Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генетической стабильности мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека в культуре

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетической стабильности мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека в культуре"

На правах рукописи

ЧАУШЕВА Аминят Исрафильевна

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ

03.02.07-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 дпР 2012

Москва 2012

005020229

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Академик РАМН, профессор Бочков Николай Павлович

Официальные оппоненты:

Журков Вячеслав Серафимович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ экологии и гигиены окружающей среды А.Н.Сысина» Минздравсоцразвития России, ведущий научный сотрудник лаборатории генетического мониторинга

Засухина Галина Дмитриевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова » Российской академии наук, главный научный сотрудник группы мутагенеза и репараций

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «_»_ 2012 г. в_часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

Актуальность темы.

Терапия мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (МСК) перспективна для лечения заболеваний различного генеза. Способность к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток делает МСК человека потенциальным источником материала для клеточной терапии.

Клинические исследования проводятся на фоне отсутствия значимых доказательств безопасности такой терапии, в том числе, данных о возможных отдаленных эффектах. Особенно остро стоит вопрос о генетической стабильности МСК. Имеющиеся на сегодняшний день экспериментальные данные противоречивы и недостаточны. В ряде работ показано, что МСК генетически стабильны (Soukup Т., 2006; Bernardo М.Е., 2007; Lange С., 2007), тогда как другие авторы в своих работах приводят примеры генотоксических изменений, возникающих при их пассировании (Rubio D., 2005; Бочков Н.П., 2011). В культивируемых стволовых клетках выявляют хромосомные транслокации, анеуплои-дии, изменение плоидности, экспрессии отдельных генов.

Проблема выбора адекватных методов оценки генетической стабильности МСК не решена и требует специальных исследований, направленных на накопление эмпирических данных и базирующихся на применении новых и классических методов оценки генетической стабильности клеток.

Первичные повреждения ДНК являются предмутационными событиями, но также могут иметь самостоятельное патогенетическое значение (Жанатаев А.К., 2011). Это определяет необходимость наряду с учетом тех или иных категорий мутационных событий учитывать повреждения ДНК. Наиболее адекватным методом определения повреждений ДНК является метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Преимуществами метода являются высокая чувствительность, возможность оценки в любых клетках, небольшое количество требуемого экспериментального материала, быстрота проведения анализа (Дурнев А.Д., 2006; Valverde М., 2009).

Учет микроядер в клетках является классическим биологическим маркером генетической нестабильности клетки. Микроядерный тест - один из наибо-

лее широко используемых и адекватных методов оценки кластогенной и анеу-генной активности в области экологической генетики и генотоксикологии.

Комплексное использование двух указанных методов составляет основу настоящей работы, главной задачей которой явился анализ генетической стабильности МСК человека.

Цель исследования

Провести сравнительное исследование уровней повреждений ДНК и кла-стогенных/анеугенных эффектов в культурах МСК из костного мозга и жировой ткани на ранних и поздних пассажах культивирования.

Задачи исследования

1. Оптимизировать метод ДНК-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) и микроядерный тест для работы с адгезивными культурами МСК.

2. Определить уровни поврежденности ДНК и частоты микроядер в МСК из костного мозга на ранних и поздних пассажах.

3. Определить уровни поврежденности ДНК и частоты микроядер в МСК из жировой ткани на ранних и поздних пассажах.

4. Проанализировать сопряженность показателей, характеризующих повре-жденность ДНК («% ДНК в хвосте кометы», «апоптотические кометы», «8-оксигуанин») и частоту микроядер.

Научная новизна

Впервые получены данные, характеризующие частоту микроядер и уровни повреждений ДНК в МСК, выделенных из разных источников (жировая ткань и костный мозг) и культивируемых в течение 3-12 пассажей. Установлено, что в культурах МСК из жировой ткани базовый уровень ДНК-повреждений выше, чем в МСК из костного мозга. Частоты микроядер в МСК из разных типов тканей статистически значимо не различаются и составляют в среднем 5,7%о на ранних и поздних пассажах. В отдельных культурах МСК наблюдаются значительное число клеток с высокой степенью поврежденности ДНК и/или высокой частотой микроядер. Увеличение поврежденности ДНК и микроядер

установлено в 2 из 28 культур МСК костного мозга и 2 из 16 культур МСК жировой ткани.

Практическая значимость

Выявление культур МСК с увеличивающимся в процессе культивирования количеством клеток с повреждениями ДНК и микроядер свидетельствует о нарастании генетической нестабильности и возможности онкогенной трансформации клеток. Использование комплексной оценки генетической стабильности с применением метода ДНК-комет и микроядерного теста может рассматриваться в качестве методической основы проведения преклинической оценки генотоксикологической безопасности клеточной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Определены базовые уровни ДНК - и хромосомных повреждений, характерные для МСК из костного мозга и жировой ткани.

2. Уровень спонтанных разрывов ДНК в МСК, выделенных из жировой ткани выше, чем в МСК из костного мозга.

3. В части культур МСК обнаружен повышенный уровень ДНК-повреждений и/или микроядер, увеличивающийся в процессе культивирования.

4. Полученные результаты демонстрируют значение комплексного применения методов ДНК-комет и микроядерного теста для проведения объективной оценки генетической безопасности клеточных культур, предназначенных для трансплантации.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на V-ой конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008 г.), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.), на 9-ой международной конференции по изучению ксенобиотиков (Стамбул, 2010 г.), а также на Европейской конференции по генетике человека (Амстердам, 2011 г.)

Личный вклад автора в проведении исследования. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Большая часть экспериментальных исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. Работа отражена в 7 печатных работах: опубликовано 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК МОН России соискателям ученой степени кандидата медицинских наук и 4 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 158 источников, из них 29 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа изложена на 107 листах машинописного текста. Текст содержит 12 рисунков и 23 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика клеточных образцов

В исследовании использовались культуры МСК, выделенные из костного мозга и жировой ткани. Двадцать восемь культур МСК выделены из костного мозга здоровых доноров, забранного в целях аллогенной трансплантации пациентам с гематологическими заболеваниями, находившимся на лечении в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии (ФНКЦ ДГОИ). Выделение и культивирование МСК из костного мозга проводилось сотрудниками этого института. Культуры МСК костного мозга анализировали на 3-4 и 10-12 пассажах.

Восемь культур МСК из жировой ткани, полученной в результате косметической операции - липосакции передней брюшной стенки здоровых доноров, предоставлены ЗАО "РеМеТэкс". Культивирование этих МСК до 3-4-го пассажа продолжали в лаборатории мутагенеза.

Четыре культуры МСК из жировой ткани на ранних и четыре культуры МСК на поздних пассажах предоставлены лабораторией молекулярной биологии ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Эти образцы жировой ткани получены при плановых операциях в ФГБУ «РОНЦ» РАМН. Выделение МСК из этих образцов жировой ткани и их культивирование проводили сотрудники лаборатории молекулярной биологии, культуры МСК получали на 3-ем и 10-ом пассажах.

От каждого донора было получено информированное согласие на использование образцов для научных целей. Для проведения настоящего исследования получено согласие этического комитета Медико-генетического научного центра РАМН.

Исследование показателей поврежденностн ДНК

Определение уровня ДНК повреждений, частоты апоптотических комет, степени окислительной поврежденности гуанина проводили с использованием метода гель-электрофореза изолированных клеток или методом ДНК-комет. Метод ДНК-комет основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденностн исследуемой ДНК (Дурнев А.Д., 2006).

В качестве показателя поврежденностн ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте комет (%ДНК в хвосте) от общего количества ДНК в комете.

Для определения доли клеток с разной степенью поврежденностн ДНК, клетки были распределены по группам в зависимости от величины показателя «%ДНК в хвосте». Разделение проводили по пяти группам: от 0 до 5; от 5,1 до 10; от 10,1 до 15; от 15,1 до 20 и более 20 % ДНК в хвосте (рис. 1).

О - от 0 до 5%ДНК в хвосте

2 - от 10,1 до 15%ДНК в хвосте

4 - >20%ДНК в хвосте

3 - от 15 до 20%ДНК в хвосте

1 - от 5,1 до 10%ДНК в хвосте

Рис.1. ДНК-кометы клеток с различной степенью поврежденности ДНК.

Одно из основных проявлений апоптоза состоит в упорядоченной эндо-нуклеазной фрагментации ДНК. Апоптотические кометы идентифицировали как специфичные "ДНК-кометы" с диффузным "хвостом" и практически отсутствующей "головой", с содержанием ДНК в хвосте более 70% и подсчиты-вались отдельно (рис.2)

Рис 2. Изображение «апоптотической кометы» с микропрепарата ДНК-комет культуры МСК.

Примечание: ДНК в хвосте > 70%. Окраска SYBR Green I. Увеличение х200.

Для определения роли свободнорадикального окисления в формировании ДНК-повреждений был проведен анализ уровня окисленного гуанина (8-оксигуанина) в МСК из костного мозга. Для оценки содержания 8-оксигуанина в ДНК клеток использовали модифицированный метод ДНК комет с использо-

ванием набора "Human 8-oxoGuanine DNA Glycosylase (OGG1) FLARE Assay. Модификация метода основана на регистрации уровней одно - и двухнитевых разрывов ДНК индивидуальных клеток после обработки ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой человека (hOGGl). Приготовление препаратов для анализа проводили в соответствии с инструкцией производителя. Уровень 8-оксигуанина выражали в относительных единицах (o.e.), определяемых как отношение показателя «%ДНК в хвосте» для ДНК клеток, обработанных ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой человека, к показателю для клеток, обработанных буфером для фермента.

Микроядерный тест

Культуры МСК отмывали от культуральной среды, клетки со дна флакона снимали с помощью раствора трипсин - ЭДТА. Полученную суспензию клеток центрифугировали (1000 об., 10 мин). Гипотонизацию проводили 0,55% раствором KCL (5 мин. при температуре 4°С). Фиксацию проводили смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Клеточные суспензии раскапывали на сухие охлажденные стекла и помещали на хладагент на 5 минут. Препараты окрашивали DAPI. Микроскопирование проводили на флуоресцентном микроскопе Axiolmager AI (Zeiss, Германия) при 1000-кратном увеличении (рис.3).

Рис. 3. МСК с микроядрами, микроядра обозначены стрелками. Примечание: Окраска ОАР1. Увеличение хЮОО.

С каждого микропрепарата анализировали не менее 1000 клеток, с использованием следующих критериев идентификации микроядер: 1) максималь-

ный диаметр микроядра не превышает 1/4 диаметра ядра; 2) микроядро имеет интенсивность окраски как у основного ядра клетки; 3) микроядро обладает округлой формой и расположено отдельно от ядра на расстоянии, не превышающем его диаметр.

Статистическая обработка результатов

Полученные результаты обрабатывались с использованием программы Statistica 7.0. Среднегрупповые показатели сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Для характеристики зависимостей между отдельными параметрами проводили корреляционный анализ, распределение частот сравнивали с помощью критерия Хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка фенотипа и дифференцировочного потенциала МСК

При визуальной оценке полученных культур с использованием фазово-контрастного микроскопа описали характерную для МСК фибробластоподоб-ную морфологию , а также было подтверждено их свойство дифференцироваться в остеогенном и адипогенном направлениях.

При длительном культивировании МСК из костного мозга наблюдается постепенное снижение их пролиферативной активности. При экспансии МСК in vitro скорость увеличения клеточной популяции максимальна на 3-4 пассаже и достоверно снижается к 10-12 пассажам.

Анализ иммунофенотипа показал, что все исследованные адгезивные культуры из костного мозга и жировой ткани, как на ранних, так и на поздних пассажах, можно отнести к МСК в соответствии с требованиями международной организации клеточной терапии (Dominici М., 2006).

Оценка показателей генетической стабильности в культурах МСК

костного мозга

Уровень ДНК повреждений в МСК костного мозга

Исследовано 28 культур МСК из костного мозга здоровых доноров на разных пассажах. Уровни ДНК-повреждений в МСК на ранних

(3,91±0,38%ДНК) и поздних пассажах (3,83±0,68%) не различались (р>0,05) (рис.4).

¡>=0.91

.3,83

Поздние пассажи

Рис. 4. Уровень ДНК-повреждений в МСК из костного мозга На ранних и на поздних пассажах наблюдается сходное распределение клеток с разной степенью поврежденности ДНК. В 82% клеток на ранних и в 83% клеток на поздних пассажах выявлено от 0 до 5% ДНК в хвосте (рис.5).

■ Ранние пассажи о Поздние пассажи

0-5% 5-10°о 10-15% 15-20% =>20%

Рис.5. Распределение МСК костного мозга по количеству ДНК разрывов

В среднем от 2 до 6% клеток отмечено в каждой из остальных выделенных групп. При сравнении долей поврежденных клеток на разных пассажах в МСК из костного мозга, статистически достоверных различий не выявлено (табл.1).

1

2 I

О -

Ранние пассажи

Таблица.1. Сравнение долей поврежденных клеток в МСК из костного мозга

0-5% 5-10% 10-15% 15-20% >20% п

кмМСК РП 1662 128 86 44 117 2037

кмМСК ПП 1426 99 74 36 114 1749

3088 227 160 80 231 3786

X2 1,58

Р 0,8124

Примечание: п - общее число клеток; км- костный мозг; РП - ранние пассажи; ПП -поздние пассажи.

Частота апоптотических ДНК-комет в культурах МСК составила в среднем 2,08±0,35% на 3-4 пассажах и 2,52±0,63% на 10-12 пассажах (рис.6). Различий между ранними и поздними пассажами не выявлено (р>0,05). Вместе с тем, сравнение с данными литературы показывает, что частота апоптотических ДНК-комет в МСК из костного мозга несколько выше, чем в лимфоцитах человека (Мороз В.В., 2008).

е 4

I 3.5 В

ё -I 1.5

0.5 0

р=0,52

2,52

Ранние пассажи

Поздние пассажи

Рис. 6. Частота апоптотических комет в МСК костного мозга

Уровень 8-оксигуанина был оценен в восьми культурах МСК из костного мозга на ранних и в 6-ти - на поздних пассажах. В культурах 3-4-го пассажей этот показатель составил 1,9±0,24 o.e., а на 10-12 пассажах наблюдали в среднем 2,1±0,22 o.e. (рис.7).

р=0,58

2,1

Ранние пассажи

Пошлине пассажи

Рис. 7. Уровень 8-оксигуанина в МСК костного мозга.

При этом значения варьировали от 1,1 o.e. до 3,1 o.e. на ранних пассажах и от 1,5 о.е до 2,6 о.е на поздних пассажах. Статистических различий между пассажами не выявлено (р>0,05). По литературным данным, уровень 8-оксигуанина, оцененный методом ДНК-комет, в лимфоцитах периферической крови здоровых людей среднего возраста также как в нашем исследовании варьирует от 0,5 до 2,0 o.e. (Мороз В.В., 2008).

Наряду с оценкой степени поврежденности ДНК в те же сроки культивирования подсчитывали частоты встречаемости клеток с микроядрами с использованием микроядерного теста. Частота микроядер в культурах МСК из костного мозга на ранних пассажах составила в среднем 5,09±0,52%о (рис.8), а на поздних пассажах 5,0±0,9%о, статистически значимых различий не выявлен (р>0,05).

р =0,92

5.0

Ранние пассажи

Поздние пассалш

Рис. 8.Частота микроядер в МСК из костного мозга

Для определения уровня генетических повреждений в МСК до культивирования были проведены исследования мононуклеарной клеточной фракции костного мозга. В клетках костного мозга (мононуклеарная фракция) были оценены частоты ДНК-повреждений, апоптотических комет и микроядер.

Проанализировано пять образцов костного мозга. Показатель поврежденное™ ДНК в клетках костного мозга составил 3,58±0,77% ДНК в хвосте и варьировал от 2,1 до 6,5% (табл.2).

Таблица 2. Уровень ДНК-повреждений, апоптотических и атипичных ДНК-комет и частоты микроядер в мононуклеарной клеточной фракции костного мозга.

№ образцов %ДНК в хвосте,% Апоптот. комет,% Атипич. комет,% Частота МЯ, %0

12В 3,4 1,9 26,6 0

13В 6,5 2,4 21,1 1

15В 2,5 1,1 19,3 2

24В 2,1 1,0 10,1 1

31В 3,4 4,2 28,1 0

М±т 3,58±0,77 2,12±0,58 21,04±3,19 0,80±0,37

Эти данные согласуются с результатами исследований Novotna и соавт. (Novotna В., 2008), показавшими, что аналогичный показатель в клетках костного мозга здоровых доноров варьирует от 2 до 9%. Число апоптотических комет в мононуклеарной клеточной фракции костного мозга составило 2,12+0,58%, а частота микроядер - 0,80±0,37%о (табл. 2).

От 10 до 28% ДНК-комет клеток костного мозга представлены атипичными ДНК-кометами (табл.2, рис.9). ДНК-кометы такой формы не поддаются обработке программным обеспечением, в литературе их обозначают как «ghost cells» (клетки-призраки). Наличие в образцах костного мозга таких ДНК-комет, по-видимому, связано с повреждением клеток активными формами кислорода в процессе криоконсервации.

Таким образом, уровни ДНК-повреждений, 8-оксигуанина и частоты апоптотических комет и микроядер не меняются при пассировании МСК из

костного мозга. Уровни ДНК-повреждений и апоптотических комет в клетках костного мозга и МСК из костного мозга не различаются (р>0,05). Частота микроядер в клетках костного мозга была значительно ниже, чем в МСК, выделенных из костного мозга. В мононуклеарах костного мозга наблюдается большое количество нетипичных клеток с высокой степенью поврежденности ДНК.

Рис.9. Цифровое изображение с микропрепарата ДНК-комет клеток костного мозга.

Примечание: Атипичные ДНК-кометы указаны стрелками. Окраска SYBR Green I. Увеличение х200.

Оценка показателей генетической стабильности в культурах МСК из жировой ткани

Уровень ДИК повреждений в МСК жировой ткани

Всего было исследовано 12 культур МСК из жировой ткани на ранних и 4 культуры МСК - на поздних пассажах. Степень поврежденности ДНК в культурах МСК составила 5,07±0,36% ДНК в хвосте на ранних пассажах и 6,63±1,19% на поздних пассажах (рис.10). Статистически достоверных различий при сравнении уровней ДНК-повреждений на ранних и поздних пассажах не обнаружено (р>0,05).

10 9 8 7 6

р =0.11

6, 63

Ранние пассажи

Поздние пассажи

Рис.10. Уровень ДНК повреждений в МСК из жировой ткани.

Так же как для культур МСК из костного мозга, определяли доли клеток с разной степенью поврежденности ДНК (рис.11). На ранних пассажах выявлено всего 74%, а на поздних - 69% клеток с повреждениями от 0 до 5%ДНК в хвосте. Число клеток с выраженными повреждениями (более 5%ДНК в хвосте) в МСК из жировой ткани составило примерно 26-30%.

70 5 60

?! 40

5 30 ?20 10 о

0-5%

'•¡10,2 Г

5.45.1

.■Ж.

■Ранние пассажи □Поздние пассажи

2,4.4

«¿71

5-104 10-15% 15-20%

>20%

Рис. 11. Распределение МСК жировой ткани по количеству разрывов.

При сравнении долей поврежденных клеток на разных пассажах, были выявлены статистически достоверные различия (табл.3). В процессе культивирования МСК из жировой ткани увеличивалось количество клеток с высоким уровнем поврежденное™ ДНК.

Таблица 3. Сравнение долей поврежденных клеток в МСК из жировой

ткани

0-5 5-10 10-15 15-20 >20 п

жтМСК РП 1001 147 73 31 Т02 1354

жтМСК ПП 509 78 37 32 77 733

1510 225 110 63 ,179 , ^2087

X2 13,14

Р 0,0106

Примечание: жт - жировая ткань; РП - ранние пассажи; ПП - поздние пассажи

Частота апоптотических комет в культурах МСК из жировой ткани на ранних пассажах составила 1,0±0,9%, а на поздних - 0,4±0,14% (рис.12), однако, статистически значимых различий не выявлено.

р =0.24

Р

-

І 1.8 -

2 1,6 ^

и

§ 1.4

5 1.2

о і

С 1

С 0.8

І 0.6 -

1 0.4

о.: -

о -

оМ

Ранние пассажи

Поздние пассажи

Рис.12. Частота апоптотических комет в МСК жировой ткани.

Частота микроядер в культурах МСК из жировой ткани составила на ранних пассажах 5,33±0,38%о , а на поздних - 7,25±1,25%о (рис.13). Частоты микроядер на ранних и поздних пассажах статистически значимо не различаются (р>0,05).

12

10

р =0,06

о

7,25

Поздние пассажи

Рис. 13. Частота микроядер в МСК жировой ткани

Таким образом, в культурах МСК из жировой ткани доли клеток с высокой степенью поврежденности ДНК увеличиваются, а частоты апоптотических комет и микроядер не меняются в процессе культивирования.

Сравнение показателей генетической стабильности в МСК костного мозга и МСК жировой ткани

При сравнении уровней ДНК-повреждений между МСК, выделенными из разных тканей, были выявлены статистически достоверные различия. Уровень ДНК-повреждений в МСК костного мозга на ранних пассажах (3,91% ДНК в хвосте) оказался значительно ниже (р=0,047), чем в МСК из жировой ткани (5,07% ДНК в хвосте) (рис. 14).

ю

9

мозга □ МСК ш жировой ткани

О

Ранние пассажи Поздние пассажи

Рис. 14. Уровень ДНК повреждений в МСК из разных источников

При этом, уровень малоповрежденных клеток в культурах МСК из костного мозга, как на ранних, так и на поздних пассажах (табл.4) оказался значительно выше, чем в МСК из жировой ткани за счет увеличения доли клеток со значительными повреждениями ДНК.

Таблица 4. Сравнение долей поврежденных клеток в МСК из разных типов тканей

0-5 5-10 10-15 >20 п

кмМСК РП 1662 128 44 \\1 ^озГ

жтМСК РП 1001 147 73 31 102 1354

х2 33.52

р <0.0001

кмМСК ПП 1426 99 74 36 114 1749

жтМСК ПП [509 78 37 32 77 733

г2 49.13

р <0,0001

Примечание: км - костный мозг; жт - жировая ткань; РП - ранние пассажи; ПП- поздние пассажи

При сравнении частот апоптотических комет также выявлены статистически значимые различия (рис. 15). На ранних пассажах для МСК из костного мозга характерно большее количество клеток со значительными (более 70% ДНК в хвосте) повреждениями, свидетельствующими о фрагментации ДНК и запуске процесса контролируемой клеточной гибели в этих клетках.

*р=0.03

1,09

Ранние пассажи

■ МСК ш ьхтиого цотгз □МСк т злфовоп лага

Поздние пассажи

Рис.15. Частота апоптотических комет в культурах МСК.

Частоты клеток с микроядрами не различались в культурах МСК из костного мозга и жировой ткани. Таким образом, уровень ДНК-повреждений выше в культурах МСК из жировой ткани, а апоптотических комет - в МСК из костного мозга.

Культуры МСК с повышенным уровнем ДНК-повреждений и микроядер

В двух культурах МСК из костного мозга № 18 и 25 на поздних пассажах (табл. 5) наблюдался повышенный уровень ДНК-повреждений (16,5% и 9,1% ДНК в хвосте комет). Частоты апоптотических ДНК-комет (18,3% и 10,2% соответственно) и микроядер (13%о) в этих культурах также были высокими.

Таблица 5. МСК из костного мозга с повышенными уровнями ДНК повреждений и микроядер.

№ Клеток %ДНК в хвосте Апоптотических комет, % Клеток Микроядер,%о

Ранние пассажи

18В 257 7,0 2,4 1000 8

25В 176 4,9 1'9 -

Поздние пассажи

18В 112 16,5 18,3 1000 13

25В 155 9,1 10,2 300 13

Ранее, в исследованиях нашей лаборатории показано, что в культуре №25 наблюдался рост клеточного клона 45,X. Начиная с 4-го по 10-ый пассажи, количество анеуплоидных клеток в ней увеличивалось с 12 до 91%. Так как количество клеток с генотипом 45,X в этой культуре на поздних пассажах составляло примерно 90%, и наблюдалось увеличение числа поврежденных клеток, можно предположить, что выявленные повреждения ДНК и микроядра характеризуют генетическую нестабильность выявленного клона 45,X.

Среди культур МСК, источником которых служила жировая ткань, также выявлено две (Ш6,119) с повышенным уровнем ДНК-повреждений и/или микроядер (табл.6). В культуре Шб, которую удалось описать только на ранних пассажах, уровень ДНК повреждений составил 12,8% ДІЖ в хвосте и 15%о кле-

ток с микроядрами. В культуре Я9 наблюдали высокую частоту микроядер без увеличения поврежденности ДНК в этих клетках.

Таблица 6. МСК из жировой ткани с повышенными уровнями ДНК повреждений и микроядер

№ Клеток %ДНК в хвосте Апоптотических комет,% Клеток Микроядер, %0

R9 98 5,7 1 1000 14

R16 45 12,8 0 1000 15

Для определения взаимосвязи между возникновением ДНК- и хромосомных повреждений проводили сравнительный корреляционный анализ. Статистически достоверных корреляционных коэффициентов между показателями, характеризующими поврежденность ДНК (% ДНК в хвосте кометы, частота апоптотических комет, уровень 8-оксигуанина) и частоты микроядер не выявлено.

Таким образом, в нашем исследовании впервые описаны уровни повреждений ДНК и микроядер в культурах МСК из разных источников и в процессе культивирования. Полученные данные, характеризуют базовый уровень повреждений в клетках. Уровень ДНК-повреждений в МСК разных типов тканей, по результатам нашего исследования, статистически значимо отличается. Более высокий уровень повреждений ДНК в МСК из жировой ткани по сравнению с МСК из костного мозга свидетельствует о разной генетической изменчивости культур из разных источников в условиях in vitro. Это можно объяснить биологическими различиями между разными типами тканей, а также методически разными подходами к выделению клеток из разных источников. Выделение МСК из жировой ткани сопровождается дезагрегацией и ферментативной диссоциацией, тогда как для выделения МСК из костного мозга применяют более щадящий метод - центрифугирование.

Частота апоптотических ДНК комет в культурах МСК из костного мозга выше, чем в МСК из жировой ткани. Учитывая, что в культурах других клеток по литературным данным наблюдается незначительное количество апоптотиче-

ских комет (0-2%), можно предположить, что в МСК из костного мозга наблюдается ускоренная элиминация поврежденных клеток посредством апоптоза. В МСК из жировой ткани клетки с высокой степенью поврежденности продолжают существование в культуре, а не элиминируются в результате запуска апоптоза.

Результаты наших исследований позволяют предположить, что культуры МСК, из разных тканей (костный мозг и жировая ткань здоровых доноров) на разных сроках и в различных условиях культивирования несут потенциальный риск развития злокачественной трансформации клеток. Клеточный материал, подверженный культивированию рекомендуется изучать по фенотипическим и генетическим характеристикам для обеспечения безопасности клеточной терапии. Применяемый в данном исследовании и оптимизированный для работы с адгезивными культурами метод гель-электрофореза единичных клеток и микроядерный тест могут быть использованы в комплексной преклинической оценке культур МСК из разных источников.

ВЫВОДЫ

1. Уровень ДНК повреждений в культурах МСК из жировой ткани (5,07% ДНК в хвосте) на ранних пассажах выше, чем в МСК из костного мозга (3,91% ДНК в хвосте).

2. При культивировании в МСК из жировой ткани наблюдается уменьшение числа малоповрежденных клеток за счет увеличения доли клеток с высоким уровнем ДНК-повреждений.

3. Частоты микроядер не различаются в МСК из разных тканей и составляют в среднем 5,7%о на ранних и поздних пассажах культивирования.

4. В 9% исследованных культур МСК выявлено формирование клеточных популяций, характеризующихся генетической нестабильностью.

5. Не обнаружено корреляционной взаимосвязи между показателями поврежденное™ ДНК и кластогенными/анеугенными эффектами.

6. Полученные данные о высоком уровне нестабильности в части культур МСК и о возможном клонообразовании при их культивировании указывают на

необходимость проведения генетического мониторинга клеточных трансплантатов.

7. Эффективность и сопоставимость использованных оптимизированных методов указывает на возможность разработки диагностической панели для оценки генетической безопасности клеточных культур при их использовании в клеточной терапии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Чаушева А.И., Никитина В.А., Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Бочков Н.П. ДНК повреждения в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках человека при разных сроках культивирования // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011. № 4. С. 1-3.

2. Никитина В.А., Чаушева А.И., Жанатаев А.К., Осипова Е.Ю., Дурнев А.Д., Бочков Н.П. Оценка ДНК-повреждений в клетках костного мозга и мультипотентных мезенхимных стромальных клетках человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2011. №2. С. 118-120.

3. Бочков Н.П., Воронина Е.С., Катосова Л.Д., Кулешов Н.П., Никитина В.А., Чаушева А.И. Генетическая безопасность клеточной терапии // Вестник РАМН. 2011. Х«9. С.5-10.

Публикации в других изданиях:

4. Жанатаев А.К., Никитина В.А., Чаушева А.И. Теоретическое обоснование оценки ДНК-повреждений в стволовых клетках // Вестник РАМН, приложение. 2008. №6. С. 145-146.

5. Чаушева А.И., Никитина В.А., Жанатаев А.К. Оценка ДНК-повреждений в стволовых клетках человека // Медицинская генетика (тезисы докладов молодых ученых). 2009. Т.8. С. 44

6. Chausheva A.I., Nikitina V.A., Zhanataev А.К., Bochkov N.P. DNA damage in human mesenchymal stem cells and human bone marrow cells: a comparative study// 9"1 International ISSX Meeting 2010 Istanbul, Turkey. Informa Abstract book. 2010. P.73-74

7. Chausheva A.I., Nikitina V.A., Bochkov N.P. DNA damage in cultured human mesenchymal stem cells at various passages // European Human Genetics Conference 2011, Amsterdam, The Netherlands. Abstract book of ESHG 2010. P.245.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

MCK - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки СК - стволовые клетки МЯ - микроядро

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота DMSO - диметилсульфоксид PBS - фосфатно-солевой буфер

DAPI - флуоресцентный краситель 4,6-диамино-2-фенилиндол

Подписано в печать:22.03.12

Объем: 1,5усл.п.л. Тираж: ЮОэкз. Заказ № 649 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Рождественка, 5/7,стр.1 (495) 623-93-06; www.reglet.ni