Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ГОРОХА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ГОРОХА"



На правах рукописи ¿htéj -

Соболева Галина Викторовна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ IN VITRO В СЕЛЕКЦИИ ГОРОХА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Орел - 2005

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биотехнологии ГНЦ РФ ГНУ — Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор А.Н, Зеленов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.Н. Агаркова доктор биологических наук Т.Н. Пузнна

Ведущая организация: Главный ботанический сад имени Н.В. Дицина

РАН

Защита состоится «/У* -лАУ&М на заседании диссер-

тационного совета КМ 220.052.01 при Орловском государствен ном агроном университете по адресу: 302019 г. Орел, ул. Генерала Родина, 69 тел/факс (08622) 9-40-64

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Орловского государственного аграрного университета по адресу: г.Орел, бульвар Победы, 19

Автореферат разослан « ^^ -о _2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

'ЗпЛ'¿егАи*^- Т-Ф-Макеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Горох является ведущей зернобобовой культурой, широко возделываемой в различных регионах России, Традиционный селекционный процесс позволил достичь значительных успехов в повышении урожайности и качества зерна гороха.

Интенсификация современного сельскохозяйственного производства ставит перед селекционерами задачи создания высокоурожайных сортов гороха нового поколения, отличающихся высокой пластичностью, устойчивостью к болезням и вредителям, стрессовым факторам внешней среды. Для этого необходим поиск и привлечение современных достижений науки, ускоряющих и повышающих результативность селекционного процесса. Одним из наиболее динамично развивающихся направлений, ориентированных на создание нового исходного материала для селекции, является использование биотехнологических методов.

Культура клеток и тканей in vitro в настоящее время находит применение в широком диапазоне биологических исследований. Методы регенерации in vitro в селекции гороха используются явно недостаточно. В связи с этим изучение возможности использования культуры тканей in vitro в селекции гороха является актуальным.

Цель работы состояла в разработке методов культивирования тканей гороха in vitro, получении растений-регенерантов с последующей их морфологической оценкой.

В задачи исследований входило:

- определение оптимальных составов питательных сред для индукции каллусогенеза, морфогенеза и ризогенезз в культуре соматических тканей гороха;

- разработка эффективной системы активного пролиферационного и ре-гея е рацио иного процессов в длительно культивируемых каллусных тканях;

- разработка условий получения растений-регенерантов в культуре длительно пассируемых каллусов гороха;

- сравнительный морфологический анализ растений-регенерантов, полученных в культуре длительно пассируемых каллусов гороха;

- разработка метода отбора устойчивых к действию осмотического стресса каллусных линий гороха;

- морфофизмологический анализ растений-регенерантов, полученных на селективных средах с осмотически активными веществами;

- апробация методики клонального микроразмножения на сортах гороха селекции ВНИИЗБК;

ЦНБ МСХА 1 Фока научной литературы

N9

Научная новизна. Впервые разработан метод длительного су б культивирования каллусов гороха с последующим получением корнесоиственны.х растений-регенерантов, Выявлена сом аклонал ьная изменчивость растений-регенерантов по массе 1000 семян, форме листа и длине стебля. Разработан метод отбора in vitro устойчивых к осмотическому стрессу каллусов гороха. Получены осмоустой ч и вые регенерантные линии гороха.

Практическая значимость работы. Определены направления использования культуры тканей in vitro в селекционных программах. В целях сохранения и ускоренного размножения ценного селекционного материала рекомендуется метод микроразмножения. Для расширения спектра исходного материала в селекции гороха рекомендуется использовать систему длительно пассируемых каллусных тканей. Разработана схема селекции in vitro гороха на осмоустой чивость. Выделены ценные для селекции генотипы гороха.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях: «Биологические основы интенсивного растениеводства» (Орел, 1993), «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, J995), «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996, 2000, 2004), IV съезде общества физиологов России «Физиология растений - наука Ш тысячелетия» (Москва, 1999), I и [I Московских международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003), VIII международной конференции «Биология культуры клеток in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 на английском языке.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из общей характеристики, шести глав, выводов, предложений и рекомендаций для селекции, списка литературы, приложений. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы в тексте и 8 в приложении, 22 рисунка. Слноок цитируемой литературы содержит 303 наименования, из них 104 на иностранном языке.

I. Обзор литературы

Приведены данные о современном состоянии исследований по разработке методов культуры клеток и тканей in vitro и возможностях их использования в селекционно-генетических программах.

Литературный анализ свидетельствует о том, что регенерация растений гороха in vitro до настоящего времени остается достаточно затрудненной. До сих нор не существует единых, эффективных, легко воспроизводимых методик регенерации.

1. Условия, материал >■ методика проведения исследований

Исследования проводились в течение 1993-2004 гг. в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института зернобобовых и крупяных культур (г. Орел),

Материалом для исследований служили: сорта гороха посевного {Pisurn sativum L.) - Зарянка, Орлус, Батрак, Орловчанин, Филбн; новые линии оригинального морфотипа гороха «хамелеон» селекции ВНИИЗБК, отличающиеся ярусной гетсроморфностью листьев - Аз 26, Аз 92-2210, Аз 93-1964; образец горюха красивого {Pisum formosum (Stev.) Alef.),

За основу при работе с культурой тканей гороха была принята методика, предложенная Р.Г. Бутенко (1964). В качестве первичных эксплантов использовали верхушки или семядольные узлы 3-5 дневных асептических проростков гороха. Семена стерилизовали поэтапно: хромовой смесью (55% раствор бнхромата калия в концентрированной серной кислоте) - I мин; промывка стерильной дистиллированной водой; 96% этанолом — 10 мин; промывка стерильной дистиллированной водой; 0.6% водным раствором хлор-гекендиндиглюконата натрия — 5 мин; пятикратная промывка стерильной дистиллированной водой. Стерильные семена проращивали в термостате, при температуре 26°С, на двух слоях влажной стерильной фильтровальной бумаги в чашках Петри по 5-10 семян. Для инициации каллусогенеза первичные экс-планты измельчали скальпелем и помещали на поверхность агаризованных питательных сред.

В качестве питательных сред использовали среды с минеральной основой MS (Murashige Т., Skoog F,} 1962) или В5 (Gamborg O.L. et al., 1968). В качестве регуляторов роста использовали: б-бензиламино пурин (БАП), индо-лил-3-уксусную кислоту (ИУК), а-иафтилуксусиую кислоту (НУК), нндолил-3-масляную кислоту (ИМК). Концентрации и соотношение регуляторов роста в питательных средах приведены в процессе обсуждения результатов. Все культуры выращивали при температуре 25°С, 16-часовом фотоперноде и освещенности 2000 лк.

Осмотический стресс моделировался введением в питательные среды полиэтилен гликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 в различных концентрациях. Продолжительность пассажа составляла 45.. .50 суток.

В 1999-2001, 2004 голах регснерантпые линии гороха изучались в полевых условиях на опытном поле лаборатории селекции зернобобовых культур ВНИИЗБК. Растения R( высевались вручную. Длина рядка 1 м, расстояние между рядками 1S см, между семенами в рядке S см. Регенератные линии Rj-Rj высевались в селекционном питомнике первого года без повторностей. Площадь делянки 1,1 м2, Рсгенерантные линии R*-Rs высевались в селекционном питомнике второго года в четырех повторностях, реидомнзированно. Площадь делянки 2 м\ Посев проводился сеялкой ССФК-7М. Восемь регене-рантных линий R«-Rt, изучались в контрольном питомнике. Посев проводился сеялкой СКС — 6-10. Площадь делянки 7,5 м1, в четырех повторностях, размещение рендомизированное. Структурный анализ растений проводился по методике ВИР (1975). В ручном посеве анализировали все растения, сохранившиеся к уборке, а в селекционных питомниках анализировали по 30 растений с каждой повторностн. В качестве контроля использовали оригинальные сорта и линии.

В 2004 году в условиях вегетационного опыта лаборатории физиологии растений и аналитических работ проводилась оценка на засухоустойчивость регекерантных линии, полученных в селективных системах с ПЭГ. Растения выращивались в сосудах с почвой при двух уровнях увлажнения: 70% и 35% от ПВ. Показатели засухоустойчивости определяли согласно «Практикуму по физиологии растений» под редакцией H.H. Третьякова (1990).

Основные количественные показатели подвергали вариационно-статистической обработке (Доспехов Б.А., 1985, Рокицкий П.Ф., 1974) с использованием ПК.

3. Индукция процессов каллусогенеза и морфогенеза в каллу сных тканях

гороха

3.1.Индукция процессов дедифференциации и каллусогенеза

В связи С многообразием данных о сочетаниях и концентрациях регуляторов роста в питательных средах был проведен сравнительный анализ наиболее часто используемых питательных сред для индукции каллусогенеза у гороха. Изучено шесть вариантов питательных сред. Базовая среда включала минеральные соли и витамины среды В5, гидролизах казеина I г/л, сахарозу 30 г/л, агар 6 г/л.

Установили, что на всех изученных средах был индуцирован каллусо-генез, независимо от происхождения первичного экспланта и присутствия регуляторов роста (табл.1). Интенсивность каллусогенеза оценивали по относительному приросту каллуса, определяемому как отношение прироста каллуса после одного пассажа к массе исходного экспланта. Интенсивность процес-

сов каллусообразования из верхушек стеблей оказалась на порядок выше, чем из семядольных узлов. Каллусы, сформированные из верхушек побегов, увеличивали перпоначальную массу в 20-30 раз, в то время как масса каллусов, происходящих из семядольных узлов, увеличивалась лишь в 4-5 раз.

Таблица 1

Относительный прирост каллусов (Д W/W0) у гороха в зависимости от типа первичных эксплантов и состава питательных сред _

Генотип, СредаГ^Зксплаит мг/л Орловчаннн Зарянка

семядольный узел верхушка побега семядольный узел верхушка побега

БАП-0,1 1 НУК-0,2 2,5 22,0 3,5 23,5

БАП-1,0 t\l 1 * НУК-2.0 4,1 20,5 4,8 22,9

__ БАП-0,66 КГз НУК-5,0 5,4 22,4 4,9 30,9

БАП-0,1 4 ИМК 1,0 4,9 21,1 4,5 26,9

Krs ИМК 1,0 4,7 20,1 ■ 4,6 29,1

КГ» ИМК-1,5 4,9 20,8 4,8 29,0

W0 - начальный вес каллуса, мг ДW — прирост каллуса, мг

У сорта Зарянка процесс каллусообразования протекал более интенсивно, чем у сорта Орловчаннн.

В присутствии ИМК наряду с каллу сообразован ием у изученных сортов нередко наблюдали формирование корней. В результате рост каллусной ткани замедлялся, шло развитие корневой системы. На средах, содержащих НУК в качестве регуляторов роста, подобных образований не наблюдалось. Таким образом, оптимальной средой для индукции каллусогенеза у изученных сортов гороха является питательная среда КГз (0,66 мг/л БАП + 5,0 мг/л НУК).

3.2. Индукция процессов морфогенеза в каллусной ткани гороха

Для индукции морфогенеза в каллусных тканях гороха изучалось несколько вариантов питательных сред. Базовая среда включала минеральные

соли среды МЭ, витамины В5, сахарозу 30 г/л, агар 6 г/л. Способность кал-лусных тканей гороха к морфогенезу побегав зависела от концентрации регуляторов роста (табл. 2).

Таблица 2

Способность к морфогенезу каллусных тканей гороха_

Среда Орловчанин Зарянка

всего каллусов эффективность морфогенеза, % число побегов на кал* лус всего каллусов эффективность морфогенеза, % число побегов на каллус

МК4 39 23,1 0.8±0,26 24 33,3 0,9±0,20

28 67,9 2,4±0,39 21 62,4 2,0±0,31

мя, 25 68,0 1,9±0,20 38 73,7 2,4±0,32

Наиболее интенсивно процессы морфогенеза протекали на средах М3| (5,0 мг/л ЕАП + 0,2 мг/л НУК) и (5 мг/л ЕАП + 0,2 мг/л ИУК), характеризовавшихся высокой концентрацией цитокининов. Среда МК* (1,0 мг/л БЛП + 0,25 мг/л ИМК) с низким содержанием цитокининов резко уступала другим средам по эффективности морфогенеза и числу побегов на каллус. Однако, как показали дальнейшие наблюдения, данная среда представляет несомненный интерес, так как является наиболее эффективной для доращивання реге-нерантных побегов н служит промежуточным звеном между морфогенпымн и ризогенными регенерационными средами.

В наших исследованиях подтвердились выводы о существовании корреляции между морфологией каллуса и его морфогенной способностью (Му-рашко Л.Н., Фадеева Т.О., 1973). Плотный, компактный каллус отличался пониженной морфогенной активностью. На морфогенных питательных средах наблюдались единичные случаи образования побегов. Рыхлый глобулярный, светло-зеленый каллус отличался высокой морфогенной активностью.

3.3.Индукция процессов ризогенеза гороха

Эффективность процессов ризогенеза у регенерантных побегов, полученных в каллусной культуре, изучали на питательных средах в присутствии ауксинов. Базовые среды включали полный состав минеральных солей и витаминов В5 (среды б Ш, 7 Ш), или уменьшенную вдвое концентрацию основных компонентов (среды 2 3 К!, 5 Ш).

Как видно нз таблицы 3 на всех изученных средах происходили процессы ризогенеза. При этом эффективность ризогенеза у изученных генотипов

колебалась от 16,4% до 26,8%. Следует отметить существование некоторых различий по интенсивности ризогенеза. Для сорта Орловчанин лучшей ризо-генной средой являлась среда ЗКк У сорта Зарянка процессы корнеобразова-ния наиболее интенсивно протекали на средах 6Кд и 5Ш. Более того, у реге-нерантных побегов сорта Зарянка в среднем образовывалось большее количество корней.

Таблица 3

Индукция ризогенеза у регенератных побегов гороха_

Среда, мг/л Орловчанин Зарянка

число вы сажен-ных побегов эффективность ризогенеза % число корней на побег число высажен-ных побегов эффективность ризогенеза % число корней на побег

НУК-1,8 28 22,1 3,1 24 19,9 4.5

ЗШ НУК-1,0 26 24,2 4а 23 26,3 4,4

51У ИМК-1,0 22 23,1 3,1 25 21,6 4.«

61У ИМК-1,0 25 16,4 3,6 20 26,8 4,8

7Ш ИМК-1,5 21 20,3 2,7 24 18,7 »-5

Важно отметить, что уменьшение в 2 раза концентрации макросолей и витаминов не оказывало решающего влияния на индукцию процессов корне-образования. Не было выявлено различий по эффективности ризогенеза между средами, содержащими в качестве индукторов ризогенеза НУК или ИМК.

4. Разработка параметров длительного субкультнвировання каллусов гороха с сохранением высокого морфогенети чес кого потенциала

4. (.Длительное субкультивирование каллусных тканей гороха

Для селекции наибольший интерес представляют длительно пассируемые каллусные культуры, среди которых возможен отбор сомаклональных вариантов. Анализировали эффективность первичного каллу сообразован и я и выживаемость каллусов при длительном субкультивировании семи генотипов гороха.

Эффективность первичного каллусообразоьания у экеплантов разных линий гороха оказалась высокой и составляла от 84 до 94%. Однако, способность к первичному каллу сообразованию не всегда совпадала со способностью к длительному субкульти в нрованию (табл. 4), Например, у селекционных линий Аз 26, Аз 92-2210, Лз 93-1964, в 1998 году погибла основная часть каллусных клонов. При этом показатели эффективности первичного каллусо-генеза были самыми высокими и колебались от 91,9% до 94,4%.

Таблица 4

Динамика выживаемости каллусных клонов различных сортов и линий

гороха по годам (1997-2004 гг.)

Сорт, линия Эфф ективность первичного кал-лусогенеза, % Выживаемость каллусных клонов (в % к первичному каллусу)

1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

Орлус 83,8 67,6 40,5 27,0 16.2 13.5 13.5 8.1

Батрак 90,0 47,5 40,0 20,0 0 0 0 0

Fitby 84,8 10,9 8.7 0 0 0 0 0

Аз 26 91,9 8.1 8,1 8Д 8,1 5,4 2,7 2.7

Аз 92-2210 94,4 11,8 8,3 5.6 5,6 5,6 2,8 2,8

Аз 93-1964 94,4 16,7 16,7 8.3 8,3 5,6 5,6 5,6

Зарянка 83,9 16,5 14,8 13,9 12,2 0 0 0

В дальнейшем наиболее стабильно процесс субкультивирования каллусных тканей протекал у селекционных линий Аз 26, Аз 92-2210, Аз 93-1964 н сорта Орлус. У сорта Орлус, выживаемость каллусов при длительном пассировании оказалась самой высокой.

Нами показана возможность культивирования in vitro каллусных культур гороха более 8 лет.

4,2,Морфогенез в длительно культивируемых каллусных культурах гороха

Длительное субкультивирование каллусных клонов показало, что для успешной индукции морфогеннных процессов в каллусных тканях гороха наиболее эффективным оказалось сочетание в питательной среде 5,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК (обозначенная нами MS,), В данном случае в каллусных тканях закладывалось неограниченно большое количество побеговых почек, и активно формировались регенерантные побеги, Морфогенная активность каллусных клонов приведена в таблице 5.

Однако, при продолжительном культивировании (более 5 пассажей) каллу сных тканей на среде М3(, способность к недифференцированному росту снижалась до минимума, следовательно, снижались и темпы регенерации.

Таблица 5

Морфогенная активность каллусных тканей гороха, _(число побегов/ зксплант, пассаж)_

Сорт, линия среда М8| среда МЭи

2-3 пассаж 5-6 пассаж 2-3 пассаж 5-6 пассаж

Орлу с 2,9±1,0 1,5 ±0,8 2,7±0,7 0,5±0.3

Батрак 3,0±1,0 1,7±0,4 1,б±1,2 0,4±0,3

Зарянка 3,7±0,5 1,5±0,2 3,1±0,4 0,8±0,6

Аз 26 3,1 ±0.4 1,4±0,2 3,0±0,4 0,5 ±0,3

Аз 92-2210 2,9±0,4 1,4±0,2 2.6±0,4 0,4±0,3

Аз 93-1964 3,5±1,7 1,1±0,6 3,2±1,5 0,9±1.3

Повышение концентрации НУК до 2,0 мг/л при неизменной концентрации БЛП - 5,0 мг/л (среда обозначена М51;) способствовало пролиферации каллу с ной ткани. Длительное культивирование на среде МЗц приводило к снижению интенсивности процессов морфогенеза и преобладанию процессов недифференцированного роста. Оптимальным оказалось чередование циклов культивирования каллусной ткани гороха на средах и МЗц через 3-4 пассажа. Предложенная схема не является идеальной, но мы пытались сохранить два диаметрально направленных процесса: морфогенез н недифференцированный рост. С использованием этой схемы в длительно пассируемых каллусных тканях устанавливалась относительно равновесная система, обеспечивающая активные пролиферативный и регенерационный процессы.

Сформировавшиеся регенерантные побеги аекапитировалн от каллус-ной ткани, доращивали на среде МП* в течение месяца, а затем переносили на среды для ризогенеза.

4.3. Получение корнесобственных регенерантных растений в длительно пассируемой каллу сной культуре

Основная культуральная среда для индукции ризогенеза включала минеральные соли и витамины среды В5, с уменьшенной вдвое концентрацией основных компонентов, 30 г/л сахарозы, б г/л агара н дополненную НУК в концентрации 1,0-1,5 мг/л.

К настоящему времени нами получены растения-ре ген еранты Яо из длительно культивируемых каллусных ююнов всех семи изученных генотипов гороха (табл. б). В длительно пассируемой культуре каллусов максимальное

количество регенерантных линий получено у сорта Орлус. Нами впервые получены коркесобствениые растения-регенеранты в культуре каллусов гороха, культивируемых in vitro йолее семи лет.

Таблица 6

Выживаемость растем и й -регенерантов На, полученных из каллусных клонов ___гороха__

Сорт, линия Время in vitro, сутки Число растений-регенерантов, R® Выживаемость, %

высаженных в почву адаптированных

Орлус 90-2880 306 107 35,3

Батрак 90-1440 66 22 33,3

Filby 90-360 16 5 31.2

Лз 26 90-1880 67 18 26,9

Лз 92-2210 90-720 24 7 29,2

Аз 93-1964 90-2880 87 25 28,7

Зарянка 90-720 15 б 40,0

У растений Ro наблюдались значительные морфологические изменения по таким признакам, как: длина стебля, размер листьев, число междоузлий, число бобов, число семян с растения, масса семян с растения. Основная часть регенерантов Ro имела укороченный стебель, длина которого составляла ]0-15 см. Растения быстро зацветали, образуя однн-два продуктивных узла, на которых формировалось один-два боба, число семян в бобе колебалось от одного до двух. Другие регенерантные растения Re. наоборот, имели нормальную морфологию и характеризовались мощным развитием, обильно цвели и завязывали семена.

4.4,Морфобиологическне особенности регенерантных растений гороха

В 1999-2001 годах в условиях полевого опыта был проведен сравнительный морфологический анализ 55 регенерантных линий, представляющих собой поколения R,-Rs. Анализируемые признаки включали показатели роста, развития и продуктивности. Регенерантные линии отличались большей вы-равкенностью основных хозяйственно полезных признаков по сравнению с исходными сортами. Это позволяет предполагать высокую степень гомози-готности полученных нами линий.

В течение трех лет изучено 12 линий, полученных из каллусов, культивируемых in vitro 90-540 суток. В 1999-2000 годах регенерантные линии Ri-Rj изучались в условиях мелкоделяночного опыта при ручном посеве. Большин-

ство линий превысили исходные сорта по многим количественным'признакам, Такие результаты могут быть объяснены значительным краевым эффектом мелкоделяночного эксперимента или влиянием последействий высоких доз регуляторов роста, В 2001 году мы смогли изучить эти линии в селекционном питомнике второго года в четырехкратной повторности (табл. 7).

Регенерантные линии сорта Орлус не отличались от исходного сорта ни по одному из изученных признаков.

Таблица 7

Характеристика некоторых регенератных линий , 2001 г_

Линия, сорт Длина стебля, см Число Масса семян, г Масса 1000 семян, г

продуктивных узлов бобов семян

Орлус 74,4 4.0 7,0 22,3 5,4 239.4

Л 28-1, Кд 75,4 4,1 7,1 24,0 5,7 239,7

Л 28-2,1*4 73,2 4,1 7,2 25,0 5,8 233,5

НСРо-; 6.7 0,9 1,7 8.0 1,8 13.2

Батрак 68.4 3,! 5,8 .22,1 4,9 227.5

Л 13-1-2, К* 62,1* 2,8 5,0* 17,6" 4.2 235,9

Л 13-2-1, к. 61,4" 2,8 5,1 18.2" 4.1 227,4

Л 13-2-2, Кл 63,0х 2,5" 4,6" 16,8" 3,9" 235,1

Л 13-2-3, Ъ 62,5я 3,1 5,7 19,9 4,5 228.7

Л 25-1.1%, 63,6" 2,9 4,9" 16,8" 4,2 251,9"

Л 25-2. Иэ 64,0 2,7* 4,5* 15,3" 3,9* 259,8"

НСРо; 4,5 0,4 0,7 3,4 1.0 22.8

Зарянка $1 81,7 81,7 5,7 23,1 5,4 233,6

Л 1-1,гъ, 74,б1 74,6" 5.1 21,3 5,2 240.8

Л 9-1-1. к5 85,9 85,9 5,5 20,1 4.9 242,5

Л 9-1-2, 82.5 82,5 6,7 23,8 5,5 231,1

Л 9-2, К* 86,7" 86,7" 5,7 21,1 5,2 243.8

НСРо; 4,9 4,9 !,9 8,1 2,9 15,5

Некоторые регенерантные линии обнаружили достоверные отклонения от контроля. Регенерантные линии сорта Батрак характеризовались меньшей длиной стебля, и соответственно числом продуктивных узлов и рядом других признаков. Наибольший интерес представляют линии Л 25-1 и Л 25-2, кото-

рые достоверно превысили контроль по массе 1СЮ0 семян. Эти линии выделены из каллуеных клонов, продолжительность пассирования которых превысила 540 дней.

Среди регенерантных линий сорта Зарянка выделилась линия Л 9-2, которая в течение трех лет изучения превышала исходный сорт по длине стебля, а в 2004 году по продуктивности зеленой массы (38,9 т/га) достоверно превысила исходный сорт {33,2 т/га),

В 2000-2001 годах проведен анализ регенератных пиний, полученных из длительно пассируемых каллусов гороха (550-1400 суток). Установлено, что с повышением времени культивирования in vitro может возрастать степень изменчивости, в том числе н генотипической. Причем, эти изменения далеко не всегда оказываются полезными.

Среди линий сортов Орлус и Батрак значительную долю составляли линии, превысившие исходный сорт по основным хозяйственно ценным признакам. Для линий генотипа Аз 26 отмечена обратная закономерность. Ни одна из изученных линий сорта Filby достоверно не отличалась от исходного сорта по изученным признакам.

В 2003 году среди растений-регенерантов R„ генотипа Аз 93-1964 было выделено растение с не характерным для образца расположением листьев на стебле. На трех нижних узлах формировались тройчатосложные листья. Такой лист свойственен многим представителям семейства Fabaceae (клеверу, фасоли, сое). В последующих узлах находились листья с усиками, на которых формировались отдельные мелкие листочки.'В генеративной зоне образовывались листья типа усиковая акация с удлиненными листочками. Прилистники на растении были очень крупными, в отличие от исходного генотипа Аз 93-1964, у которого они были редуцированы.

Таким образом, можно говорить о получении сом&клональных вариантов по массе 1000 семян, типу листа, длине стебля в культуре длительно пассируемых каллусов гороха.

5. Селекция каллусов гороха in vitro на ycroiiчнвость к осмотическому

стрессу

5.1. Определение сублетальных и летальных концентраций селективного

фактора

Практическая значимость, использования сомаклональных вариантов повышается, если отбор генотипов ведется с использованием селективных сред. Важной задачей селекции гороха является создание сортов, устойчивых

к засухе. Поэтому, разработка селективных систем для отбора засухоустойчивых генотипов гороха имеет актуальное значение. Полиэтилен гликоль (ПЭГ) в составе питательной среды может служить адекватным селективным агентом, отражающим реакцию целых растений на засуху. Работы по клеточной селекции гороха на осмоустойчивость в культуре т хШо неизвестны.

Материалом для отбора устойчивых к действию осмотического стресса линий гороха служили длительно пассируемые морфогенные каллусныс ткани гороха генотипов Орлус и Аз 93-1964. Концентрация полиэтилен гликоля в питательной среде составляла 10...35%.

Изученные генотипы характеризовались сходной реакцией на присутствие селективного фактора в питательной среде. При 10% концентрации ПЭГ происходило увеличение прироста каллусной массы гороха в сравнении со стандартной средой на 7-8 % (рис. 1). Вследствие чего использование среды с 10% концентрацией селективного фактора для отбора в последующих пассажах нецелесообразно. Реакция каллусной ткани на увеличение концентрации ПЭГ в среде выражалась в замедлении темпов роста. При повышении концентрации ПЭГ до 35% наблюдалась гибель всех инокулированных экс-плантов. Таким образом, 35% концентрация ПЭГ в питательной среде является летальной для каллусных тканей гороха. Наибольшие различия между генотипами по интенсивности роста в присутствии селективного фактора выявлены на средах с содержанием ПЭГ 15...20%,

120 п

Орлус Аз 93-1964

10 15

Концентрация ПЭГ, %

Рис. I. Зависимость прироста каллуса гороха от содержания полиэтилен гликоля в среде

5,2. Субхульти ви рован и е каллусных линий гороха на селективных средах

Для отбора истинно толерантных к действию осмотического стресса клеток использовали принцип длительного субкультивирования на средах с ПЭГ в концентрациях 15-30%.

При длительном пассировании в присутствии 15% ПЭГ число растущих каллусов изученных генотипов уменьшилось незначительно. При повышении концентрации ПЭГ до 20% и продолжительности субкультивирования число растущих каллусов резко снижалось (рис. 2). К концу шестого пассажа выживаемость каллусов сорта Орлус составила 30%, генотипа Аз 93-1964 - 14%. Особенно резкая элиминация каллусов происходила на средах с высоким содержанием селективного фактора. В присутствии 25% ПЭГ в питательной среде выживаемость каллусов сорта Орлус в пятом пассаже снизилась до 2,5%, Подобная реакция наблюдалась и при 30% концентрации ПЭГ. При дальнейшем су б культивирован и и в присутствии 25,..30% ПЭГ наблюдали некроз и гибель всех каллусных клонов. Генотип Аз 93-1964 характеризовался большей чувствительностью к осмотическому стрессу, у которого на средах с 30% концентрацией ПЭГ жизнеспособность каллусов сохранялась только в течение четырех пассажей.

—31 * 10% ПЭГ —+ 30% ПЭГ

пэг

8« +23% ПЭГ

—•—31.

—И + 10ЧПЭГ

»14154 ПЭГ 81 ПЭГ

Рис. 2. Выживаемость каллусных клонов гороха при субкуль гивировании на селективных средах с ПЭГ-6000

После трех пассажей на селективных средах каллусные клоны делили на две части. Одну использовали для дальнейшего субкультивирования в селективных условиях, другую - для индукции органогенеза и получения растений-регеиерантов.

5.3, Индукция стабильного морфогенеза у толерантных к осмотическому стрессу каллусных линий гороха

Индукция регенерационных процессов осуществлялась на среде МЭ и (5,0 мг/л БАП + 2,0 мг/л НУК). Среда использовалась для увеличения массы каллусной ткани, поскольку изначально на селективных средах культивировались маленькие инокулюмы. Для получения регенерантных побегов каллусы переносили на среду М3( (5,0 мг/л БАП + 0,2 мг/л НУК).

Каллусы, отселектированные на среде, содержащей 15% ПЭГ, были зеленого цвета, интенсивно разрастались на регенерационных срезах, образуя регенерантные побеги. Каллусы, отобранные на среде с 20% концентрацией ПЭГ, имели более низкие темпы роста на регенерационных средах. Большая часть каллусов была буровато-зеленого цвета без зачатков побегов. На сохраняющихся зеленых морфогенных участках образовывались регенерантные побеги, которые очень слабо росли. Большое количество каллусов не теряло способности к неорганизованной пролиферации каллусной массы, но побегов не образовываю.

Каллусные клоны, отобранные на питательных средах, содержащих 25..,30% ПЭГ, на регенерационных средах бурели и некротизпровались. Наблюдалась гибель всех отобранных каллусов изученных генотипов.

Определен коэффициент корреляции между массой исходного эксплан-та и относительным ростом каллуса (г = -0,80...-0,85) у разных генотипов, отсел ектированных на средах с ПЭГ, что указывает на очень тесную отрицательную корреляцию между изученными признаками. Следовательно, чем меньше масса исходного экспланта, тем выше относительный рост каллуса.

Наибольшее число регенерантных побегов обоих генотипов было получено из каллусных линий, отселектированных в течение 3 и 4 пассажей на среде с 15% содержанием ПЭГ. В целом получено 38 растений-регеиерантов Ко в системах с ПЭГ у сорта Орлуе и 5 растений у генотипа Аз 93-1964. Регенерантные растения всех генотипов цвели и формировали семена. Таким образом, отбор осмоустойчивых каллусных линий целесообразно проводить на 100-150 сутки су б культивирования при концентрациях ПЭГ 15-20%.

5.4. Морфофизиологическая оценка регенерантных линий гороха на засухоустойчивость

В 2004 году в условиях смоделированной почвенной засухи был проведен морфофизиологический анализ растений-регенерантов Яг сорта Орлус.

полученных в селективных средах с ПЭГ-15% после трех пассажей и расте-нийгрегенерантов, не подвергавшихся действию ПЭГ. В качестве контроля высевались семена сорта Орлус, полученные в полевых условиях.

Анализ динамики потери воды растениями гороха в течение 6 часов завядай ия не выявил существенных различий между исходным сортом и потомством растений-регенерантов, отселектированных на средах с ПЭГ, по показателю водоотдачи при оптимальном уровне увлажнения почвы (70% ПВ). В условиях почвенной засухи (35% ПВ) потери воды, у отселектированных на средах с ПЭГ регенерантов гороха, были несколько ниже в сравнении с контролем (рис.3).

15 л

О Орлус - В Орлус Н2 □ Орлус Я2 (ПЭГ)

Рис, 3 Потери воды (%) растениями гороха при завядай и н (35% ПВ)

В условиях почвенной засухи произошло увеличение массы и объема корневой системы у всех изученных растений практически в два раза. При этом у регенерантов, отобранных на среде с ПЭГ, доля рабочей адсорбирующей поверхности корневой системы оказалась выше, чем у контроля.

Структурный анализ элементов урожая показал, что растення-регенеранты, отселектированные на средах с ПЭГ, отличались меньшей длиной стебля и меньшим числом непродуктивных узлов в сравнении с контрольными. В условиях 35% влажности почвы отмечена тенденция к повышению числа продуктивных узлов, числа бобов и семян у растений-регенерантов, выявлено существенное повышение продуктивности семяобразования.

Таким образом, в условиях смоделированной почвенной засухи выявлена тенденция превосходства по ряду морфофизиологических показателей, характеризующих засухоустойчивость, у регенерантов, отобранных на селективных средах с ПЭГ.

6. Микроразмножение форм гороха /л \itro

Для сохранения и ускоренного размножения ценного селекционного материала отрабатывались условия микроразмножения. Регенерация растений достигалась в два последовательных этапа:

- индукция многочисленных побегов на питательных средах;

- корнеобразование у изолированных побегов.

На среде МЭ] без регуляторов роста регенерантные побеги формировались, но скорость роста была достаточно низкой и, как правило, формировался один побег на эксплант {табл. 8). Наиболее активно формирование побего-вых почек и побегов отмечалось на среде МЭг с повышенным содержанием цитокининов (4,5 мг/л БАП + 0,02 мг/л НУК),

Таблица 8

е Зарянка Орловчанин

Е-? 5 к л с S Н Среда ЧИСЛО побегов длина побегов, мм число вторичных эксплантов число побегов длина побегов, мм число вторичных эксплан- TOB

« MSj 1,1±0,1 П,3±1,4 - 0,9±0,1 20,4±1,6 -

S ЭГ X а о. MR, 3,3 ±0.2 !9,9±1.9 18.2 2,5=Ь0,3 23,0±1,7 15,5

4> С MSj 5,1 ±0,4 8,2±0,9 5,1 3,8±0,3 15,5±U 3.7

'S" X э- MR* 3,9±0,4 I7,4±I,5 21,8 2,б±0,2 21,9±2,9 14,3

1- MSä 4,8±0,5 3,4±0,7 15,0 3,4±0,4 16,8 ±2,4 17,3

На среде М1*4 (1,0 мг/л БАП + 0,25 мг/л ИМ К), с уменьшенной концентрацией цитокининов, отмечалось образование меньшего числа побегов, в среднем формировалось от 2,5 побегов на эксплант у сорта Орловчанин, до 3,3 — у сорта Зарянка. Следует отмегить тот факт, что образовавшиеся побеги обладали активным ростом, были лучше сформированы и по морфологическим признакам имели явное преимущество перед регеиерантнымн побегами, сформированными на среде МБ;, Сформировавшиеся регенерантные побеги использовали как вторичные экспланты. К пятому пассажу из одного первич-

ного экспланта было получено от 150 до 450 регенерантных побегов. Эффективность ризогенеза у изученных сортов была достаточно высокой и составляла от 56% у сорта Орловчанин до 64% у сорта Зарянка.

Методика микроразмножения была апробирована на генотипах гороха посевного и гороха красивого.

Выводы

1. Определен оптимальный состав среды для индукции каллусогенеза у гороха. Индукция каллусогенеза у гороха наиболее эффективно протекает на питательной среде КГ3 содержащей 0,66 мг/л БАП + 5,0 мг/л НУК. Эффективность каллусогенеза определяется сортовой и тканевой специфичностью эксплакта,

2. Оптимизированы составь| сред для индукции морфогенеза у гороха. Подтверждены данные о решающей роли цитокининов при индукции морфо-генетических процессов в каллусных тканях гороха.

3. Установлена взаимосвязь между морфологической структурой каллуса и его регенерационной способностью. Показано, что плотный, компактный каллус отличается пониженной морфогенной активностью. Максимальный морфогенный потенциал отмечен у рыхлого глобулярного каллуса.

4. В длительно пассируемых каллусных тканях гороха для обеспечения активных пролиферативных и регенерационных процессов, эффективно чередование циклов культивирования на средах MSi (с низким содержанием НУК — 0,2 мг/л) и MS |2 (с более высоким содержанием НУК — 2,0 мг/л), через 3-4 пассажа (при неизменной концентрации БАП-5,0 мг/л). Выявлены генотипи-ч ее кие различия по способности к длительному субкультивированию каллусных тканей.

5. Разработаны условия получения корнесобственных регенерантных растений гороха в длительно пассируемой культуре каллусов на ризогенных средах в присутствии ауксинов. Для индукции ризогенеза предпочтительно использовать НУК к концентрации 1,0-1,5 мг/л.

6. Регенерантные линии Ri — R* большинства изученных сортов отличаются большей выравненностью (меньшим значением коэффициента вариации) по сравнению с исходным сортом.

7. Выделены сомаклональные варианты по массе 1000 семян, типу листа, длине стебля. Частота появления сомаклональных вариантов несколько возрастает с увеличением продолжительности культивирования in vitro-

8. Разработана схема отбора осмоустойчивых линий гороха, включающая отбор каллусов на средах с полиэтил ей гликолем в концентрации 15-20%

в течёние 3-4 пассажей, индукцию морфогенеза и получение корнесобствен-ных растений-регенерантов.

9. Выявлена отрицательная корреляционная зависимость (г = -0,80 0,85) между массой исходного экспланта и относительным ростом каллуса при индукции процессов морфогенеза у каллу сных линий гороха, отселекти-рованных на средах с ПЭГ.

10.В условиях смоделированной почвенной засухи выявлено преимущество по ряду морфофизиологических показателей, характеризующих засухоустойчивость, регенерантных линий гороха сорта Орлус, отселектирован-ных на осмоустой ч ивость в каллусной культуре.

11.Адаптирована методика ускоренного клонального микроразмножения гороха применительно к различным генотипам гороха.

Предложения и рекомендации для селекции

К Рекомендуется использовать методы клонального микроразмножения для сохранения коллекционного и ценного селекционного материала.

2. Рекомендуется использовать систему длительно пассируемых кал-лусных тканей для расширения спектра исходного материала в селекции гороха.

3. Рекомендуется использовать в селекции Линии Л 25-1 и Л 25-2 сорта Батрак, выделенные по массе 1000 семян. В качестве ценного исходного материала при селекции сортов гороха зерноукосного направления рекомендуется использовать линию Л 9-2 сорта Зарянка.

4. Для создания исходного материала, характеризующегося повышенной засухоустойчивостью, рекомендуется проводить отбор на селективных средах с ПЭГ. Использовать регенераптные линии гороха сорта Орлус, отсе-лектированные на средах с ПЭГ, в качестве исходного материала при селекции на засухоустойчивость.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1, Соболева Г.В., Кострубин М.М., Нагорнюк М.В., Варлахов М.Д. Микроразмножение ценных форм гороха в культуре ин витро // Биологические основы интенсивного растениеводства. — Орел, 1993. — С.82,

2, Соболева Г.В, Микроразмнозкение гороха красивого (Pisuni formo-sum) в культуре ин витро//Регуляция роста и развития растений.-М., 1995. -С.221.

3, Соболева Г.В, Микроразмножение гороха в культуре in vitro И Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии. - М., 1996.-С.75.

, 4. Соболев А.Н., Соболева Г.В., Легкобит М.П. Изучение методов кло-нального микроразмножения гороха ин витро И Актуальные проблемы естествознания в средней и высшей школе. - Орел, 1997.-4.3.-С.14-15.

5. Соболева Г.В., Зеленое А.Н. Длительное субкультивирование каллусных тканей гороха с высоким морфогенетическим потенциалом // Генетика и селекция растений. — Орел, I999.~C.27.

6. Соболева Г.В. Получение длительно пассируемых каллусных культур гороха Pisum sativum L, // Тезисы докладов IV съезда общества физиологов России. - М-, 1999, — Т.2. - С.700.

7. Соболева Г.В. Возможности использования культуры тканей in vitro в селекции гороха посевного Pisum sativum L. //1 Межд. науч. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». — М., 2000. — С.40-41.

8. Soboleva G. The qvestion of regeneration in long term callus culture of pea (Pisum sativum L.) // 4 European Conference on Grain Legumes, — Cracow, 2001.-P.156.

9. Soboleva G.V. Plant regeneration in somatic tissue culture of pea Pisum sativum И I International congress. «Biotechnology — state of the art and prospects of development». - M., 2002. -P.128.

10. Soboleva G.V, Selection of osmotic-resistant callus clones of pea (Pisum sativum L.) tt Vllt Intern, conf. «The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotech* nology». - Saratov, 2003. -P.290-291.

11. Soboleva G.V. Raising of Pea callus lines {Pisum sativum L.), resistant to osmotic stress // II International congress «Biotechnology - state of the art and prospects of development». - M., 2003. - P.228-229.

12. Соболева Г.В. Получение устойчивых к осмотическому стрессу каллусных линий гороха посевного {Pisum sativum L.) II Физиологические аспекты продуктивности растений. - Орел, 2004.-4.1.-С. 140-144.

13. Соболева Г.В., Зеленов АН. Морфогенез и регенерация растений в длительно пассируемой каллусной культуре гороха посевного Pisum sativum L. И Научное обеспечение производства зернобобовых и крупяных культур. — Орел, 2004, — С.213-219,

14. Соболева Г.В. Разработка метода отбора in vitro осмоустойчивых каллусных линий гороха посевного (Pisum sativum L.) IIII Межд. науч. конф, «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - М., 2004, — С.70-73.

15. Soboleva G, Obtaining of osmoresistant callus lines of sowing pea (Pisum sativum L.) // Biotechnology and Agriculture and the Food Industry. -N-Y: Nova Science Publishers, Inc., 2004.- ISBN 1-59454-119-1. - P.89-94.

Издательство ОрелГАУ, 2005, Орел, Бульвар Победы, 19. Заказ 21/05. Тираж 100 экз.

»10513