Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии кости.

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии кости."

Вахрушев Игорь Викторович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУЛЬПЫ МОЛОЧНОГО ЗУБА И КОСТНОГО МОЗГА: ФЕНОТИП И ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ КОСТИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о з ОЕВ 2011

Москва 2010

4853740

Работа выполнена в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии учреждения Российской академии медицинских наук «НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН».

Научный руководитель:

Зав. лаб. клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ ОПП РАМН, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ярыгин Константин Никитич

Официальные оппоненты:

Зав. кафедрой гистологии и эмбриологии лечебного ф-та ГОУ ВПО РГМУ Росздрава,

доктор медицинских наук Дубовая Татьяна Клеониковна

Ст.н.с. лаб. молекулярной кариологии и основ клеточной терапии ИМБ РАН,

кандидат биологических наук Попов Константин Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «1?~» февраля 2011 года, в [Ч^ часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан «А;» января 2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Саврова Ольга Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время наиболее распространенными высокотехнологичными хирургическими подходами к восстановлению поврежденных органов являются реконструктивная хирургия и трансплантация органов. С их помощью спасены миллионы жизней, но они имеют принципиальные ограничения, Биомедицннские конструкции, как правило, не могут полностью заменить живую ткань, а главные проблемы трансплантологии - дефицит пригодных для пересадки органов и иммунологическая несовместимость реципиента и донора. Эти ограничения поставили на повестку дня исследования в области тканевой инженерии (ТИ) как более эффективного метода структурного и функционального восстановления органов и тканей.

ТИ - одна из новых и очень перспективных биомедицинских технологий, позволяющих индуцировать и/или ускорять регенерацию поврежденных тканей, а также проводить замещение дефектных органов или их частей. В то же время ТИ -это современная медицинская методология, основанная на использовании естественной способности организма пациента к восстановлению. Согласно определению, ТИ - это процесс создания трехмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма, на основе комбинации клеток и носителей (скэффолдов), а также прочих факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию экстрацеллюлярного матрикса [Tortelli and Cancedda, 2009].

Одним из наиболее востребованных и, следовательно, интенсивно развиваемых направлений ТИ является терапия костных дефектов [d'Aquino et al., 2009]. Дефекты костной ткани, возникающие в результате травм, хирургических вмешательств, а также вследствие различных заболеваний, во многих случаях приводят к функциональной недостаточности опорно-двигательного аппарата, тем самым существенно снижая качество жизни. Практически во всех случаях в зоне поражения формируется значительный косметический дефект. Актуальность проблемы

Г~\ \ J

репарации костной ткани связана также с увеличением встречаемости остсодсгенеративных заболеваний, особенно в развитых странах.

ТИ любой ткани возможна лишь при наличии по крайней мере двух исходных компонентов - клеток-родоначальниц ее паренхиматозных элементов и биосовместимого материала для создания трехмерного скэффолда, в пределах которого протекают процессы гисто- и морфогенеза. В идеале материал скэффолда должен имитировать свойства межклеточного вещества и составлять часть «микрониши», т.е. непосредственного окружения клеток, создающего адекватные условия для их пролиферации и/или дифференцировки в нужном направлении, а также для осуществления нормальных функций после дифференцировки, в том числе продукции межклеточного вещества.

В качестве клеточного материала для заселения скэффолдов чаще всего используют аутологичные мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга [Costa-Pinto et al., 2009] или жировой ткани [Haimi et al., 2009] и размноженные в культуре. К сожалению, в течение жизни эти клетки, подобно всем другим клеткам человеческого организма, стареют [Bellantuono et al., 2009] и подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что приводит к накоплению соматических мутаций и снижению пролиферативного и остсогенного потенциала [Cancedda et al., 2003]. Эффективный путь решения этой проблемы - применение аутологичных остеогенных клеток пульпы молочного зуба, которые после выделения и экспансии в культуре могут до момента их использования храниться в жидком азоте в криобанке.

Цель исследования.

Целыо данного исследования явилась сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека и оценка возможности применения пульпы молочного зуба в качестве источника клеточного материала для тканевой инженерии кости.

Задачи исследования.

1. Получить культуры мезенхимальных клеток (МК) пульпы молочного зуба и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека.

2. Сравнить цитофенотипические профили полученных культур.

3. Сравнить способность исследуемых клеток к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

4. Отработать методику культивирования изучаемых клеток на биодеградируемых скэффолдах.

5. Оценить возможность остеогенной дифференцировки МК пульпы молочного зуба, культивируемых на трехмерных скэффолдах.

Научная новизна.

Впервые осуществлена фенотипическая характеристика первичных культур МК пульпы молочного зуба в сравнении с МСК костного мозга, выявившая различия в их фенотипических профилях.

Впервые показана возможность создания тканеинженерных конструкций на основе мезенхимальных клеток человека и биодеградируемого полилактидного скэффолда, полученного методом селективного лазерного спекания.

Впервые показано, что МК пульпы молочного зуба способны к остеогенной дифференцировке в составе тканеинженерного комплекса с полилактидным скэффолдом, изготовленным методом селективного лазерного спекания.

Практическая значимость.

Полученные результаты обосновывают возможность применения МК пульпы молочного зуба в качестве клеточного материала в тканевой инженерии кости.

Созданные на базе разрабатываемой технологии тканеинженерные комплексы могут найти широкое применение в травматологии, онкологии, стоматологии и многих других областях современной медицины в случаях необходимости восстановления костных дефектов.

Показано, что пульпа молочного зуба является доступным источником большого количества клеток, обладающих остеогенным потенциалом. Закладка МК пульпы

молочного зуба в криобанки позволит значительно расширить круг людей, имеющих возможность в течение жизни использовать аутологичные мультипотентные клетки.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены на V, VI и VII ежегодных конференциях «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении» (Москва, 2006-2008), британско-российском совещании в сотрудничестве с Европейской Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, 2007), конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), а также V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых научных журналах и 6 публикаций в материалах научных конференций.

Структура к объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на источник. Диссертация изложена на страницах, содержит 10 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Культуры клеток.

МСК костного мозга получали из аспирата костного мозга человека. Мононуклеарную фракцию клеток выделяли в градиенте плотности фиколла-

урографина (1,077 г/см3) и культивировали в ростовой срсде (DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (все реактивы - Gibco, США)) в СОг-инкубаторе в стандартных условиях (37°С, 5% С02, 80% влажности) до формирования монослоя, меняя среду два раза в неделю.

Молочные зубы детей получали в результате естественного выпадения. Материал отмывали в растворе Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением культурального антибиотика-антимикотика (Gibco, США). После вскрытия коронки пульпу извлекали, измельчали, а затем инкубировали в 0,1%-ом растворе коллагеназы I типа (Gibco, США). Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в вышеупомянутой ростовой среде и культивировали в стандартных условиях до формирования монослоя, меняя среду два раза в неделю.

Изготовление полнлактндных скэффолдов.

Трехмерные синтетические биодеградируемые скэффолды на основе полилактидной кислоты были изготовлены в виде пластин 5x5x1 мм методом поверхностного селективного лазерного спекания на установке CJIC-100, разработанной и изготовленной в Институте проблем лазерных и информационных технологий (ИПЛИТ) РАН. Источником непрерывного излучения служил одномодовый волоконный лазер с длиной волны излучения 1,06 мкм и мощностью до 10 Вт (НТО "ИРЭ-Полюс", РФ). Скорость сканирования составляла 21 см/сек, размер пучка лазерного излучения - 125 мкм.

Для спекания использовались частицы биорезорбируемого полимера D,L-полилактида Medisorb 100 DL HIGH IV (Alkermes, США) с молекулярной массой 90 кДа и полидисперсностью 1,4. Средний размер частиц составлял 200 мкм. В порошок полимера добавлялись наночастицы углерода в количестве 0,1 весовых процента. Удельная геометрическая поверхность частиц поглотителя была 50 м2/г.

Стерилизацию скэффолдов осуществляли путем погружения их в 70%-ный С2Н5ОН с последующей инкубацией в течение 24 ч в растворе Хэнкса (ПанЭко, РФ) с добавлением культурального антибиотика/антимикотика (Gibco, США).

Заселение скэффолдов клетками.

Клетки переводили в суспензию путем инкубации в смеси 0,25%-ного раствора трипсина с раствором Версена (1:1) (ПанЭко, РФ) в течение 5 мин. при 37°С, осаждали центрифугированием, а затем в капле объемом 200 мкл (концентрация клеток - 1 млн./мл) в стерильных условиях наносили на скэффолды, находящиеся в колодцах 24-луночного планшета. Планшет со скэффолдами и нанесенными на них клетками помещали в С02-икубатор и инкубировали в течение 45 мин. в стандартных условиях для обеспечения эффективной адгезии клеток. Затем в колодца планшета вносили ростовую среду. Иммобилизованные на скэффолде клетки культивировали в стандартных условиях со сменой ростовой среды каждые три дня.

Проточная цитофлуориметрия.

Клетки переводили в суспензию с помощью раствора Версена (ПанЭко, РФ), осаждали центрифугированием, а затем ресуспендировали в 1 мл буферного раствора, состоящего из PBS с добавлением 1% сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) и 0,1% NaN3 (Sigma, США). Затем клетки трижды отмывали этим раствором путем осаждения центрифугированием, напоследок ресуспендировав осажденные клетки в 0,2 мл того же раствора. В полученную суспензию вносили 15 мкл раствора моноклональных антител, прямо меченных флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) и тандемным красителем фикоэритрин-цианин 5 (РЕ-Су5) (Caltag, Великобритания), и инкубировали при +4°С в течение 60 мин. В качестве отрицательного контроля использовали изотопические антитела, меченные соответствующими флуоресцентными метками (Caltag, Великобритания). После осаждения и отмывки клетки ресуспендировали в 0,25 мл буферного раствора и фиксировали с помощью 4%-ного раствора параформальдегида, добавляемого в количестве 0,25 мл на 4 мин. при комнатной температуре. Затем объём клеточной суспензии доводили до 1 мл путем добавления буферного раствора и фильтровали для исключения клеточных агрегатов (диаметр пор фильтра 30 мкм).

Исследование выполняли на проточном цитофлуориметре-сортере FACSAria (Becton Dickinson, США). Для управления прибором и первичного анализа данных применялся пакет программ BD FACSDiva Software.

Уровень экспрессии исследуемого маркёра оценивали по гистограмме интенсивности флуоресценции метки, конъюгированной со специфическими антителами. Производили запись регистрируемых событий в количестве 10 тысяч при минимальной скорости подачи клеточной суспензии. Для исключения регистрации шумов, а также объектов с размерами меньше клеточных задавали порог регистрации (threshold) по прямому светорассеиванию, равный 20000.

Дальнейший анализ полученных данных проводили в программе WinMDI 2.8. Для сравнения интенсивности флуоресценции опытного образца и изотипического контроля применяли наложение результатов исследования образца и контроля в режиме гистограммы.

Остеогенная дифференцировка.

Исследуемые клетки культивировали на покровных стеклах. Диффсренцировку культур МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга в костную ткань осуществляли в ростовой среде без сыворотки с добавлением 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ (3-глицерофосфата кальция, 10"7 М дексаметазона (все реактивы -Sigma, США). Клетки культивировали в течение трех недель, меняя среду два раза в неделю. Остеогенную дифференцировку клеток оценивали на 8-й, 15-й и 22-й день культивирования. Для этого препараты фиксировали 4%-ным параформальдегидом и окрашивали ализариновым красным.

Адипогенная дифференцировка.

МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга культивировали на покровных стеклах. Адипогенную дифференцировку клеток проводили в ростовой среде без сыворотки с добавлением 10% лошадиной сыворотки, 0,5 мМ изобутилметилксантина и 60 (iM индометацина (все реактивы - Sigma, США) в течение семи дней, заменяя среду один раз на 3-й день культивирования. На 8-й день дифференцировки препараты фиксировали 4%-ным параформальдегидом и окрашивали масляным красным.

Исследование активности щелочной фосфатазы.

Цитохимическую реакцию на щелочную фосфатазу проводили путем погружения препаратов клеток на покровных стеклах в реакционную смесь, содержащую 100 мМ NaCl, 100 мМ Tris-HCl (рН 9,5), 5 мМ MgCl2, 1 мг/мл NBT (nitro-blue tetrazolium chloride) и 0,1 мг/мл BCIP (5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) (все реактивы - Sigma, США). Реакцию останавливали добавлением 10 мМ ЭДТА.

Иммуноцитохимическое окрашивание.

Культуры клеток промывали PBS по стандартной методике (три раза по 2 мин.) и фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в течение 4 мин. при комнатной температуре. После фиксации клетки отмывали PBS, проводили пермеабилизацию с помощью PBS, содержащего 1% Triton Х-100 (Sigma, США), в течение 10 мин. при комнатной температуре и затем отмывали. Неспецифическое связывание моноклональных антител с материалом блокировали в течение 30 мин. при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 2% нормальной козьей сыворотки, 0,05% Tween 20, 0,01% мертиолята (Sigma, США). Разведение первичных (специфических) и вторичных (антивидовых) моноклональных антител готовили на этом же буферном растворе. Клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 90 мин., затем отмывали PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween 20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин., после этого клетки отмывали PBS с добавлением 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween 20. Ядра клеток окрашивали раствором DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) в PBS в концентрации 1 мкг/мл. Полученные препараты заключали в среду для протектирования флуоресценции (Dako Cytomation, США).

Дополнительно к клеткам, находящимся непосредственно на скэффолде, мы исследовали клетки, пересаженные на покровные стекла после культивирования на скэффолде. Для снятия клеток скэффолд с иммобилизованными клетками погружали на 10 мин. в смесь 0,25%-ного раствора трипсина с раствором Версена (1:1)

(ПанЭко, РФ). Клетки переводили в суспензию путем пипетирования, осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали в ростовой среде и культивировали на покровных стеклах в СО2-инкубаторе в стандартных условиях в течение 24 ч. Далее окрашивали препараты по стандартной методике.

В данной работе были использованы первичные моноклональные кроличьи антитела против остеонектина человека (разведение 1:50) (Chemicon, США), а также первичные моноклональные мышиные антитела против остеокальцина человека (разведение 1:10) (R&D Systems, США). В качестве вторичных антител применялись межвидовые антитела против IgG кролика, конъюгированные с родамином (разведение 1:300) (Chemicon, США), и антитела против IgG мыши, конъюгированные с флуоресцентным красителем DyLight 488 (разведение 1:300) (Rockland, США).

Получение и обработка цифровых изображений.

Фотосъёмку полученных флуоресцентных микропрепаратов проводили на флуоресцентном микроскопе ZEISS AxioPlan 2 с установленной на нём цифровой камерой AxioCam HRc при помощи программного пакета AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Для регистрации данных световой микроскопии использовали инвертированный микроскоп AxioVert (Carl Zeiss, Германия) с установленной цифровой камерой D80 (Nikon, Япония). Дальнейшую обработку полученных цифровых микрофотографий проводили в программе Photoshop CS3 (Adobe, США).

Результаты исследования и их обсуждение

Нативные культуры клеток.

МСК костного мозга выделяли из аспирата красного костного мозга методом градиентного центрифугирования, МК пульпы молочного зуба - путем ферментативной обработки пульпы. Все клетки полученных культур имели фибробластоподобную морфологию (рис. 1) и представляли собой распластанные клетки преимущественно веретеновидной формы. Клетки культуры МСК костного мозга были сильнее распластаны, чем МК пульпы молочного зуба.

Рис. 1. Нативные культуры клеток

А - МСК костного мозга; Б - МК пульпы молочного зуба. Увеличение х200.

Цитофеиотипические профили МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

Полученные культуры клеток были исследованы на экспрессию поверхностных маркерных белков CD29, CD34, CD44, CD45, CD49b, CD54, CD90, CD 105, CD 106 и HLA-DR (рис. 2, 3).

Экспрессия CD34, CD45 и HLA-DR, характерная для гемопоэтических стволовых клеток, в изучаемых культурах не наблюдалась (рис. 2).

Клетки обеих исследуемых культур продемонстрировали высокий уровень экспрессии CD44, CD 105 и CD90, а также менее выраженную экспрессию CD54 и CD 106 (рис. 2). CD44 (hyaluronic acid receptor), CD54 (inter-cellular adhesion molecule 1), CD90 (thymocyte differentiation antigen 1), CD105 (endoglin) и CD106 (vascular cell adhesion molecule 1) - поверхностные белки, характерные для мультипотентных клеток мезенхимального ряда. Они играют важную роль в межклеточных взаимодействиях, а также в процессах миграции, хоуминга и дифференцировки клеток.

Маркерные молекулы CD49b и CD29 представляют собой, соответственно, сс2- и (51-субъединицы интегрина VLA-2, способного связываться с коллагеном и ламинином. Данный пептидный комплекс обеспечивает взаимодействие клеток с экстрацеллюлярным матриксом. МК пульпы молочного зуба экспрессировали эти маркеры на высоком уровне, а МСК костного мозга продемонстрировали низкий уровень экспрессии СD29 и отсутствие экспрессии CD49b (рис. 3).

С034

а Ьй и 2

СБ44

С045

С054

я ю

Р)

ч

о Е

Ч с

ж

С090

С0Ю5

С0106

НЬА-ОЯ

х ь

и о а Ьй и

Ч о

с л

£ с ье 2

: ЛА

Рис. 2. Экспрессия С034, С044, С045, СБ54, С090, С0Ю5, СО 106 и НЬА-ОЯ в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии поверхностного маркера; по оси ординат - количество регистрируемых событий (клеток). Изотипический контроль обозначен черной линией.

Таким образом, в результате проведенного иммуноцитохимического исследования было показано соответствие фенотипа клеток полученных культур мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам [НопуЦг е! а1., 2005]. Выявлено различие в экспрессии СЭ29 и СБ49Ь, являющихся субъединицами

интегрина УЬА-2. В отличие от МСК костного мозга МК пульпы молочного зуба обладали высоким уровнем экспрессии этих маркеров, что связано, по-видимому, с различным микроокружением клеток в естественных нишах, а также их различным происхождением.

СБ49Ь СБ29

ЛСК костного мозга я 1 3

,0' 10' ^ .0' ю-

сч 3 Я

ю

СП

Ц

2 1| 1 1 Д

л С а А

ц А /1 1\ \

с 1 / V I \

«

Рис. 3. Экспрессия С049Ь и СЭ29 в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, отражающая уровень экспрессии поверхностного маркера; по оси ординат - количество регистрируемых событий (клеток). Изотопический контроль обозначен черной линией.

Дальнейшая оценка наличия мультипотентных мезенхимальных клеток в изучаемых культурах включала исследование способности к дифференцироке в различных направлениях, а именно в жировую и костную ткань.

Оценка способности к дифференцировке в адипоциты.

Индукцию адипогенной дифференцировки осуществляли путем внесения в культуральную среду лошадиной сыворотки, изобутилметилксантина и индометацина. Через семь дней культивирования все клетки обеих исследуемых культур накапливали в цитоплазме жировые вакуоли, специфически окрашиваемые

масляным красным (рис. 7). Таким образом было показано, что МК пульпы молочного зуба, как и МСК костного мозга, способны к адипогенной дифференцировке.

Рис. 7. Накопление жировых вакуолей в МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе адипогенной дифференцировки.

А - МСК костного мозга; Б - МК пульпы молочного зуба. Увеличение хбЗО.

Оценка способности к дифференцировке в остеобласты.

Дифференцировку клеток изучаемых культур в остеобласты проводили в ростовой среде без сыворотки с добавлением аскорбиновой кислоты, (3-глиперофосфата кальция и дексаметазона. Накопление клетками солей кальция в процессе дифференцировки в остеобласты выявляли при помощи окрашивания ализариновым красным. К 8-му дню культивирования в среде для остеогенной дифференцировки в культурах обнаруживались области повышенной концентрации клеток, специфически связывающих краситель (рис. 4, а, б). В дальнейшем плотность клеток в данных участках увеличивалась. Находящиеся в них клетки активно накапливали фосфаты кальция, что проявлялось в увеличении интенсивности окраски к 15-м суткам дифференцировки (рис. 4, в, г). К 22-м суткам культивирования в обеих культурах встречалось значительное количество локусов окостенения, характеризующихся наличием в них клеток, обладающих типичной для остеобластов морфологией и высоким содержанием солей кальция в вакуолях (рис. 4, д, е). Происходило активное вовлечение близлежащих клеток в процесс остеогенной

дифференцировки. Результаты данного исследования подтверждают гипотезу о наличие мультипотентных клеток в первичной культуре МК пульпы молочного зуба.

Рис. 4. Накопление фосфатов кальция в культурах МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки.

A, В, Д - МСК костного мозга; Б, Г, Е - МК пульпы молочного зуба. А, Б - 8-е сутки;

B, Г - 15-е сутки; Д, Е - 22-е сутки. Окраска ализариновым красным. Увеличение х200.

Способность МК пульпы молочного зуба отвечать на стимуляцию остеогенной дифференцировки накоплением минеральных отложений и образованием локусов окостенения в двумерной культуре указывает на способность клеток к дифференцировке в остеобласты. Однако, комплексная оценка возможности применения МК пульпы молочного зуба в ТИ кости требовала исследования большего количества маркеров дифференцировки клеток в костную ткань. Для решения этой задачи было осуществлено изучение изменения уровня экспрессии остеонектина и активности щелочной фосфатазы при культивировании клеток в остеоиндуктивной среде. При этом производили сравнение МК пульпы молочного зуба с МСК костного мозга по исследуемым параметрам.

Рис. 5. Экспрессия остеонектина МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки.

А, В - МСК костного мозга; Б, Г - МК пульпы молочного зуба. А, Б - 1-е сутки; В, Г - 8-е сутки. Окраска ядер ОАР1. Увеличение хбЗО.

Изменение уровня экспрессии остеонектина в процессе остеогенной дифференцировки.

Остеонектин - один из основных белков межклеточного вещества костной ткани. Он представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 32 кДа, обладающий способностью связывать кальций. Взаимодействие остеонектина с коллагеном I типа приводит к созданию комплекса, связывающего кристаллы гидроксиапатита и свободные ионы кальция Са2+. Образовавшиеся структуры становятся центром отложения минеральных солей, составляющих минеральную компоненту межклеточного вещества костной ткани [Termine et al., 1981]. На начальном этапе остеогенной дифференцировки в культурах клеток пульпы зуба и МСК костного мозга наблюдалась экспрессия данного маркера на фоновом уровне (рис. 5, а, б). К 8-му дню культивирования уровень экспрессии остеонектина возрастал в обеих исследуемых культурах (рис.5, в, г).

Изменение уровня активности щелочной фосфатазы в процессе остеогенной дифференцировки.

Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты. Этот фермент играет важную роль в процессах формирования и роста костей; высокий уровень его активности приводит к отложению минеральных солей [El-Amin et al., 2006]. Для подтверждения способности МК пульпы молочного зуба к дифференцировке в остеобласты проводили сравнение активности щелочной фосфатазы в культурах МК пульпы и МСК костного мозга при культивировании в среде с индукторами дифференцировки.

На начальном этапе в культуре МСК костного мозга обнаруживались только отдельные клетки, обладавшие невысоким уровнем активности щелочной фосфатазы; в культуре клеток пульпы зуба активность фермента не выявлялась (рис. 6, а, б). К 8-му дню культивирования в среде для остеогенной дифференцировки уровень активности щелочной фосфатазы критически возрастал во всех клетках изучаемых культур (рис. 6, в, г).

В клеточной биологии экспрессия остеонектина и активность щелочной фосфатазы традиционно используются в качестве основных маркеров остеогенной

дифференцировки [Jundt et al, 1987; George et al., 2006]. Нами было показано, что клетки обеих культур схожим образом отвечают на индукцию дифференцировки увеличением этих параметров. Таким образом, МК пульпы молочного зуба обладают высоким остеогенным потенциалом, практически аналогичным остеогенному потенциалу МСК костного мозга. Следовательно, пульпа молочного зуба может быть использована в качестве источника клеток для ТИ кости наравне с костным мозгом.

Б

:->

'ШГ

Рис. 6. Активность щелочной фосфатазы в культурах МСК костного мозга и МК пульпы зуба в процессе остеогенной дифференцировки

А, В - МСК костного мозга; Б, Г - МК пульпы молочного зуба. А, Б - 1-е сутки; В, Г - 8-е сутки. Увеличение хбЗО.

Культивирование МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба на полилактидных скэффолдах.

Концепция ТИ кости подразумевает применение остеогенных клеток в комплексе со скэффолдом. Скэффолд иммобилизует клетки на своей поверхности,

обеспечивает механическую прочность конструкции, а также имитирует межклеточное вещество костной ткани, в естественных условиях взаимодействующее с остеопрогениторными клетками и обеспечивающее реализацию их функций.

Было осуществлено заселение изготовленных полилактидных скэффолдов клетками костного мозга и пульпы молочного зуба человека. В обоих случаях на 8-й день после заселения на скэффолдах обнаруживалось значительное количество клеток (рис. 8, а, б). Через шесть недель культивирования жизнеспособность клеток сохранялась в обоих случаях; разница между клетками пульпы зуба и клетками костного мозга визуально не обнаруживалась (рис. 8, в, г). Тем самым была продемонстрирована возможность культивирования клеток на изучаемых скэффолдах.

Рис. 8. МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба, культивируемые на полилактидных скэффолдах.

А, В - МСК костного мозга; Б, Г МК пульпы молочного зуба. А, Б - 8-е сутки; В, Г -43-е сутки. Окраска ядер БАР!. Увеличение хЮО.

Изменение уровня экспрессии остеокальцнна МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки на полилактидных скэффолдах.

С целью подтверждения полученного вывода о перспективности МК пульпы молочного зуба человека в качестве источника остеопрогениторных клеток для ТИ кости была произведена оценка способности МК пульпы молочного зуба к остеогенной дифференцировке на полилактидных скэффолдах. Клетками заселяли скэффолды, а затем культивировали в среде для остеогенной дифференцировки, содержащей аскорбиновую кислоту, Р-глицерофосфат кальция и дексаметазон. Для оценки дифференцировки клеток в остеобласты исследовали изменение уровня экспрессии остеокальцнна путем иммуноцитохимического окрашивания клеток на скэффолдах с применением вторично меченных моноклональных антител.

Для подтверждения результатов мы осуществляли также окрашивание клеток, которые после культивирования на скэффолдах были перенесены на покровные стекла.

К 21-му дню инкубации в остеогенной среде в культуре МК пульпы молочного зуба, заселенных на скэффолды, наблюдалось существенное увеличение экспрессии остеокальцнна в отличие от культуры тех же клеток на скэффолдах, инкубированных в ростовой среде (рис. 9, а, б). Исследование клеток, пересаженных на покровные стекла, дало такой же результат (рис. 9, в, г).

Полученные данные указывают на то, что МК пульпы молочного зуба сохраняют свой остеогенный потенциал при культивировании на полилактидных скэффолдах; также показано отсутствие негативного влияния на процесс дифференцировки клеток со стороны самого скэффолда. Следовательно, изучаемые полилактидные скэффолды могут быть использованы для целей ТИ кости. Стоит отметить, что технология селективного лазерного спекания позволяет эффективно контролировать такие характеристики создаваемых скэффолдов как эффективность клеточной адгезии [Е1-Атт й а1., 2003] и сроки резорбции [АШопоу с: а1., 2004; Капсг1ег й а1., 2009]. Дополнительно в состав скэффолдов могут быть введены остеоиндуктивные вещества, например наноструктурированный гидроксиапатит.

Рис. 9. Экспрессия остеокальцина МК пульпы молочного зуба, культивированными на полнлактидных скэффолдах.

А, В - клетки, культивированные в ростовой среде; Б, Г - клетки, культивированные в среде для остеогенной дифференцировки. А, Б - иммуноцитохимическое окрашивание клеток на скэффолдах (слева - окраска антителами, справа - окраска ядер ОАР1); В, Г -иммуноцитохимическое окрашивание клеток на покровных стеклах, окраска ядер ОАР1. Увеличение хЮО (А, Б); х400 (В, Г).

В результате выполненной работы нами показано, что пульпа молочного зуба является перспективным источником клеточного материала для ТИ кости. Кроме того, МК пульпы молочного зуба с большой степенью вероятности могут применяться для создания технологий регенерации других типов соединительной ткани, таких как хрящ, сухожилия и связки. Известно, что культуры МК, полученные из пульпы молочных зубов, содержат плюрипотентные клетки, способные к нейрогенной, миогенной и гепатогенной дифференцировке [Мшга е1 а1., 2003]. По своей природе МК пульпы зуба являются высокогетерогенной популяцией, содержащей, в том числе, клетки, обладающие васкулогенным потенциалом [ГоЬага й а1., 2008], способствующим неоангиогенезу при трансплантациях.

Одной из наиболее широких областей применения ТИ кости является челюстно-лицевая хирургия. Широко распространены костные дефекты, возникающие в результате резорбции альвеолярных отростков, экстракции зубов, воспалительных процессов и онкологических заболеваний. Однако, попытки клинического применения аутотрансплантатов из трубчатых костей для замещения этих дефектов оказались недостаточно эффективны [А1ап1оуе е1 а1., 2006], что, вероятно, связано с различным эмбриональным происхождением этих тканей. Данная несовместимость отсутствует при применении МК пульпы молочного зуба [Бео е1 а1., 2008].

В отличие от болезненной для пациента инвазивной процедуры пункции костного мозга забор материала для получения культур МК пульпы молочного зуба чрезвычайно прост и не связан с какими-либо рисками. Один выпавший молочный зуб позволяет получить сотни миллионов МК. Таким образом, МК пульпы молочного зуба могут быть использованы для закладки на хранение в банки аутологичных стволовых клеток. В настоящее время в таких банках хранятся лишь образцы пуповинной крови, в которой содержание плюрипотентных клеток невелико и колеблется в широких пределах от родов к родам. Закладка МК пульпы молочного зуба в криобанки позволит существенно расширить круг детей, чьи аутологичные стволовые клетки могут быть заложены на хранение с целыо последующего использования в течение жизни.

выводы.

1. Пульпа молочного зуба человека, выпавшего естественным путем, дает возможность получить в культуре значительное количество мезенхимальных клеток.

2. Первичные культуры МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга обладают сходными цитофенотипическими профилями и содержат мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, способные к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro.

3. МК пульпы молочного зуба экспрессируют CD29 и CD49b на высоком уровне в отличие от МСК костного мозга, для которых характерен низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b.

4. Трехмерные биодеградируемые скэффолды на основе полилактида, полученные методом селективного лазерного спекания, могут быть использованы в комплексе с мезенхимальными клетками при создании тканеинженерных конструкций.

5. МК пульпы молочного зуба обладают способностью к остеогенной дифференцировке при культивировании на полилактидных скэффолдах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. Сравнение способности к дифференцировке мезенхимальных клеток человека, выделенных из разных источников, в ткани мезодермапьного происхождения // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, №1, с. 3-10.

2. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Петракова Н.В., Вахрушев И.В., Ярыгин К.II., Ярыгин В.Н. Сравнительный анализ цитофенотипов клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2007, №1, с. 38-45.

3. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.II. Сравнение in vitro иммунологических свойств культивируемых мезенхимальных клеток человека, изолированных из разных источников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2008, №2, с. 188-191.

4. Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Каралкин П.А., Лупатов А.Ю., Ярыгин К.Н. Мезенхимальные клетки пульпы молочного зуба: цитофенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии костной ткани // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2010, №1, с. 55-60.

5. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Лупатов А.Ю., Вахрушев И.В., Каралкин П.А., Ярыгин К.Н. Сравнительный анализ фенотипов и способности к дифференцировке клеток мезенхимального ряда, изолированных из тканей человека // Материалы конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 24-25 мая 2006 г., с. 27-29.

6. Ярыгин В.Н., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Чеглаков И.Б., Холоденко Р.В., Холоденко И.В., Лупатов А.Ю., Вахрушев И.В., Каралкин П.А., Ярыгин К.Н. Сравнительная характеристика культивируемых человеческих клеток мезенхимального ряда, выделенных из разных источников. Тезисы докладов и сообщений Всероссийского симпозиума "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006 г. // Цитология, 2006, т. 48, №9, с. 817-818.

7. Vakhrushev I.V., Suzdaltseva Y.G., Burunova V.V., Lupatov A.Y., Karalkin P.A., Yarigin K.N. Comparison of cytophenotypic profiles of mesenchymal cells isolated from various human tissues // Proceedings of British-Russian workshop in association with the European Commission "Stem cells: policy, research, and innovations. European Union - Russian Federation perspectives", Moscow, 15-16 March 2007. P. 7-8.

8. Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Ярыгин К.Н. Использование постнатальных мезенхимальных стволовых клеток человека, иммобилизованных на синтетическом трёхмерном биодеградируемом матриксе, для инженерии костной ткани in vitro. Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, ММА им. Сеченова, 19-22 мая 2008г. // Вестник Российской академии медицинских наук, 2008, спец. выпуск, с. 6.

9. Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Ярыгин К.Н. Сравнительный анализ цитофенотипов и способности к дифференцировке мезенхимальных етромальных клеток костного мозга и пульпы зуба человека // Материалы конференции "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении", Москва, 29 мая 2008 г.

10. Суздальцева Ю.Г., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н. Пульпа зуба - источник постнатальных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток // Материалы конференции "Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения", Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 9-11 июня 2008 г.

Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в

тканевой инженерии кости

Проведено сравнительное исследование первичных культур мезенхимальных клеток (МК) пульпы молочного зуба человека и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга в отношении свойств, характеризующих потенциал клеток как материала для тканевой инженерии кости. Фенотипический профиль обеих культур соответствовал мультипотентным клеткам мезенхимального ряда. Было обнаружено различие между исследуемыми типами клеток в экспрессии CD29 и CD49b: МК пульпы молочного зуба экспрессировали эти маркеры на высоком уровне, а МСК костного мозга продемонстрировали низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b. Клетки пульпы молочного зуба и костного мозга обладали почти одинаковой способностью как к адипогенной, так и к остеогенной дифференцировке, о чем судили по накоплению жировых вакуолей либо фосфатов кальция в соответствующих условиях. В ответ на введение в среду индукторов остеогенной дифференцировки в обеих культурах возрастали уровни экспрессии остеонектина и активности щелочной фосфатазы. Исследуемые клетки были использованы для заселения биодеградируемых полилактидных скэффолдов. При культивировании МК пульпы молочного зуба на скэффолдах в остеогенной среде возрастал уровень экспрессии клетками остеокальцнна. Полученные результаты указывают на то, что МК пульпы молочного зуба могут быть использованы в составе тканеинженерных конструкций для восстановления костных дефектов, являясь при этом легко доступным источником мультипотентных клеток для закладки в криобанки.

Vakhrushev I.V.

Comparative characteristics of mesenchymal cells from deciduous tooth pulp and bone marrow: phenotype and an initial evaluation of the potential for use in bone

tissue engineering

This study was performed to compare the primary cultures of mesenchymal cells isolated from the pulp of human exfoliated deciduous teeth (often abbreviated SHED, stem cells from human exfoliated deciduous teeth) and human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMMSC) regarding their properties characterizing the potential of cells as a material for bone tissue engineering. The phenotypic profile of both cell cultures was indicative of multipotent cells of a mesenchymal line. A difference between SHED and BMMSC was found concerning the expression of CD29 and CD49b: SHED expressed high levels of these markers, whereas low-level expression of CD29 and no expression of CD49b were observed on BMMSC. The cultured cells from both sources exhibited nearly the same capacity for adipogenic as well as for osteogenic differentiation, as judged by the accumulation of fat vacuoles or calcium phosphates under appropriate conditions. The addition of osteogenic inducers to any of both cell cultures caused the increase in the levels of osteonectin expression and alkaline phosphatase activity. We used SHED and BMMSC to populate a biodegradable polylactide scaffold. Upon cultivation of the SHED-seeded scaffold in osteogenic differentiation medium, the level of osteocalcin expression in the cells increased. Our data suggest that SHED may be used as a component of tissue engineering constructions for bone defect reparation. In addition to this, these cells are an easily accessible source of multipotent cells for stem cell banking.

Подписано в печать: 23.12.2010 Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, 2-ой Автозаводский пр-д, д. ЗА Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Вахрушев, Игорь Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ!.;.;.

ВВЕДЕНИЕ:.;.:.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1'. 1. Тканевая инженерия костной ткани: основные принципы и область применения.'.:„.;.л.:.

1.2. Источники клеточного материала для остеорегенеративной .•".,'• терапии;.;.1 1Ш

1.2.Г. Эмбриональные стволовые;клетки.

1.2.1.1. История изучения эмбриональных стволовых;клеток;.

1.2.1.2: О возможности клинического применения эмбриональных

• стволовых! клеток;;.,.:.;.:. :.

1.2';2; Мезенхимальныестволовыеклетки.

1.2.2.1. История изучения мезенхимальных стволовых клеток.

1.2.212. Источники мезенхимальных стволовых клеток.

1.2.2.3. Характеристика мезенхимальных стволовыхклеток.'.".

1.2.2.4. Мультипотенгность мезенхимальных стволовых клеток.

1.2.2.5. Попытки применения мезенхимальных стволовых клеток в терапии костных дефектов .

1.2.2:6. Основания для поиска альтернативных источников мезенхимальных,стволовых клеток.—.

1.2.3; Мезенхимальные клетки пульпы зуба.

1.23.1. История изучения.мезенхимальных; клеток пульпы зуба:.

1.23;2. Свойства;мезенхимальных клеток пульпы зуба.

1.2.3.3. Мультипотентность мезенхимальных,клеток пульпы зуба.

1.2.4. Мезенхимальные клетки пульпы молочного зуба.

1.2.4.1. Мультипотентность мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба.

1.2.4.2. Остеоиндуктивный потенциал мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба.

1.2.5. Клиническое применение мезенхимальных клеток пульпы зуба

1.3. Скэффолды, применяемые в тканевой инженерии кости:.

1.3.1. История создания скэффолдов для тканевой инженерии кости

1.3.2. Биодеградируемые полимеры.

1.3.2.1. Полиэстеры.

1.3.2.2. Прочие биодеградируемые полимеры.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культуры клеток.

2.2. Изготовление полилактидных скэффолдов.

2.3. Заселение скэффолдов клетками.44*

2 Л. Проточнаящитофлуориметрия.

2.5. Остеогенная дифференцировка.

2.6. Адипогенная дифференцировка.

2.7. Исследование активности щелочной фосфатазы.

2.8. Иммуноцитохимическое окрашивание.

2.9. Получение и обработка цифровых изображений.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Морфология полученных культур клеток.

3.2 Цитофенотипические профили МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба.503.3. Оценка способности клеток к дифференцировке в адипоциты.

3.4. Оценка способности клеток к дифференцировке в остеобласты.

3.5. Изменение уровня экспрессии остеонектина клетками в процессе остеогенной дифференцировки.

3.6. Изменение уровня активности щелочной фосфатазы в клетках в процессе остеогенной дифференцировки.

3.7. Культивирование МСК костного мозга и МК пульпы молочного зуба на полилактидных скэффолдах.

3.8. Изменение уровня экспрессии остеокальцина МК пульпы молочного зуба в процессе остеогенной дифференцировки на полилактидных скэффолдах.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга обладают сходной морфологией и фенотипом, соответствующим мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам.

4.2. Культура МК пульпы молочного зуба содержит прогениторные клетки, обладающие остеогенным потенциалом.

4.3. МК пульпы молочного зуба сохраняют остеогенный потенциал при культивировании на полилактидном скэффолде в составе тканеинженерного комплекса.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и костного мозга: фенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии кости."

В настоящее время наиболее распространёнными высокотехнологичными хирургическими подходами к восстановлению повреждённых органов являются реконструктивная хирургия и трансплантация органов. С их помощью спасены миллионы жизней, но они имеют принципиальные ограничения. Во-первых, биомедицинские конструкции, как правило, не могут полностью заменить живую ткань. Во-вторых, главной проблемой трансплантологии является дефицит пригодных для пересадки органов и иммунологическая несовместимость реципиента и донора. Эти ограничения поставили на повестку дня исследования в области тканевой инженерии как более щадящего метода структурного и функционального восстановления органов и тканей.

Тканевая инженерия - одна из новых и очень перспективных биомедицинских технологий, позволяющих индуцировать и/или ускорять регенерацию повреждённых тканей, а также проводить замещение дефектных органов или их частей. В то же время тканевая инженерия - это современная медицинская методология, основанная на использовании естественной способности организма пациента к восстановлению. Согласно определению, тканевая инженерия - это процесс создания трёхмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма, на основе комбинации клеток и скэффолдов {от англ. scaffold — носитель, матрица, каркас), а также прочих факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию внеклеточного матрикса [153].

Одним из наиболее востребованных и, следовательно, интенсивно развиваемых направлений тканевой инженерии является терапия костных дефектов [30]. Дефекты костной ткани, возникающие в результате травм, хирургических вмешательств, а также вследствие различных заболеваний, во многих случаях приводят к функциональной недостаточности опорнодвигательного аппарата, тем самым существенно снижая качество жизни. Практически во всех случаях в зоне поражения формируется значительный косметический дефект. Актуальность проблемы репарации костной ткани связана также с увеличением встречаемости остеодегенеративных заболеваний, особенно в развитых странах.

Тканевая инженерия любой' ткани возможна лишь при наличии по крайней мере двух исходных компонентов: клеток-родоначальниц её паренхиматозных элементов и биосовместимого' материала для создания трёхмерного скэффолда, в пределах которого протекают процессы, гисто- и морфогенеза. В идеале, материал скэффолда должен имитировать свойства межклеточного вещества и составлять часть «микрониши», т.е. непосредственного окружения клеток, создающего адекватные условия для их пролиферации и/или дифференцировки в нужном направлении, а также для осуществления нормальных функций после дифференцировки, в том числе, для продукции межклеточного вещества.

В качестве клеточного материала для заселения скэффолдов чаще всего используют аутологичные мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга [28] или жировой ткани [60] и размноженные в культуре. К сожалению, в течение жизни- эти клетки, подобно всем другим клеткам человеческого организма, стареют [13] и подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что приводит к накоплению соматических мутаций и снижению пролиферативного и остеогенного потенциала [21].

На основании данных, представленных в диссертационной работе, можно предложить в качестве решения этой проблемы использование-аутологичных остеогенных клеток пульпы молочного зуба, которые после выделения и экспансии в культуре могут до момента их использования храниться в жидком азоте в криобанке.

В данной работе в результате разнообразных экспериментов показано, что культура мезенхимальных клеток (МК) пульпы молочного зуба обладает остеогеннымшотенциалом не меньшим;, чем у мезенхимальных стромальных клеток» (МСК) костного мозга. МСК костного мозга1 были выбраны образцом для!8 сравнения;. .так; как; эти* клетки? традиционно;, рассматриваются* исследователями«' в качестве: основных кандидатов.' на ; роль остеопрогениторных клеток в составе тканеинженерных костных имплантов. В качестве * скэффолда в данной' работе был использован биодеградируемый полилактидный скэффолд нового поколения, созданный с помощью поверхностного селективного лазерного спекания. Можно сказать, что он успешно прошёл первичные испытания; по использованию с МК из пульпы зуба и стромы костного мозга.

Целью данного исследования явилась сравнительная характеристика мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба и стромы красного костного' мозга человека и оценка возможности применения пульпы молочного зуба человека в качестве, источника. клеточного ^материала для тканевой инженерии кости.

В соответствии с. целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуры мезенх11 маль ных клеток (МК) > пульпы молочного: зуба и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга, человека.

2. Сравнить цитофенотипические профили полученных культур.

3. Сравнить.сгюсобносты1ссле;1уемых клеток к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

4; Отработать методику культивирования изучаемых клеток на биодеградируемом скэффолде. 5. Оценить возможность остеогенной дифференцировки; МК пульпы молочного зуба, культивируемых на трёхмерном скэффолде.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Вахрушев, Игорь Викторович

выводы

1. Пульпа молочного зуба человека, выпавшего естественным путем, дает возможность получить в культуре значительное количество мезенхимальных клеток.

2. Первичные культуры МК пульпы молочного зуба и МСК костного мозга обладают сходными цитофенотипическими профилями и содержат мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, способные к остеогенной и адипогенной дифференцировке in vitro.

3. МК пульпы молочного зуба экспрессируют CD29 и CD49b на высоком уровне в отличие от МСК костного мозга, для которых характерен низкий уровень экспрессии CD29 и отсутствие экспрессии CD49b.

4. Трехмерные биодеградируемые скэффолды на основе полилактида, полученные методом селективного лазерного спекания, могут быть использованы в комплексе с мезенхимальными клетками при создании тканеинженерных конструкций.

5. МК пульпы молочного зуба обладают способностью к остеогенной дифференцировке при культивировании на полилактидных скэффолдах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате выполненной работы нами показано, что пульпа молочного зуба является перспективным источником клеточного материала для тканевой инженерии кости. Основной упор в нашей работе был сделан на оценку остеогенного потенциала МК пульпы молочного зуба в сравнении с МСК костного мозга. Это обусловлено тем, что в мире наибольшее число исследований {in vitro и на лабораторных животных) в области регенерации костных дефектов проведено с использованием МСК костного мозга, так как считается, что эти клетки могут быть достаточно эффективными в роли клеток-предшественников костной ткани. Есть примеры удачного использования МСК костного мозга и в клинической практике.

Тем не менее, терапевтическое применение МСК костного мозга ограничено рядом проблем. С возрастом количество МСК в костном мозге резко уменьшается и, кроме того, они накапливают мутации (возникающие, например, под действием неблагоприятных факторов внешней среды), снижающие их остеорегенеративный потенциал. Ко всему прочему, забор материала для получения культур этих клеток требует пункции красного костного мозга - болезненной и небезопасной инвазивной процедуры.

Очевидно, что молочный зуб, выпавший естественным путём, - это чрезвычайно простой и не связанный ни с какими рисками способ получения исходного материала для выделения МК, которые, как показывают результаты данной работы, обладают не меньшим остеогенным потенциалом, чем МСК костного мозга. Благодаря высокой пролиферативной активности клеток пульпы молочного зуба один выпавший зуб позволяет получить сотни миллионов МК. На основании результатов нашего исследования мы ратуем за то, чтобы МК пульпы молочного зуба закладывались на хранение в банки аутологичных стволовых клеток. В настоящее время в таких банках хранятся лишь образцы пуповинной крови, в которой содержание плюрипотентных клеток невелико и колеблется в широких пределах от родов к родам.

Закладка МК пульпы молочного зуба в криобанки позволит существенно расширить круг детей, чьи аутологичные стволовые клетки могут быть заложены на хранение с целью последующего использования в течение жизни. Кроме того, внедрение пульпы зуба в качестве очень доступного и эффективного источника мультипотентных клеток может внести значительный вклад в развитие клеточных технологий и тканевой инженерии, что крайне актуально для зравоохранения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Вахрушев, Игорь Викторович, Москва

1. Abbondanzo S.J., Gadi I., Stewart C.L. Derivation of embryonic stem cell lines // Method Enzymol, 1993, V.225, P. 803-823.

2. About I., Bottero M.J., de Denato P., Camps J., Franquin J.C., Mitsiadis T.A. Human dentin production in vitro // Exp Cell Res, 2000, V.258, No.l, P. 33-41.

3. Akintoye S.O., Lam T., Shi S., Brahim J., Collins M.T., Robey P.G. Skeletal site-specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals // Bone, 2006, V.38, No.6, P. 758-768.

4. Albrecht-Olsen P., Kristensen G., Tormala P. Meniscus bucket-handle fixation with an absorbable Biofix tack: development of a new technique // Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 1993, V.l, No.2, P. 104-106.

5. Alexander J.T., Branch C.L., Jr., Subach B.R., Haid R.W., Jr. Applications of a resorbable interbody spacer via a posterior lumbar interbody fusion technique//Orthopedics, 2002, V.25, No. 10 Suppl, P. 1185-1189.

6. Amit M. Feeder-layer free culture system for human embryonic stem cells // Methods Mol Biol, 2007, V.407, P. 11-20.

7. Amit M., Margulets V., Segev H., Shariki K., Laevsky I., Coleman R., Itskovitz-Eldor J. Human feeder layers for human embryonic stem cells // Biol Reprod, 2003, V.68, No.6, P. 2150-2156.

8. Aubin J.E. Bone stem cells. // J Cell Biochem Suppl, 1998, V.30-31, P. 7382.

9. Barry F.P., Boynton R., Murphy M., Zaia J. The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells. // Biochem Biophys Res Commun, 2001, V.289, P. 519-524.

10. Barry F.P., Boynton R.E., Haynesworth S., Murphy J.M., Zaia J. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105). // Biochem Biophys Res Commun, 1999, V.265, P. 134-139.

11. Batouli S., Miura M., Brahim J., Tsutsui T.W., Fisher L.W., Gronthos S., Robey P.G., Shi S. Comparison of stem-cell-mediated osteogenesis and dentinogenesis // J Dent Res, 2003, V.82, No. 12, P. 976-981.

12. Bellantuono I., Aldahmash A., Kassem M. Aging of marrow stromal (skeletal) stem cells and their contribution to age-related bone loss // Biochim Biophys Acta, 2009, V.1792, No.4, P. 364-370.

13. Bianco P., Constantini M., Dearden L., Bonucci E. Alkaline phosphatase positive precursors of adipocytes in the human bone marrow. // J Haematol, 1988, V.68, P. 401-411.

14. Bianco P., Gehron Robey P. Marrow stromal stem cells // J Clin Invest, 2000, V.105, No.12, P. 1663-1668.

15. Bonzani I.C., George J.H., Stevens M.M. Novel materials for bone and cartilage regeneration // Curr Opin Chem Biol, 2006, V.10, No.6, P. 568575.

16. Burns A.E. Biofix fixation techniques and results in foot surgery // J Foot Ankle Surg, 1995, V.34, No.3, P. 276-282.

17. Burns A.E., Varin J. Poly-L-lactic acid rod fixation results in foot surgery // J Foot Ankle Surg, 1998, V.37, No.l, P. 37-41.

18. Buttery L.D., Bourne S., Xynos J.D., Wood H., Hughes F.J., Hughes S.P., Episkopou V., Polak J.M. Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. // Tissue Eng, 2001, V.7, P. 89-99.

19. Campagnoli C., Roberts I.A., Kumar S. Identification of mesenchymal • stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. //Blood, 2001, V.98, P. 2396-2402.

20. Cancedda R., Bianchi G., Derubeis A., Quarto R. Cell therapy for bone disease: a review of current status // Stem Cells, 2003, V.21, No.5, P. 610619.

21. Cantatore F.P., Crivellato E., Nico B., Ribatti D. Osteocalcin is angiogenic in vivo // Cell Biol Int, 2005, V.29, No.7, P. 583-585.

22. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // J Orthop Res, 1991, V.9, No.5, P. 641-650.

23. Casagrande L., Demarco F.F., Zhang Z., Araujo F.B., Shi S., Nor J.E. Dentin-derived BMP-2 and odontoblast differentiation // JDent Res, 2010, V.89, No.6, P. 603-608.

24. Conget P. A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells // J Cell Physiol, 1999, V.181, No.l, P. 67-73.

25. Couble M.L., Farges J.C., Bleicher F., Perrat-Mabillon B., Boudeulle M., Magloire H. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures // Calcif Tissue Int, 2000, V.66, No.2, P. 129-138.

26. D'Ippolito G., Schiller P.C., Ricordi C., Roos B.A., Howard G.A. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. // J Bone Miner Res, 1999, V.14, P. 1115-1122.

27. Dennis J.E., Carbillet J.P., Caplan A.I., Charbord P. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential // Cells Tissues Organs, 2002, V.170, No.2-3, P. 73-82.

28. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., Yoo J.U., Johnstone B., Caplan A.I. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse // J Bone Miner Res, 1999, V. 14, No.5, P. 700-709.

29. Doetschman T., Williams P., Maeda N. Establishment of hamster blastocyst-derived embryonic (ES) cells. // Dev Biol, 1989, V.127, P. 224-227.

30. Eglin D., Alini M. Degradable polymeric materials for osteosynthesis: tutorial // Eur Cell Mater, 2008, V. 16, P. 80-91.

31. El-Amin S.F., Lu H.H., Khan Y., Burems J., Mitchell J., Tuan R.S., Laurencin C.T. Extracellular matrix production by human osteoblasts cultured on biodegradable polymers applicable for tissue engineering // Biomaterials, 2003, V.24,No.7, P. 1213-1221.

32. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. // Br J Haematol, 2000, V.109, P. 235-242.

33. Evans M J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. // Nature, 1981, V.292, P. 154-156.

34. Fernandez M., Simon V., Herrera G. Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients. // Bone Marrow Transplant, 1997, V.20, P. 265-271.

35. Ferrari G., Cusella-DeAngelis G., Coletta M. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. // Science, 1998, V.279, P. 15281530.

36. Fibbe W.E. Mesenchymal stem cells. A potential source for skeletal repair // Ann Rheum Dis, 2002, V.61 Suppl 2, P. Ü29-31.

37. Friedenstein A. Stromal mechanisms of bone marrow: cloning in vitro and retransplantation in vivo. In: Thienfelder S, RodtH, Kolb HJ (eds). Immunology Of Bone Marrow Transplantation. Berlin: Springer-Verlag;1980.

38. Friedenstein A .J., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet, 1970, V.3, No.4, P. 393-403.

39. George J., Kuboki Y., Miyata T. Differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts on honeycomb collagen scaffolds // Biotechnol Bioeng, 2006, V.95, No.3, P. 404-411.

40. Gepstein L. Derivation and potential applications ofhuman embryonic stem cells // Circ Res, 2002, V.91, No. 10; P. 866-876.

41. Giles J.R., Yang X., Mark W., Foote R.H. Pluripotency of cultured rabbitinner cell mass cells.detected by isozyme analysis and eye pigmentation ofjfetuses following injection into blastocyst or morulae. // Mol Reprod Dev, 1993, V.36,P." 130-138.

42. Golub E.E. Role of matrix vesicles inbiomineralization// Biochim Biophys Acta, 2009, V.l,790, No.l2,P: 1592-1598.

43. Gronthos S., Brahim Ji, Li W., Fisher L.W., Cherman N., Boyde A., DenBestenP;, Robey P.G., Shi S. Stem cell properties of human dental pulp stem cells //J Dent Res, 2002, V.81, No.8, P. 531-535.

44. Gronthos S., Graves S.E., Ohta S., Simmons P.J. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors // Blood, 1994, V.84, No. 12, P. 4164-4173.

45. Gronthos S., Mankani M;, Brahim J., Robey P.G., Shi S. Postnatal human? dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, V.91, No.25, P. 13625-13630.

46. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived' conditions in vitro // Blood, 1995, V.85, No.4, P. 929-940.

47. GrundelR.E., Chapman M.W., Yee T., Moore D.C. Autogeneic bone marrow- and porous biphasic calcium phosphate ceramic for segmental bone defects in the canine ulna // Clin Orthop Relat Res, 1991, No.266, P. 244258.

48. Han Z., Cheng Y., Liang C.G., Latham K.E. Nuclear transfer in mouse oocytes and embryos // Methods Enzymol, 2010, V.476, P. 171-184.

49. Haynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M:, Caplan A. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow. // Bone, 1992, V.13, P. 81-88. :

50. Hench L.L., Polak J.M. Third-generation biomedical materials // Science, 2002, V.295, No.5557, P. 1014-1017.

51. Heng B.C., Cao T., Stanton L.W., Robson P., Olsen B. Strategies for directing the differentiation of stem cells into the osteogenic lineage in vitro // J Bone Miner Res, 2004, V.19, No.9, P. 1379-1394.

52. Hoang Q.Q., Sicheri F., Howard A.J., Yang D.S. Bone recognition mechanism of porcine osteocalcin from crystal structure //Nature, 2003, V.425, No.6961, P. 977-980:

53. Hogan B., Beddington R., Costantini F., Lacy E. Isolation, culture and manipulation of embryonic stem cells. (2nd ed), In Manipulating the Mouse

54. Embryo. A laboratory Manual. New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press; 1994.

55. Huang G.T., Shagramanova K., Chan S.W. Formation of odontoblast-like: cells from cultured human dental.pulp cells on dentin in vitro IIJ Endod, 2006, V.32, No:l 1, Pi 1066-1073.

56. Huang G.T., Sonoyama W., Chen J., Park S.H. In vitro:characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments// Cell Tissue Res, 2006, Y.324i No.2, P. 225-236;

57. Ishaug S.L., Crane G.M., Miller M.J., Yasko A.W., Yaszemski M.J., Mikos A.G. Bone formation by three-dimensional stromal osteoblast culture in biodegradable polymer scaffolds // J Biomed Mater Res, 1997, V.36, No. l, P. 17-28. ;i

58. Jaiswal N., Haynesworth S.E., Caplan A.I., Bruder S.P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro // J Cell Biochem, 1997, V.64, No.2, P. 295-312.

59. Jeon O., Rhie J.W., Kwon I.K., Kim J.H., Kim B.S., Lee S.H. In vivo bone formation following transplantation of human adipose-derived stromal cells that are not differentiated osteogenically // Tissue Eng Part A, 2008, V.14, No.8, P. 1285-1294.

60. Jundt G., Berghauser K.H., Termine J.D., Schulz A. Osteonectin—a differentiation marker of bone cells // Cell Tissue Res, 1987, V.248, No.2, P. 409-415.

61. Kaigler D., Pagni G., Park C.H., Tarle S.A., Bartel R.L., Giannobile W.V. Angiogenic and osteogenic potential of bone repair cells for craniofacial regeneration // Tissue Eng Part A, 2010, V.16, No.9, P. 2809-2820.

62. Kaigler D., Wang Z., Horger K., Mooney D.J., Krebsbach P.H. VEGF scaffolds enhance angiogenesis and bone regeneration in irradiated osseous defects // J Bone Miner Res, 2006, V.21, No.5, P. 735-744.

63. Krebsbach P.H., Kuznetsov S.A., Satomura K. Bone formation in vivo: comparison of osteogenesis by transplanted mouse and human marrow stromal fibroblasts. // Transplantation, 1997, V.63, P. 1059-1069.

64. Lee C.K., Piedrahita J.A. Transgenesis and germ cell engineering in domestic animals. // Asian-Australas J Anim Sci, 2003, V.16, P. 910-927.

65. Lee J.B., Song J.M., Lee J.E., Park J.H., Kim S.J., Kang S.M., Kwon J.N., Kim M.K., Roh S.I., Yoon H.S. Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells // Reproduction, 2004, V.128, No.6, P.727-735.

66. LeGeros R.Z. Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates // Clin Orthop Relat Res, 2002, No.395, P. 81-98.

67. Lennon D.P., Haynesworth S.E., Arm D.M., Baber M.A., Caplan A.I. Dilution of human mesenchymal stem cells with dermal fibroblasts and the effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis // Dev Dyn, 2000, V.219, No.l, P. 50-62.

68. Liang H., Wang K., Shimer A.L., Li X,, Balian G., Shen F.H. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect model // Bone, 2010, V.47, No.2, P. 197-204.

69. Liu H., Slamovich E.B., Webster T.J. Less harmful acidic degradation of poly(lacticco-glycolic acid) bone tissue engineering scaffolds through titania nanoparticle addition // Int J Nanomedicine, 2006, V.l, No.4, P. 541-545.

70. Liu X., Ma P.X. Polymeric scaffolds for bone tissue engineering // Ann Biomed Eng, 2004, V.32, No.3, P. 477-486.

71. Lu J., Hou R., Booth C.J., Yang S.H., Snyder M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells // Proc Natl Acad Sci USA, 2006, V.103, No.15, P. 5688-5693.

72. Lucas P.A., Price P.A., Caplan A.I. Chemotactic response of mesenchymal cells, fibroblasts and osteoblast-like cells to bone Gla protein // Bone, 1988, V.9,No.5, P. 319-323.

73. Mackay A.M., Beck S.C., Murphy J.M. Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow. // Tissue Eng, 1998, V.4, P. 415-428.

74. Maillard C., Malaval L., Delmas P.D. Immunological screening of SPARC/Osteonectin in nonmineralized tissues // Bone, 1992, V.13, No.3, P. 257-264.

75. Mareschi K., Biasin E., Piacibello W. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. // Haematologica, 2001, V.86, P. 1099-1100.

76. Martin M.J., Muotri A., Gage F., Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. // Nat Med, 2005, V. 11, P. 228-232.

77. McCulloch C.A., Strugurescu M., Hughes F., Melcher A.H., Aubin J.E. Osteogenic progenitor cells in rat bone marrow stromal populations exhibit self-renewal in culture. // Blood, 1991, V.77, P. 1906-1911.

78. Middleton J.C., Tipton A.J. Synthetic biodegradable polymers as orthopedic devices // Biomaterials, 2000, V.21, No.23, P. 2335-2346.

79. Miura M., Gronthos S., Zhao M., Lu B., Fisher L.W., Robey P.G., Shi S. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth // Proc Natl Acad Sci USA, 2003, V.100, No.10, P. 5807-5812.

80. Mizuno M., Shindo M., Kobayashi D., Tsuruga E., Amemiya A., Kuboki Y. Osteogenesis by bone marrow stromal cells maintained on type I collagen matrix gels in vivo // Bone, 1997, V.20, No.2, P. 101-107.

81. Morsczeck C., Gotz W., Schierholz J., Zeilhofer F., Kuhn U., Mohl C., Sippel C., Hoffmann K.H. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth // Matrix Biol, 2005, V.24, No.2, P. 155-165.

82. Moss D.W. Perspectives in alkaline phosphatase research // Clin Chem, 1992, V.38, No. 12, P. 2486-2492.

83. Nakahara H., Dennis J.E., Bruder S.P. In vitro differentiation of bone and hypertrophic cartilage from periosteal-derived cells. // Exp Cell Res, 1991, V.195, P. 492-503.

84. Nandakumar A., Fernandes H., de Boer J., Moroni L., Habibovic P., van Blitterswijk C.A. Fabrication of Bioactive Composite Scaffolds by Electrospinning for Bone Regeneration // Macromol Biosci, 2010, P.

85. Nathanson M.A. Bone matrix-directed chondrogenesis of muscle in vitro. // Clin Orthop, 1985, V.200, P. 142-158.

86. Navarro M., Michiardi A., Castano O., Planell J.A. Biomaterials in orthopaedics // J R Soc Interface, 2008, V.5, No.27, P. 1137-1158.

87. Ohgushi H., Goldberg V.M., Caplan A.I. Heterotopic osteogenesis in porous ceramics induced by marrow.cells // J Orthop Res, 1989, V.7, No.4, P. 568578.

88. V.105,No.41, P. 15767-15772.

89. Owen M. Marrow stromal stem cells // J Cell Sci Suppl, 1988, V. 10, P. 6376.

90. Pereira R.F., O'Hara M.D., Laptev A.V. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesis imperfecta. // Proc Natl Acad Sci USA, 1998, V.95, P. 1142-1147.

91. Petersen B., Bowen W., Patrene K. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. // Science, 1999, V.284, P. 1168-1170.

92. Pihlajamaki H., Bostman O., Rokkanen P. A biodegradable expansion plug for fixation of the coracoid bone block in the Bristow-Latarjet operation // Int Orthop, 1994, V.18, No.2, P. 66-71.

93. Pitt C.G., Gratzl M.M., Kimmel G.L., Surles J., Schindler A. Aliphatic polyesters II. The degradation of poly (DL-lactide), poly (epsilon-caprolactone), and their copolymers in vivo // Biomaterials, 1981, V.2, No.4, P. 215-220.

94. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science, 1999, V.284, No.5411, P. 143-147.

95. Pittinger M., Mackay A., Beck S.C. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science, 1999, V.284, P. 143-147.

96. Porter J.R., Henson A., Popat K.C. Biodegradable poly(epsilon-caprolactone) nanowires for bone tissue engineering applications // Biomaterials, 2009, V.30, No.5, P. 780-788.

97. Power M.J., Fottrell P.F. Osteocalcin: diagnostic methods and clinical applications // Crit Rev Clin Lab Sci, 1991, V.28, No.4, P. 287-335.

98. Quarto R., Thomas D., Liang C.T. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity. // Calcif Tissue, 1995, V.56, P. 123-129.

99. Reyes C.D., Garcia A.J. Alpha2betal integrin-specific collagen-mimetic surfaces supporting osteoblastic differentiation // J Biomed Mater Res A, 2004, V.69, No.4, P. 591-600.

100. Reyes M., Lund T., Lenvik T. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. // Blood, 2001, V.98, P. 2615-2625.

101. Reyes M., Verfaillie C.M. Turning marrow into brain: generation of glial and neuronal cells from adult bone marrow mesenchymal stem cells. // Blood, 1999,V.94,P. 377a.

102. Richards M., Tan S., Fong C.Y., Biswas A., Chan W.K., Bongso A. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells // Stem Cells, 2003, V.21, No.5, P. 546-556.

103. Robbins M.M., Vaccaro A.R., Madigan L. The use of bioabsorbable implants in spine surgery // Neurosurg Focus, 2004, V.16, No.3, P. El.

104. Robertson E.J., Bradley A., Evans M.J., Kuhen M.R. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. // Nature, 1986, V.323, P. 445-448.

105. Sakai V.T., Zhang Z., Dong Z., Neiva K.G., Machado M.A., Shi S., Santos C.F., Nor J.E. SHED differentiate into functional odontoblasts and endothelium // J Dent Res, 2010, V.89, No.8, P. 791-796.

106. Satomura K., Derubeis A.R., Fedarko N.S., Ibaraki-O'Connor K., Kuznetsov S.A., Rowe D.W., Young M.F., Gehron Robey P. Receptor tyrosine kinase expression in human bone marrow stromal cells // J Cell Physiol, 1998, V.177, No.3, P. 426-438.

107. Schimming R., Schmelzeisen R. Tissue-engineered bone for maxillary sinus augmentation // J Oral Maxillofac Surg, 2004, V.62, No.6, P. 724-729.

108. Seo B.M., Miura M., Gronthos S., Bartold P.M., Batouli S., Brahim J., Young M., Robey P.G., Wang C.Y., Shi S. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament // Lancet, 2004, V.364, No.9429, P. 149-155.

109. Seo B.M., Sonoyama W., Yamaza T., Coppe C., Kikuiri T., Akiyama K., Lee J.S., Shi S. SHED repair critical-size calvarial defects in mice // Oral Dis, 2008, V.14, No.5, P. 428-434.

110. Shi Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies // Curr Mol Pharmacol, 2009, V.2, No.l, P. 1518.

111. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in, human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1 // Blood, 1991, V.78,No.l,P. 55-62.

112. Simon J.A., Ricci J.L., Di Cesare P.E. Bioresorbable fracture fixation in orthopedics: a comprehensive review. Part I. Basic science and preclinical studies // Am J Orthop (Belle Mead NJ), 1997, V.26, No.10, P. 665-671.

113. Smith A.J., Cassidy N., Perry H., Begue-Kirn C., Ruch J.V., Lesot H. Reactionary dentinogenesis // Int J Dev Biol, 1995, V.39, No.l, P. 273-280.

114. Sonoyama W., Liu Y., Fang D., Yamaza T., Seo B.M., Zhang C., Liu H., Gronthos S., Wang C.Y., Wang S., Shi S. Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine // PLoS One, 2006, V.l, P. e79.

115. Sonoyama W., Liu Y., Yamaza T., Tuan R.S., Wang S., Shi S., Huang G.T. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study // J Endod, 2008, V.34, No.2, P. 166-171.

116. Sottile V., Thomson A., McWhir J. In vitro osteogenic differentiation of human ES cells. // Cloning Stem Cells, 2003, V.5, P. 149-155.

117. Sung H.J., Meredith C., Johnson C., Galis Z.S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis // Biomaterials, 2004, V.25, No.26; P. 5735-5742.

118. Suvorova L.A., Gordukova V.I., Gruzdev G.P. Heterogeneity of the stromal precursor cells of human and guinea pig bone marrow. // Probl Gematol Pereliv Krovi, 1981, V.26, No.6, P. 30-33.

119. Tortelli F., Cancedda R. Three-dimensional cultures of osteogenic and chondrogenic cells:: a-tissue engineering«approach to mimic bone and . cartilage in vitro // Eur Cell Mater, 2009, V.17, P. 1-14.

120. Tran G.T., Gargiulb. C., Thao H:D., Tuan H.M., Filgueira L., Michael' Strong D. Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells // Cell Tissue Bank, 2010, DOl 10.1007/sl 0561-010-9208-2

121. Trounson A. Human embryonic stem cells: Mother of all cell and tissue types. // Reprod Biomed Online, 2002, V.4(Suppl 1), P. 58-63.

122. Tsukamoto Y., Fukutani S., Shin-Ike T., Kubota T., Sato S;, Suzuki^^Y., Mori M: Mineralized nodule: formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts//Arch Oral Biol, 1992, V.37,No.l2, P. 1045-1055.

123. Vert M. Aliphatic polyesters: great degradable polymers that cannot do everything // Biomacromolecules, 2005, V.6, No.2, P. 538-546.

124. Vert M., Li S., Garreau H. New insights on the degradation of bioresorbable polymeric devices based on lactic and glycolic acids // Clin Mater, 1992, V.10, No. 1-2, P. 3-8.

125. Wang J., Wang X., Sun Z., Yang H., Shi S., Wang S. Stem cells from human-exfoliated deciduous teeth can differentiate into dopaminergic neuron-like cells // Stem Cells Dev, 2010, V.19, No.9, P. 1375-1383.

126. Wang Y., Shi X., Ren L., Yao Y., Zhang F., Wang D.A. Poly(lactide-co-glycolide)/titania composite microsphere-sintered scaffolds for bone tissue engineering applications // J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2010, V.93, No.l, P. 84-92.

127. Xu C., Inocuma M.S., Denham J., Golds K., Kundu P., Golds J.D., Carpenter M.K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.//Nat Biotechnol, 2001, V.19, P. 971-974.167: Yamaza Т., Kentaro A.,

128. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок // Цитология, 1970, Т.12, №9, С. 1147-1155.