Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые структурно-функциональные особенности каллусов гороха и сои с различным морфогенным потенциалом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Некоторые структурно-функциональные особенности каллусов гороха и сои с различным морфогенным потенциалом"

91

[ г - п

~ ~ АКАДЕМИЯ • НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

КИЛМОВА Рамэия Галлямовна

НЕКОТОРЫЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КАЛЛУСОВ ГОРОХА И СОИ С РАЗЛИЧНЫМ МОРЮГЕКНШ ПОТЕНЦИАЛОМ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992 .

У,

ЫУ

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского научного центра АН РСФСР и в секторе электронной микроскопии Ме «факультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. а.н.Белозерского МГУ.

Научные руководители

- доктор биологических наук, профи;.сор ЛОЗОВАЯ В.В. (г.Назань), доктор биологичесюи наук, пра1*)ссир ПОЛЯКОВ В.Ю. (г.Москва)

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, ЧЛ. корр. УД АН, СИДОРОВ В.А. доктор биологических наук САРНАЩАЯ В.В.

Ведущая организация

Институт э^ссзриштальной ботаники им. В.й.Купраьича АН Белоруссии.

Защита состоится "Á/ " ШСЛА 1992 г. в " чая. на заседании специализированного совета Д 016.01 по прасус-дешт ученой степени кандидата биологических каук ( специальностьфизиология растений) .upa Институте физиологии растесЗ в генетики АН Украины по адресу: 252022, г.Киев-,22, а&. Васи-дьковская 31/17.

. С диссертацией uoeho ознакомиться в библиотека Института.

,Автореферат разослан * . <<<92 г.

УчаныЯ секретарь специализированного совета, квндагат Ог&логкчаскьх паук

трлмт ь.д.

Актуальность теми исследования. В настоящее время

тканевые и клеточные культуры, представляющие собой незаменимые экспериментальные системы для генетических манипуля иий с растениями, все активнее используются при исследовании фундаментальных проблем биологии клетки, включая вопросы ее физиологии, генетики, популяциошгах взаимодействий, адаптации к условиям выращивания и отбора на клеточном уровне, регуляции различных потенций клетки, в том числе морфогенеза. Преимущество работы с клеточными и тканевыми культурами обусловлены сравнительной простотой этих модельных систем, возможностями контроля и регуляции метаболизма, роста и развития изоли-ро ванных систем.

Между тем, до последнего времени существует серьезный недостаток знаний в области физиологии, биохимии, генетики, молекулярной биологии клеток и тканей in vitro, что неизбежно ограничивает эффективность их использования в биотехнологических целях. Особый интерес представляет сравнительное исследование морфогеншх и неморфогенных культур и выявление маркерных признаков на способность к органогенезу.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилась сравнительная оценка каллусных культур гороха и сон, различаемся по способности к морфогенезу, на Морфологическом, клеточном и ультраструктурнсм уровнях.

Были поставлены следующие задачи:

1) описать морфологию каллусных культур гороха и каллуса сои, различающихся по способности к морфогенезу.

2) определить состав клеточных стенок каллусов гороха с различной способностью к морфогенезу.

3) провести цитологический и гистологический анализ поп-

- г -

ределить состав и морфологию клеток в этих каллусах.

4) дать онтогенетическую характеристику каллусных культур гороха и сои и определить степень варьирования содержание ДНК в морфогенных и неморфогенних каллусных культурах.

Б) провести электронно-микроскопический анализ и описать ультраструктуру клеток, интерфазных ядер и митотических хромосом в клетках каллусных культур гороха и сои с различным морфогеннш потенциалом.

Научная новизна. Показано, что морфогенныэ каллусы

гороха отличаются по морфологии, интенсивности нарастания каллу сной массы, компонентному составу клеточных стенок, морфологии составляющие их клеток от неморфогенвдх каллусов гороха и сои.

При исследовании морфогенных каллусов гороха, обнару»ено, что они характеризуются относительной цитогенетичаской стабильностью. Б неморфогенша каллусах гороху происходят наиболее значительные изменения генома культивируемых клеток, что проявляется в изменении морфологии интерфазши ядер и митотических хромосом {"четковидные" хромосомы), смещении модального числа хромосом, увеличении относительного содержания ДНК.

О помощью реконструкции изображай с серийных ультратонких срезов показана, что хромосомы в клетках гороха и сои соединены меаду собой хроматиновыш мостиками. В клетках каллусов, особенно неморфогенных, характеризующихся еысоким уровнем полиплоидии, количество таких мостиков увеличивается,, что приводит к появлению больших хромосомных ассоциаций. Этот метод позволил обнарукять остатки ыатрикса хрокосоа из РКН-чаатиц (рлбонуклеопротидащ части;) в юзтафазншс клетках проростков и каллусов гороха к сои.

Прктическая ценность. Полученные результаты могут

быть . использованы в биотехнологических и в физиолого-биохимических исследованиях при отборе каллусных культур, потенциально способных к морфогенезу.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на отчетных конференциях Казанского института биология КНЦ АН СССР (Казань, 1986, 1987), на конференциях молодых ученых (Петразаводск, 1988; Москва, 1988), на Всесоюзных совещаниях по структуре и функциям хромосом (Пущино, 1988, 1991), на научном семинаре в секторе электронной микроскопии 11Ш им.А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 206 стр. машинописного текста, включает 39 рис., 3 таблицы, I35 фотографий. Список литературы включает 207 наименований, из них 72 на русском языке.

МАТЕРИАЛ) И МЕТОДЫ В качестве обьекта Исследования использовали три типа каллусных культур гороха, различающихся по морфолспш и способности к морфогенезу, а также каллус сой. Каллусы получены из эксплантатов (зпикотилей и апексов) четырех сортов гороха*. Булат, Смарагд, Татарстан, Казанский-38 и сои сорта Мелкосеменная апексального происхождения. В качестве контроля использовали меристему трехдневных проростков гороха и сои.

Соя была выбрана в качестве альтернативной модели как вид, содержащий низкое содержание ДНК на ядро (Эо = 6,5 мг), в от-

ЛИЧИй от гороха (Зо = 14,7 Iir) (Bennet, Smith, 1976).

Для получения каллусных культур использовали агаризованяые среды О^Р, В^К, предложешша Ежовой с соавт. (Ежова и др., 198е)). Измельченные эксплантаты помещали в чашки Петри на среду В^К (или ее модификации с уменьшенным вдвое содержанием фитогормонов ЯУК - 2 мг/л, БАЛ - 0,5 мг/л) и через 30-40 дней культивирования переносили на среду В5Р (НУК - 0,2 мг/л, БАЛ -- 5 мг/л).

При получении каллуса сои среда для инициации каллусообра-зования и длительного пассирования не различалась.

Каллусы пересаживали через каждые 20-30 дней на свежую среду в чашки Петри в стерильных условиях в ламинарах фирмы Flow.

Цитологический анализ клеток меристемы трехдневных проростков и различных тгаов каллусных культур гороха и сои проводили на постояшшх давленых препаратах в световом микроскопе фирмы Cois (Германия) по методике, предложенной Паушевой (Иаушева, 1970).

Для анализа ядер и хромосом и клетках сои была применена оригинальная методика окрашивания азур-эозином, предложенная Лугишпшм Н.В., разработанная им на базе Белорусского государственного университета (Лугинин, 1990).

Для цитофотомотрического анализа содержания ДНК использовали методику, любезно преялохенную сотрудниками кафедры цитологии Московского государственного университета, и модифицировали еа применительно к меристеме проростков и каллусам гороха и сои. Образца фиксировали, подбирали оптимальное время гидролиза и окрашивали реактивом Шиффа. Приготавливали давленые препараты и переводили их в постоянные. Интегральную оптическую протность окрашенных ядер измеряли на интегрирующем микрофото-

метре МИФ-4К (Хруст и др., 1975) при длине волны 546 нм.

Определение состава клеточных стенок проводили совместно с Заботиной О.А. по методу.Нишитани с соавт. (Nishltany et al., 1982). Определение моносахаридного состава полисахаридов мат-рикса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Honda, 1984) проводили на хроматографе системы "Oilson" с двумя последовательно соединенными колонками Separon NH? (Чехо-Слова-КИЯ) И Praotisial Carbonhydran (Whatman).

Для анализа ультраструктуры клеток, ядер и хромосом в кал- • лусах гороха и сои использовали метод электронной микроскопии. Фиксацию, контрастирование, дегидратацию и заливку в эпон проводили по стандартной схеме. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB 8800 (Швеция), контрастировали по Рейнолд-су (Reynolds, 1963). Препараты просматривали на электронных микроскопах HU-11B, HU-12 (Ititaohi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Для анализа митотических клеток в меристеме проростков я в каллусах гороха и сои использовали метод полутонких срезов (Клюева и др., 1974).

Полутонкие срезы получали на пирамитома (Pyramytome, 1KB, Швеция) толщиной 6 или 10 мк. В световом микроскопе (Optone, ФРГ) просматривали полутонкие срезы и находили нужную клетку. Переклеивали срез' на эпоновую шайбу и маркировали выбранную клетку. Изготовляли ультратонкие серийные срезы с этого полутонкого среза с целью реконструкции отдельных хромосом я части митотической клетки. Реконструкцию проводили перерисовывая с фотографий контуры хромосом на прозрачную пленку.

Статистическую обработку проводили по Рокицкому (Рокицкий, 1964)

"РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфологические и физиолого-биохимические особенности каллусных культур гороха и сои.

На четырех сортах гороха: Булат, Смарагд, Казанский-38, получены каллусные линии гороха алексального и эпикотильного происхождения, отличающиеся большим фенотипическим разнообразием. По способности к морфогенезу, по скорости нарастания кал-лусной массы и по внешнему виду были классифицированы три типа каллусных культур гороха: I - твердый, буро-зеленоватый окраски каллус, способный к регенерации единичных побегов: 2 -частично дифференцированная, содержащая многочисленные меристемы культура, способная к массовой регенерации побегов: Э -рыхлый, не зеленеющий на свету, неморфогенный каллус.

Неморфогенная каллусная культура сои по внешнему виду напоминает каллусную культуру гороха третьего типа, однако на свету начинает активно зеленеть.

Морфогешще каллусы гороха характеризуются невысокой скоростью нарастания каллусной массы (1,06+0,03 отн.ед. за 10 дней культивирования). Особенностью неморфогенных каллусных • культур гороха и сои является интенсивное нарастание каллусной массы (каллус гороха Зго. типа за 10 дней культивирования увеличивает свою массу на 20%, а каллус сои почти в 3 раза).

Интенсивность нарастания каллусной массы, вероятно, связана со способностью к морфогенезу, которая отсутствует у быстрона-растаодих рыхлых каллусов гороха (3 тип) и сои. В литературе также отмечается, что наибольшей способностью к морфогенезу обладают плотные, компактные, медленно нарастаюиие каллусы (Теау, 1990; Румянцева, 1990).

Цитологический анализ каллусов гороха и сои показал, что -

существует большая гетерогенность по составу, форме и размерам каллусных клеток.

Морфогенные каллусы гороха имеют в своем составе клетки паренхишого и меристематического типов, а также клетки, занимающие промежуточное положение мезду ними.

Клетки паренхишого типа, как правило, большого размера, разнообразной формы, с пристеночным расположением цитоплазмы, с одам или несколькими ядрами, часть из которых является мно-гоядрыиковыми. Большие вакуоли часто заполнены хлопьевидными включениями осмиофилыюй природа и, по-видимому, выполняют роль накопителей веществ вторичного метаболизма. Такие клетки получили название клеток-вместилиц (Запрометов, 1979).

Морфогенный каллус 2го типа характеризуется наличием очагов меристематических клеток. Очень часто на поверхности таких очагов и скоплений паренхимных клеток наблюдается слой клеток с темной деградированной цитоплазмой. Внутри каллусной массы обнаружены необычные клетки с автолитической вакуолью, которая содержит в -себе пузырьки цитоплазмы с различными органе лла\га. В дальнейшем мембрана пузырьков нарушается н содержимое лизиру-этся в вакуоли. Автолитическая вакуоль описана в клетках нектарника огурца (Козуба, Данилова, 1972). Авторы отмечают, что такие клетки чаще всего встречаются в дифГвреншгругаихся я стареющих клетках, особенно в вакуолязирующихся клетках, которые не имеют стадии роста растяжением. По-видимому твердая и компактная организация каллуса 2-го типа на дает возможности клеткам, находящимся внутри каллусной массы иметь нормальную стадию роста растяжением.

Следует отметить, что частично морфогенный каллус 1-го типа имеет в своем составе небольшие скопления меристематических

клеток, среди паренхимных клеток встречаются клетки циллиндри-ческой формы.

В этих каллусах, особенно на первых этапах культивирования, присутствуют проводящие сосуды, количество которых со временем уменьшается. Образование проводящих элементов в каллусах наблюдали уже через 48 часов после начала культивирования эксплантата (Ба1еззапс1го, КогШоке, 1977). Авторы также отмечают уменьшение проводящих элементов в длительно пассируемых каллусах.

Неморфогенные каллусы гороха (3-й тип) и сои имеют в своем составе преимущественно клетки паренхимного типа, проводящие элементы в этих каллусах не обнаружены. Существенной особенностью каллуса гороха Зго типа, в отличие от каллуса сои, .является большая гетерогенность по размерам и форме паренхимных клеток, а также наличие большого количества клеток цилиндрической формы.

Таким образом, морфогенше каллусы отличаются по морфологии от каллусов не способных к морфогенезу. Морфогенше каллусы гороха - твердые и компактные, а неморфогенные каллусы гороха и сои болев мягкие, и рыхлые. На кле•Точном уровне обнаружено, что морфогенше каллусы имеют более разнообразный клеточный состав (меристематические очаги,- проводящие элементы, клетки с темной цитоплазмой и автолитической вакуолью н т.д.). Зато неморфогенные каллусы обладают большей гетерогенностью по Форма и размерам паренхимных клеток. Значительной физиологической особенностью неморфогенных каллусов является быстрое нарастание каллуслой массы.

Анализ состава клеточных стенок каллусных культур гороха и сои

Одним из существенных компартментов клетки является клеточная стенка. Некоторые компоненты клеточной стенки (олигоса-харины) выполняют регуляторную роль и имеют отношение к процессам морфогенеза (AlberBhaim et el., 1985). В связи с ЭТИМ, нами была поставлена задача выяснить, существуют ли различия в составе клеточной стенки у каллусов с разным морфогенным потенциалом.

Показано, что процентное содержание массы клеточных стенок выше у каллусов гороха с невысоким морфогенным потенциалом (1го и Зго типа)(табл.1). При анализе моносахаридного состава клеточных стенок было обнаружено, что содержание глюкозы и арабинозы во всех трех типах каллусных культур гороха повышено по сравнению с остальными моносахаридами. Наибольшее количество арабинозы находится в клеточных стенках каллусов гороха 1-го и 3-го типа (табли). Как уже отмечалось выше, эти каллусы характеризуются невысоким морфогенным потенциалом или полным его отсутствием, а также разнообразием формы и размеров паренхимных клеток. Высокое содержание арабинозы было обнаружено в составе клеточной стенки в суспензионной культуре Catharanthye roeus, состоящей из циллиндрических клеток (Suzuki etal.,'1990). По-, вимому, арабиноза принимает участие в определении морфологии клеток.

В табл.1 видно, что содержание таких моносахаридов геми-целлюлозной фракции как рамноза, ксилоза, манноза и галактоза не велико и уменьшается в ряду каллусов с убывающим морфогенным потенциалом. Возможно, это связано с частичной или полной потерей этими каллусами способности к морфогенезу.

Табл.1.

Масса клеточной стенки.(кс) и моносахаридный состав гемицеллюлоз (ГЦ) клеточных стенок трех типов каллусов гороха (в Ж от общего содержания ГЦ).

Растения и каллусы гороха КС(мг) В 100 мг. Рам-. ' ноза Араби-ноза Ксилоза Ман-ноза Глюкоза Галактоза Неиден-тифиц.

сорт Булат Стебель гороха 37,3+0,4 2,7+0,3 1,4+0,4 5,0+0,1 12,3+0,9 42,1+2,5 35,2+2 ,0 1,3+0,2 |

Каллус 2-го типа, (морфогенный) 43,0+0,3 15,2+1,5 12,6+6,6 3,9+0,2 2,4+0,2 39,7+4,0 23,6+2 ,0 0 1 2,6+0,3

Каллус 1-го типа (с низким морфо-генныы потенц.) 61,0+0,5 '14,1+1,4 38,1+3,5 0,8+0,3 - 29,5+1,5 12,8+1 ,5 4,7+0,1

Каллус 3-го типа (не морфэгенный) 63,0+0,1 "9,6+0,9 38,5+2,5 I,0+0,1 - 29,5+2,0 16,2+2 ,0 6,2+0,3

Сравнительное кариологическое изучение клеток меристемы проростков и каллусных культур гороха и сои Изменение числа и структуры хромосом в процессе культивирования является особенностью каллусных клеток, однако причины такой изменчивости остаются до сих пор не изученными. Не ясно, в какой степени хромосомные нарушения затрагивают популяции каллусных клеток, и как это отражается на процессе морфогенеза, а также в какой ?<чре связаны эти два явления между собой.

На рис.1 представлены распределения хромосомных чисел в клетках проростков и каллусов гороха. Большинство митотических клеток (около 80%) меристемы проростков гороха содержит диплоидный набор хромосом. Среди нормальных делящихся клеток меристемы проростков часто встречаются клетки с различными аномалиями митоза: анафазы с отстающими хромосомами, многополюсные митозы, клетки с хромосомными фрагментами небольшого размера и т.д.. Частота аберрантных анафаз составляет 23+1,4(%).

В клетках каллусов гороха трех типов число клеток с хро- . мосомными нарушениями и аномалиями митоза увеличивается. На рис.1 б,в можно видеть, что хотя в каллусах первых двух типов увеличивается число гипо- и гипердиплоидных клеток, модальное число не изменяется и равняется 14 (диплоидный набор). В этих каллусах возрастает доля аберрантных анафаз (32+2,3(3) и 28+1,9(Ж) соответственно). Следует отметить, что хромосомные нарушения в клетках каллусов первых двух типов наблюдаются, в основном, при делении паренхимных клеток. В меристематических клетках, а особенно, в меристематических очагах, аномалии митоза наблюдаются гораздо реже. Этим, вероятно, можно объяснить факт регенерации растений из каллусов первых двух типов, преимущественно с диплоидным набором хромосом.

» ¥ 0 Л .....гь.. '' * • . «V р п гЛ

г а №птг • а я я т и ч * \ 1, ж пгк п п

9 » * 111(1 я *> ьлй Я я и к т » 1 п 1 г 1 п п р 0:

Г" А .....„„гГ « м ь и и о га А , » Р| »•& 1 ......|Шшзи111Ь1а^4и1ЫиА«(и*!

Рис. 1. Распределение хромосомных чисел в клетках проростков (а) и каллусов гороха 1,2 и 3-го типа (б,в,г). По оси абцисс - количество хромосом, по оси ординат -количество клеток

' - 13 -

По-видимому, морфогенез в культуре клеток возможен только при участии клеток без видимшс хромосомных нарушений. Подобное утверждение коррелирует с положением о том, что органогенез в культуре ткани Р1зит ваПтот связан с диплоидной частью гетерогенной популяции (Фролова, Шамина, 1974).

Значительные изменения хромосом наблюдаются в популяции паренхимных клеток неморфогенного каллуса гороха Зго типа. Резко возрастает число полиплоидах и анеуплоидных клеток, модальное число не четко выражено и смещается в область три- и тет-раплоидных значений (рис.1 г). Возрастает число структурных хро мосомшх нарушений как в метафазе, так и в анафазе. Количество аберрантных анафаз в каллусе Зго типа составляет 44,8+3,9(%).

В некоторых клетках каллуса гороха Зго типа наблюдаются необычные хромосомы "четковидного" строения. Такие хромосомы не однородны по толщине и состоят как бы из прилегающих друг к другу плотных глобулярных структур с более светлыми промежутками. Природа таких глобулярных структур не известна, и, предположительно, они могут соответствовать либо блокам структурного гетерохроматина, либо участкам дифференциальной конденсации (Турков и др., 1986), выявляемым в хромосомах при обработке их пониженной температурой. Следует отметить, что в нашей работе "четковидные" структуры выявляются без дополнительных обработок и дифференциального окрашивания.

Показано, что в каллусе ^ороха Зго типа имеют место очаги клеток с хромосомами разных размеров, где можно наблюдать как бы стадии перехода от клеток с крупными хромосомами к клеткам с мелкими хромосома1«! и с большим количеством хромосомных фрагментов. Непонятно, каким образом идет превращение крупных хромосом в мелкие. В связи с этим, вызывают большой интерес хро-

мосомы "четковидного" строения. Возможно, в каллусе под влиянием каких-то условий может происходить поперечная фрагментация хромосом в местах соединения "глобулярных" структур. При этом образуется множество центрических и ацентрических фрагментов, часть которых (без центромеры) элиминирует во время последующих делений. На возможность появления спонтанных разры-ров хромосом указывает ряд литературных данных (Yao-Meng-Chao et al., 1987? Öhonson et al., 1987} Zakshmi, 1988).

В паренхимных клетках каллуса сои также наблюдается значительный размах изменчивости по числу хромосом, встречаются клетки с числом хромосом более 220 (рис.1е). В каллусе сои, также как в неморфогенном каллусе гороха 3-го типа, нет четко выраженного модального числа. Однако, наибольшее количество клеток имеют ди- и триплоидные наборы хромосом.

. . (1*1...... г,..... д , »' HD iVl . . rt ............_

& » « (Mrr,runnri™f] ■ с я « » ii К е [i тгптгп1тгг ul fi hvдпа* x a "<i "Ii м 'ч jjI

Рис. 1 (окончание). Распределение хромосомных чисел в клетках проростков (д) и каллуса сои (е).

- 15 -

Полученные данные коррелируют с положением о том, что в культуре in vitro клетки видов растений с малым количеством хромосом в наборе склонны к полиплоидизации в большей степени, чем клетки растений, содержащих большое число хромосом (Кордам и др., 1980).

Приняв во внимание, что морфогенез возможен только в кал-лусных культурах гороха 1го и 2го типов, где имеют место очаги меристематических клеток, можно заключить, что процесс морфогенеза в культуре клеток и тканей гороха находится в тесном единстве и взаимосвязи с процессами онтогенетической и цитологической изменчивости культивируемых клеток. Сравнительно стабильный геном меристематических клеток в морфогенных каллусах гороха первых двух типов, вероятно, обеспечивает их способность к морфогенезу. .

В неморфогенных каллусах гороха и сои перестройки генома затрагивают наиболее значительную часть клеточной популяции, что, вероятно, ведет к потере способности к морфогенезу.

Изучение изменения количества ДНК в интерфазных и мито-тических клетках проростков и каллусных культур гороха

и сои

Паралельно с изучением распределения хромосомных чисел в длительнопассируемых каллусах было изучено изменение содержания ДНК в клетках проростков и каллусов гороха и сои.

За эталон тетраплоидного содержания ДНК клеток гороха было принято 64-72 отн.ед.. Эта величина была получена при цито-фотометрическом измерении профазннх. меток корневой меристемы гороха, которые содержат 4С ДНК. На гист. I (рис. 2а) наибольший пик соответствует 4 С , т.е. большинство пнтерфазкш ядер

в

■ь

н-

ги

¡ь

л

г

ч-т

а

А-

Ьь

/ ».я

гЬ

гЬ

гН—■,

Рис. 2. Распределение относительного содержания ДНК в клетках проростков (а), каллусов гороха 1,2 и 3-го типов (0,в,г). По оси аОцисс - содержание ДНК, отн. ед., по оси абцисс -количество клеток.

п

находится в постсинтетической стадии интерфазы о2. Содержание ДНК в клетках каллусных культур гороха первых двух типов варьирует в более широких пределах, чем в клетках меристемы проростков гороха (рис.2 б,в).

Гораздо более значительные изменения размера генома происходят в митотических и интерфазных клетках паренхимного типа рыхлой каллусной культуры Зго типа. В клетках этого каллуса содержание ДНК варьирует от 33 до 240 отн.ед. и в большинстве клеток превышает 4 С (рис.2 г). Это соответствует высокому уровню поли- и анеуплоидии, наблюдаемой цитологически в мета-фазных клетках этого каллуса (рис.1 г). Большинство клеток содержит ДНК в пределах 6-7 С, что коррелирует с модальным распределением хромосом в клетках каллусной культуры Зго типа, в которой значительное количество клеток имеет околотриплоидноа число хромосом (рис.1 г),

В клеттсях _каллуса сои_содержание ЛНК также повышено, и т;а

1 I

1 «

' * я ':

«. т

"3 *> О/

9

«./у

Рис. 2 (окончание). Распределение относительного содержания ДШС в клетках проростков (д) я каллуса соя (а).

®

гистограмме пик смещен в область гипердиплоидных значений (рис. 2е), что коррелирует с данными цитологического анализа в каллусе сои, где наибольшее количество клеток имеет диплоидный и триплоидный набор хромосом (рис. 1е).

Исходя из вышеизложенных данных можно заключить, что варьирование содержания ДНК в каллусных клетках является отражением цитогенетической гетерогенности культивируемых клеток. Размах варьирования значений относительного содержания ДНК различается у трех типов каллусных культур гороха, коррелирует со способностью каллусной культуры к морфогенезу вне зависимости от вида растения. Неморфогенные каллусные культуры гороха (Зго типа) и каллуса сои имеют большее варьирование значений относительно содержания ДНК, чем морфогенные каллусные культуры гороха 1го и 2го типов.

Ультраструктурный анализ интерфазных ядер и митотических хромосом в меристеме проростков и каллусах гороха и сои.

Для того, чтобы выявить более тонкие изменения генома в процессе культивирования каллусных клеток был предпринят анализ ультраструктуры интерфазных ядер и митотических хромосом в клетках меристемы проростков и каллусов гороха и сои.

При электронно-микроскопическом анализе интерфазных ядер в меристеме проростков гороха, имеющих "хромомерный" тип организации хроматина (N051, 19е4) обнаружено большое разнообразив ядер по их размерам и ультраструктуре. Для сравнения морфологии интерфазных ядер в клетках проростков и в каллусных культурах ядра были классифицированы по структуре конденсированно-

го хроматина.

За основу были приняты классификации ядер в клетках меристемы проростков Allium сера (Xuroiwa, Tanaka,1971{ Клюева И др.,1974).

В клетках меристемы проростков и в каллусах гороха были выделены основные две группы ядер, различающиеся по характеру расположения конденсированного хроматинового материала:

1) интерфазные ядра с равномерным распределением хроматина по всему ядру»

2) интерфазные ядра с неравномерным распределением хроматина по ядру.

Вторая груша ядер включает в себя две подгруппы (а и б), различающиеся по размерам и характеру распределения хроматиновых скоплений в интерфазном ядре.

Согласно классификации вышеназванных авторов, было определено, что ядра 1ой группы соответствуют s-периоду интерфазы, а ядра 2а и-26 групп принадлежат о1 и а2 периодам интерфазы соответственно.

В клетках каллусов гороха была обнаружена большая гетерогенность морфологии интерфазных ядер. Часто встречаются ядра неправильной лопастной, вытянутой, гантелавидной и другой формы с глубокими инвагинациями ядерной оболочки. Имеют место клетки с двумя и более ядрами, многие из которых являются мно-гоядрышковыми. Иногда в ядрышках наблюдается большое количество (Цибриллярных центров. Увеличение количества ядер, ядрншвЛ и фибриллярных центров свидетельствует о высоком уровне эндо-и полиплоидии (Ченцов, Поляков, 1974), что хорошо согласуется с нашими цитологическими наблюдениями.

- 20 -

Благодаря составленной классификации, помимо основных групп, были выявлены интерфазные ядра необычной морфологии в культивируемых клетках гороха. Это ядра с дисперсным хроматином, ядра "хромонемного" типа, а также ядра с грубоструктури-рованным хроматином. Следует отметить, что если основные две группы Ядер Имели место как в меристематических, так и в паре-нхимных клетках, то ядра с необычным распределением хроматина наблюдались преимущественно в клетках паренхимного типа. Появление таких ядер в каллусных клетках неслучайно и отражает, вероятно, специфику каллусных клеток и связано с процессами, происходящими в условиях культивирования In vitro. По всей видимости, грубая структуризация хроматина происходит в ядрах некротизирунцих больших клеток на поверхности каллусной массы.

Ядра с дисперсным хроматином наблюдаются в паренхимных клетках и каллусов гороха, и каллуса сои. Дисперсия хроматина отражает высокий уровень транскрипционной активности (Kuroiwa, Tanaka, 1971t Prantißhek, 1987) И свидетельствует о высокой интенсивности физиолого-биохимических процессов, протекающих как в клетках каллуса гороха, так и сои.

Черты хромонемной организации ядра приобретают, по-видимому, из-за увеличения количества ДНК в них в результате процессов эндополиплоидии и эндоредупликации, с высокой интенсивностью протекающих в каллусных клетках, особенно в неморфо-генном каллуса гороха Зго типа. Подобное утверждение было сделано на базе данных о том, что интерфазные ядра растений в зависимости от содержания ДНК в них (2 С) на диплоидный набор (2п) имеют определенный тип организации хроматина: "хромо-центрический" (до 2 пг на 2 С), "хромомерный" (от2 до 10 пг

- 21 -

на 2 С) и "хромонемннй" (свыше 10 пг на 2 С) (Hagl, 1984).

По всей видимости, тип организации хроматина в интерфазном ядре может различаться не только у разных видов растений с неодинаковым содержанием ДНК на ядро, но и у одного вида растеши! при увеличении содержания ДНК в них в процессе культивирования in vitro. Аналогичные данные получены на каллуснсй культуре сон, для которой характерен "хромоцентричоский" тип организации хроматина в интарфазном ядре. Некоторые ядра в клетках каллуса сои в процессе культивирования приобретают черты "хромомерной" организации.

Метод полутонких срезов позволил проанализировать под электронным микроскопом все стадия мнтотического цикла в клетках меристемы проростков, а главнее, в клетках каллуса гороха.

Было обнаружено, что хромосомы гороха raw ют неровный край с выступами, который в момент наибольшей конденсации в мотафа-зе становится наиболее ровным, причем диаметр выступов на всех стациях митоза больше в клетках каллуса по сравнению с клетками меристемы проростков. Интересно отметить, что выступы, сливаясь, образуют иногда четкошадше структуры хромосом, вероятно, подобные описанным при световой микроскопии.

Метод серийных электронно-микроскопических срезов позволил представить пространственное расположение хромосом и подтвердить их неслучайное расположение в ивтафаза. С пешцьв реконструкции серийных срезов ciano возможным определить взаиыо-располсгоняэ и строение отдельных хромосом. Установлено, что хромосомы соединены между собой хроматшювнод! мостиками, кото-рае исчезают только в мокант наибольшей конденсация хроматина в йбт.'г^аза. Особенно закатим связи швду хромосоикяа а клетках

неморфогенных каллусов, где, в результате, образуются огромные хромосомные ассоциации.

На электронно-микроскопических срезах метафазных клеток меристемы проростков , а также клеток каллусов гороха и сои обнаружено гранулярное вещество типа облака. По-видимому, это остатки матрикса хромосом состоящего из РНП-частиц.

Таким образом, с помощью электронной микроскопии подтверждены наши данные о том, что в неморфогенных каллусах, в процессе культивирования происходят наиболее значительные изменения генома. Показано, что в некоторых каллусных клетках меняется морфология интерфазных ядер,_ а в митозе хромосомы связаны мявду собой хроматиновыми мостиками, в результате чего, образуются огромные хромосомные ассоциации.

Выводы.

1. Каллусы гороха, способные к морфогенезу, отличаются по морфологии и интенсивности нарастания каллусной массы от неморфогенных каллусов гороха и сои и характеризуются большим разнообразием составляющих их клеток. В морфогенных каллусах обнаружены и описаны очаги меристематических клеток, клетки с автолятической вакуолью и с темной цитоплазмой.

2. Обнаружено, что морфогенныв каллусы гороха отличаются по составу компонентов клеточной стенки от каллусов гороха с низким морфогенным потенциалом. Показано некоторое обеднение моносахаридного состава клеточных стенок каллусов гороха с низким морфогенным потенциалом. Высокий уровень врабинозы коррелирует в этих каллусах с наличием клеток циллиндрической

формы..

4. Обнаружено, что морфэгенше каллусы гороха характеризуются относительной онтогенетической стабильностью. Неморфо-генные каллусные культуры гороха и сои обладают большей онтогенетической изменчивостью, что выражается в смещении модального числа хромосом и увеличений относительного содержания ДНК в клетках.

4. В клетках каллусов обнаружены и описаны не типичные для клеток меристемы проростков ядра с грубоструктурированным хроматином и с дисперсным хроматином. В неморфогешшх каллусах гороха с высоким уровнем полиплоидии описаны интерфазные ядра "хромонемного* типа, а в каллусе сои - "хромомерного" типа.

5. В некоторых клетках неморфогешшх каллусов гороха меняется структура и морфология хромосом. Описаны хромосомы "четксьлдной" структуры, а также очаги клеток с хромосомами разных размеров и большим количеством хромосомных фрагментов .

6. Применение метода реконструкции изображений с ультратонких серийных срезов позволило обнаружить, что на всех стадиях митоза в клетках меристемы проростков и каллусов гороха хромосомы связаны друг с другом хроматиновыми мостиками. В результате, в каллусных клетках неморфогешшх культур гороха я сои образуются большие хромосомные ассоциации.

7. Показано, что в мотафазных клетках меристемы проростков а в клетках каллусов города и сои присутствует гранулярный материал, соответствупкиЯ так называемому Р1Ш- матриксу хромосом.

- 24 -Список публикаций.

1. Иванова А.Б., Киямова Р.Г., Горшкова Т.А. Различные типы каллусных культур гороха: их цитогенетическая характеристика // Деп. В ВИНИТИ, -1987. -N 5055 -В 87. с. Э4-40

2. Заботина O.A., Киямова Р.Г., Горшкова Т.А. Состав клеточных стенок каллусных культур гороха, пассируемых на средах с различным содержанием бора // В кн. Проблемы современной биологии/ МГУ. Москва. -1988. -4, вып. 2. Деп. в ВИНИТИ, N 6711-В 88. -С.25-29

3. Киямова Р.Г., Пислегина Е.Г. Частота хромосомных нарушений в проростках и каллусной культуре гороха // Мат-лы конф. мол. ученых Казанск. ин-та биологии КФАН СССР / Казань. -1988, -Деп. в ВИНИТИ, -N 1014 -В 90. -с.2-5

4. Lozovaya V.V., Oorehkova T.A., Zabotlna O.A., Kiyamova R.O. Cell formathion In plant oall and tiBBue culture // Abstr. of üth Cell Wall Meeting. -Edingburg. -1989. (30 aug.-Я cept.), -p. 64

5. Заботина O.A., Киямова Р.Г., Малихов Р.Г., Горшкова Т.А. Влияние некоторых условий культивирования на состав клеточных стенок различных типов каллусных культур гороха и сои // Тез. докл. 3 Всесоюзн. конф. "Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки", Казань. -1990. (13-15 июня), -с.42

6. Киккова Р.Г., Лозовая В.В., Горшкова Т.А., Поляков B.D. Нестабильность кариотипа в каллусных линиях гороха // ЦИТОЛОГИЯ. -1991. -т.33. -N1. -о. 33-37

о