Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови

Волчков, Станислав Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови"

004613865

На правах рукописи

ВОЛЧКОВ СТАНИСЛАВ ЕВГЕНЬЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АДГЕЗИВНОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК АСПИРАТА КОСТНОГО МОЗГА, ЖИРОВОЙ ТКАНИ И ПУПОВИННОЙ/ПЛАЦЕНТАРНОЙ КРОВИ

03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология 14.03.10 Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

2 5 НОЯ 2010

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ОРЕНБУРГ 20

004613865

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», ГУЗ СО «Клинический центр клеточных технологий»

Научные руководители:

Официальные оппоненты

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Волова Лариса Теодоровна. кандидат медицинских наук, Тюмина Ольга Владимировна

доктор медицинских наук, профессор Сазонов Сергей Владимирович кандидат медицинских наук, Копылов Юрий Николаевич

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «01» декабря 2010 г. в 09.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», л

Автореферат разослан 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Шевлюк Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Современная медицина рассматривает область клеточных технологий как одну из самых перспективных. Со времени введения термина «стволовая клетка» (Максимов A.A., 1908) до первого клинического применения стволовых клеток прошло более 50 лет (Thomas E.D., 1957). Сегодня в мире активно обсуждаются вопросы клеточной медицины и биотехнологии. Наряду с гемопоэтическими клетками, перспективно использование мультипотентных мезенхимальных стромапьных клеток костного мозга (ММСК) (Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, American textbook of internal medicine; Kasper DL et al., 2008; Ichiro Sekiya, 2002). ММСК были обнаружены среди адгезивной фракции клеток стромы костного мозга (А.Я. Фриденштейн, 1968). В экспериментах in vitro была показана высокая пролиферативная активность этих клеток, а также их способность дифференцироваться в жировую, костную, хрящевую, нейрональную и мышечную ткань (Baksh D. et al., 2004; Bruno Delorme, 2009). В отдельных экспериментах удавалось дифференцировать эти клетки в кардиомиоциты, гепатоциты, инсулин-продуцирующие клетки (Bianco Р., 2001; Salamon А, 2009).

Создание банков клеток позволяет в качестве отдельного направления клеточных технологий применять метод тестирования различных материалов и лекарственных средств, используемых в медицине и трансплантологии на токсичность и биологическую совместимость. (Roeker S. et al., 2009; Manso-Silván M. et al., 2007; Ahmadi R. et al., 2008; Волова Л.Т., 2008)

В клинической практике ММСК применяются в гематологии при совместной трансплантации с гемопоэтическими клетками для уменьшения времени приживления трансплантата и нивелирования реакции «трансплантат против хозяина» (Schäfer R. et al., 2009; Le Blanc К., 2004), что значительно повышает эффективность трансплантаций. Перспективно применение ММСК в травматологии и ортопедии для лечения дефектов хрящевой ткани (Murdoch A.D. et al., 2007; Kevin B.L. Lee et al., 2007), костных дефектов (Cancedda R., 2003; Dennis J.E. et al., 2007), в нейрохирургии для лечения нейродегенеративных заболеваний (Bae J. et al., 2007; Coleman В. et al., 2007). В последних работах показано, что генетически модифицированные ММСК можно успешно применять для лечения некоторых генетических заболеваний (Samantha L. Ginn et al., 2005).

В настоящее время в клинических испытаниях преимущественно используются аутологичные ММСК аспирата костного мозга. Процедура получения материала достаточно травматична и может вызвать ряд нежелательных реакций (Bain B.J., 2001). В качестве альтернативного источника ММСК ряд авторов предлагает использовать аспират жировой ткани или пуповинную кровь (Kem S. et al., 2006). Однако отсутствие в доступной литературе полной сравнительной характеристики этих источников и наличие противоречивых данных о принадлежности получаемых клеток из жировой ткани и пуповинной крови к группе ММСК, а, следовательно, их биологических свойств, не позволяют использовать эти клетки в качестве альтернативы ММСК костного мозга для клинических и других видов исследований.

Таким образом, являются актуальными исследования направленные на доказательство принадлежности клеток из различных источников к группе ММСК, оценка потенциала

каждого источника для применения в клинической практике и тестирования биоматериалов и других средств медицинского назначения на биосовместимость и токсичность. Цель исследования

Проведение сравнительного анализа адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и плацентарной/пуповинной крови для определения оптимального источника мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для применения в области клеточных технологий. Задачи исследования

1. Охарактеризовать пролиферативную активность адгезивных клеток, полученных из разных источников с помощью комплекса морфологических методов исследования в зависимости от длительности культивирования и времени удвоения клеточной культуры.

2. Сравнить фенотипические характеристики и охарактеризовать дифференцировочный потенциал адгезивных клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови с помощью гистохимических и иммунологических методов исследования для определения принадлежности клеток к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

3. Определить уровни синтеза цитокинов во внеклеточной среде клеточной популяции аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови, характер изменений этих показателей в процессе культивирования с помощью иммунологических методов исследования.

4. Сравнить степень биологической совместимости и адгезивной способности изучаемых клеток к бионосйтелям из лиофилизированной костной матрицы ЬуоИазК® и титановой пружины (Металлорезина®) с использованием электронно-растровой микроскопии, провести исследование на совместимость имплантатов нитинол (N¡11) и нитинол с гидроксиапатитом (№"П+ОА) на мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках самого оптимального источника.

5. Провести комплексную сравнительную оценку адгезивной фракции клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови с позиции: биоэтичекой пригодности, доступности и стоимости получения материала, степени пролиферативной активности, направленной дифференцировки, совместимости с биологическими носителями.

Научная новизна

• Впервые на территории РФ получена сравнительная оценка фенотипа и дифференцировочной способности клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови в условиях одной лаборатории и в абсолютно идентичных условиях культивирования.

• Впервые были получены данные сравнительного анализа уровня синтезируемых цитокинов и их изменений в зависимости от длительности культивирования у всех групп клеток.

• Проанализированы в сравнительном аспекте комплексные морфологические и пролиферативные характеристики адгезивных фракций клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови, выведены формулы

определения максимально возможного количества удвоений культуры, получены индексы падения скорости пролиферации.

• Впервые проведено сравнение адгезивной совместимости клеток из трех источников на биоимплантатах ЬуоПавК®, имплантатах металлорезина®, показана эффективность метода тестирования совместимости материалов нитинол и нитинол с гидроксиапатитом на мультипотентных мезенхимальных клетках жировой ткани.

• Разработана и внедрена методика определения наличия, жизнеспособности и подвижности адгезивных клеток на имплантатах без использования методов электронной микроскопии (Рационализаторское предложение №97 от 27 сентября 2010г.).

• Впервые проведена комплексная сравнительная оценка адгезивных клеток из трех источников с использованием не только лабораторных методов исследования, но и с позиции биоэтики, доступности получения материала и перспективы их применения в области клеточных технологий.

Научно-практическая значимость

• Получены данные о максимально возможном количестве удвоений культуры клеток из различных источников, их индекса пролиферативной активности, что позволяет рассчитывать эффективность культивирования.

• Разработаны математические модели и функции, благодаря которым можно рассчитать максимально возможное количество удвоений культуры в пределах пролиферативной активности, вычислить индекс пролиферативной активности на любом этапе культивирования.

• Определены потенции дифференцировки в мезенхимном направлении (адипогенное, остеогенное, хондрогенное) и подтверждена специфическая экспрессия антигенов, что позволило отнести изучаемые клетки к группе мезенхимальных стромальных.

• Выявлена способность клеток из трех источников одинаково эффективно образовывать комбинированные клеточные имплантаты. Опытным путем доказана эффективность использования ММСК оптимального источника для тестирования имплантатов.

• Путем комплексного сравнительного анализа выявлен оптимальный источник мультипотентных мезенхимально стромальных клеток для применения в области клеточных технологий.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Адгезивные, фибробластоподобные клетки из костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани являются мультипотентыми мезенхимально стромальными клетками.

2. Клетки из всех трех источников успешно адгезируются и пролиферируют на материалах ЬуоРкв!®, Металлорезина® и Нитинол, образуя комбинированные имплантаты, и потенциальны для клинического применения как отдельно, так и в виде тканеинженерных конструкций, а так же могут быть использованы для тестирования материалов медицинского назначения.

3. Жировая ткань является самым эффективным источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с точки зрения биоэтичекой пригодности, доступности получения материала, степени пролиферативной активности, направленной дифференцировки, совместимости с биологическими носителями, перспективности

использования в области клеточных технологий, а также тестирования средств медицинского назначения.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Результаты диссертационного исследования используются в работе Государственного учреждения здравоохранения Самарской области «Клинический центр клеточных технологий», в учебном процессе кафедры челюстно-лицевой хирургии и стоматологии ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава, кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава. Практическое применение результатов работы реализовано в институте экспериментальной медицины и биотехнологий ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава, в Самарском филиале Физического института им. П.Н. Лебедева РАН, ГУЗ Оренбургская областная станция переливания крови.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были представлены на форуме "Лабораторная медицина: фундаментальные основы и современные технологии" (Самара, 2006); Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); XII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2007); Международной конференции «International Society for Cellular Therapy Annual Meeting» (Miami, Florida, 2008); Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008); Международном симпозиуме «Актуальные вопросы донорского и персонального хранения стволовых клеток» (Москва, 2009); Международной конференции «International Society for Cellular Therapy 16 th Annual Meeting» (Philadelphia, Pennsylvania. 2010);

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией министерства образования и науки РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию объектов и методов исследования, главы с описанием результатов работы, обсуждением результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертация изложена на 143 страницах, иллюстрирована 59 рисунками, содержит 21 таблицу. В работе использовано 220 источников (21 отечественный и 199 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на базе ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий». В качестве источника клеток были использованы костный мозг (15 образцов), жировая ткань (15 образцов), пуповинная кровь - 26 образцов, как наиболее изученные источники мультипотентных мезенхимальных клеток, из-за доступности материала. Все материалы получали после подписания информированного согласия пациентов (доноров), работа была проведена с учетом международных требований и в соответствии с Российскими этическими принципами и нормами.

Костный мозг получали у пациентов (доноров) -мужчин от 35 до 65 лет (Ме= 54 года), находящихся в отделении сосудистой хирургии СОКБ им М.И. Калинина по поводу лечения атеросклероза нижних конечностей. Пациенты участвовали в протоколе клинического исследования, по условию которого становились донорами костного мозга путем односторонней трепанобиопсии передней ости подвздошной кости, с учетом правил асептики и антисептики. Собранный костный мозг разбавляли в соотношении 1:1 антикоагулянтом CPDA (Baxter, США) в стерильных 50мл пробирках Falcon (BD, США). Транспортировка и обработка костного мозга проводилась не позднее 4 часов от момента сбора. Количество получаемого материала составило по Ме= 50,4 мл (п=15). Пуповинную/плацентарную кровь собирали в родильных домах города Самары у здоровых обследованных женщин (родильниц) для нужд банка пуповинной крови ГУЗ СО «Клинический центр клеточных технологий», согласно внутренним инструкциям, стандартам NETCORD и Приказу от 25 июля 2003 г. N 325 «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации». Процедура получения пуповинной/плацентарнои крови осуществлялась только при отсутствии осложнений в процессе родов и состоянии новорожденного не менее 5 баллов по шкале Апгар. Сбор крови проводили не позднее Зх минут после рождения ребенка и отсечения пуповины путем пунктировання вены пуповины набором для сбора пуповинной крови Terumo Blood collection system (Terumo, Япония), состоящего из мешка с антикоагулянтом CPDA и иглы диаметром 21G. Кровь транспортировали и обрабатывали не позднее 24 часов с момента сбора. Количество получаемого материала составило по Ме= 64,2 мл (п=26). Жировую ткань получали в косметологической клинике, после процедур липосакции с учетом правил асептики и антисептики. Донорами жировой ткани были женщины в возрасте от 30 до 55 лет (Me 42 года) без хронических заболеваний. После подписания информированного согласия на процедуру медицинского вмешательства и передачи биологических образцов ткани на исследование проводили процедуру липосакции, после чего полученный биологический материал был помещен в транспортную среду, содержащую питательную среду альфа-MEM (Биолот, Россия), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Биолот, Россия), 2 мМ L-аланил-глютамина (Панэко, Россия), пенициллин-стрептомициновую смесь (Панэко, Россия). Транспортировку и обработку жировой ткани проводили не позднее 4 часов от момента сбора. Количество получаемого материала составило по Ме= 32 гр (п=15).

Выделение клеток проводили в лаборатории, оснащенной комплексом «чистых» помещений класса Б или IS05, согласно ОСТ 42-510-98 и ISO 14644-1 соответственно. Получение клеток из костного мозга и пуповинной крови осуществляли методом центрифугирования на градиенте плотности (фиколл) 1.077 Ficoll-Plus (GE Healthcare, США), согласно инструкции производителя. Клетки из жировой ткани выделялись методом химической диссоциации с применением коллагеназы 2 типа.

Характеристика получаемого материала

В процессе исследования 15 образцов костного мозга с объемом Ме= 50,4 мл., мы обнаружили следующую картину распределения клеточных элементов крови до обработки (Табл. 1):

Таблица 1

Клеточный состав костного мозга

Le до обработки (1x106) Lym до обработки (1х106) Моп до обработки (1х106) MNC до обработки (1х106) N£8 до обработки (1x106) RBC до обработки (1x10®) PLT до обработки | (1х106)

СРЕДНЕЕ 307,46 87,41 29,68 117,1 190,36 1,75 78,4

МЕДИАНА 255 70.5 24 92,2 164,5 1,62 66

Ст. откл. 180,54 43,51 18,46 61,55 121,27 1,20 56,41

МИН. 90 30 8,5 38,5 48,9 0,73 23

МАКС. 652 152,5 62 214,5 447,2 5,68 264

25 % 135 44,2 12,4 56,6 83 0,9 48

75% 460 132,4 53 185.5 274,5 2,01 88

Примечание: Le - лейкоциты; Lym - лимфоциты: Мои - моноциты; MNC ~ мононуклеарные клетки; NEB — нейтрофилы, эозинофилы и базофилы; RBC - эритроциты: PLT- тромбоциты;

В пересчёте на объём образцов костного мозга лейкоциты по Ме составили 255x106, лимфоциты - 70,5x10®, моноциты - 24х106, мононуклеарные клетки составили 92,2x10'', нейтрофилы, эозинофилы и базофилы - 164,5x10®, эритроциты - 1,62х109, тромбоциты -66x106 клеток.

В группе пуповинной крови было получено 26 образцов с объемом Ме= 64,2 мл. Картина распределения клеточных элементов крови до обработки была следующей (Табл. 2):

Таблица 2

Клеточный состав пуповинной крови

Le до обработки (1x10е) Lym до обработки (1х106) Моп до обработки (1x10®) MNC до обработки | (1x10®) N£8 до обработки (1x10") RBC до обработки (1х109) PLT до обработки (1х10б)

СРЕДНЕЕ 169,65 53,75 19,83 73,58 96,06 1,51 101,73

МЕДИАНА 164 54,65 18,45 71,65 86,6 1,25 99

Ст. откл. 57,70 17,83 8,29 25,41 33,50 0,76 34,95

МИН. 90 30,6 7 38,2 46,3 0,6 66

МАКС 333 105,6 40,5 146,1 186,9 4,02 242

25% 120 38 14 50,6 71,1 1 86

75% 200 65 27,2 93,8 114,1 2 112

Примечание: Le — лейкоциты; Lym - лимфоциты; Mon - моноциты; MNC — мононуклеарные клетки; NEB — нейтрофилы, эозинофилы и базофилы; RBC—эритроциты; PUT— тромбоциты;

В пересчете на объем пуповинной крови, лейкоциты составили Ме= 164x106, лимфоциты - 54,65х106, моноциты - 18,45x10®, мононуклеарные клетки составили -71,65x10®, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы составили - 86,6x106, эритроциты - 1,25x109, тромбоциты - 99x106 клеток.

Жировой ткани было получено 15 образцов с весом по Ме= 32 грамма. Оценка клеточного состава полученного материала не осуществлялась ввиду невозможности

проведения анализа без дополнительных манипуляций с материалом (химическое выделение клеток)

Культивирование

Наращивание клеточного материала поводили по унифицированному протоколу для клеток всех источников. Для обеспечения стандартных условий для клеток разных источников в качестве среды культивирования была выбрана охарактеризованная, стандартизированная и оптимизированная для мезенхимальных стромальных клеток питательная среда NH Expansion médium фирмы Miltenyi Biotec (Германия). Клетки рассаживались на культуральные флаконы площадью до 175см2 Flask 175 (NUNC, Дания). Соотношение клеток на см2 посуды составлял: 40 тысяч мононуклеарных клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани (инициальный посев 10). Последующее культивирование проводилось с меньшей плотностью посева - 1000 клеток на см2. После посева культуральная посуда маркировалась идентификационным номером и помещалась в СО2 инкубатор Sanyo 20 AIC (Sanyo, Япония) с установленной температурой 37°С и 5% углекислоты. Оценка культуры проводилась ежедневно на исследовательском микроскопе Axio Observer.Al (Cari Zeiss, Германия). Смена питательной среды проводилась не реже 1 раза в неделю или при изменении цвета индикатора среды. Клетки культивировались до получения крупных колоний, по медиане - 12 дней для костного мозга, 22 - для пуповинной крови и 10 - для жировой ткани. Затем производили снятие клеток химическим методом, раствором трипсин-версена (Биолот, Россия).

ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение клеточного состава образцов пуповинной крови и костного мозга

Для исследования клеточного состава костного мозга и пуповинной крови использовался гематологический анализатор Pentra 60С+ (АВХ, Франция) с коммерческими реактивами этой же фирмы. Изучались следующие параметры: количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, количество лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов.

Исследование иммунофепотипа клеток

Анализ иммунофенотипа клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACS Canto (Becton Dickinson, США). Для определения антигенов на поверхности клетки применялись моноклональные антитела: фирмы Becton Dickinson - анти CD73, HLA - DR, меченные фикоэретрином (РЕ) и CD 90, HLA - ABC, меченные флюоресцеинизотиоцианатом (FITC); и анти CD38, меченный красителем РегСР - Су5.5. Антитела против антигенов CD 34 и 105 (РЕ) фирмы Becman Coulter (США);

Для анализа собирали не менее 200 тысяч клеток в культуральной среде, в качестве контроля использовались клетки, не обработанные антителами. Интерпретация показателей флюоресценции производились в программе FACS Diva 5.0.

Характеристика колониеобразующей функции клеток

Оценку колониеобразующей функции проводили методом культивирования клеток на коммерческих средах NH CFU-F фирмы Miltenyi Biotec (Германия) с последующим подсчетом колониеобразующих едишщ-фибробластов (КОЕ-Ф). Исследование проводилось на этапе инициального посева исследуемого образца. От исследуемого образца отбирали 200 тысяч клеток и помещали в два 25см2 культуральных флакона, по 100 тысяч клеток в каждый. Клетки культивировали в стандартных условиях в течение двух недель, со сменой среды каждые 3 дня. Для подсчета колоний культуру фиксировали спиртом, затем

окрашивали красителем Гимза (AppliChem, Германия). Колонии клеток подсчитывали« визуально и с помощью инвертированного микроскопа. Результат представляли в виде процентной концентрации КОЕ-Ф.

Определение жизнеспособности и морфометрия клеток Жизнеспособность и морфометрию рассчитывали на автоматическом анализаторе жизнеспособности и концентрации клеток Vicell XR (Becman Coulter, США). Определяли следующие данные: количество событий (клеток), окружность, циркулярность, цветовой показатель. На основании этих показателей происходил подсчет, оценка размеров и жизнеспособности клеток. Исследование проводилось при каждом пассаже, начиная с инициального. Получаемые значения использовали также для определения скорости удвоения клеток в культуре.

Морфологические, морфометрические методы исследования, кластеризация и time-

lapse

Оценка морфологии, морфометрии, кластерный анализ и исследования видеонаблюдения за клетками в реальном времени (Time-lapse), проводили на микроскопе исследовательского класса, Axio Observer.AI фирмы Carl Zeiss, Германия, оснащенного высокоскоростной видеокамерой, системой флюоресценции и системой инкубации. Для наблюдения за неокрашенной культурой клеток использовали следующие методы контрастирования: 1. Фазовый контраст; 2. ПласДик (PlasDIC). Морфологию клеток, а так же морфометрические параметры, такие как размер, площадь и форма клетки, наличие отростков оценивали каждые трое суток у всех исследуемых образцов на всех этапах культивирования. Кластерный анализ проводился на программном комплексе ImagePro PLUS (Media Cybernetics, США). Для этого проводили функцию выделения и определения площади клеток на фотографиях культур клеток. Программа в автоматизированном режиме рассчитывала популяции клеток и их соотношение, сортируя клетки по кластерам. Эксперименты time-lapse были проведены для одного образца клеток из каждого источника. Каждую культуру инкубировали не менее 7 дней. Полученный видеоматериал секвенировали, и с помощью программного комплекса Axio Vision и ImagePro Plus оценивали популяции клеток, а так же их деление.

Изучение дифференцировочного потенциала Оценку дифференцировочных потенций проводили с помощью метода культивирования на дифференцировочных средах фирмы Miltenyi Biotec (Германия), согласно инструкции производителя. Культивирование выполняли в 35 мм чашках и 48 луночных планшетах фирмы NUNC, в стандартных условиях. Смену среды проводили каждый третий день. Определение адипогенной дифференцировки оценивали по изменению морфологии клеток и методом окрашивания липофильным красителем Oil Red О (Sigma, США). Дифференцировку считали положительной, если в клетках появлялись крупные вакуоли, приобретающие красный цвет при окрашивании реактивом Oil Red О. Дифференцировку в остеобласты определяли по изменению морфологии клеток и определению щелочной фосфатазы, с помощью реагента FAST BCIP/NBT (Sigma, США). Изменение формы клеток с веретенообразного на кубический, а также окрашивание культуры клеток в чёрный цвет при обработке реагентом FAST BCIP/NBT свидетельствовало о положительной дифференцировке. Дифференцировку в хондробласты оценивали с

помощью иммунофлюоресцентной микроскопии, по экспрессии аггрекаиа (Abeam, США) -маркера хондробластов.

Выявление функции синтеза цитокинов

Оценку функции синтеза цитокинов проводили путем определения концентрации цитокинов в культуралыюй среде мультиплексным методом на аппарате Luminex 100 (Luminex, США). Были использованы наборы для определения 27 цитокинов (Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma, IL-10, IL-12 (p70), IL-I3, IL-15, IL-17, IL-lbeta, IL-lra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IP-10, MCP-1 (MCAF), MIP-lalfa, MIP-lbeta, PDGF bb, RANTES, TNF-alfa, VEGF), 27-plex assay, фирмы Bio-Rad (США). Исследование культуралыюй среды проводили для всех клеток на первом и втором пассаже, после достижения клетками монослоя.

Исследование клеток на биосовместимость, адгезию к имплантатам и тестирование изделий медицинского назначения

В качестве имплантатов использовались следующие материалы: 1. LyoPlast® -губчатая лиофилизированная кость, производства Банка тканей при СамГМУ; 2. Металлорезина® - нетканый титановый материал со сквозной пористостью, производства СГАУ и СамГМУ; 3. Нитинол (NiTi) - сплав никеля и титана и 4. НитинолГА (NiTI+GA) -сплав никеля, титана и гидроксиапатита, производства Самарского филиала Учреждения Российской академии наук «Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН»

Исследование осуществляли в два этапа. Для определения функциональных и биологических свойств клеток из трех источников на первом этапе проводили оценку биосовместимости и адгезивной способности клеток из всех трех источников к материалам LyoPlast® и Металлорезина® методом культивирования клеток на имплантатах. Для этого исследуемые материалы помещали в культуральную среду, затем добавляли исследуемые клетки в концентрации 1x106 на нмплантат. Культивирование проводили в 50 мл пробирках типа Фалькон в условиях инкубатора (+37°С, 5% COi) в течение 35-ти дней, со сменой среды каждую неделю или при изменении цвета индикатора среды. Оценку адгезии проводили на микроскопе Axio Observer А.1 на протяжении всего эксперимента, а также на электронно-сканирующем микроскопе FEI Quanta inspect S (FEI, Япония) на 24-32 сутки. Для этого клеточные препараты фиксировали 2,5% глютаровым альдегидом (Sigma, США), затем проводили обезвоживание восходящими концентрациями спиртов, после чего напыляли углерод и проводили исследование.

Для выявления возможности использования оптимального источника клеток (подобранного на основании результатов работы по определению оптимального источника ММСК) для проведения исследований по определению токсичности и биосовместимости средств медицинского назначения вторым этапом работы проводили оценку токсичности материалов Нитинол и Нитинол с гидроксиапатитом. В работе использовали клетки первого пассажа. Оценивали скорость пролиферации культуры, изменения морфологии, и способности клеток к миграции в присутствии имплантатов. Контрольной группой служили клетки без имплантатов.

Для выявления наличия клеток на материале проводился «эксплант» - тест, разработанный в ходе работы. Суть метода заключается в предварительном культивировании клеток на имплантате в малом объеме культуральной среды в пробирке с неадгезивным покрытием, в течение 24-48 часов. Такое культивирование способствует адгезии клеток к

исследуемому материалу. Следующим этапом имплаитат удаляется из питательной среды, троекратно отмывается в фосфатно-солевом буфере (рН 7.2-7.4) и переносится в новую культуральную посуду в стандартные условия культивирования. Дальнейшее культивирование идет по стандартным протоколам исследования, с ежедневным контролем появления клеток как на имплантате, так и пластике. Выявление клеток на пластике или имплантате свидетельствует о наличии жизнеспособных клеток, способных к миграции и пролиферации.

В работе по определению токсичности и биосовместимости материалов «нитинол» и «нитинол с гидроксиапатитом» проводили ежедневную съемку клеточных культур, оценку морфологии и кластерный анализ популяции клеток. Эксперимент Time-lapse проводился для имплантата нитинол и контрольной группы. Запись видео проводили в течение 4-х часов, со скоростью съемки 10 кадров в минуту. Кластерный анализ и оценка способности клеток к миграции проводили на программном комплексе ImagePro Plus.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ И МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

Предварительные расчёты осуществляли в программе MS EXCEL 2007 с последующим статистическим анализом в Пакете прикладных программ STATISTICA 6.0. Предварительный статистический анализ показал, что наиболее адекватным способом статистического анализа в данном случае является методология непараметрического анализа, так как большинство данных не имело нормального распределения или было представлено в процентах. Поэтому полученные данные были описаны с использованием таких статистических характеристик, как медиана (Me) и квартили (Ql - Q3); также приводятся среднее арифметическое (М), максимум и минимум, 95 % интервал, стандартные отклонения (о). Для оценки формы распределения исследуемых показателей использовался графический метод (визуальная оценка гистограмм распределения), оценивались показатели скошенности и крутизны, отражающие асимметрию распределения, тесты на нормальность с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса и Шапиро-Уилки. Одной из задач данного исследования являлось определение различий между изучаемыми показателями в зависимости от источника клеток. Для выполнения этой задачи использовался графический метод (диаграммы размаха, отражающие положение медианы, максимумов и минимумов, интерквартильный размах), а также непараметрические методы - медианный тест и критерий Крускал-Уоллиса.

На основании сведений о концентрации, размерах и жизнеспособности клеток, полученных из аппаратного комплекса ViCell XR и, используя следующую формулу

_ ppg Щ.УЙ) - log 10(.Vff 1) 1 подсчета удвоений культуры: 1вк10(2} ; где, NH - количество клеток

при посеве культуры (10); NH1 - количество полученных в ходе культивирования клеток (Р), мы получили данные о количестве удвоений культуры за время культивирования. Применив Ct

следующую формулу" И, где, Ct - продолжительность культивирования, час.; Dt -количество удвоений культуры, мы определили скорость удвоения культуры (удвоений/час) в течение рассчитанного выше количества удвоений (Vincent J, 1998).

Выстроив графики диаграмм рассеяния в программе Statistica и проанализировав данные, бьии получены значения (индексы) падения скорости и увеличения диаметра клеток

после каждого удвоения, а также максимальной скорости удвоений для каждой культуры клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ВЫДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК

Эффективность выделения клеток из пуповннной крови и костного мозга

Мультипотентные мезенхимальиые стромальные клетки (ММСК) по своим морфологическим характеристикам в неадгезированном состоянии относятся к группе лимфоцитов (Сар1ап АЛ., 1991). Соответственно, выделение мононуклеарной фракции клеток, к которой относятся и лимфоциты и ММСК, предпочтительнее всего. Оценка эффективности выделения мононуклеарной фракции клеток проводилась в виде отношения исходного количества клеток (до обработки) и оставшихся клеток (после обработки). Результаты оценки эффективности выделения клеток представлены в таблице 3.

Таблица 3

Эффективность выделения клеток из костного мозга (КМ) и пуповннной крови (ПК)

Источник получение мононуклеаров, % получение не мононуклеаров, %

Me Нижний Верхиий Me Нижний Верхний

квартиль квартиль квартиль квартиль

КМ 44,20 40,73 65,51 10,84 4,68 14,51

ПК 67,10 58,44 74,01 6,74 3,75 9,17

Анализ полученных результатов показал следующее: 1. Получение мононуклеарной фракции эффективнее из пуповннной крови (Ме= 67,10% у ПК, против 44.20% у КМ, р=0,0018); 2. Эффективность деплеции клеток гранулоцитарного ряда была выше в группе пуповннной крови (Me 93,26% у ПК, против 89,16% у КМ, р=0,019); Выявленные показатели соответствуют данным литературы (Quirici N, 2002; Tocci А, 2003). Эффективность выделения клеток из жировой ткани

Масса полученного материала составила по Ме= 32 грамма, количество выделенных клеток было по Ме= 1 538 496 клеток (1,5х106), или 48 078 клеток в пересчете на 1 грамм материала. Жизнеспособность клеток была по Ме= 86 %. Полученные данные сопоставимы с результатами работ других авторов (Kitagawa Y. et al., 2006; Fraser J.K. et al, 2006).

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА

Результаты исследования колониеобразующей функции

Результаты нашей работы по определению КОЕ-Ф из клеток костного мозга оказались схожими с данными литературы (Shinisuke Sakai et al., 2008; Caplan AI, 1991), в которых представлен схожий процент колониеобразующих единиц (0,00025%). В нашем случае КОЕ-Ф составили 0,0005% всех мононуклеарных клеток, частота получения колоний составила 100% (15 из 15 образцов КМ). Количество колониеобразующих единиц фибробластоподобных клеток из пуповннной крови оказалась значительно ниже, чем в костном мозге и жировой ткани (0,000059% всех мононуклеарных клеток). Кроме того, частота получения колоний оказалась крайне низкой (15,33%, 4 из 26 образцов ПК), полученные результаты были ниже по частоте (15,33% против 26%), но схожи по концентрации колониеобразования с работами других авторов (Perdikogianni С. et al., 2008;

Wexler S.A. et al., 2003). Представленные в литературе повышенные значения частот колониеобразования были связаны с добавлением в стандартные среды экзогенных факторов роста, в частности фактора роста фибробластов (FGF). Использование таких факторов увеличивает частоту колониеобразования, но в значительной степени повышает стоимость культивирования. Концентрация колониеобразующих клеток из жировой ткани оказалась самой высокой из всех анализируемых групп (0,25% всех клеток), частота получения колоний составила 100%. Полученные результаты несколько отличаются от результатов других авторов (Todd Е. Meyerrose et al., 2006) 0,25% против 0,35%, однако такие различия связаны с методами химической обработки.

Сравнение результатов исследования показало, что жировая ткань является самым , эффективным источником, а костный мозг менее перспективным источником КОЕ-Ф. Использование пуповинной крови без модификации существующих протоколов выделения КОЕ-Ф, неприемлемо (рис. 1,2).

КМ " . J

ПК

Источники клеток

Рисунок 1. Частота колониеобразования при культивировании клеток из разных

источников

ЖИР

ПК

источники клеток

Рисунок 2. Концентрация КОЕ-Ф из разных источников

Изучение пролиферативной активности клеток

Анализ морфологии адгезивных клеток показал типичную фибробластоподобную форму клеток у всех трех источников, что соответствует данным литературы (Huss R., 2000; Deans R.J., 2000; Dennis J.E., 2002). Клетки приобретали форму веретена, некоторые имели от одного до нескольких отростков, ядра клеток располагались эксцентрично. По мере увеличения сроков культивирования, а следственно и количества удвоений, происходило изменение морфологической картины клеток всех источников. Клетки увеличивали свою площадь и меняли форму на более прямоугольную, цитоплазма приобретала большее количество отростков, края которых заострялись. Результаты анализа видео time-lapse показали, что удвоение культуры клеток происходило в основном за счет деления клеток малого размера. Клетки средних размеров отличались сниженной скоростью деления. Клетки с большой площадью поверхности практически не участвовали в процессах деления. Увеличение размеров (площади) клеток и изменение их формы указывает на старение культуры (Rubin Н., 2002; Portugal R.D. et.al 2008). Морфометрические данные дополнили вышеуказанные результаты и подтвердили, что максимальной пролиферативной активностью обладают клетки с минимальной площадью, что соответствует данным литературы (Avanzini MA, 2009; Perez-Ilzarbe М, 2009;). Используя методы статистической обработки, впервые были получены математически рассчитанные максимальные скорости удвоений клеток, индексы падения скорости удвоения культуры после каждого удвоения, а также функция регрессии, с помощью которой определяли максимально возможное количество удвоений культуры для каждого источника клеток:

* » DTmcx-OTä х log ICi»);

где, DTmax - максимальная скорость удвоения культуры; DTd - индекс падения скорости удвоения; р - количество удвоений. Одновременно с определением

скорости удвоения было выявлено достоверное увеличение диаметра клеток после каждого удвоения. Полученные данные позволили нам прогнозировать эффективность и продолжительность культивирования клеток, а также рассортировать клетки по степени их пролиферативной активности.

При проведении сравнительного анализа пролиферативного потенциала клеток из трех источников мы рассчитали, что максимальным пролиферативным потенциалом обладают клетки пуповинной крови (ПК), так как они имеют самый высокий уровень пролиферативной активности - 0,1480 удвоений/час, и самое большое количество возможных удвоений культуры - 60 удвоений. Клетки костного мозга (КМ) обладают меньшей активностью, скорость их пролиферации составляет — 0,1375 удвоений/час, а максимальное количество возможных удвоений культуры - 31 удвоение. Самым низким пролиферативным потенциалом обладают клетки жировой ткани (ЖИР) - 0,0379 удвоений/час, максимально возможное количество удвоений культуры - 27 удвоений (рис. 3, 4):

ПК 60

ПК

Источники клеток

ЖИР

Рисунок 3. Максимальное возможное удвоение культуры клеток из трех источников

...ПК 0,1480

I 1

I <и

<и са

о «С

а >:

и Ф а. *

0.1500 -| 0,1000 "! 0,0500 -0,0000

ПК

Источники клеток

Рисунок 4. Максимально возможная скорость удвоения культуры клеток из трех

источников

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОФЕНОТИПА КЛЕТОК

Адгезивные клетки из костного мозга (КМ), пуповинной крови (ПК) и жировой ткани (ЖИР) не имели достоверных различий (р>0,05) в уровнях экспрессии изучаемых антигенов в течение всего срока культивирования. Клетки всех трех источников экспрессировали типичные маркеры стромальных клеток, что отражено на рисунке 5.

С0105 С014 СР34 С038 С073 С090 ША-АВС НЦА-ОК поверхностные антигены кластеров дифференцировки

Рисунок 5. Сравнительная экспрессия антигенов на клетках трех источников

У <

Маркеры поверхностных антигенов, характерных для ММСК, экспрессировались следующим образом: интенсивность флуоресценции (ИФ) маркера CD73 для костного мозга составила Ме= 15626,0 ИФ, процент культуры, экспрессирующий этот маркер Ме= 89,1%, для клеток пуповинной крови - 19013,0 ИФ и 98,8%, клеток жировой ткани - 12874,8 ИФ и 99,2% соответственно. Маркер CD90 - ИФ клеток костного мозга составила 28896,7 а процент культуры - 94,0%, пуповинной крови 28133,6 и 98,7%, жировой ткани 10843,3 и 98,3% соответственно. Для CD105 ИФ и процент культуры составили для клеток костного мозга 6457,2 ИФ и 66,3%, для пуповинной крови 10776,6 и 86,7%, для клеток жировой ткани 6746,3 ИФ и 84,9% соответственно. CD 38 на клетках костного мозга экспрессировался с интенсивностью 1120,1 ИФ и процентом культуры - 21,2%, клеток пуповинной крови -2324,6 ИФ и 25,3%, жировой ткани - 899,8 ИФ и 37,7% соответственно. Маркеры гемопоэтических клеток (CD 14, CD34, HLA-DR) не экспрессировались на клетках всех трех источников. Полученные данные не отличаются от данных других авторов (Baglioni S., 2009; Dominici М., 2009; Tormin А., 2009;)

Вышеуказанная экспрессия антигенов кластера дифференцировки на клетках из всех трех источников, согласно минимальным критериям для ММСК, принятых на международной конференции ISCT 2006, Berlin, и опубликованным в журнале Cytotherapy в 2006 году (Dominici М, 2006) указывает на принадлежность изучаемых клеток к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ КЛЕТОК

Позитивная дифференцировка в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлении является характерным признаком для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Адипогенная дифференцировка была позитивной среди всех клеток изучаемых групп (клетки костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани), что подтвердилось изменениями морфологии в виде увеличения площади клеток, изменения формы на кубическую, накопления липидных включений в области ядер клеток и позитивного окрашивания на липофильный краситель Olil Red О. Было выявлено, что для полной дифференцировки клеток пуповинной крови необходимо увеличивать время культивирования с 21 дня (по протоколу) до М=35±2 дня. Схожие результаты опубликованы другими авторами (Markov V., 2007). Остеогенная дифференцировка характеризовалась изменением морфологии на кубическую с большим количеством острых углов и отростков, а так-же позитивной реакцией на щелочную фосфатазу на всех клетках из трех источников. Хондрогенная дифференцировка оценивалась по наличию аггрекана в культурах клеток. Позитивная флюоресценция антител к аггрекану позволила подтвердить дифференцировку клеток всех трех источников. Также мы выявили тенденцию дифференцированных клеток к потере контакта с пластиком и образованию клеточных конгломератов.

Таким образом, исследуемые клетки из костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани показали успешную дифференцировку во всех стандартных мезенхимальных направлениях (остеогенное, адипогенное, хондрогенное), что указывает на их принадлежность к группе мультипотентных мезенхимальных клеток (Kern S., 2006; Dominici М„ 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ УРОВНЯ СИНТЕЗА ЦИТОКИНОВ

Впервые были получены результаты сравнительного анализа уровней синтеза цитокинов и их изменения в динамике среди адгезивных клеток костного мозга, пуповинной

крови и жировой ткани в условиях одной лаборатории и единого протокола культивирования. Нам не удалось выявить достоверные (р>0,05) количественные различия в уровнях синтеза цитокинов клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани: в таблице 4 указаны показатели концентрации цитокинов в культурах клеток всех источников. Однако были выявлены количественные изменения уровней цитокинов в зависимости от сроков культивирования клеток (Табл. 5).

Таблица 4

Концентрация цитокинов в культурах из трех источников ^/т!)

Цитокииы FGF basic IL-15 IL-17 IL-Ira IL-6 IL-8 MCP-1 (MCAF) VEGF Eotaxin IFN-gamma IP-10

Me (pg/ml) 7,72 5,85 5,6 190,1 26318 458,7 1157,6 1280,3 15,1 212,3 23,3

Ст. откл 2,38 1,02 2,8 121,3 4790,1 6720,6 388,9 746,4 3,0 38,9 27,4

Мин 5,49 4,64 4,5 116,1 6567,7 91,2 208,1 236,7 9,1 98,2 11,9

Макс 15,27 8,21 16,7 659,7 26318 20627 1157,6 2982,9 22.2 253,7 133,1

Таблица 5

Изменение концентрации цитокинов в процессе культивирования (pg/ml)

G-CSF GM-CSF IL-4 RANTES TNF-alfa

Пассаж 1 25,29 24,34 3,37 7,608 80,270

Пассаж 2 38,07 32,52 3,90 79,440 114,997

Достоверность p < 0,05 p < 0,05 p<0,01 p<0,01 p<0.01

Концентрация цитокинов G-CSF, GM-CSF, IL-4, RANTES, TNF-alfa, достоверно (р<0,05) менялась во время культивирования во всех исследуемых группах, кроме FGF basic, IL-15, IL-17, IL-Ira, IL-6, IL-8, MCP-1 (MCAF), VEGF, Eotaxin, IFN-gamma, IP-10, которые оставались без изменений (р>0,05).

Изменения концентраций цитокинов в кулътуральной среде из культуры костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани подтверждают способность клеток регулировать процессы гемопоэза и иммунологического ответа, стимулируют и регулируют пролиферацию, апоптоз, ангио- и васкуло- генез, что соответствует данным других авторов (Gwendal Lazennec et al., 2008; Giselle Chamberlain et al., 2007). Отсутствие различий в экспрессии цитокинов клетками всех трех источников свидетельствует о схожей биологической функции данных клеток.

Изменения в уровнях экспрессии (увеличение концентрации) цитокинов G-CSF, GM-CSF, IL-4, RANTES, TNF-alfa могут быть связаны с потерей регулирующей функции со стороны гемопоэтических клеток (отсутствие «обратной связи») при культивировании монокультуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОК К МАТЕРИАЛАМ

Результаты сравнительного исследования адгезивных свойств клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани на имплантатах были получены впервые. При исследовании способности клеток образовывать комбинированные имплантаты на материале LyoPlast®, в группе костного мозга мы впервые обнаружили признаки адгезивных клеток на

материале на 5-е сутки, в группе пуповинной крови на 6-е сутки, жировой ткани на 5-е стуки. Заселение имплантата ЬуоР^® клетками костного мозга проходило в течение 32 суток, пуповинной крови - 31 и жировой ткани - 32 суток. Клетки всех трех источников прорастали вглубь имплантата. В первую очередь наблюдалось равномерное заселение в небольших порах, крупные поры заселялись медленнее за счет нарастания клеток с периферии. На рисунке 6 стрелками показаны поры материала на 32 сутки культивирования, закрытые нарастающим друг на друга плотным слоем клеток из костного мозга.

Рисунок 6. Клетки из костного мозга, ЬуоР1а81®, 32 сутки культивирования, фазовый

контраст, об-в 5х, ок 10х.

На рисунке 7 отображен участок материала ЬуоР1аз1® на 32-е сутки культивирования, стрелками отмечены клетки из жировой ткани, равномерно покрывающие поверхность материала.

Рисунок 7. Сканирующая электронная микроскопия, LyoPIast®, 32 сутки культивирования, клетки жировой ткани, ув. 150

При использовании в качестве имплантата Металлорезины® первые признаки адгезивных клеток на материале мы обнаружили во всех группах на 3-й сутки

культивирования. Из-за высокой пористости материала мы смогли наблюдать и оценивать плавное нарастание клеток на материале. На 6-е стуки в группе костного мозга плотность заселения материала составила 5-10%, пуповинной крови 10% и жировой ткани также 10%. Полное зарастание материала (100%-е покрытие материала клетками) в группе костного мозга было зафиксировано на 25-е сутки, пуповинной крови на 24-е и жировой ткани на 26-е сутки культивирования. В сравнительном анализе скорости роста клеток на материале достоверной (р>0,05) разницы не наблюдалось. На рисунке 7 стрелками указаны клетки из пуповинной крови на 6-е сутки культивирования, послойно нарастающие между петлями материала.

Рисунок 8. Клетки из пуповинной крови на материале Металлорезина 6-е стуки культивирования, фазовый контраст, об-в 5х, ок 10х.

На рисунке 9 стрелками указаны клетки из костного мозга на 27-е сутки культивирования, равномерно закрывающие поры исследуемого материала.

Рисунок 9. Сканирующая электронная микроскопия, Металлорезина®, 27-е стуки культивирования, клетки костного мозга, ув. 200

Разница в скорости полного прорастания клеток на различных материалах объясняется различными свойствами самих материалов и их пространственной (трехмерной) организацией.

Адгезивные способности клеток костного мозга, пуповиной крови и жировой ткани позволяют использовать их при создании тканеинженерных конструкций для применения в области клеточных технологий, а так же при использовании для тестирования средств медицинского назначения.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА, ПУПОВИННОЙ

КРОВИ И ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Обобщая полученные данные, можно сказать, что все полученные клетки из различных источников относятся к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам, что подтверждено позитивной экспрессией стромальных маркеров СБ 73, 90, 105 и отсутствием гемопоэтических маркеров СБ 14, 34, Н1_А-ОЯ, положительной дифференцировкой в основные мезенхимальные направления (адипогенное, хондрогенное и остеогенное) и типичными морфологическими признаками.

Для определения наилучшего источника клеток для культивирования и последующего применения в области клеточных технологий мы построили сравнительную таблицу, в которой присваивали каждому источнику баллы (от 1 минимум, до 3 максимум) по следующим критериям:

• Варианты получения клеточного материала: ауто/алло - критерий, показывающий возможность получения аутологичного и аллогенного материала: 1 балл - только один вариант (ауто или алло), 2 балла - ауто и алло, с ограничением, 3 балла - ауто/алло

• Этичность получения - критерий, показывающий насколько этично получение этого материала: 1 балл - с нарушением этических норм, 3 балла - без нарушения этических норм;

• Травматичность получения - критерий, по которому оценивается опасность медицинских осложнений для донора материала: 1 балл - очень травматично, существуют риски осложнений, 2 балла - мало травматично, рутинная процедура со стандартными рисками осложнений, 3 балла - не травматично, не несет рисков для донора;

• Количество исходного материала - параметр, определяющий максимальное количество материала, которое можно получить у донора без увеличения медицинских рисков (в случае с КМ) или максимальное количество материала (в случае с ПК): 1 балл - не более 50 мл, 2 балла - не более 100 мл, 3 балла -100 мл и более

• Эффективность получения КОЕ-Ф - показатель частоты получения колоний при посеве первичной культуры: 1 балл - менее 100%, 3 балла - 100%

• Частота клеток КОЕ-Ф - параметр, показывающий концентрацию клеток - КОЕ-Ф в получаемом материале, баллы присваиваются по показателям: 1 балл - минимум, 2 балла - среднее количество, 3 балла - максимум.

• Пролиферативный потенциал - показатель скорости удвоения клеток и максимального количества удвоений культуры: 1 балл - минимальная активность, 2 балла - умеренная активность, 3 балла- максимальная активность;

• Дифференцировочный потенциал - показатель способности клеток дифференцироваться в мезенхимальных направления: 1 балл - одно мезенхимальное направление, 2 балла -два направления, 3 балла - во всех направлениях;

• Адгезивные способности - показатель, который указывает возможность создания комбинированных имплантатов: 1 балл - не образуют комбинированные конструкции, 2 балла - образуют только на одном исследуемом материале, 3 балла - образуют комбинированные конструкции на всех исследуемых материалах;

• Оценка стоимости получения клеточного материала - показатель, который показывает стоимость получения культуры клеток для возможного применения: 1 балл - увеличение стоимости получения культуры клеток, так как для ее получения необходимо менять условия или проводить большее количество культивирований, что приводит к удорожанию метода получения клеток, 3 балла - эффективно, получение клеток происходит в стандартных условиях без удорожания методик;

В таблице 6 указаны баллы, для каждого из изучаемых источников клеток.

Таблица 6

Сравнительный анализ клеток трех источников

-^Источник Критерий —^ Костный мозг Баллы КМ Пуповинная кровь Баллы ПК Жировая ткань 1 §

Варианты материала ауто/алло Ауто/алло 3 Ауто/алло, с ограничением 2 Ауто/алло 3

Этичность получения Этично 3 Этично 3 Этично 3

Травматичность получения Очень травматично 1 Не травматично 3 Мало травматично 2

Количество исходного материала минимальное 1 среднее 2 Практически неограниченное 3

Эффективность получения КОЕ-Ф 100% 3 15,33 % 1 100% 3

Частота КОЕ-Ф на 1 млн клеток смешанной популяции 0,0005% 2 0,000059% 1 0,25% 3

Пролиферативный потенциал средний 2 наивысший 3 наименьший 1

Дифференцировочный потенциал Полный 3 Полный 3 Полный 3

Адгезивные способности Ко всем материалам 3 Ко всем материалам 3 Ко всем материалам 3

Экономическая составляющая Эффективно 3 Не эффективно 1 Эффективно 3

Итого 24 22 27

Для получения интегральных показателей баллов проводили следующие расчеты колкктвд Здляо»

количество вопросов. Наилучшим источником, с точки зрения материала для культивирования и научно-исследовательского применения, мы считаем жировую ткань, которая имела интегральный показатель - 2,7. Следующим по эффективности стал костный мозг: - интегральный показатель - 2,4. Менее эффективным источником стала пуповинная кровь: с показателем - 2,2.

Основными показателями, повлиявшими на получение самой высокой интегральной оценки как источника ММСК - жировой ткани, стали: этичность получения материала, малая травматичность и большое количество первичного материала, что невозможно для пуповинной крови и костного мозга. Так, в среднем можно получить только 60 мл пуповшшой/плацентарной крови и 50 мл костного мозга, при увеличении объема получаемого КМ более 50 мл требуется проводить пункцию с использованием общей анестезии, что значительно увеличивает риск осложнений. Несмотря на минимальный пролиферативный потенциал жировой ткани, её максимальный процент частоты КОЕ-Ф и большое количество материала позволяют получать значительно большие (по сравнению с другими источниками) стартовые количества колониеобразующих клеток. Для сравнения, из 50 грамм жировой ткани можно получить 2 403 900 (2,4х106) клеток, 6009 КОЕ-Ф, из 50 мл пуповиной крови - 45x106 мононуклеарных клеток, 26,55 КОЕ-Ф, костного мозга - 50х106 клеток, 252 КОЕ-Ф. Такое количество колониеобразующих единиц позволяют даже при меньшем пролиферативном потенциале проводить наращивание быстрее и получать значительно большие количества необходимых клеток. Стоимость получения культуры также значимо повлияла на текущий выбор, так как в случае с жировой тканью недостатки пролиферативной активности компенсируются большим количеством КОЕ-Ф, а значит, в стандартных условиях культивирования возможно получение большего количества клеток. Клетки костного мозга по пролиферативному потенциалу менее эффективны, чем клетки из пуповинной крови, тем не менее, каждый образец костного мозга дает колонии необходимых клеток. В случае с пуповинной кровью только каждый пятнадцатый образец дает колонии, что соответственно в 6,6 раз увеличивает стоимость получения клеток. Например, затраты лаборатории на расходные материалы для получения культуры клеток в концентрации ЮхЮ6 составляют 14 834,00 руб. для клеток из костного мозга и 16 500,00 руб. для жировой ткани. В случае с клетками из костного мозга и жировой ткани частота получения колоний составляет 100%, что значит, что стоимость получения необходимых клеток составит 14 834,00 и 16 500,00 рублей соответственно. Затраты на выделение клеток пуповинной крови, как и в случае с костным мозгом, составляют 14 834,00 рубля, однако процент получения колоний - 15%. Соответственно, стоимость получения клеток составит (100/15)* 14 834 = 98 893,00 рубля. Немаловажным является и возможность получения аллогенного и аутологичного материала. В случае с костным мозгом и жировой тканью получение ауто- или алло- материала не составляет трудностей, так как процедуры получения материала отработаны, доступны, а эффективность получения необходимых клеток составляет 100%. В случае с пуповинной кровью гарантировать получение аутологичного материала невозможно, так как сбор пуповинной крови можно осуществить только один раз в жизни, во время родов, а частота получения клеток только около 15%. В случае, если необходим аллогенный материал пуповинной крови, потенциальному банку

необходимо будет обработать не менее 15 образцов пуповинной крови, что в 6,6 раз дороже, чем получение клеток из костного мозга или жировой ткани.

ТЕСТИРОВАНИЕ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ НА КЛЕТКАХ

ОПТИМАЛЬНОГО ИСТОЧНИКА

Результаты определения токсичности материалов «нитинол» и «нитинол с гироксиапатитом» при культивировании совместно с ММСК, методами морфометрии, кластерного анализа, вычисления пролиферативной активности, а так же оценки скорости миграции клеток в присутствии имплантатов на клетках из жировой ткани были получены впервые. Результаты применения «эксплант»-теста так же являются новыми и не публиковались другими авторами ранее. Результатом кластерного анализа явилось деление клеток на три группы (рис. 10):

1) первая группа клеток - «незрелые» молодые, активно делящиеся клетки, внешний вид таких клеток веретенообразный, площадь не более 8000 мкм , активно участвуют в делении и миграции (отображены на рисунке 10 красным цветом);

2) вторая группа - «взрослые» клетки, могут иметь треугольную или неправильную формы, площадь клеток свыше 8000, но не более 20000 мкм2, также участвуют в пролиферации и миграции, но значительно медленнее (отображены на рисунке 10 синим цветом);

3) третья группа - «гигантские клетки», имеют неправильную форму, заостренные края, очень большую площадь поверхности от 20000 и до 40000 мкм2, в редких случаях и выше, не участвуют в процессах деления, практически не мигрируют (отображены на рисунке 10 желтым цветом).

Рисунок 10. Клетки трех групп, кластерный анализ культуры

По морфологическим признакам был проведен анализ и отдельная выборка клеток на разных этапах созревания, характеризующая процесс старения. Справа налево и снизу вверх идут клетки, сортированные по возрасту, начиная с самой молодой (рис. 11).

Рисунок 11. Сортировка клеток по "зрелости"

В результате исследования в исследуемых группах было выявлено увеличение концентрации «гигантских» клеток, что свидетельствует об уменьшении пролиферативной активности культуры. В группе «нитинол» (N¡"10 она составила - 3,7%, «нитинол с гидроксиапатитом» (МЛЮА) - 6%, в контрольной группе - 0,03% (Табл. 7).

Таблица 7

Кластерный анализ концентрации групп клеток в исследуемых группах

Контроль «№п» «№ТЮА»

Гигантские клетки 0,03% 3,7% 6%

Взрослые клетки 39,4% 30,9% 35,4%

Незрелые клетки 60,6% 65,4% 58,6%

Результатом исследования пролиферации стало выявление снижения пролиферативной активности в группах с имплантатами. В группе имплантатов «нитинол» мы зафиксировали скорость удвоения 0,02 удвоений/час при общем количестве удвоений 10,63. В группе «нитинол с гидроксиапатитом» скорость удвоения составила 0,01 удвоения/час при общем количестве удвоений 7,60, что значительно ниже контрольной группы, где скорость удвоения составила 0,03 удвоения/час, при общем количестве удвоений 11,11 (Табл. 8).

Таблица 8

Пролиферативиая активность клеток в исследуемых группах

Контроль «N¡71» «ЮТЮА»

Удвоений в час 0,03 0,02 0,01

Количество удвоений 11,11 10,63 7,60

В результате оценки способности клеток к миграции было выявлено: в контрольной группе за 4 часа наблюдения клетки преодолевали дистанцию М= 350,42 мкм (минимум 78,70, максимум 768,65, с - 187,01). Клетки из серии «Нитинол» в схожих условиях прошли М= 42,49 мкм (минимум 8,17, максимум 153,89, а - 29,88, график не показан). Результатом «эксплант»-теста стала миграция и рост колонии ММСК с поверхности №Т1 на пластик культуральной посуды и появление клеток в мелких порах материала на 13-е сутки культивирования. В группе имплантата МГП-СА клетки выявлены не были. Результаты проведенной работы позволили выявить негативное влияние представленных имплантатов на пролиферативную активность, способность к миграции, а так-же морфологическое состояние культуры мезенхимальных стромальных клеток. Данное исследование не дает возможности установить причину негативного воздействия на клеточную культуру, однако позволяет не допустить потенциально токсический имплантат в клиническую практику.

Проведенная работа доказывает эффективность использования ММСК из жировой ткани для проведения тестирований средств медицинского назначения.

ВЫВОДЫ

максимально возможное количество удвоений культуры 31). Минимальной активностью обладают клетки жировой ткани (0,0344 удвоений/час, максимально возможное количество удвоений культуры -27).

2. На всех исследуемых клетках из костного мозга, пуповинной/плацентарной крови и жировой ткани выявлена одинаковая позитивная экспрессия стромальных антигенов CD73 М= 15837,9ИФ и 95,7% экспрессии, для CD90 М= 22624,5ИФ и 97% экспрессии, для CD 105 М= 7993,ЗИФ и 79,3% экспрессии, для CD38 М= 1448,1ИФ и 28% экспрессии, отсутствие экспрессии гемопоэтических маркеров CD 14, CD34, HLA-DR, а также успешная дифференцировка по основным мезенхимным направлениям (адипогенное, хондрогенное, остеогенное). Это позволяет отнести клетки всех трех исследуемых источников к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

3. Клетки, независимо от их источника, стабильно экспрессируют во внеклеточную среду цитокины FGF basic, IL-15, IL-17, IL-lra, IL-6, IL-8, MCP-1 (MCAF), VEGF, Eotaxin, IFN-gamma, IP-10. Концентрация цитокинов G-CSF (25,29 -> 38,07 pg/ml), GM-CSF (24,34 -» 32,52 pg/ml), IL-4 (3,37 — 3,90 pg/ml), RANTES (7,6 -» 79,4 pg/ml), TNF-alfa (80,2 114,9 pg/ml) достоверно (p<0,05) возрастает по мере культивирования.

4. Клетки из всех трех источников обладают сравнимой адгезивной и пролиферативной активностью на лиофилизированной костной матрице LyoPlast® и Металлорезнне®, образуют комбинированные трансплантаты и перспективны для использования в области клеточных технологий.

5. Жировая ткань является оптимальным источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с точки зрения этики, безопасности получения первичного материала и эффективности получения большого количества колониеобразующих клеток. В качестве альтернативы возможно использование клеток костного мозга. Использование пуповинной крови как источника ММСК в стандартных условиях получения и культивирования крайне не эффективно.

6. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из жировой ткани и других источников эффективны при использовании их для тестирования средств медицинского назначения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Учреждениям, заготавливающим мультпотентные мезенхимальные стромальные клетки для научной работы, тестирования материалов или клинических исследований, рекомендуется получать клетки из жировой ткани.

2. Производителям и разработчикам средств медицинского назначения рекомендуется проводить тестирование материалов на совместимость и токсичность с использовнием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани, костного мозга или пуповинной крови.

3. Лабораториям, проводящим тестирование средств медицинского назначения на совместимость и токсичность использовать «эксплант»-тест, в ходе которого можно определить наличие клеток на имплантате без дополнительного оборудования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волчков, С. Е. Сравнительная характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из разных источников / О. В. Тюмина, А. Н. Тороповский, Л. М. Трусова, П. В. Борискин, Л. Т. Волова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - № 3. - С. 8-9.

2. Корымасов, Е. А. Исследование эффективности трансплантации аутологичных прогенеторных клеток костного мозга больным с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / О. В. Тюмина, С. Е. Волчков, А. М. Аюпов, Г. В. Михеев, В. А. Россиев, А. В. Казанцев, А. Н. Торопоский // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток: материалы Всерос. конф. с междунар. участием, 18-20 июня 2008 г. - Самара, 2008. -С. 189-191.

3. Тороповский, А. Н. Жизнеспособность клеток пуповинной крови при долгосрочном криохранении / А. Н. Тороповский, О. В. Тюмина, С. Е. Волчков, Л. М. Трусова, П. В. Борискин // Актуальные вопросы последипломного образования и здравоохранения : материалы межрегаон. науч.-пракг. конф., посвящ. 25-летию Ин-та последипломного образования Самар. гос. мед. ун-та. - Самара, 2008. - С. 216-217.

4. Тороповский, А. Н. Оценка качества клеток пуповинной крови при обработке и криохранении / А. Н. Тороповский, О. В. Тюмина, С. Е. Волчков, Л. М. Трусова, П. В. Борискин // Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток : материалы Всерос. конф. с междунар. участием, 18-20 июня 2008 г. - Самара, 2008. - С. 226-228.

5. Тюмина, О. В. Оптимизация метода выделения концентрата стволовых клеток из пуповинной крови / В. Г.Савченко, Г. И. Гусарова, В. В. Павлов, М. И. Жарков, С. Е. Волчков, В. А. Россиев, Г. Н. Гридасов // Терапевтический архив. - 2005. - № 7. - С. 39-41.

6. Тюмина, О. В. Анаши лабораторного скрининга при 6aiжировании пуповинной крови / О. В. Тюмина, Г. И. Гусарова, В. В. Павлов, М. Н. Жарков, С. Е. Волчков, А. Н. Тороповский, Н. Н. Краснова, И. А. Нижегородцев!, В. А. Россиев, В. Г.Савченко // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - № 1. - С. 72-73.

7. Тюмина, О. В. Высокие технологии в практике здравоохранения Самарской области / О. В. Тюмина, С. Е. Волчков, А. Н. Тороповский // Вестник Самар. гос. ун-та. Естествешюнауч. сер. - 2006. - № 6/2 (46). - С. 5-18.

8. Тюмина, О. В. Внедрение оптимальных методов обработки и тестирования пуповинной крови / О. В. Тюмина, А. Н. Тороповский, С. Е. Волчков, Л. М. Трусова // Вестник Самар. гос. ун-та. Естествешюнауч. сер. - 2006. - № 6/2. - С. 18-25.

9. Тюмина, О. В. Работа банка пуповинной крови в Самарской области / О. В. Тюмина, С. Е. Волчков, Л. М. Трусова, А. Н. Тороповский, П. В. Борискин // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении : материалы ежегод. Всерос. и междунар. науч. конф., 30-31 мая 2007 г. / РАМН; Рос. гос. мед. ун-т. - М., 2007. - С. 40.

10. Тюмина, О. В. Организация банка пуповинной крови в Самарской области / С. Е. Волчков, А.Н. Тороповский, Л. М. Трусова, П. В. Борискин // Вопросы управления качеством медицинской помощи. -2007. -№ 1-2 (7-8).- С. 57-61.

11. Тюмина, О. В. Оценка эффективности методик обработки пуповинной крови / П. В. Борискин, С.Е. Волчков, А. Н. Тороповский, Л. М. Трусова // Онкогематологая. - 2008. - № 4. - С. 77.

12. Тюмина, О.В. Внедрение системы качества в работу публичного банка пуповинной крови / С. Е. Волчков, Л. М. Трусова, А. И. Тороповский, П. В. Борискин // Онкогематология. - 2008. -№4.-С. 78.

13. Tyumina, V. Randomized double blind placebo-controlled research of efficiency of treatment patients with lower limb arteriosclerosis obliterans by autologous transplantation of bone marrow progenitor cells / E. Korymasov, S. Volchkov., V. Rossiev, A. Kazantscev, A.N. Toroposkiy // Cytotherapy. -2008.-Vol. 10.-P. 236.

14. Toropovskiy, A. The influence of different factors on cord blood cells viability / A. Toropovskiy, O. Tyumina, L.Trusova,S. Volchkov, P. Boriskin//Cytotherapy.-2008.-Vol. 10.-P. 158.

15. Volchkov, S.E. Defining the best source of human multipotential mesenchymal stromal cells from cord blood, fat tissue and bone marrow / O.V. Tyumina, P.V. Boriskin, L.M. Trusova, A.N. Toropovskiy //Cytotherapy.-2010.-Vol. 12,-Supl. l.-P. 56.

Подписано к печати 28.10.2010. Формат А4 210x297 Печать офсетная. Усл.пл. 7. Заказ № 402 Тираж 140

Отпечатано в типографии ООО "ЦПР", г. Самара, Московское шоссе, 3, тел. (846) 276-85-92

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Волчков, Станислав Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Исторические аспекты в изучении стволовых клеток.

1.2. Современные представления о стволовых клетках.

1.3. Биологическая значимость стволовых клеток и их возможное применение в медицине.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объект исследования.

2.1.1. Получение биологического материала для выделения клеток.

2.1.2. Характеристика получаемого материала.

2.1.3. Выделение клеток.

2.1.4. Культивирование клеточного материала.

2.1.5. Замораживание и оттаивание клеток.

2.2. Лабораторно-методическая база исследований клеток из разных источников

2.2.1. Изучение клеточного состава биологических образцов пуповинной крови и костного мозга.

2.2.2. Исследование иммунофенотипа клеток.

2.2.3. Определение колониеобразующей функции.

2.2.4. Исследование жизнеспособности и морфометрия клеток.

2.2.5. Микроскопические методы исследования. Морфология; морфометрия, кластеризация и time-lapse.

2.2.6. Исследование дифференцировочного потенциала.

2.2.7. Определение функции синтеза цитокинов.

2.3. Исследование клеток на биосовместимость, адгезию к имплантатам и тестирование изделий медицинского назначения.

2.4. Статистическая и математическая обработка результатов исследования

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

3.1. Выделение клеток из всех источников.

3.1.1. Эффективность выделения клеток из пуповинной крови и костного мозга.

3.1.2. Эффективность выделения клеток из жировой ткани.

3.2. Культивирование клеточного материала из костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани.

3.2.1. Результаты исследования колониеобразующей функции.

3.2.2. Изучение пролиферативной активности клеток.

3.3. Исследование иммунофенотипа клеток.

3.4. Оценка дифференцировочного потенциала клеток.

3.5. Результаты оценки функции синтеза цитокинов.

3.6. Исследование клеток из различных источников на биосовместимость, адгезию к имплантатам и тестирование изделий медицинского назначения.

3.6.1. Изучение адгезивной способности клеток к биоматериалам.

3.6.2. Результаты тестирования средств медицинского назначения на клетках из оптимального источника.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Эффективность выделения клеток из пуповинной крови и костного мозга

4.3. Изучение колониеобразующей функции.

4.4. Морфология и пролиферативная активность клеток.

4.5. Иммунофенотипирование клеток.

4.6. Дифференцировочный потенциал.

4.7. Продукция цитокинов.

4.8. Адгезивнные свойства к материалам.

4.9. Сравнительный анализ клеток костного мозга, пуповинной крови и жировой ткани.

4.10. Тестирование средств медицинского', назначения на клетках опти-' мального источника.

ВЫВОДЫ.!.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови"

Актуальность темы

Современная медицина-рассматривает область клеточных технологий как одну из самых перспективных. Go времени; введениям термина; «стволовая клетка» (Максимов A.A., 1908) до первого клинического применения стволовых клеток прошло более 50 лет (Thomas E.D., 1957). Сегодня в мире активно обсуждаются» вопросы клеточной . медицины и биотехнологии. Наряду с гемопоэтическими; клетками, перспективно? использование мультипотентных мезенхим ал ьных стромальных клеток- костного* мозга (ММСК) (Harrison's Principles- of . Internal, Medicine, 17th Edition, American textbook of internal, medicine,. Rasper D.L., et al:, 2008; Ichiro Sekiya, 2002). ММСК были обнаружены среди адгезивной фракции клеток стромы костного мозга (А.Я. Фридешдтейн, 1968). В, экспериментах in vitro была, показана • высокая пролиферативная активность этих клеток, а также, их способность дифференцироваться в жировую, костную, хрящевую, нейрональную и мышечную ткань (Baksh D., et al.,. 2004; Bruno Delorme, 2009). В*отдельных; экспериментах^ удавалось дифференцировать эти : клетки в- кардиомиоциты, гепагоциты, инсулин-продуцирующие клетки; (Paolo Bianco, 2001; Salamon A., 2009).

Создание: банков клеток позволяет в качестве отдельного направления* клеточных технологий? применять метод тестирования раз личных материалов -> и; лекарственных средств, используемых в медицине и трансплантологии на токсичность, и,биологическую совместимость. (Roeker S., et al, 2009; Mänso-Silván Mí, ettal., 2007; Ahmadi R., et al., 2008; Волова Л.Т., 2008)

В клинической практике ММСК применяются в гематологии- при совместной трансплантации? с гемопоэтическими, клетками,для уменьшения времени приживления трансплантата; и нивелирования реакции «трансплантат против хозяина» (Schäfer Rl, et al., 2009; Le Blanc К., 2004), что значительно повышает эффективность трансплантаций. Перспективно применение ММСК в травматологии и ортопедии для лечения дефектов хрящевой ткани (Murdoch A.D., et al., 2007; Kevin B.L., Lee et al., 2007), костных дефектов (Cancedda R., 2003; Dermis J.E., et al., 2007), в нейрохирургии для лечения* нейродегенеративных заболеваний (Вае J., et al., 2007; Coleman В., et al., 2007). В ряде работ показано, что генетически модифицированные ММСК можно успешно применять для лечения некоторых генетических заболеваний (Samantha L Ginn et al., 2005).

В настоящее время в клинических испытаниях преимущественно используются аутологичные ММСК аспирата костного мозга. Процедура получения материала достаточно травматична и может вызвать, ряд нежелательных реакций (Bain B.J., 2001). В качестве альтернативного источника ММСК ряд авторов предлагает использовать, аспират жировой ткани или пуповинную кровь (Kern S., et al., 2006). Однако, отсутствие в доступной литературе полной сравнительной, характеристики этих источников и наличие противоречивых данных о принадлежности получаемых клеток из жировой ткани и пуповинной крови к группе ММСК, а, следовательно, их биологических свойств, не позволяет использовать эти клетки в качестве альтернативы- ММСК костного мозга для- клинических и других видов исследований.

Таким образом, является актуальным доказательство принадлежности клеток из различных источников к группе ММСК, определение значимости и потенциала каждого источника для применениям в клинической практике и тестирования биоматериалов и других средств медицинского назначения, на биосовместимость и токсичность.

Цель исследования:

Проведение сравнительного анализа адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и плацентарной/пуповинной крови для определения оптимального источника мультипотентных мезенхимально стромальных клеток для применения в области клеточных технологий.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать пролиферативную активность адгезивных клеток, полученных из разных источников с помощью комплекса морфологических методов исследования в, зависимости от длительности культивирования и-времени,удвоения клеточной культуры.

2. Сравнить фенотипические характеристики» и охарактеризовать дифференцировочный потенциал адгезивных клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и: пуповинной/плацентарной крови с помощью г гистохимических и иммунологических методов исследования; для определения принадлежности . клеток; к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

3. Определить,уровни синтеза?цитокинов во>внеклеточной среде клеточной популяции аспирата костного мозга-. жировой ткани • и пуповинной/плацентарной крови; характер изменений« этих- показателей»в процессе • культивирования? с помощью- иммунологических: методов исследования; •

4. Сравнить степень, биологической' совместимости. и адгезивной способности изучаемых клеток к бионосителям из; лиофилизированной костной матрицы ЬуоР1аз1® и титановой пружины, (Металлорезина®) с использованием« электронно-растровой микроскопищ провести исследование на совместимость- имплантатов нитинол (№П)и нитинол с гидроксиапатитом (МИ-ЮА) на мультипотентных. мезенхимальных стромальных клетках самого оптимального:источника.

5; Провести, комплексную сравнительную- оценку адгезивной: фракции клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной. крови« с позиции: биоэтичекой пригодности, доступности и стоимости получения материала, степени, пролиферативной активности^ направленной дифференцировки, совместимости с биологическими носителями.

Научная новизна:

Впервые на территории РФ получена сравнительная оценка фенотипа и дифференцировочной способности клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови в условиях одной лаборатории и в абсолютно • идентичных условиях культивирования.

Впервые были получены данные сравнительного анализа уровня синтезируемых цитокинов и их изменений в зависимости от длительности культивирования у всех групп клеток. Проанализированы в сравнительном аспекте комплексные морфологические и пролиферативные характеристики адгезивных фракций клеток из аспирата костного мозга, жировой ткани? и пуповинной/плацентарной крови, выведены формулы определения

1» максимально возможного количества удвоений культуры, получены индексы» падения-скорости'пролиферации.

Впервые проведено сравнение адгезивной совместимости клеток из трех источников на биоимплантатах- ЬуоР1аз1®, имплантатах металлорезина®, показана эффективность метода тестирования совместимости материалов нитинол и нитинол с гидроксиапатитом на-мультипотентных мезенхимальных клетках жировой-ткани. Разработана- и внедрена методика определения. наличия, жизнеспособности и подвижности адгезивных клеток- на имплантатах без использования методов электронной^ микроскопии (Рационализаторское предложение №97 от 27 сентября 2010г.). Впервые проведена комплексная сравнительная оценка адгезивных клеток из трех источников с использованием не только лабораторных методов исследования, но и с позиции биоэтики, доступности получения материала и перспективы их применения в области клеточных технологий.

Научно-практическая значимость:

• Определены потенции дифференцировки в мезенхимном направлении (адипогенное, остеогенное, хондрогенное) и подтверждена специфическая экспрессия антигенов, что* позволило отнести изучаемые клетки к группе мезенхимальных стромальных.

• Выявлена способность клеток, из? трех источников одинаково эффективно ■■ образовывать комбинированные клеточные имплантаты. Опытным путем , доказана эффективность использования ММСК оптимального «источника для тестирования имплантатов.

• Путем комплексного сравнительного анализа выявлен оптимальный « источник мультипотентных мезенхимально стромальных клеток для применения в области клеточных технологий. I

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Клетки из всех трех источников успешно адгезируются и пролиферируют на материалах ЬуоР1аз1®, Металлорезина® и Нитинол, образуя, комбинированные имплантаты, и потенциальны для клинического применения-как отдельно, так и в виде тканеинженерных конструкций, а так же могут быть использованы для тестирования материалов медицинского назначения. 3. Жировая ткань является самым эффективным источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток с точки зрения биоэтичекой пригодности, доступности получения материала, степени пролиферативной активности, направленной дифференцировки, совместимости с биологическими носителями, перспективности использования в области клеточных технологий, а также тестирования средств медицинского назначения.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на форуме "Лабораторная медицина: фундаментальные основы и современные технологии" (Самара, 2006); Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции. «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); XIL Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2007); Международной конференции «International Society for Cellular Therapy Annual Meeting» (Miami, Florida, 2008); Всероссийской конференции* с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008); Международном симпозиуме «Актуальные вопросы донорского и персонального хранения- стволовых клеток» (Москва, 2009); Международной конференции «International Society for Cellular Therapy 16 th Annual Meeting» (Philadelphia, Pennsylvania. 2010);

Внедрение результатов в практику

Результаты диссертационного исследования используются в работе Государственного учреждения здравоохранения Самарской области «Клинический центр клеточных технологий», в учебном процессе кафедры челюстно-лицевой. хирургии и стоматологии ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава, кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава. Практическое применение результатов работы реализовано в институте экспериментальной медицины и биотехнологий ГОУВПО «СамГМУ» Росздрава, в Самарском филиале Физического института им. П.Н. Лебедева РАН, ГУЗ Оренбургская областная станция переливания крови

Публикации

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав: в 1 главе проанализированы публикации по теме исследования; 2 глава посвященна описанию объектов и методов исследования; в 3,4 главе представлены и проанализированы полученные результаты, сформулированы выводы, предложены практические рекомендации.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Волчков, Станислав Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Максимальной пролиферативной активностью обладают клетки пуповинной крови (0,1480 удвоений/час, максимально возможное количество удвоений культуры - 60). Клетки костного мозга отличаются более низкой пролиферативной активностью (0,1375 удвоений/час, максимально возможное количество удвоений культуры 31). Минимальной активностью обладают клетки жировой ткани (0,0344 удвоений/час, максимально возможное количество удвоений культуры -27)

2. На всех исследуемых клетках из костного мозга, пуповинной/плацентарной крови и жировой ткани выявлена одинаковая позитивная экспрессия стромальных антигенов CD73 М= 15837,9ИФ и 95,7% экспрессии, для CD90 М= 22624,5ИФ и 97% экспрессии, для CD105 М= 7993,ЗИФ и 79,3% экспрессии, для CD38 М= 1448,1ИФ и 28% экспрессии, отсутствие экспрессии гемопоэтических маркеров CD 14, CD34, HLA-DR, а также успешная дифференцировка по основным мезенхимным направлениям (адипогенное, хондрогенное, остеогенное). Это позволяет отнести клетки всех трех исследуемых источников к группе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

3. Клетки, независимо от их источника, стабильно экспрессируют во внеклеточную среду цитокины FGF basic, IL-15, IL-17, IL-Ira, IL-6, IL-8, MCP-1 (MCAF), VEGF, Eotaxin, IFN-gamma, IP-10. Концентрация цитокинов G-CSF (25,29 38,07 pg/ml), GM-CSF (24,34 32,52 pg/ml), IL-4 (3,37 -> 3,90 pg/ml), RANTES (7,6 79,4 pg/ml), TNF-alfa (80,2 -> 114,9 pg/ml) достоверно (p<0,05) возрастает по мере культивирования.

4. Клетки из всех трех источников обладают сравнимой адгезивной и пролиферативной активностью на лиофилизированной костной матрице LyoPlast® и Металлорезине®, образуют комбинированные трансплантаты и перспективны для использования в области клеточных технологий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Волчков, Станислав Евгеньевич, Оренбург

1. Волова, Л. Т. Биологическая система оценки качества биоимплантантов с помощью клеточных технологий Текст. / Л. Т. Волова // Успехи современного естествознания. — 2008. — № 5. С. 86-88.

2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика Текст. / С. Гланц. — М. : Практика, 1999. 459 с.

3. Деев, Р. В. Посттравматическая регенерация костной ткани при трансплантации культуры костномозговых стромальных клеток (экспериментальное исследование) Текст. : дис. .канд. мед. наук : 03.00.25, 14.00.22 / Р. В. Деев. СПб., 2006. - 126 с.

4. Лекарственные препараты в России Текст. : справ. Видаль / ред,-сост. Н. Б. Николаева и др. — М. : АстраФармСервис, 1999. — 1166 с.

5. Максимов, А. А. Основы гистологии Текст. / А. А. Максимов. — СПб : [Б. и.], 1908.-614 с.

6. Максимов, А. А. Основы гистологии Текст. Ч. 1. Учение о клетке / А. А. Максимов. Петроград : [Б. и.], 1917. - 401 с.

7. Медик, В. А. Специальные вопросы методологии статистического анализа в биомедицинских исследованиях Текст. / В. А. Медик, Б. Б. Фишман // Проблемы управления здравоохранением. — 2004. — № 14. — С. 78-82.

8. П.Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных Текст. : применение пакета прикладных программ «STATISTICA» / О. Ю. Реброва. М.: Медиа сфера, 2003. - 312 с.

9. Руководство по гематологии Текст. : в 3 т. Т. 1 / под ред. А. И. Воробьева. 3-е изд., перераб. и доп. — М. : Ньюдиамед, 2002. 280 с.

10. Румянцев, А. Г. Трансплантация пуповинной крови у детей с различными заболеваниями Текст. / А. Г. Румянцев, А. А. Масчан, 3. М. Дышлевая и др. // Биотехнология и онкология : сб. материалов I рос. -амер. конф., 29-31 мая 2005 г. СПб., 2005. - С. 59-60.

11. Румянцев, А. Г. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей Текст. / А. Г. Румянцев, А. А. Масчан. М. : МИА, 2003. - 921 с.

12. Стволовые клетки. Некоторые биологические особенности и терапевтические возможности Текст. // Е. Е.Зуева, А. В. Куртова, JI. С. Комарова // Гематология. 2005. - № 11 (Т.6). - С. 705-724.

13. Стрижаков, А. Н. Пуповинная кровь — источник стволовых клеток Текст. / А. Н. Стрижаков, Д. М. Мхеидзе, Е. В. Тимохина, В. В. Гришина // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2003. — Т. 2, № 4. -С. 33-37.

14. Углов, Б. А. Основы статистического анализа и математического моделирования в медико-биологических исследованиях Текст. / Б. А. Углов, Г. П. Котельников, М. В. Углова. Самара : СГМУ, 1994. - 35с.

15. Фриденштейн, А. Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки предшественники Текст. / А. Я. Фриденштейн, К. С. Лалыкина. — М. : Медицина, 1973. 223 с.

16. Фриденштейн, А. Я. Клетки предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга Текст. / А. Я. Фриденштейн, К. В. Петракова, А. И. Куралесова, Г. П. Фролова // Цитология. 1968. - № 5. - С. 557-567.

17. Фриденштейн, А. Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения Текст. / А. Я. Фриденштейн, Е. А. Лурия. М. : Медицина, 1980. - 213 с.

18. Чертков, И. JI. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение Текст. / И. Л. Чертков, О. А. Гуревич. М. : Медиум, 1984. - 238 с.

19. Ahmadi, R. Biocompatibility and gelation of chitosan-glycerol phosphate hydrogels Text. // R. Ahmadi, J. D. de Bruijn // J. Biomed. Mater. Res. A.2008. Sep.(3). - P. 824-832.

20. Amabile, G. Induced pluripotent stem cells: current progress and potential for regenerative medicine Text. / G. Amabile, A. Meissner // Trends. Mol. Med.2009. Feb. 15(2). - P. 59-68 ; Epub. - 2009. - Jan 21.

21. Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells Text. / M. Amit, V. Margulets, H. Segev, K. Shariki, I. Laevsky, R. Coleman, J. Itskovitz-Eldor // Biol. Reprod. 2003. - Jun. 68(6). - P. 2150-2156 ; Epub. - 2003. - Jan. 22.

22. Angoulvant, D. Human mesenchymal stem cells suppress induction of cytotoxic response to alloantigens Text. / D. Angoulvant, A. Clerc, S. Benchalal et al. // Biorheology. 2004. - Vol. 41. - P. 469-476.

23. Anthony, S. Fauci. Harrison's Principles of Internal Medicine Text. / S. Fauci Anthony //American textbook of internal medicine. — 17th Edition. — McGraw-Hill Medical, 2008.

24. Arslan, O. Mobilization of peripheral blood stem cells Text. / O. Arslan, R. Moog // Transfus Apher Sci. 2007. - Oct. 37(2). - P. 179-85 ; Epub. - 2007. -Nov. 5.

25. Bae, J. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote Neuronal Networks with Functional Synaptic Transmission After Transplantation into Mice with Neurodegeneration Text. / J. Bae, H. S. Han, D. Youn // Stem Cells. 2007. -Vol. 25-P. 1307-1316.

26. Bain, B. J. Bone marrow aspiration Text. / B. J. Bain // J. Clin. Pathol. -2001. -Sep. 54(9). P. 657-663.

27. Bain, B. J. Bone marrow aspiration Text. / Bain B. J. // J. Clin. Pathol. -2001. -Sep. 54(9). -P. 657-63.

28. Bain, B. J. Bone marrow biopsy morbidity and mortality Text. / B. J. Bain // Br. J. Haematol. 2003. - Jun. 121(6). - P. 949-951.

29. Bain, B. J. Bone marrow biopsy morbidity: review of 2003 Text. / B. J. Bain // J. Clin. Pathol. 2005. - Apr. 58 (4). - P. 406-408.

30. Bain, B. J. Bone marrow trephine biopsy Text. / B. J. Bain // J. Clin. Pathol.-2001.-Oct. 54(10).-P. 737-742.

31. Baksh, D. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy Text. / D. Baksh, L. Song, R. S.Tuan// J. Cell. Mol. Med. Cytotherapy. 2004. - Jul-Sep (8). - P. 301-316.

32. Ballas, C. B. Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies: implication for greater use Text. / C. B. Ballas, S. P. Zielske, S. L. Gerson // J. Cell Biochem. 2002. - Vol. 38 (suppl). - P. 20-28.

33. Barker, J. N. Umbilical cord blood transplantation: current practice and future innovations Text. / J. N. Barker, J. E. Wagner // Crit. Rev. Oncol. Hematol. -2003.-Vol. 48.-P. 35-43.

34. Bartholomew, A. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo Text. / A. Bartholomew, C. Sturgeon, M. Siatskas et al. // Exp. Hematol. 2002. - Vol. 30. -P. 42-48.

35. Becker, A. J. Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells Text. / A. J. Becker, E. A. McCulloch, J. E. Till // Nature. 1963. - Feb. 2. - P. 452-454.

36. Bernardo, A. S. Stem cells and metabolic disease Text. / A. S. Bernardo // Biochem. Soc. Trans. 2008. - Jun. 36 (Pt 3). - P. 363-365.

37. Bhatia, R. Mesenchymal stem cells : future source for reparative medicine Text. / R. Bhatia, J. M. Hare // Congest Heart Fail. 2005. - Vol. 11. - P. 87-91, quiz 92-93.

38. Bianco, P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications Text. / P. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos, P. G. Robey // Stem Cells.-2001.-Vol. 19. P. 180-192.

39. Bieback, K. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood Text. / K. Bieback, S. Kern, H. Kluter et al. // Stem Cells. 2004. - Vol. 22. - P. 625-634.

40. Bradford, G. B. Quiescence, cycling, and turnover in the primitive hematopoietic stem cell compartment Text. / G. B. Bradford, B. Williams, R. Rossi, I. Bertoncello // Exp Hematol. 1997. - Vol. 25. - P. 445-453.

41. Bremer, S. The use of embryonic stem cells for regulatory developmental toxicity testing in vitro — the current status of test development / S. Bremer, T. Härtung // Curr. Pharm. Des. 2004. - № 10. - P. 2733-2747.

42. Bruder, S. P. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells Text. / S. P. Bruder, A. A. Kurth, M. Shea et al. // J. Orthop. Res. 1998. - Vol. 16. - P. 155-162.

43. Bruder, S. P. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects Text. / S. P. Bruder, K. H. Kraus, V. Goldberg et al. // J. Bone Joint. Surg. Am. 1998. - Vol. 80. - P. 985-996.

44. Buitrago-Pérez, A. Molecular Signature of HPV-Induced Carcinogenesis: pRb, p53 and Gene Expression Profiling Text. / A. Buitrago-Pérez, G. Garaulet, A. Vázquez-Carballo, J. M. Paramio, R. García-Escudero // Curr Genomics. -2009. Mar. 10(1).-P. 26-34.

45. Cancedda, R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone Text. / R. Cancedda, B. Dozin, P. Giannoni, R. Quarto // Matrix Biol. 2003. -Mar. 22(1).-P. 81-91.

46. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells Text. / A. I. Caplan // J. Orthop. Res. 1991. - Sep. 9 (5). - P. 641-650.

47. Cavazzana-Calvo, M. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-Xl disease Text. / M. Cavazzana-Calvo, S. Hacein-Bey, B. G. de Saint, F. Gross, E. Yvon, P. Nusbaum, F. Selz, C. Hue, S. Certain, J.

48. Casanova, P. Bousso, F. L. Deist, A. Fischer // Science. 2000. - Vol. 288. - P. 669-672.

49. Chen, L. Current progress and prospects of induced pluripotent stem cells Text. / L. Chen, L. Liu // Sci. China C. Life Sci. 2009. - Jul. 52(7). - P. 622636.

50. Clarke, D. L. Generalized potential of adult neural stem cells Text. / D. L. Clarke, C. B. Johansson, J. Wilbertz, B. Veress, E. Nilsson, H. Karlstrom, U. Lendahl, J. Frisen // Science. 2000. - № 288. - P. 1660-1663.

51. Coleman, B. Concise review: the potential of stem cells for auditory neuron generation and replacement Text. / B. Coleman, M. G. de Silva, R. K. Shepherd // Stem Cells. 2007. - Nov. 25(11). - P. 2685-2694.

52. Colter, D. C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow Text. / D. C. Colter, R. Class, C. M.

53. DiGirolamo et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 32133218.

54. D'Ippolito, G. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal cells from human vertebral bone marrow Text. / G. D'Ippolito, P. C. Schiller, C. Ricordi et al. // J. Bone Miner. Res. 1999. - Vol. 14. - P. 1115-1122.

55. Daadi, M. M. Adherent self-renewable human embryonic stem cell-derived neural stem cell line: functional engraftment in experimental stroke model Text. / M. M. Daadi, A. L. Maag, G. K. Steinberg // PLoS One. 2008. - Feb. 20(2). - P. 1644.

56. Deans, R. J. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses Text. / R. J. Deans, A. B. Moseley // Exp. Hematol. 2000. - Aug. 28(8). - P. 875-84.

57. Dennis, J. E. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential Text. / J. E. Dennis, J. P. Carbillet, A. I. Caplan, P. Charbord //Cells Tissues Organs. -2002. Vol. 170 (2-3). - P. 73-82.

58. Devine, S. M. Mesenchymal stem cells: Will they have a role in the clinic? Text. / S. M. Devine // J. Cell Biochem. Suppl. 2002. - Vol. 38. - P. 73-79.

59. Dexter, T. M. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro Text. / T. M. Dexter, T. D. Allen, L. G. Lajtha // J. Cell Physiol. -1977.-Vol. 91.-P. 335-344.

60. Dominici, M. Heterogeneity of multipotent mesenchymal stromal cells: from stromal cells to stem cells and vice versa Text. / M. Dominici, P. Paolucci, P. Conte, E. M. Horwitz // Transplantation. 2009. - May 15, 87(9 Suppl). - P. 36-42.

61. Ellor, S. Stem cell therapy for inherited metabolic disorders of the liver Text. / S. Ellor, T. Shupe, B. Petersen // Exp. Hematol. 2008. - Jun. 36 (6). - P. 716-25 ; Epub. - 2008. - Apr. 2.

62. Erices, A. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood Text. / A. Erices, P. Conget, J. J. Br. Minguell // J. Haematol. 2000. - Vol. 109. -P. 235-242.

63. Evans, M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos Text. / M. Evans, M. Kaufman // Nature. 1981. - Jul. 9 (292). - P. 154-156.

64. Folkman, J. Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs Text. / J. Folkman // Circulation. 1998. - Vol. 97. - P. 1108-1110.

65. Fraser, J. K. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology Text. / J. K. Fraser, I. Wultur, Z. Alfonso, M. H. Hedrick // Trends Biotechnol.-2006.-Vol. 24.-P. 150-154.

66. Friedenstein, A. J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs Text. / A. J. Friedenstein, J. F. Gorskaja, N. N. Kulagina // Exp. Hematol. 1976. - Vol. 4. - P. 267-274.

67. Friedenstein, A. J. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells Text. / A. J. Friedenstein, I. I. Piatetzky-Shapiro, K. V. Petrakova // J. Embryol. Exp. Morphol. -1966. Dec. 16 (3). - P. 381-390.

68. Ginn, S. L. Treatment of an infant with X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-X1) by gene therapy in Australia Text. / S. L. Ginn, J.

69. A. Curtin, B. Kramer, C. M. Smyth, M. Wong, A. Kakakios, G. B. McCowage, D. Watson, S. I. Alexander, M. Latham, S. C. Cunningham, M. Zheng, L. Hobson, P.

70. B. Rowe, A. Fischer, M. Cavazzana-Calvo, S. Hacein-Bey-Abina, I. E. Alexander // Med. J. Aust. 2005. - May 2 (9). - P. 458-463.

71. Gronthos, S. The biology and application of human bone marrow stromal cell precursors Text. / S. Gronthos, P. J. Simmons // J. Hematother. 1996. - Vol. 5.-P. 15-23.

72. Guo, T. Stem Cells to Pancreatic Cells : New Sources for Diabetes Cell Therapy Text. / T. Guo, M. Hebrok // Endocr. 2009. - Rev. 30. - P. 214-227.

73. Gwendal Lazennec. Concise Review: Adult Multipotent Stromal Cells and Cancer: Risk or Benefit? Text. / Gwendal Lazennec, Christian Jorgensen // Stem Cells. 2008. - Vol. 26. - P. 1387-1394.

74. Hacein-Bey-Abina, S. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy Text. / S. Hacein-Bey-Abina, F. Le Deist, F. Carlier et al. // N. Engl. J. Med. 2002. - Apr. 18. - P. 1185-1193.

75. Haynesworth, S. E. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies Text. / S. E. Haynesworth, M. A. Baber, A. I. Caplan // Bone. 1992. - Vol. 13. - P. 69-80.

76. Hertzog, R. G. Ancestral telomere shortening: a countdown that will increase mean life span? Text. / R. G. Hertzog // Med. Hypotheses. 2006. - № 67(1). - P. 157-160; Epub.-2006.-Mar. 10.

77. Heyden, von H. W. Differentiation and cell growth by symmetrical and asymmetrical mitosis: a hypothesis / H. W. von Heyden, D. von Heyden // Perspect Biol Med.-1973.-Spring 16(3).-P. 348-356.

78. Horowitz M. M. Uses and growth of hematopoietic cell transplantationj Text. / M. M. Horowitz // Forman, S. J., ed. Hematopoietic cell transplantation. -Second ed. Maiden, MA : Blackwell Science Inc., 1999. - P. 12-18.

79. Huang, J. I. Chondrogenic potential of progenitor cell derived from human bone marrow and adipose tissue: a patient-matched comprsion Text. / J. I. Huang, N. Kazmi, M. M. Durbhakula // J. Orthop. Res. 2005. - Vol. 23. - P. 383-389.

80. Human Cell Differentiation Molecules Electronic resource. : база данных по молекулам кластера дифференцировки. — Режим доступа : http://www.hcdm. org/MoleculeInformation/tabid/54/Default.aspx. Загл. с экрана.

81. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells Text. / R. Huss // J. Hematother. Stem. Cell Res. 2000. - Dec. 9 (6). -P. 783-793.

82. Hviid Nielsen, T. What happened to the stem cells? Text. / T. Hviid Nielsen // J. Med. Ethics. 2008. - № 34. - P. 852-857.

83. Ianus, A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion Text. / A. Ianus, G.G. Holz, N. D. Theise, M. A. Hussain // J Clin Invest. 2003. - Vol. 111. - P. 843-850.

84. Im, G. I. Do adipose-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as a bone marrow-derived cells? Text. / G. I. Im, Y. W. Shin, К. B. Lee // Osteoarth. Cart. -2005. Vol. 13. - P. 845-853.

85. Jalving, M. Induced pluripotent stem cells: will they be safe? Text. / M. Jalving, H. Shepers // Curr. Opin. Mol. Ther. 2009. - Aug. 11(4). - P.383-393.

86. Jancär, J. Mechanical response of porous scaffolds for cartilage engineering Text. / J. Jancär, A. Slovikovä, E. Amler, P. Krupa, H. Kecovä, L. Plänka, P. Gäl, A. Necas // Physiol. Res. 2007. - Vol. 56, Suppl 1. P. 17-25 ; Epub. 2007. - May 31.

87. Kadiyala, S. Culture-expanded, bone marrow derived mesenchymal stem cells can regenerate a critical-sized segmental bone defect Text. / S. Kadiyala, N. Jaiswal, S. P. Bruder// Tissue Eng. 1997. - Vol. 3. - P. 173-185.

88. Kern, S. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue Text. / S. Kern, H. Eichler, J. Stoeve, H. Klüter, K. Bieback // Stem Cells. 2006. - May 24(5). - P. 1294-1301.

89. Kevin, B. L. Injectable Mesenchymal Stem Cell Therapy for Large Cartilage Defects-A Porcine Model Text. / B. L. Lee Kevin, H. P. Hui James, Im Chim Song, Lenny Ardany and Eng Hin Lee // Stem Cells. 2007. - № 25. - P. 2964-2971.

90. Kiel, M. J. SLAM family receptors distinguish hematopioetic stem and rogenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells Text. / M. J. Kiel, O. H. Yilmaz, T. Iwashita, C. Terhorst, S. J. Morrison // Cell. 2005. - № 121. - P. 1109-1121.

91. Kitagawa, Y. History of discovery of human adipose-derived stem cells and their clinical application Text. / Y. Kitagawa, M. Korobi, K. Toriyuama, Y. Kamei, S. Torii // Ipn. J. Plast. Reconstr. Surg. 2006. - Vol. 49. - P. 1097-1104.

92. Knight, A. Non-animal methodologies within biomedical research and toxicity testing Text. / A. Knight // Altex. 2008. - Vol. 25 (3). - P. 213-31.

93. Kode, J. A. Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration Text. / J. A. Kode, S. Mukheijee, M. V. Joglekar, A. A. Hardikar // Cytotherapy. 2009. - Vol. 11 (4). - P. 377-91.

94. Lagasse, E. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo Text. / E. Lagasse, H. Connors, M. Al-Dhalimy et al. // Nat. Med. 2000. - Vol. 6. - P. 1229-1234.

95. Le Blanc, K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells Text. / K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl et al. // Exp. Hematol. 2003. - Vol. 31. - P. 890-896.

96. Le Blanc, K.Treatment of severe acute graft-versus host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells Text. / K. Le Blanc, I. Rasmusson, B. Sundberg et al // Lancet. -2004. May 1. - P. 1439 -1441.

97. Lee, M. Y. Smad, PI3K/Akt, and Wnt-Dependent Signaling Pathways Are Involved in BMP-4-Induced ESC Self-Renewal Text. / M. Y. Lee, H. W. Lim, S. H. Lee, and H. J. Han // Stem Cells. 2009. - Aug. 27(8). - P. 1858-1868.

98. Lemischka, I. A few thoughts about the plasticity of stem cells Text. / I. Lemischka // Exp. Hematol. 2002. - Vol. 30. - P. 848-852.

99. Lemoli, R. M. Hematopoietic stem cell mobilization Text. / R. M. Lemoli, A. D'Addio // Haematologica. 2008. - Mar. 93(3). - P. 321-324.

100. Liuyun, J. Preparation and biological properties of a novel composite scaffold of nano-hydroxyapatite/chitosan/carboxymethyl cellulose for bone tissue engineering Text. / J. Liuyun, L. Yubao, X. Chengdong // J. Biomed. Sei. 2009. -Jul. 14.-P. 16-65.

101. Lu, J. Defined culture conditions of human embryonic stem cells Text. / J. Lu, R. Hou, C. J. Booth, S. H. Yang, M. Snyder // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -2006. № 103. - P. 5688-5693.

102. Mahendra Rao. Meeting Report : Adult Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine Conference, August 2007 Text. / Mahendra Rao // Stemcells. 2007. - Vol. 25. - P. 2973-2974.

103. Maitra, B. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Text. / B. Maitra, E. Szekely, K. Gjini et al. // Transplant. 2004. - Vol. 33. - P. 597- 604.

104. Majumder, M. A. Future directions for oversight of stem cell research in the United States: an update Text. / M. A. Majumder, C. B. Cohen // Kennedy Inst. Ethics. J. -2009. Jun. 19(2). - P. 195-200.

105. Mareschi, K. Isolation of human mesenchymal stem cells: Bone marrow versus umbilical cord blood Text. / K. Mareschi, L. Biastin, W. Piacibello et al. // Haematologica.-2001.-Vol. 86.-P. 1099-1100.

106. Martin-Rendon, E. Stem cell-related therapies for vascular diseases Text. / E. Martin-Rendon, J. A. Snowden, S. M. Watt // Transfus. Med. 2009. Vol. 19 (4).-P. 159-171.

107. Matsubara, H. Therapeutic angiogenesis for patient with critical limb ischemia using autologous bone marrow cell transplantation Text. / H. Matsubara // Nippon Gakkai Zasshi. 2003. - Vol. 92 (5). - P. 877-883.

108. Matsumoto, D. Cell-assisted lipotransfer: supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection Text. / D. Matsumoto, K. Sato, K. Gonga // Tissue Eng. 2006. - Vol. 12. - P. 3375-3382.

109. Maximov, A. A. Textbook of Histology Text. / A. A. Maximov, W. A. Bloom. Philadelphia : Saunders, 1957. - 257 c.

110. Maximov, A. A. Über experimentelle Erzeugung von KnochenmarksGewebe Text. / A. A. Maximov //Anat. Anz. -1906. Bd. 28. - S. 24-38.

111. Maximow, A. A. Über embryonale Entwicklung der Blut- und Bindegewebszellen bei den Säugetieren Text. / A. Maximow // Anat. Anz. -1908. Vol. 32 (Suppl.). - P. 65-72.

112. Maximow, A. A. Der Lymphocyte als goneinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen. Eutwicklung und in postfactalen Steden der Zengetiere Text. / A. Maximow // Fol. Haematol. 1909. - Vol. 8. -P. 125-134.

113. Meng, G. L. Current state of establishing and maintaining human embryonic stem cell lines and key problems in these studies Text. / G. L. Meng, K. G. Shang, M. X. Ding // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2002. - Jan. 18(2). - P. 131-135.

114. Mets, T. In vitro aging of human bone marrow derived stromal cells Text. / T. Mets, G. Verdonk // Mech. Ageing. Dev. 1981. Vol. 16. - P. 81-89.

115. Mezey, E. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey, K. J. Chandross, G. Harta, R. A. Maki, S. R. McKercher // Science. 2000. - Vol. 290. - P. 1779-1782.

116. Minoo Battiwalla. Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation Text. / Minoo Battiwalla, Peiman Hematti // Cytotherapy. 2009. - Vol. 11, Issue 5.-P. 503-515.

117. Morrison, S. J. The biology of hematopoietic stem cells Text. / S. J. Morrison, N. Uchida, I. L. Weissman // Annu Rev Cell Dev Biol. 1995. - Vol. 11.-P. 35-71.

118. Morrison, S. J. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype Text. / S. J. Morrison, I. L. Weissman // Immunity. 1994. - № 1. - p. 661-673.

119. Morrison, S. J. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype Text. / S. J. Morrison, I. L. Weissman // Immunity. 1994. - № 1. - P. 661-673.

120. NIH primer, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health : Stem Cell Basics Electronic resource. II Режим доступа : http://health.nih.gov. 2009. - P. 1-26. - Загл. с экрана.

121. Nishikawa, S. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy Text. / S. Nishikawa, R. A. Goldstein, C. R. Nierras // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008. - Sep. 9(9). - P. 725-729.

122. Okabe, S. Differentiation of embryonic stem cells Text. / S. Okabe // Curr. Protoc. Neurosci. 2001. - May; Chapter 3. - Unit 3.6.

123. On the Origin of the Term "Stem Cell". Miguel Ramalho-Santos and Holger Willenbring // Cell Stem Cell. 2007. - June 7 (1). - P. 35-38.

124. Owen, M. Marrow derived stromal stem cells Text. / M. Owen // J. Cell Science Supp. 1988. - Vol. 10. - P. 63-76.

125. Paolo, Bianco. Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biology, and Potential Applications Text. / Paolo Bianco, Mara Riminucci, Stan Gronthos and Pamela Gehron Robey // Stem Cells. 2001. - № 19. - P. 80-192.

126. Pappenheim, A. Über die Entwicklung und Ausbildung der Erythroblasten Text. / A. Pappenheim // Virchows Arch. 1896. - Vol. 145. - P. 587-643.

127. Paul, S. Knoepfler. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap to Safe Regenerative Medicine Text. / Paul S. Knoepfler // Stem Cells. 2009. -May 1, Vol. 27, Number 5. - P. 1050-1056.

128. Perdikogianni, C. Could cord blood be a source of mesenchymal stromal cells for clinical use? Text. / C. Perdikogianni, H. Dimitriou, E. Stiakaki, G. Martimianaki, M. Kalmanti // Cytotherapy. 2008. - Vol. 10, Number 5. - P. 452-459(8).

129. Pittenger, M. F. Mesenchymal stem cells of human adult bone marrow Text. / M. F. Pittenger, D. R. Marshak, D. K. Gardner, D. Gottlieb, eds. // Cold Spring Harbor. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. - P. 349-374.

130. Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells Text. / M. F. Pittenger, A. M. Mackay, S. C. Beck et al. // Science. 1999. -Vol. 284.-P. 143-147.

131. Ploemacher, R. E. Stem cells: characterization and measurement Text. / R. E. Ploemacher // Baillieres Clin. Haematol. 1997. - Vol. 10. - P. 429-444.

132. Portugal, R. D. A computational model for telomere-dependent cell-replicative aging Text. / R. D. Portugal, M. G. Land, B. F. Svaiter // Biosystems. -2008.-Jan. 91 (l).-P. 262-267. Epub. - 2007. - Nov. 1.

133. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhaemopoietic tissues Text. / D. J. Prockop // Science. 1997. - Vol. 276. - P. 71-74.

134. Quirici, N. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies Text. / N. Quirici, D. Soligo, P. Bossolasco, F. Servida, C. Lumini, G. L. Deliliers // Exp. Hematol. 2002. - Jul. 30 (7). -P. 783791.

135. Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells Text. / M. Richards, S. Tan, C. Y. Fong, A. Biswas, W. K. Chan, A. Bongso // Stem Cells. -2003.-№21.-P. 546-556.

136. Richards, M. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells Text. / M. Richards, C. Y. Fong, W. K. Chan, P. C. Wong, A. Bongso // Nat. Biotechnol. 2002. - № 20. -P. 882-883.

137. Rubin, H. Promise and problems in relating cellular senescence in vitro to aging in vivo Text. / H. Rubin // Arch Gerontol Geriatr. 2002. - May-Jun. 34(3). -P. 275-286.

138. Rubin, H. The disparity between human cell senescence in vitro and lifelong replication in vivo Text. / H. Rubin // Nat. Biotechnol. 2002. - Jul. 20 (7).-P. 675-81.

139. Salamon, A. Use of mesenchymal stem cells from adult bone marrow for injured tissue repair Text. / A. Salamon, E. Toldy // Orv. Hetil. 2009. - Jul. (5). -P. 1259-1265.

140. Schulz, C. Hematopoietic stem and progenitor cells: their mobilization and homing to bone marrow and peripheral tissue Text. / C. Schulz, U. H. von Andrian, S. Massberg // Immunol. Res. 2009. - Vol. 44(1-3). - P. 160-168.

141. Shi, X. Novel mesoporous silica-based antibiotic releasing scaffold for bone repair Text. / X. Shi, Y. Wang, L. Ren, N. Zhao, Y. Gong, D. A. Wang // Acta Biomater. 2009. - Jun. 5 (5). - P. 1697-1707 ; Epub. - 2009. - Jan. 23.

142. Simmons, P. J. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1 Text. / P. J. Simmons, B. Torok-Storb // Blood. 1991. - Vol. 78. - P. 55-62.

143. Solbakk, J. H. The ethics of stem cell research: can the disagreements be resolved? Text. / J. H. Solbakk, S. Holm // J. Med. Ethics. 2008. - № 34. - P. 831-832.

144. Soo Han Hwang. Analysis of Cytokines in Umbilical Cord Blood-derived Multipotent Stem Cell Text. / Soo Han Hwang, Mi Ho Kim, II Ho Yang, Jong Yoon Bahk and Hoon Han // Biotechnology and Bioprocess Engineering. -2007. Vol. 12, Number 1. - P. 32-38,

145. Spangrude, G. J. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells Text. / G. J. Spangrude, S. Heimfeld S., I. L. Weissman // Science. -1988.-Vol. 241.-P. 58-62.

146. Stacey, G. N. The development of 'feeder' cells for the preparation of clinical grade hES cell lines: Challenges and solutions Text. / G. N. Stacey, F. Cobo, A. Nieto, P. Talavera, L. Healy, A. Concha // J. Biotechnol. 2006. Vol. 125.-P. 583-588.

147. Stenderup, K. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow cells Text. / K. Stenderup, J. Justesen, C. Clausen et al. // Bone. 2003. - Vol. 33. - P. 919-926.

148. Terskikh, A. V. From hematopoiesis to neuropoiesis: evidence of overlapping genetic programs Text. / A. V. Terskikh, M. C. Easterday, L. Li et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 7934-7939.

149. TERT telomerase reverse transcriptase Homo sapiens., GenelD: 7015, updated Sep. 09-2009 [Electronic resource] : база данных по генам // Режим доступа : http://www.ncbi.nlm.nih.gov /sites/entrez?db=gene\EntrezGene. Загл. сэкрана.

150. Thomas, Е. D. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy Text. / E. D. Thomas, H. L. Jr. Lochte, W. C. LU, J. W. Ferrebee // N. Engl. J. Med. 1957. - Sep. 12(11).- P. 491-496.

151. Thorén, L. A. Kit regulates maintenance of quiescent hematopoietic stem cells Text. / L. A. Thorén, К. Liuba, D. Bryder, J. M. Nygren, С. T. Jensen, H. Qian, J. Antonchuk, S. E. Jacobsen // J. Immunol. 2008. - Feb. 15, 180(4). - P. 2045-2053.

152. Tocci, A. Mesenchymal stem cell: use and perspectives Text. / A. Tocci, L. Forte // Hematol. J. 2003. - Vol. 4 (2). - P. 92-96.

153. TP53 tumor protein p53 Homo sapiens., GenelD: 7157, updated Sep. 09 -2009 [Electronic resource] : база данных по генам // Режим доступа : http://www.ncbi.nlm.nih.gov /sites/entrez?db=gene\EntrezGene. Загл. сэкрана.

154. Tweedell, К. S. New paths to pluripotent stem cells /Text. K. S. Tweedell // Curr. Stem. Cell Res. Ther. 2008. - Sep. 3(3). - P. 151-62.

155. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution Text. /1. L. Weissman // Cell. 2000. - Vol. 100. - P. 157-168.

156. Wickham, M.Q. Multipotent stromal cells derived from the infrapattelar fat pad of the knee Text. / M. Q. Wickham, G. R. Erikson, G. M. Gimble // Clin. Orthop. Relat. Res. 2003. - Vol. 412. - P. 196-212.

157. Xu, Y. Adipose-derived mesenchymal cells as a potential cell source for skeletal regeneration Text. / Y. Xu, P. Malladi, D. R. Wagner et al. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. - Vol. 7. - P. 300-305.

158. Yoshimura, K. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose derived stem/stromal cells Text. / K. Yoshimura, K. Sato, N. Aoi, M. Kurita, T. Hirohi, K. Harii // Aesthetic Plast. Surg. 2008. - Vol. 32.-P. 48-55.

159. Zappia, E. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy Text. / E. Zappia, S. Casazza, E. Pedemonte et al. // Blood. 2005. - Vol. 106. - P. 1755-1761.

160. Zhang, F. Embryonic stem cell transplantation: promise and progress in the treatment of heart disease Text. / F. Zhang, K. B. Pasumarthi // BioDrugs. 2008. -№22(6).-P. 361-74.

161. Zuk, P. A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells Text. / P. A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian et al. // Mol. Biol. Cell. 2002. - Vol. 13. - P. 4279^1295.

Информация о работе

Волчков, Станислав Евгеньевич
кандидата медицинских наук
Оренбург, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Сравнительная оцека адгезивной фракции клеток аспирата костного мозга, жировой ткани и пуповинной/плацентарной крови - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы