а,25-дигидроксивитамина 03 и дексаметазона; В -дексаметазона. Окрашивание ализариновым красным. Ув. 200. Стрелками указаны адипоциты

В результате окрашивания ализариновым красным очаги минерализации были выявлены после культивирования в присутствии 1а,25-дигидроксивитамина 03, что свидетельствует о развитии остеогенной дифференцировки. В среде с дексаметазоном наблюдались преимущественно клетки с жировыми включениями — адипоциты, что указывает на активный адипогенез в культуре (рис. 4).

Остеокальцин

| 0,000025

| 0,00002 I

0,000015

а

Остеопонтин **

£ 0,0007 ■ 2 i 0,0006 • 1 1 0,0005 ■ '5 0,0004 ■ 1 | 0,0003 ■ £ 0 0002 *

**

*

и.иии. | 0,0001

контроль Оех ЭЗ+йех 03

Рис. 5. Анализ транскрипции генов белков остеокальцина (А) и остеопонтина (Б) при индукции остогенной дифференцировки культур ММСК ЖТ в присутствии разных индукторов (Оех - дексаметазон, ОЗ - 1а,25-дигидроксивитамин 03). ПЦР в режиме реального времени. *р<0,05 по сравнению с контрольной группой, **р<0,05 по сравнению с культивированием в присутствии дексаметазона

Данные ПЦР-анализа показали, что наибольший прирост транскрипции генов остеокальцина (В С ¿АР) и остеопонтина (ОГ'М) наблюдался при культивировании клеток в остеогенной среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин 1)3 как в качестве единственного индуктора, так и в сочетании с дексаметазоном (рис. 5). Культивирование в среде, содержащей только дексаметазон. не приводит к значимому повышению экспрессии исследуемых генов.

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что на 14 сутки культивирования 1а,25-дигидроксивитамин ОЗ эффективно индуцирует остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ человека в отличие от дексаметазона, который на данном сроке не оказывает остеоиндуктивного эффекта, а способствует развитию адипогенеза [Логовская, Бухарова, 2013].

Предположение об ингибирующем действии дексаметазона на остеогенную дифференцировку ММСК ЖТ было высказано в статье Zuk [гик, 2002]. Основанием для него послужил невысокий уровень экспрессии ключевого транскрипционного фактора остеогенеза Яипх2 в присутствии дексаметазона в отличие от культивирования с витамином ОЗ. а также снижение экспрессии остеокальцина, наблюдаемое в культурах ММСК из жировой ткани и из костного мозга. В нашем исследовании мы подтвердили отсутствие остеогенного действия дексаметазона на ММСК ЖТ на 14 сутки культивирования, показав отсутствие экспрессии остеокальцина и остеопонтина и низкую минерализацию матрикса. Полученные нами данные позволяют рассматривать 1а,25-дигидроксивитамин ОЗ как более эффективный индуктор остеогенеза для ММСК ЖТ, действие которого не только активирует остеогенные потенции клеток, но и позволяет избежать нежелательного адипогенного сценария.

Для определения оптимальных сроков остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ клетки инкубировали в дифференцировочной среде, содержащей 1а,25-

дигидроксивитамин ОЗ в течение 21 суток (рис. 6, 7).

13

Рис. 6. Динамика минерализации внеклеточного матрикса при остеогенной дифференцировке ММСК ЖТ. Окрашивание ализариновым красным. Сроки дифференцировки — 7 суток (А), 14 суток (Б) и 21 сутки (В). Ув. 100. Г - Количество красителя, связавшегося с минеральными компонентами матрикса. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой (0 сут). # р<0,05 по сравнению культивированием 7 суток. Лр <0,05 по сравнению с культивированием 14 сутки

Рис. 7. Анализ экспрессии генов белков коллагена I типа (А), остеопонтина (Б), остеокальцина (В), щелочной фосфатазы (Г) и ВМР-2 (Д) в культурах ММСК ЖТ. ПЦР в режиме реального времени. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой (0 сут). # р<0,05 по сравнению культивированием 7 суток. лр <0,05 по сравнению с культивированием 21 сутки

