Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности состава клеточных стенок каллусных культур гречихи с различным регенерационным потенциалом в процессе роста и морфогенеза

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности состава клеточных стенок каллусных культур гречихи с различным регенерационным потенциалом в процессе роста и морфогенеза"

На правах рукописи

ВАЛИЕВА АЛЬФИЯ ИСМАГИЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ГРЕЧИХИ С РАЗЛИЧНЫМ РЕГЕНЕРАЦИОННЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ В ПРОЦЕССЕ РОСТА И МОРФОГЕНЕЗА

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-1998

Работа выполнена в Казанском институте биологии Казанского научного центра РАН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор В. В. Лозовая, кандидат биологических наук, с.н.с. Н. И. Румянцева

доктор биологических наук, профессор Ф. Г. Каримова кандидат биологических наук, доцент О. А. Тимофеева

Казанская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится " " 1998 г. в -/У час.

на заседании специализированного Совета К 002.16. 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН (420503, г. Казань, а/я 30).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " с^ец/х&^Л. 1997 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук О ¿'¿V Н. Л. Лосева

се^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. В настоящее время клеточная стенка рассматривается как метаболически активный компонент клетки, принимающий участие в регуляции и выполнении важнейших функций растительного организма (Fry, 1988). