Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИССЛЕДОВАНИЕ СОПРЯЖЕННОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА С РОСТОМ И СОДЕРЖАНИЕМ СТРУКТУРНЫХ ЛИПИДОВ В КАЛЛУСНЫХ КЛЕТКАХ ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ СОПРЯЖЕННОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА С РОСТОМ И СОДЕРЖАНИЕМ СТРУКТУРНЫХ ЛИПИДОВ В КАЛЛУСНЫХ КЛЕТКАХ ГОРОХА"



На правах рукописи УДК 581.121:631.589

ИВАНОВА АННА БОРИСОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СОПРЯЖЕННОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ

КИСЛОРОДА С РОСТОМ И СОДЕРЖАНИЕМ СТРУКТУРНЫХ ЛИПИДОВ В КАЛЛУСНЫХ КЛЕТКАХ

ГОРОХА

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань -1994

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского научного центра РАН.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Л.Х.ГОРДОН

Сору ко вод 11тел ь

кандидат химических наук, А-В.ЛЫГИН

Официальные оппоненты

доктор биологических наук,

Ф.Г.КАРИМОВА

кандидат биологических наук,

М.Л.ХУСАИНОВ

Ведущая организация

Санкт-Петербургский государственный университет, каф. физиологии и биохимии растений

Защита состоится 1994 г. в "¿^^чпс ,

на заседании Специализированного Совета К 002.16.01 присуждению ученой степени кандидата биологических нГу»: (специальность - физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ* РАН (420503, г.Казо£»ь, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30) ^

С диссертацией можно ознакомиться Казанского ф из ико-технич ее кого института КИЦ Автореферат разослан у* —

I п

Ученый секретарь * ''

Специализированного Совета • >. -

кандидат биологических наук "^//¿¿¿^Г Н.Л.ЛОСЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

На современном этапе все большее внимание исследователей обращается К возможности культивирования тканей, органов, а также отдельных клеток растений на питательных средах. Однако перспективы управления морфогенезом в условиях in vitro ограничиваются необходимостью выявления морфологических, генетических и физ полого -биохимических особенностей клеток, находящихся в искусственной среде обитания. Это связано с тем, что условия изолированной культуры приводят к изменению метаболизма (Fowler, 1986). В ряде случаев при продолжительном культивировании на питательной среде возникают особые формы каллусыых тканей, получивших название "привыкших** или химических опухолей (Рубин, 1978). Изучение их интересно с точки зрения адаптационных возможностей клеток в условиях культивирования.

Перевод клеток в культуру и последующий питательный стресс являются для них экстремальными условиями. Индуцируя геномную нестабильность, они вызывают быстрые И существенные изменения генома (Негрук, 1987). Логично предположить, что любые изменен if я в нем повлекут за собой существенную перестройку обмена веществ клеток. Геномную изменчивость в ответ на действие стрессовых факторов можно рассматривать, как одну из сторон клеточного ответа на стресс. С другой стороны, клеточный ответ на любые стрессовые воздействия состоит из защитного и мутабильного компонентов (Соловьян, 1991). Без всестороннего изучения защитной составляющей' клеточного ответа на стресс, невозможно выявить рычаги управления геномом, т.к. изменения в нем сопряжены с изменением физ полого-биохимических процессов клетки, являющихся ранней ответной реакцией на любые стрессовые воздействия на нее.

Целью работы явилось исследование взаимосвязи роста,

ЦЕНТРАЛtS-IAfl v НАУЧИЛЛ ОЧЗЛЛОТЕКА Моек, ;-ъ, ooj гмадзмин

■инГйадаз©

дыхания, содержания структурных липндов в каллусных клетках в различных условиях их культивирования.

Задачи исследования

1. Исследование роста и . дыхания каллусных > клеток в процессе пассажа.

2. Выявление, динамики содержания структурных липндов в каллусе в течение пассажа. . , ■ •

3. Исследование /, ультраструктурных перестроек в кал л ус ных клетках в процессе пассажа.

4. Изучение особенностей роста и дыхания каллуса при блокировании, АТФ-азных систем и проводимости плазм а л ем м ы.

5. Выявление изменений в ростовых процессах, дыхании, содержании структурных липидов каллусных клеток, растущих на среде, лишенной ионов Са2+. . ■

Все результаты были получены на рыхлом (неморфо генном) типе каллуса.

Научная новизна

Впервые проведен сопоставительный анализ дыхательного газообмена каллусных . клеток и ткани - источника получения каллуса. Доказано, что интенсивность дыхания каллуса в 8-10 раз ниже, чем в исходной ткани, что обусловлено, по-видимому, реализацией эффекта Крэбтри (подавление дыхания глюкозой). ~

' Впервые установлено, что в процессе роста каллуса происходят изменения в содержании структурных липндов: увеличение содержания фосфолипидов в экспоненциальной фазе роста 'и снижение в стационарной фазе; в экспоненциальной .фазе роста повышается степень ненасыщенности жпрнокнслотных остатков фосфолипидов и.снижается соотношение стерины/фосфолипиды. В стационарной фазе эти изменения . носят : противоположный .характер. , Можно полагать, что они имеют регуляторно« значение в процессах перехода каллуса из одной фазы роста в .другую..'

Получены новые данные о снижении пролиферативной. активности каллуса и более быстрому переходу его в стационарную фазу при дефиците hqhob кальция.-■ ■ ^ '

Выявлены особенности в ультраструктуре каллусных

клеток гороха: преобладание, агранулярного эндоцлпзма-тического ретикулума (АЭПР) в виде коротких цистерн и присутствие в цитоплазме свободных рибосом .и полисом; появление кольцевых крист в митохондриях.

Практическая значимость работы

Результаты работы дают возможность получить представление об изменениях физиолога-биохимических процессов, протекающих в каллусных клетках, что имеет существенное значение для дальнейших разработок в области биотехнологии.

Обнаруженные изменения в энергетическом обмене каллусных клеток, по сравнению с клетками исходной ткани, из которой каллус получен, являютс^ основой для выявления регуляторных механизмов, обеспечивающих экономное расходование энергетических ресуроов.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при разработке методов культивирования клеток, тканей, необходимо учитывать роль ионтранспортирукнцих систем плазмалеммы в обеспечении ростовых функций.

Апробация - работы. Результаты работы доложены на конференциях молодых ученых (Казань.1985; Уфа,1987), на отчетных конференциях Казанского института биологин КНЦ РАН (Казань, 1987, 1988, 1989, 1991, 1992), на конференции "Биология • сельскому хозяйству" (Казань, 1987), на Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), иа II съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), на Международной конференции "Лициды" (Казань, 1591).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 7 рисунков и 15 фотографий. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 222 источника, из них 136 иностранных. ■ '

ГЛАВА' I. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Способ получения каллусов. Объектом исследования явилась каллусная культура гороха (Pisum sativum) сорта Татарстан-2, Каллусообразование индуцировали культивированием нзмельченных апексов 5-6 дневных проростков на средах, разработанных Т.А.Ежовой с соавторами (1985), или их. модификациях, предложенных вами, с уменьшенным вдвое содержанием фнтогормонов, на свету (20 Вт/м2, 16-часовой светоперяод, t°-27c,-280C).

Характеристика каллусов. ■ Было получено : три тина каллусов, резко отличающихся морфологически: .

а) твердый, медлен нон а растающнй каллус, способный к единичному побегообразованию;

б) частич недифференцированная, содержащая многочисленные меристемы культура, дающая множественную регенерацию побегов. Достигнут высокий процент укоренения побегов при культивирований их, в жидких питательных средах, содержащих низкие концентрации ауксинов: НУ К (0,05мг/л-0,4мг/л),; ИМК (0,5мг/л-1,0мг/л) и ИУК (0,3мг/л-0,7мг/л). Наиболее успешно процесс укоренения происходил на средах с НУК, В течение полутора месяцев из 48 побегов 63% образовали корни. Данные литературы свидетельствуют о больших трудностях, связанных с укоренением побегов гороха, полученных, в культуре in vitro (Hussey, Gunn, 1984);

в) рыхлый* быстройарастаклций каллус, полностью лишенный способности к морфогенезу. ,

В отличие от 2-х первых типов каллуса рыхлый каллус не имеет меристематических клеток. Он характеризуется существенным изменением одтогенетнческих характеристик в сравнении с исходным растением и другими полученными культурами (Иванова и др., 1987; Киямова и . др., 1991; Киямова, 1992). •

Возникновение каллуса с. измененным карнотапом, высокая скорость его нарастания, a также неспособность к регенерации привели нас к выводу, что он требует дальней-' шего изучения с точки зрения оценки некоторых интегральных

показателей его физиологического статуса и ультраструктуры.

Методы - исследования рыхлого, быстропарастающего каллуса.

Исследования проводили через 24 часа, на 3-й, 10-е, 17-е и 24-е сутки (сут.) культивирования.'

Сырую массу каллуса определяли по среднему значений Ю-ти-12-ти кусочков, рассчитывая относительную скорость нарастания ее в процентах.

Изменения дыхательного газообмена регистрировали манометрически в аппарате Варбурга на протяжении 1 часа, снимая показания каждые SO мин (Семихатова, Чулановская, 1965).

. При изучении дыхания каллусных клеток был также ис- . пользован ингибиторный метод. Применяли: а - NaF [2,5-10~2М] - блокирует гликолиз; 6 - KCNt5*10"3MJ - ингибитор цитохром-оксидазы; в • сал ицилгидроксамовая кислота (СГК)[10'2М] • б локатор цианидустойчивого окисления в митохондриях.

Лип иды экстрагировали модифицированным методом Блайя и ДаЙера (Кейтс, 1975). Количественное содержание фосфолипидов в экстракте определяли по (ЕЫе, Lands, 1969). Фосфолипидную и стериновую фракции выделяли из общего экстракта методом тонкослойной хроматографии (Кейтс, 1975). Качественный и количественный состав фитостеринов определяли методом обращеннофазовой ВЖХ (Bulder et al., 1984). Жирнокислотный состав фосфолипидов анализировали методом ГЖХ (Lepage.Roy, 1986).

Содержание С02 в чашках определяли методом ГЖХ. Хроматограф Chrom-5. НФ-молекулярные сита СаН, ПФ-гелий. VHe— ЗОмл/мнн, t=50°C. Детектор • катарометр.

Для электронно микроскопических исследований кусочки каллуса фиксировали в 2,5% глютаровом альдегиде ва фосфатном буфере (рН 7,2), постфикс провал и 1% раствором 0s04 на том же буфере с добавлением сахарозы (25 мг/мл), обезвоживали и заливали в Эпои-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III, контрастировали по методу (Tandler, 1990) и цитратом свинца. Просматривали на электронном микроскопе Jem-100 СХ.

.Экспериментальные данные обрабатывали методом вариационной статистики (Вознесенский, 1969).

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Рост и дыхание каллусных клеток гороха в условиях . модуляции активности транспортных систем плаз мал ем мы блокаторами ионных каналов н АТФ-аэных систем В результате исследования особенностей роста и дыхательной. активности клеток каллуса гороха при блокировании ионных каналов лантанидами (Сс1{Ж>3)3 [5*10*5М]) и АТФ-азных систем ионами серебра (А^Н03[ 1 О^М])

показано, что рост каллуса характеризуется типичной 8-образной кривой. Наибольшая интенсивность роста наблюдалась на 10-ые сут. пассажа (рис.1). Скорость потребления кислорода была максимальной на 3-й сутки (рис.2), что, по-видимому, отражает подготовительный этап к пролиферации, требующий значительных ' энергетических затрат. .Этим

Т' ' т'о ~ ' ~ ' ' ' ' Л'О ~ ' ' ' Рис.1. Изменение веса каллуса гороха в ходе культивировав и я его на разных средах. По горизонтали - длительность культивирования, сут. .

По вертикали - относительный вес каллуса, в % от исходного:

а • при культивировании ва нормальной среде; Ь - при культивировании иа среде с 04(1403)3, 1&х10-®М];

в - ори культивировании на среде о А^МОд. [10*вМ)> Вертикальные отрезки • доверительные интервалы средних.

объясняется отсутствие тесной корреляции между интенсивностью потребления кислорода и приростом массы каллуса (рис.2.1). . *

' Количество выделенного СОг также увеличивалось, перекрывая потребление 02 (рис,2), .что привело к росту дыхательного коэффициента в-первые дни пассажа (табл.1). Можно полагать, что это связано с преобладанием гликолиза и

задержкой "сброса" восстановителя через мито-хондрнальное окисление. Подтверждением этому является накопление в атмосфере выращивания каллуса С02 (до 6%). При этом интенсивность потребления Оа и выделение СОг каллус ны ми клетками намного ниже, чем у исходной растительной ткани, ДК которой «1 (табл.2). В связи с этим, мы предположили, что в

Рис.2. Дыхательная активность клеток каллуса гороха в ходе кул ьтиви роя ня его на разных средах. По горизонтали - длительность культивировав ия, еут.

По вертикали - потребление 02 (I) и каллусе реализуется эффект с02 (П) в мкл/г сырого веса.

а • при культивировавии на нормаль-вой среде;

Ъ - при культивировании на среде о СК1(Н0^|3, [5-Ю"6*!};

с - при культи ей ромвии, лЬ среде с АвЫ03, (10 вМ1;

Верти кальиые отрезки - доверительные интервалы средних.

Крэбтри (подавление дыхания глюкозой и активация гликолиза), свойственный опухолевым клеткам. Появление его могло быть обусловлено тем, что каллус выращивался на среде с избытком Сахаров, что не характерно для исходной ткани. Обнаруженное Г.М.Незиуо с соавторами (1989) угнетение синтеза ряда дыхательных ферментов высокими концентрациями Сахаров в каллусной культуре, табака, с одновременным отсутствием чувствительности к ним ал ко гол ьдегидро геназы и лактатдетад рогеназы, подтвердили наше предположение.

Поскольку двуокись углерода является специфическим ингибитором сукцинатдегидрогеназы, то в условиях . ее избытка работа цикла Кребса должна модифицироваться. В.серии работ А.У.Игамбердиева с сотрудниками (1990,1991) обосновано предположение, что ч условиях блокирования . электрон транспортной цепи митохондрий и подавления отдельных звеньев окислительных процессов возможно переключение метаболизма органических кислот в

направлении их конструктивной утилизации и восстановления за счет НАДФ Н. Процесс может возрастать из-за невозможности окисления кислородом воздуха.

Таблица 1. Дыхательный коэффициент кмлусвых клеток горох« в Н£0.

- Сутки 1 3 10 17

1.14*0.06 1,28±0,17 1,08*0.04 0,9±0.13

Тйблица 2. Дыхание и дыхательный коэффициеят, «аексов в-ти дяеваых

проростков горохе

о2 СО, ДК

мкл/г.сыр.в. час

1731,5±47,64 I 1568±188 0.9±0,084

Указанное приводит к мысли,, что наблюдаемые высокие концентрации С02 (до 6%) в атмосфере выращивания каллуса являются следствием изменения метаболически, путей усвоения углерода в каллусе* требующих дальнейшего пристального изучения.

Следует отметить, что в течение первых трех сут. ионы (М3+ и Ав+ ингибировали рост (рнс.1) и потребление 02 в каллусе (рис.2). По-видимому, ингибироваыне пусковых процессов через ионные каналы и блокирование активного ионного транспорта приводят к задержке пролиферации каллуса, что особенно выражено при торможении АТФ-азных систем серебром (рис.1). Однако, к 17-м суткам при снижении роста и потребления кислорода в контроле, ионы Ск13+ и стимулировали эти процессы (рис.1,2). Такая парадоксальная ситуация - могла быть следствием синтеза новых транспортных единиц, либо индукции эндоцитоза используемых ионов,'что привело каллусные клетки к выходу на новый пролиферативныЙ уровень. -

Установив определенные корреляции между ростом каллусных клеток, их дыхательным газообменом и активностью ионтранспортирующих систем, мы показали, что блокирование ионтранспортирующих систем сопровождается

и содержание процессе роста

первоначально торможением роста, потребления кислорода, с последующим включением адаптационных механизмов, восстанавливающих ростовые процессы.

2.2. Дыхательный газообмен структурных липидов в калл у с 11 ы х клеток.

В процессе роста культуры наблюдалось постепенное снижение действия на , дыхание клеток (рис.3),

свидетельствующее о способности глнколитической системы работать лишь на ранних этапах ростового цикла, что подтверждается и

СО

2 ..

Я 0 П 1

В „ п П II 1

§ п П п П

■ П П п п 1 -

I - л п 1 • IV .

выделением (рис. 2).

Потеря чувствительности в ходе пассажа дыхания каллуса к К СМ и появление • чувствительности ' к СГК (рис.3) указывает на то, что в стационарной фазе роста в митохондриях клеток каллуса ' запускается альтернативный путь переноса электронов.

Обращало на себя внимание, что к концу пассажа наблюдалось, аномальное действие всех используемых ингибиторов КСМ, СПС, СГК+КСМ) . (рис.3),

проявляющееся в усилении потребления 02 клетками. Основываясь на данных. В.К.Акименко и А.Г.Меденцева (1980), В.М.Пахомовой и Л.Х.Гордона (1987). можно полагать, что наблюдаемое действие ингибиторов дыхания имеет общий характер и определяется физиологическим состоянием клеток- По-видимому, это связано с неспецифической ответной реакцией клеток, обусловленной выводом'

Рие.З. Влияние ингибиторов ыа интявсиявость дыхавия клеток каллуса гороху в зи>де его кудьтиви роваяил.

По вертикали - ивтевсивность дыхания кмток, % от контроля (К), условно принятого 9» 100% . -1-1У - при действия еоотвегсгвенно; КдГ КСК ¡БЮ^М], СГК [10'2М) н СГК+КСИ. По горхмктиш - длительность культивирования, сут.

' ± ' ' 'ib' ' ' 'iW' ' ' ab' ' ' 'гЬ Рис.4. Изменение липидиого состава кал л у сны х клеток гороха а ходе и* культивирования. По гормэотали - длительность культивирования, сут.;

По вертикали :

А - содержание фосфолиоидоа (мкМ х10*^/г сырого веса);

Б • отношение стерины/фосфолипнды х50; В • степень насыщенности фосфолипидов (S/U).

их из состояния

покоя. Можно ожидать, что переход каллуса в состояние покоя будет сопровождаться изменениями в метаболизме структурных лип и-дов, т.к. они играют определяющую роль в формировании клеточного ответа на воздействие (Бужу-рина, Панов, 1986).

В ходе роста культуры наблюдалось резкое возрастание количеч11^а фосфолипидов (ФЛ), достигавшее мак-

симума к 10-м сут. Затем уровень их снижался, становясь минимальным к концу пассажа (рис.4). Степень же насыщенности жирно кислотных остатков ФЛ к 10-м суткам была минимальна, а к концу культивирования вновь увеличивалась (рис.4). Аналогичным образом изменялось соотношение СТ/ФЛ (рис.4). На основании последних двух показателей можно оценить микровязкость мембран, которая в момент нахождения каллуса в фазе экспоненциального роста (10-е сут.) значительно уменьшалась. При этом зафиксирован высокий уровень дыхания и максимальный прирост биомассы (рис.2, 1).

При переходе к стационарной фазе роста микровязкость мембран возрастала (рис.4), уменьшалась их проницаемость. С этим, по-видимому, связаны и минимальные энергетические затраты на транспорт ионов, метаболитов и, соответственно, снижена активность потребления 02 (рис.2).

Таким образом, показано, что в процессе роста каллуса существует взаимосвязь между дыхательным газообменом и

метаболизмом структурных лип идо в. Взаимодействие этих двух метаболических систем, по-видимому, реализуется через изменение ионной проницаемости мембран.

2.3. Рост, дыхание и содержание структурных лип идо в в каллусных клетках при недостатке

ионов

Са2+.

Известно, что рост клеточных культур замедляется при снижении концентрации кальция в среде, а при достижении ее 0,05-0,01 мМ размножение нормальных клеток останавливается (Веренинов, Марахова, 1986)- Однако, в некоторых случаях инициация проли-феративной активности возможна и в отсутствии ионов Са2* в среде (Епифанова и др., 1988). В данном случае запуск ее может быть следствием внутриклеточного перераспределения кальция, не сопровождающегося изменением его общего -¿•»держания в клетке (Гуковская, 1984).

В литературе практически нет информации о росте каллусных культур в условиях недостатка

кальция. Сведений - о взаимосвязи между процессами роста и дыхания клеток каллусов в этих условиях, липидов в их мембранах, также нет.

При определении прироста массы каллуса в норме и при отсутствии в среде ионов Са2+ обнаружено, что их дефицит приводит к ослаблению ростовой функции и способствует боле*« быстрому. переходу культуры в стационарную фазу роста (рис.5).

4 ' ' ' ' ' ' ' 1» ' ' ' ' »'а' ' ' ' гк Рис.5. Изменение веса каллуоа гороха в . ходе культи в ироваяия его на разных средах.

По горизонтали г длительность культи, вирования, сут.;

По вертикали - относительный вес каллуса в % от исходного: А - при культивировании ва нормальной среде;

В - при культи вироваяии на среда без кал щи».

Вертикальные отрезки - доверител! иле интервалы средник.

а также содержанием

УШ

лй.

• Ь * » 4 Ь * *

У а к

С помощью ин-гибнторного анализа (ЫаР) было установлено, что система аэробного. гликолиза в клетках каллуса работает, как в контроле, так и при дефиците кальция (рис.6).

Отсутствие ионов Са2+" в среде привело к значительному уменьшению содержания в клетках фосфолипидов после 3-их сут. пассажа (рис.7). На пике активации проли-феративных процессов - (рис.5) отношение СТ/ФЛ минимально (табл.3). Однако, к концу культивирования оно резко увеличивалось, значительно превышая контрольный вариант (табл.3). По-видимому, проницаемость плазмалеммы

Таблица 3. Изменение липндного состава каллусных клеток гороха в ходе его культивиров&и и я на разных средах, а • культивирование каллуса на вормальноЯ среде;-б - культивировав не каллуса на бескальциевой среде

Рис.в. Влияние ИаГ^ва дыхааиие клеток каллуса гороха, культивируемого на розных средах. По вертикали - потребление кислорода в мкл за 1 час на 1г сырого веса; в) в отсутствие действия ингибитора, Ь) при действии ингибитора. I • ври кулмивирсваяии на нормальной среде; П - при культивировании аа среде без кальция. По горизонтали - время культивирования, сут.; Вертикальные отрезки доверительные

интервалы средни*.

Длительность Степень насыщенности Отношение

пассирования жирнокислотных остатков стерин ьг/фосфолишгды

(сутки) фосфолипидов (8/4) Х*8

а б а б

1 - 1.9*0.12 0.18*0.017 0.16*0.065

3 1.9*0.12 2.2*0.25 0.12*0.025 0.10*0.021

10 2.8*0.4 2.0±0.26 0.11*0.021 0.12*0.025

17 3.5*0.25 2.6*0.2 0.17*0.03 0.14*0.021

24 - - 0.17*0.05 0.37*0.06

для ионов у клеток каллуса к этому времени ниже» чем в контроле. Возможна ком* пенсация недостатка кальция стеринами-

В ускоренном переходе клеток в стационарную фазу роста при отсутствии Са2+ в среде (рис.5) определенную роль,. по-ввдим* ому, сыграло более быстрое снижение содержания в клетках ФЛ (рис.7), а также увеличивающаяся сте-ринизация мембран* ных структур (табл.3).

Рис.7.' Нзмевевие содежання фосфолвпидов в клетках каллуса гороха' . » -хода культивировдаяя его ва разных средах. По горизонтали - длительность культивирования, еут.;

По вертикали - содежание фоофолипидов в вМ на 1г сырого веса: "

Л - при культивировании ва вормальной среде; . Б - при культи»ированни ва среде без кальция. . Вертикальные отрезки - доверителиые интервалы средних.

Наблюдавшееся, особенно в первые, 10 сут. культивирования, снижение дыхания клеток в опытном варианте (рис.6) также обусловило их замедленную пролиферацию. По данным А.С.Гуковской иВ.П.Зннченко (1988) ингиб про ванне энергетического обмена тимоцитов крысы сопровождается исчезновением кальциевых сигналов в ответ на митогены. Возможно, что существует и - обратная ■- зависимость — отсутствие ионов Са2+ в среде может привести к торможению энергетического обмена и снижению пролиферации.

Полученные результаты позволили заключить, что снижение яролиферативной активности каллусных клеток гороха при дефиците ионов Са2+ в среде обусловленд, по-видимому, нарушением в системе - передачи сигнала репродуктивному аппарату клетки. Оно может быть связано с изменением синтеза фосфолипидов и нарушением энергообеспечения пролиферации клеток. » '

2,4, Изменение ультраструктуры клеток длительно культивируемого каллуса гороха на протяжении пассажа

В ходе экспериментов были выявлены существенные морфологические различия клеток между фазами их ростового цикла.

В лаг-фазе ■ пассажа ядра клеток отличались характерными инвагинациями оболочки, наблюдалось увеличенное количество пластид, почти полностью заполненных крахмалом, множество коротких цистерн агранулярного ЭПР, присутствие липидных капель в цитоплазме, наличие мелких митохондрий с малым числом кринст, плотное нримыкание плаз мал еммы к клеточной стенке, отсутствие илазмодесм.

По данным Н.А-Шугаевой с сотрудниками . (1992) экзогенная глюкоза окисляется по пути, отличному от пути окисления эндогенного сахара, а синтезированные из экзогенных Сахаров полимеры накапливаются исключительно в пластидах и, как правило, в виде крахмал» Физиологический смысл этого явления, по мнению авторов, заключается в регуляции пластидами концентрации Сахаров в апопласте. .

Можно полагать, что поставщиком АТФ в клетках в начальный период лаг-фазы служит гл и политический путь утилизации крахмала, количество которого уменьшалось к ее окончанию. Это подтверждается малой активностью митохондрий и соответствует сделанному нами ранее предположению, что в лаг-фазе роста каллусных клеток источником энергии является гликолиз (Иванова и др., 1989). В это же время, вероятно, активизируется И ПФП окисления глюкозы, поставляющей НАДФ Н на разнообразные биоспнтетические процессы, в т.ч. на синтез липндов и нуклеиновых кислот.

В фазе экспоненциального роста каллусной культуры наблюдалось наибольшее развитие фотосшг^тнческого аппарата в пластидах и крист в митохондриях. Митохондрии становились крупнее и в них увеличивалось количество крист.

В стационарной фазе роста культуры наблюдались признаки старения клеток: вакуолизация цитоплазмы, - появление в ней и центральной вакуоли - осмиофильных капель и миелиноподобных. телец, накопление крахмала в пластидах и редукция тилакоидной системы.

-Основываясь на данных Е.Л.Кордюм с сотрудниками (1980), мы пришли к заключению о сходных перестройках цитоплазматических органелл в процессе культивирования клеток растений разных видов.

вывода!

1. При введении в культуру гороха (ДОяшп ваИийт) получено три -типа каллусов, ■ резко отличающихся морфологически:

а) твердый медлен но нарастающий каллус;

б) частичнедифференцированная,содержащая многочисленные ■■" меристемы культура, дающая множественную регенерацию побегов с высоким

- процентом их корнеобразования (63%);

в) рыхлый, быстронарастающий каллус.

2. Установлено, что потребление кислорода каллусными клетками в 8-10 раз ниже, чем у. исходной ткани, из которой каллус получен. Это может быть связано с избытком Сахаров в среде выращивания каллуса и реализацией эффекта Крэбтри (подавление дыхания глюкозой); В , атмосфере выращивания каллуса обнаружена высокая концентрация С02 (до 6%). .

3. Установлена положительная^ .корреляция между ростом, дыханием и активностью ионтранспортирующих систем каллусных клеток. Блокирование ионтранспортирующих систем ионами гадолиния и серебра сопровождается первоначально торможением роста, потребления кислорода и последующим включением адаптационных-, /механизмов,, способствующих-восстановлению, ростовых, процессов. .

4. Впервые установлено, .что при перех9де из од ной.фазы роста в другую в каллусных клетках происходит изменение в е. .держании структурных липидов:

а) повышение содержания фосфолшшдов в экспоненциальной фазе роста и снижение его в стационарной фазе;

б) снижение степени насыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов, а также отношения стеринов к фосфолииидам в экспоненциальной фазе роста и увеличение этих показателей в стационарной фазе.

5. Дефицит ионов кальция в среде выращивания каллуса резко снижает пролиферативную активность клеток, синтез фосфолипидов и дыхание, что, вероятно, обусловлено сбоями в передаче кальциевых информационных сигналов.

6. Обнаружены характерные особенности ультраструктуры каллусных клеток гороха:

а) тесное прилегание плазмалеммы к клеточной стенке и отсутствие плазмодесм;

б) преобладание аграну л яркого ЭПР в виде коротких цистерн;

в) присутствие в цитоплазме свободных рибосом и -полисом;

г) отсутствие пластоглобул в пластидах, содержащих крахмал и появление их с исчезновением крахмала;

д) появление кольцевых крист в митохондриях, *

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Иванова А.Б. Индукция органогенеза в каллусных культурах различных сортов гороха, районированных в ТАССР. Деп.в ВИНИТИ 21.04.86. N 2888-В86. 5 с.

2. Иванова А.Б., Горшкова Т.А. Укоренение побегов гороха, полученных в культуре//Всесоюзная конф. молод, учен. Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов. Тез.докл., Уфа, 1987. С. 104.

3. Иванова A.B., Киямова Р.Г., Горшкова Т.А. Различные типы каллусных культур гороха: цито генетическая характеристика. Деп. в ВИНИТИ 14.07.87. N5055-BS7. 16с. '

4. Романова Т.Д., Иванова A.B., Лыгин A.B., Курбская О.Г., Рубан Н.Ф., Буртаева Т.Е. Особенности дыхательного метаболизма клеток каллуса гороха//Междунар. конф. Биология культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл. Новосибирск, 1988. С. 41.

5. Иванова A.B., Романова Т.Д.," Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Лыгин A.B. Влияние ионов тяжелых металлов на рост и дыхательную активность каллусных тканей гороха. Деп. в ВИНИТИ 15.11.89. N 6898-В89. 19 с.

6. Лыгин A.B., Иванова A.B., Буртаева Т.Е., Гордон Л.Х., Романова Т.Д. Дыхательный газообмен н содержание структурных лииидов в процессе роста каллусных клеток // Регуляция ферментативной активности у растений. Горьк. гос. ун-т. Горький, 1990. С. 56-61.

7. Иванова А.Б., Романова Т.Д., Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Лыгин A.B. Рост и дыхание каллусных клеток при торможении ионного транспорта//II Съезд Всес. о-ва физиологов раст., Минск, 24*29 сент., 1990: Тез. докл. 4.2. М., 1992.С.80.

8. Иванова А.Б-, Лыгин A.B., Гордон Л.Х., Буртаева Т.Е., Курбская О.Г. Рост, дыхание и содержание структурных липидов в каллусных клетках при недостатке ионов кальция//Цитология. 1993. Т.35. Вып.1. С. 79-87.

9. - Полыгалова О.О., Иванова А.Б., Гордон Л.Х. Динамика

ультраструктурных изменений в клетках каллуса гороха в процессе его роста//Ш Съезд Всес. о-ва физиологов раст. Санкт-Петербург, 24-29 июня, 1993: Тез.докл. Санкт-Петербург, 1993. С. 186.

10. Полыгалова О.О.", Иванова А.Б., Бутакова И.В., Гордон Л.Х- Ультраструктурные изменения каллусных клеток гороха под влиянием ионов серебра//Междунар. конф. Биология- культивируемых клеток и биотехнология. Тез. докл., Алма-Ата, 1993. С. 27.

11. Полыгалова О.О., Иванова А.Б., Гордон Л.Х., Бутакова И.В. Изменения ультраструктуры клеток длительно культивируемого каллуса гороха на протяжении пассажа //Цитология, 1994. Т.36. Вып.4. С. 354-414.

Сдано а набор 4.10.94. Подписало к печати 18.10.94. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 120 экз. Заказ Б-87

Издательство «Зоря-Таи» : 420111, г.Казань,'ул.Ленина,9