С помощью ПЦР в режиме реального времени было показано, что в культурах ММСК ЖТ в процессе остеогенной дифференцировки наблюдается увеличение транскрипции генов белков остеопонтина, остеокальцина, коллагена 1 типа, щелочной фосфатазы и ВМР-2 (рис. 7). При этом пик экспрессии гена остеокальцина (BGLAP) приходился на 7-е сутки дифференцировки, генов коллагена I типа (Col al) и остеопонтина (OPN) - на 14 сутки (рис. 6А-В). Увеличение экспрессии генов щелочной фосфатазы (ALP) и костного морфогенетического белка 2 (ВМР-2) начиналось с 7 и 14 суток, соответственно, и продолжалось до 21 суток (рис. 7 Г, Д). Таким образом, в течение первых 14 суток дифференцировки in vitro в клетках активно экспрессировались гены белков, формирующих внеклеточный матрикс (коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина). Затем экспрессия этих генов снижалась, но продолжался рост транскрипции гена щелочной фосфатазы, и увеличивалось количество кальциевых депозитов в матриксе, выявляемых окрашиванием ализариновым красным (рис. 6), что свидетельствует о прогрессирующем развитии минерализации. По мере созревания остеобластов увеличивалась экспрессия гена ВМР-2 - ключевого остеоиндуцирующего фактора. Согласно нашим экспериментальным наблюдениям, при минерализации внеклеточный матрикс становится прочным и нечувствительным к ферментативной обработке, что серьезно затрудняет снятие клеток с пластика. На основании этих данных было определено, что оптимальным сроком дифференцировки культур ММСК ЖТ является срок 14 суток - за этот промежуток транскрипция генов основных белков внеклеточного матрикса достигает максимального уровня, наблюдается начальная стадия минерализации и клеточный монослой может быть легко дезагрегирован. Очень важно, что к этому сроку, 14 суток, в клетках уже активирована транскрипция остеоиндуцирующего фактора ВМР-2. которая продолжает увеличиваться к 21 суткам, что обеспечит остеоиндуктивные свойства культуры при трансплантации. В ранее опубликованных работах транскрипция этого фактора в клетках ММСК человека в присутствии 1а,25-дигидроксивитамина D3 не была выявлена [Zuk, 2002] или детектировалась на поздних сроках [Zhou, 2006].

В результате были определены оптимальные условия остеогенной дифференцировки ММСК - инкубация клеток 14 суток в индуктивной среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин D3 в качестве основного индуктора [Логовская, Бухарова, 2013].

Получение и характеристика матриц-носителей

Носители для ТИК были изготовлены из полилактида методом поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС) - одной из разновидностей технологий быстрого прототипирования. Метод ПСЛС позволяет на основе данных компьютерной томографии костного дефекта создать трехмерную компьютерную модель, на основании которой затем послойно изготавливается ее трехмерная копия. Таким образом, изготавливаемая конструкция в точности соответствует геометрии костного дефекта, что при

трансплантации приведет к плотному прилеганию конструкции к краям раны и обеспечит успешную интеграцию трансплантата. Геометрия укладки материала внутри слоя и толщины слоев задаются с помощью программного обеспечения, что позволяет сформировать внутри матриц заранее заданную структуру, воспроизводимую в экспериментах. Варьирование составом материала и режимами спекания позволяет оптимизировать скоростью резорбции образцов [Antonov, 2006; Попов, 2007]. Кроме того, отсутствие высокотемпературной обработки позволяет получать носители, инкупсулированные биологически-активными веществами, с пролонгированным высвобождением [Антонов. 2008]. На данный момент применение носителей, синтезированных по данной технологии, для получения тканеинженерных эквивалентов костной ткани было показано лишь в одном исследовании in vivo с применением эмбриональных остеопрогениторных клеток [Kanczler, 2009]. В настоящей работе проводились исследования носителей в сочетании с культурами ММСК взрослого организма с целью применения для аутологичных трансплантаций.

Полилактидные матрицы-носители были сформированы в виде дисков диаметром 12 мм и высотой 5 мм, с трехмерной ячеистой структурой. Размер ячеек - 0,6 х 0,6 мм (Рис. 8). Носители были протестированы на цитотоксичность, способность к поддержанию клеточной адгезии и пролиферации культур ММСК ЖТ человека.

Рис. 8. Структура матриц носителей на основе полимолочной кислоты. А - вид макропор, Б - область спекания гранул лазерным лучом

Согласно данным МТТ-теста, проведенного после 1 и 7 суток инкубации клеток в присутствии матриц-носителей, не было выявлено значимых различий между опытными группами и контролем, что свидетельствует об отсутствии цитотоксического действия образцов в отношении культур ММСК ЖТ (рис. 9).

Рис. 9.

Отсутствие цитотоксического действия матриц носителей. МТТ-тест

С помощью витального флуоресцентного мембранного красителя РКН26 наблюдали, что на первые сутки после заселения клетки прикреплялись к поверхности носителя и распластывались по ней (рис. 10). Адгезия клеток к поверхности носителя наблюдалась как минимум в течение 21 суток. Клетки по поверхности гранул были распределены равномерно и расположены как на внешней поверхности матриц, так и внутри макропор. Кроме того, по микрофотографиям можно судить об увеличении плотности расположения клеток на поверхности носителя с увеличением срока культивирования [Бухарова, 2013].

Рис. 10. Распределение клеток ММСК ЖТ на поверхности полилактидных носителей сразу после заселения (А), и при культивировании в течение 7 (Б), 14 (В) и 21 (Г) суток. Витальное мечение клеток РКН26. Ув. 100. Флуоресцентная микроскопия

Количественную оценку пролиферации ММСК ЖТ на полилактидных носителях проводили с помощью МТТ-теста. Наблюдали увеличение количества клеток, адгезированных на поверхности носителя, при культивировании в течение 1, 4 и 7 суток (рис. 11), что свидетельствует о пролиферативной активности ММСК ЖТ на исследуемых носителях. Наглядное подтверждение результатов МТТ-теста получено с помощью СЭМ на тех же сроках (рис. 12).

Рис. 11.

Пролиферация ММСК ЖТ на поверхности полилактидных носителей. Результаты МТТ теста. р<0,05 при сравнении групп попарно

С помощью СЭМ наблюдали, что в первые сутки после заселения на поверхности полилактидных гранул наблюдались, главным образом, одиночные клетки вытянутой формы (рис. 12 А). На третьи сутки культивирования обнаруживались скопления близко расположенных друг к другу клеток, преимущественно веретеновидной формы, многие из которых крепились своими отростками к соседним гранулам (рис. 12 Б). К 7 суткам клетки на поверхности носителей образовывали плотные многослойные структуры (рис. 12 В).

Пролиферация МСК на носителях

52 °'25 2 3 02 -1-

s 0,5 1 0.1 S S 0.05 I 0- нЧ

7=„

Рис. 12. ММСК ЖТ на поверхности матриц-носителей при культивировании 1 сутки (А), 4 суток (Б) и 7 суток (В). СЭМ

Проведенные исследования показали, что полилактидные матрицы-носители, полученные методом ПСЛС, характеризуются высокой цитосовместимостью - не оказывают токсического действия на клетки культур ММСК ЖТ, обеспечивают адгезию исследуемых клеток на своей поверхности в течение 3 недель, а также поддерживают пролиферацию культур. Ранее нами была показана биосовместимость аналогичных

18

образцов с культурами ММСК костного мозга [Бухарова, 2010]. Тестирование матриц, полученных методом ПСЛС, но из другого полимера, полилактогликолида, проводилось на культурах стволовых клеток человека из пульпы молочных зубов [Вахрушев. 2010; 2012]. Недавние эксперименты показали, что полилактиды более предпочтительны для изготовления матриц тканеинженерных конструкций в отличие от полилактогликолидов [Tayton, 2013]. Следует заключить, что матрицы из полиэфира молочной кислоты, полученные методом ПСЛС, могут быть рекомендованы в качестве носителей для клеток в тканевой инженерии в сочетании с культурами ММСК, полученными из взрослого организма.

Получение тканеинженерных конструкций

Для иммобилизации клеток на носителе использовали тромбоцитарный гель. Клетки ресуспензировали в PRP, наносили на матрицу и добавляли тромбин для получения фибрина. Использование тромбоцитарного геля, согласно мнению многих авторов, позволяет значительно повысить эффективность регенерации. Во-первых, содержащиеся в а-гранулах тромбоцитов ростовые и дифференцировочные факторы при высвобождении оказывают ангиогенное действие, усиливают митотическую и секреторную активность клеток, служат цитокиновой поддержкой регенерации [Schliephake, 2002; Anitua, 2004; Bucholz, 2006; Alsousou 2009]. Во-вторых, полимеризация фибрина приводит к формированию сгустка, внутри которого распределены клетки. Такой сгусток, как и в случае формирования гематомы при естественной репарации, послужит субстратом для миграции воспалительных и прогениторных клеток, а также поддержкой прорастающим сосудам. В-третьих, использование тромбоцитарного геля позволяет быстро собирать конструкцию без длительного предварительного культивирования клеток на носителе, определив заранее концентрацию клеток, обеспечивающую эффективную регенерацию [Бухарова, 2010; 2013].

В настоящем исследовании выбор концентрации клеток проводился на основе оценки выживаемости клеток внутри конструкции в условиях in vitro культивирования (рис. 13).

Рис. 13. Гибель клеток ММСК ЖТ внутри ТИК в условиях in vitro в зависимости от концентрации клеток. * р<0,05 по сравнению с группой, в которой концентрация клеток 1 млн. ** р<0,05 по сравнению с группой, в которой концентрация клеток 4 млн

Было определено, что после 7 суток культивирования гибель клеток, взятых в концентрации не более 4 млн на 1 см3 ТИК составила около 6%. Концентрация клеток 7 млн приводит к заметной гибели клеток (около 18%), что в 3 раза превышает значения для

предыдущей точки. На основании данного эксперимента был сделан вывод, что концентрация клеток в составе ТИК не должна превышать 4 млн на 1 см3 конструкции. Выбранная концентрация клеток в составе данной конструкции позволяет обеспечить достаточное снабжение клеток кислородом и питательными веществами в течение 7 суток культивирования при стандартных условиях без дополнительной перфузии среды.

Разработанная ТИК представляет собой пористый полилактидный носитель, внутри которого заключены дифференцированные в остеогенном направлении ММСК ЖТ в тромбоцитарном геле. 1 см3 ТИК содержит 4х106 клеток. Выживаемость клеток при культивировании in vitro составляет 94% в течение 7 суток [Бухарова, 2013].

Трансплантация тканеинженерной конструкции в мышечную ткань бедра крыс

Для оценки эффективности тканеинженерной конструкции использовали модель гетеротопического остеогенеза, которая позволяет оценить непосредственное участие трансплантата в формировании костной ткани [Troum, 2001; Lee, 2003; Lin, 2006; Ye, 2012].

При морфологическом исследовании образцов контрольной группы на 30 сутки после имплантации носителей с тромбоцитарным гелем пространство между гранулами материала заполнено соединительной (фиброзной) тканью с высокой плотностью расположения клеток (рис. 14). Преимущественно обнаруживаются клетки веретеновидной формы, наблюдается незначительная лимфоцитарная инфильтрация. На поверхности гранул находятся гигантские клетки инородных тел. Сосуды полнокровные, выражена капиллярная сеть. По периферии образца располагается зрелая соединительная ткань и волокна поперечнополосатой мышечной ткани.

Рис. 14. Область имплантации через 30 суток после введения носителя с тромбоцитарным гелем (контроль). Соединительная ткань с признаками гранулематозного воспаления. Окрашивание гематоксилином и эозином (А) и по Массону-Голднеру (Б). Ув. 400. М - материал носителя

При морфологическом исследовании образцов опытной группы через 30 суток после трансплантации ТИК между гранулами материала обнаруживаются участки

20

новообразованной грубоволокнистой костной ткани (рис. 15). Выявляется плотный структурированный внеклеточный матрикс, внутри которого находятся погруженные в лакуны остеоциты с полигональным гиперхромным ядром. Местами наблюдается формирование остеонов. По периферии гранул материала выявляются гигантские клетки инородных тел или тонкая соединительнотканная капсула из фибробластов. В участках, свободных от костного матрикса, наблюдается лимфоцигарная инфильтрация. Трансплантат пронизан сосудами артериального и венозного типа различного диаметра. Местами, главным образом по периферии конструкции, выявляется рыхлая волокнистая соединительная ткань. В центральной части трансплантата новообразованное костное вещество заполняет все пространство между гранулами материала. Ориентация волокон в костном матриксе имеет разнонаправленный характер.

Рис. 15. Область трансплантации через 30 суток после введения ТИК. Грубоволокнистая костная ткань 9 формированием остеонов. Окрашивание гематоксилином и эозином (А, Б) и по Массону-Голднеру (Б, Г). А, Б - ув. 400; В, Г - ув. 1000. М - материал носителя, КМ - костный матрикс, «стрелка» - остеоциты

Таким образом, результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что при внутримышечном введении ТИК на 30 сутки в области трансплантации формируется грубоволокнистая костная ткань, т.е. наблюдается гетеротопический неоостеогенез - образование костной ткани с/е novo. Поскольку в выбранной экспериментальной модели трансплантат является единственным источником остеогенеза,

следует заключить, что новообразованная костная ткань сформировалась за счет трансплантированных клеток. На срезах не обнаружено хондробластов, остеогенез идет по пути интрамембранного окостенения. При трансплантации остеогенной клеточной культуры на полилактидном носителе без тромбоцитарного геля выявляются очаги хрящевой ткани [Капсг1ег, 2009]. Отсутствие промежуточного формирования хрящевой ткани при трансплантации разработанной нами ТИК является следствием высокой васкуляризации трансплантата, обусловленной использованием тромбоцитарного геля.

Результаты экспериментального исследования позволяют заключить, что ТИК, полученная по разработанному в ходе исследования протоколу, содержащая культуру ММСК жировой ткани, дифференцированных в остеогенном направлении, трехмерный пористый полилактидный носитель и тромбоцитарный гель, при внутримышечной трансплантации приводит к формированию ретикулофиброзной костной ткани, что характеризует ее высокий остеогенный потенциал и является обоснованием применения для восполнения костных дефектов [Бухарова, 2013].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана тканеинженерная конструкция для восполнения дефицита костной ткани. В качестве остеогенной клеточной культуры выбрана культура ММСК жировой ткани. Определены оптимальные условия остеогенной дифференцировки культуры — 14 суток инкубации в среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин БЗ. Носитель для клеток получен по уникальной технологии методом поверхностно-селективного лазерного спекания, который, благодаря применению компьютерного моделирования, предполагает изготовление образца точно в соответствии с геометрией дефекта, что является залогом успешной остеоинтеграции ТИК при трансплантации. Исследуемый носитель, изготовленный из полилактида в виде трехмерного пористого каркаса, характеризуется высокой цитосовместимостью, а при внутримышечной трансплантации не вызывает выраженных воспалительных процессов, подвергается резорбции за счет макрофагов и ГКИТ, поддерживает эффективное формирование костной ткани. Важным преимуществом разработанной конструкции является использование тромбоцитарного геля для иммобилизации клеток на носителе. Подход к сборке конструкции, основанный на свободном распределение клеток внутри фибринового сгустка, позволяет эффективно использовать весь свободный объем трансплантата при формировании тканевых структур. Кроме того, ростовые и дифференцировочные факторы, содержащиеся в тромбоцитарном геле, способствуют васкуляризации трансплантата, что обеспечивает выживаемость трансплантированных клеток и развитие неоостеогенеза по пути интрамембранной оссификации. При внутримышечной трансплантации ТИК крысам наблюдается формирование грубоволокнистой костной ткани за счет трансплантированных клеток. Полученная конструкция может быть рекомендована к использованию при разработке медицинских технологий, направленных на лечение дегенеративных заболеваний и травматических повреждений костной ткани.

выводы

1. Разработана и охарактеризована тканеинженерная конструкция на основе дифференцированных в остеогенном направлении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, трехмерных пористых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля. Способ получения культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека соответствует требованиям, предъявляемым к медицинским технологиям.

2. На 14 сутки культивирования 1а,25-дигидроксивитамин D3 оказывает выраженное остеогенное действие на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани по сравнению с дексаметазоном, повышая уровень минерализации матрикса и экспрессии генов белков остеокальцина и остеопонтина

3. При действии 1а,25-дигидроксивитамина D3 на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, максимальная экспрессия белков коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина, формирующих органический костный матрикс, выявляется на 7-14 сутки, а на 14-21 сутки наблюдается увеличение уровня экспрессии щелочной фосфатазы и отложений кальциевых депозитов, задействованных в минерализации матрикса, и экспрессии гена остеогенного фактора ВМР-2. Установлен оптимальный срок для остеогенной дифференцировки культур перед трансплантацией — 14 суток.

4. Трехмерные пористые полилактидные носители, полученные методом поверхностно-селективного лазерного спекания, не оказывают цитотоксического действия на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, способствуют прикреплению и пролиферациий клеток.

5. При сборке тканеинженерных конструкций путем полимеризации в тромбоцитарном геле концентрация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани 4 млн на 1см3 конструкции обеспечивает высокую выживаемость клеток при in vitro культивировании и формирование костной ткани в условиях in vivo.

6. Трансплантация в скелетную мышцу крыс тканеинженерной конструкции, содержащей дифференцированные в остеогенном направлении аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани, трехмерные пористые полилактидные носители и тромбоцитарный гель, приводит к гетеротопическому формированию грубоволокнистой костной ткани на 30 сутки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Баграташвили В.Н., Волков A.B., Гольдштейн Д.В., Кротова Л.И., Попова A.B., Попов В.К., Фатхудинов Т.Х. Тканеинженерные конструкции на основе пористых полилактидных матриц и мультипотентных стромальных клеток // Вестник новых медицинских технологий. - Том XVI. - 2009. - №1. - с. 85-86.

2. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Фатхудинов Т.Х., Попов В.К., Волков A.B., Попова A.B., Баграташвили В.Н., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерные конструкции на основе мультипотентных стромальных клеток костного мозга и пористых полилактидных носителей // Сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции для молодежи "Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования" — 2009. - с.55.

3. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Попов В.К., Фатхудинов Т.Х., Попова A.B., Бочкова С.А., Баграташвили В.Н., Гольдштейн Д.В. Биосовместимость тканеинженерных конструкций на основе пористых полилактидных носителей, полученных методом селективного лазерного спекания, и мультипотентных стромальных клеток костного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2010. - №1, - с.40-46.

4. Popov V., Antonov Е., Bagratashvili V., Bochkova S., Bukharova Т., Fatkhutdinov Т., Markvicheva E., Popova A., Rumsh L., Volkov A. Surface selective laser processing: a new methodology to work with thermoliable polimer particles / Materials of World conference on regenerative medicine II Regenerative medicine. - 2009. - №4 (6). - p. 253-254.

5. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Волков A.B., Попов В.К., Фатхудинов Т.Х., Попова A.B., Шустров С.А., Алексеева И.С., Баграташвили В.Н., Гольдштейн Д.В. Остеорегенерация при трансплантации тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и полилактидных носителей // Сборник тезисов Всероссийской научной школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина». — 2010. — с. 15.

6. Бухарова Т.Б., Арутюнян И.В., Шустров С.А., Алексеева И.С., Федюнина И.А., Логовская Л.В., Волков A.B., Ржанинова A.A., Григорьян A.C., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В.. Тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и материала «Остеоматрикс» для регенерации костной ткани // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011, - № 3: - с. 167-173.

7. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Волков A.B., Попова A.B., Логовская Л.В., Попов В.К., Гольдштейн Д.В. Создание тканеинженерной конструкции для репаративного остеогенеза на основе биорезорбируемых носителей и мультипотентных стромальных клеток жировой ткани // Сборник материалов Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина». - 2011. — с. 28-29.

8. Логовская Л.В., Бухарова Т.Б., Вихрова Е.Б., Гольдштейн Д.В. Оптимизация условий остеогенной дифференцировки мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека // Сборник материалов Всероссийской научной школы-конференции для молодежи «Стволовые клетки и регенеративная медицина». — 2011. — с. 48-49.

9. Бухарова Т.Б, Антонов Е.Н, Попова A.B., Гольдштейн Д.В., Попов В.К., Волков A.B. In vivo оценка остеогенного потенциала тканеинженерных конструкций на основе ММСК ЖТ, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля // Сборник материалов Национального конгресса по регенеративной медицине. — 2013. — с. 43-44.

10. Логовская Л.В., Бухарова Т.Б., Волков A.B., Вихрова Е.Б., Махнач О.В., Гольдштейн Д.В. Индукция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2013. - №1. - с. 28-34.

11. Бухарова Т.Б., Волков A.B., Антонов E.H., Вихрова Е.Б., Попова A.B., Попов В.К., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2013. -№4. - с. 68-75.

* Журналы, выделенные жирным шрифтом, входят в Перечень ВАК МОН РФ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки (Соглашение № 8309) и Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 0902-00935 и 13-04-12073) П

Список использованных сокращений

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ЖТ - жировая ткань

ТИК - тканеинженерная конструкция

ПСЛС - поверхностно-селективное лазерное спекание

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ГКИТ - гигантские клетки инородных тел

PRP - platelet-rich plasma/плазма, обогащенная тромбоцитами

РКН - Red Fluorescent Cell Linker Kit/мембранный красный флюоресцентный маркер ALP - alkaline phosphatase/щелочнэя фосфатаза OPN - osteopontin/остеопонтин Col - collagen/коллаген

BMP - bone morphogenetic protein/костный морфогенетический белок

BGLAP - bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein/костный гамма-

карбоксиглутамат содержащий протеин (остеокальцин)

GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase/глицеральдегид фосфат дегидрогеназа

Подписано в печать 19.03.2014.

Формат А5. Тираж 100 Экз. Заказ № 15572. Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский проспект, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бухарова, Татьяна Борисовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

04201456873

Бухарова Татьяна Борисовна

РАЗРАБОТКА ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМА Л Ь Н ЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ, ПОЛИЛАКТИДНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И ТРОМБОЦИТ АРНОГО ГЕЛЯ ДЛЯ ВОСПОЛНЕНИЯ КОСТНОГО ДЕФЕКТА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Дмитрий Вадимович Гольдштейн

Москва 2014

Оглавление

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................6

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................13

2.1 Строение и регенерация костной ткани.................................................15

2.2 Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани......20

2.3 Характеристика и остеогенный потенциал культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани...............................27

2.4 Матрицы-носители для тканеинженерных конструкций.....................35

2.5 Использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови в тканевой инженерии........................................................................................................42

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................47

3.1 Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.............................................47

3.2 Иммунофенотипический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.............................................................48

3.3 Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека....................................................................49

3.4. Получение и дифференцировка культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс.....................54

3.5 Получение полилактидных матриц-носителей......................................54

3.6 Заселение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на носителях.....................56

3.7 Оценка цитотоксичности материала носителей и пролиферативной активности клеток на носителях с помощью МТТ-теста...........................56

3.8 Визуализация клеток с использованием мембранной метки РКН26 .. 57

3.9 Изучение морфологии клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии....................................................................................................58

3.10 Получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови.....................59

3.11 Изготовление тканеинженерных конструкций....................................59

3.12 Оценка жизнеспособности клеток внутри тканеинженерной конструкции in vitro........................................................................................60

3.13 Трансплантация тканеинженерных конструкций крысам..................60

3.14 Подготовка и обработка гистологических срезов...............................63

3.15 Статистический анализ данных.............................................................63

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................65

4.1. Характеристика культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.............................................................65

4.2 Выбор оптимальных условий остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека............................................................................................................78

4.3 Оценка цитосовместимости матриц-носителей.....................................87

4.4 Характеристика тканеинженерной конструкции..................................95

4.5 Морфологическое исследование области введения тканеинженерной конструкции в толщу мышечной ткани бедра крыс...................................98

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................110

5.1 Выбор культуры остеогенных клеток...................................................110

5.2 Обоснование выбора матриц-носителей..............................................116

5.3 Получение тканеинженерных конструкций.........................................120

5.4 Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс................................................................................................................124

Заключение..........................................................................................................132

Выводы.................................................................................................................136

Список литературы.............................................................................................138

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки ЖТ - жировая ткань

СВФ - стромально-васкулярная фракция ТИК - тканеинженерная конструкция ДМСО - диметилсульфоксид

МТТ - тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ИЛ - IL/интерлейкин

КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы фибробластов (3-ТКФ - (3-трикальций фосфат ФСБ - фосфатно-солевой буфер БСА - бычий сывороточный альбумин ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ПСЛС - поверхностно-селективное лазерное спекание ГКИТ - гигантские клетки инородных тел

DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham/ Среда Игла, модифицированная Дульбекко/питательная смесь Хэма F12

BMP - bone morphogenetic protein/костный морфогенетический белок

PRP - platelet-rich plasma/плазма, обогащенная тромбоцитами

CD - cluster of differentiation, кластер дифференцировки (мембранные маркеры)

FGF - fibroblast growth factor/фактор роста фибробластов

PDGF - platelet-derived growth factor/ тромбоцитарный фактор роста

PKH - Red Fluorescent Cell Linker Kit/мембранный красный флюоресцентный маркер

VEGF - vascular endothelial growth factor/фактор роста эндотелия сосудов

ALP - alkaline phosphatase/щелочная фосфатаза

OPN - osteopontin/ocTeonoHTHH

BSP - bone sialopmtein/костный сиалопротеин

Col - collagen/коллаген

BGLAP - bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein/костный гамма-карбоксиглутамат содержащий протеин (остеокальцин)

GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate de hydrogenase/глицеральдегид фосфат дегидрогеназа

FITC - fluorescein 18оШуосуапа1е/флуоресцин-5'-изотиоционат

TRITC - tetramethyl-rhodamine isothiocyanate/ тетраметилродамин изотиоцианат

АРС - allophycocyanin/алофикоцианин

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

Лечение травматических повреждений и дегенеративных заболеваний кости, таких как неконсолидирующиеся переломы, обширные костные дефекты, возникающие в результате травмы или резекции ткани в случае онкологических заболеваний, пороки развития, является актуальной медико-биологической проблемой. Потребность в костных графтах (graft (англ.) -трансплантат) в мире составляет более 800 ООО в год, наращиванию костной ткани у дентальных хирургов подвергаются 27 млн европейцев в год. Более 44 млн американцев и столько же жителей Европы подвержены остеопорозу [Иванов, 2009]. Традиционно для восполнения дефицита костной ткани при данных заболеваниях используют следующие методы - пересадку собственных тканей пациента (аутопластику), трансплантацию аллогенной костной ткани и введение различных остеопластических материалов на основе ксеногенного костного матрикса, синтетических кальцийфосфатных соединений, полимерных композиций и различных гибридных материалов [Chatterjea, 2010].

Аутотрансплантация на сегодняшний день является «золотым стандартом» в лечении костных дефектов, обеспечивая высокий уровень остеоинтеграции, отсутствие иммунологических реакций, немедленное закрытие дефекта. Однако при аутопластике возникают проблемы, связанные с ограниченностью собственной костной ткани для пересадки и выраженными процессами резорбции трансплантатов. Забор материала из донорской зоны - это дополнительное хирургическое вмешательство, сопровождающееся болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования и развития других осложнений [Laurie, 1984; Arrington, 1996; Fröhlich, 2008]. Также аутографтинг исключен в случаях остеопороза, несовершенного остеогенеза и остеомиелита [Laurencin, 2003]. Использование аллогенных трансплантатов связано с риском

отторжения графта и инфицирования пациента. Для снижения иммуногенности проводят децеллюляризацию аллогенных графтов, что существенно уменьшает их остеоиндуктивность, а, следовательно, и эффективность применения в сравнении с аутографтами [Finkemeier, 2002]. Остеопластические материалы в большинстве случаев выполняют остеокондуктивную функцию, обеспечивая клеточную адгезию и поддержание прорастающих сосудов, но не обладают достаточными остеогенными свойствами [Finkemeier, 2002; Fellah, 2008; Bueno, 2009].

Одним из альтернативных подходов для регенерации костной ткани является трансплантация в область костного дефекта собственных остеопрогениторных клеток пациента после предварительного процессинга, позволяющего масштабировать количество первоначально полученных клеток и индуцировать их остеогенные потенции. Для адресной доставки, стабильной локализации в реципиентном ложе, обеспечения высокой выживаемости при трансплантации клетки иммобилизуют на матрицах-носителях из биосовместимых материалов. Важным фактором успешной регенерации является создание оптимального микроокружения для клеток при трансплантации, что достигается введением в состав конструкции ростовых и дифференцировочных факторов, направленных в первую очередь на стимуляцию неоангиогенеза, а также привлечение и дифференцировку резидентных мезенхимальных предшественников. Таким образом, тканеинженерные эквиваленты костной ткани, с одной стороны, оказывают остеоиндуктивное действие за счет остеопрогениторных клеток и биологически активных факторов, что приводит к органотипической регенерации, а с другой стороны, они могут быть получены практически любого требуемого объема при минимально травматичном заборе первичного материала, т.е. их применение лишено недостатков аутопластики. Это позволяет считать тканевую инженерию наиболее перспективным направлением при лечении травматических и дегенеративных заболеваний костной ткани в настоящее время [Деев 2007; Howard 2008; Murphy, 2013].

1.2. Цель и задачи Цель исследования:

Целью исследования является разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, трехмерных пористых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для восполнения дефицита костной ткани.

Задачи исследования:

1. Получить культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям;

2. Провести иммунофенотипический анализ и оценку дифференцировочного потенциала культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

3. Оптимизировать время и условия остеогенной дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на основании динамики экспресии остеогенных маркеров и минерализации внеклеточного матрикса;

4. Изучить цитотоксический эффект трехмерных пористых полилактидных матриц-носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, в отношении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

5. Оценить адгезионные свойства и пролиферативную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на поверхности полилактидных носителей;

6. Разработать методику сборки тканеинжеиериой конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля;

7. Изучить формирование костной ткани на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечной трансплантации крысам тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля.

1.3. Научная новизна исследования

Впервые получена тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, дифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани.

Матрицы-носители на основе полиэфиров молочной кислоты, полученные методом поверхностно-селективного лазерного спекания, не оказывают цитотоксического действия на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, поддерживают адгезию и пролиферацию клеток.

Установлено, что на 14 сутки культивирования 1а,25-дигидроксивитамин БЗ оказывает выраженное остеогенное действие на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека в отличие от дексаметазона, повышая минерализацию внеклеточного матрикса и уровень экспрессии генов белков остеокальцина и остеопонтина.

С помощью ПЦР в режиме реального времени показано, что при действии 1а,25-дигидроксивитамина ЭЗ на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека,

9

максимальная экспрессия белков коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина, формирующих органический костный матрикс, выявляется на 7-14 сутки, а на 14-21 сутки наблюдается увеличение уровня экспрессии генов щелочной фосфатазы и костного морфогенетического белка ВМР-2.

Разработан протокол сборки тканеинженерной конструкции на основе дифференцированных в остеогенном направлении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и полилактидных носителей путем полимеризации в тромбоцитарном геле. Установлено, что концентрация клеток 4 млн на 1см3 конструкции обеспечивает высокую выживаемость клеток при in vitro культивировании и формирование костной ткани в условиях in vivo.

Впервые показано, что внутримышечная трансплантация крысам тканеинженерной конструкции, содержащей дифференцированные в остеогенном направлении аутологичные ММСК жировой ткани, трехмерные пористые полилактидные носители и тромбоцитарный гель, приводит к гетеротопическому формированию грубоволокнистой костной ткани на 30 сутки.

1.4. Практическое значение

Значение проведенных исследований для медицинской практики заключается в разработке и обосновании применения тканеинженерных конструкций на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани. Тканеинженерные конструкции, протокол изготовления которых разработан в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям, могут быть рекомендованы для проведения клинических исследований в травматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Практическое значение исследований также заключается в разработке протокола доклинической апробации имплантационных материалов с целью

создания на их основе тканевых эквивалентов для регенерации костной ткани. Протокол включает в себя три основных этапа: (1) исследование цитосовместимости матриц носителей на основании оценки их цитотоксичности, способности к поддержанию клеточной адгезии и пролиферации, (2) иммунофенотипическую и функциональную характеристику клеточной культуры с оценкой ее остеогенного потенциала и (3) экспериментальное изучение неоостеогенеза в гетеротопической локализации с участием клеточной культуры и матриц-носителей у животных.

По результатам работы разработана и зарегистрирована новая медицинская технология «Способ получения и хранения культуры мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека», авторы Гольдштейн Д.В., Ржанинова A.A., Бухарова Т.Б., Макаров A.B. (Разрешение на применение ФС № 2010/287 от 05.08.2010).

1.5. Положения, выносимые на защиту

Разработана тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, преддифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани.

Трехмерные пористые носители на основе полимолочной кислоты, полученные методом селективного лазерного спекания, характеризуются высокой биосовместимостью.

Инкубация в индуктивной среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин D3, в течение 14 суток приводит к эффективной остеогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

Тканеинженерная конструкция на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, дифференцированных

в остеогенном направлении, трехмерных полилактидных носителей и тромбоциторного геля при внутримышечной трансплантации крысам приводит к формированию грубоволокнистой костной ткани.

1.6. Апробация работы

Основные положения работы изложены на Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Ялта-Гурзуф, 2009 г); World Conference on Regenerative Medicine (Germany, Leipzig, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: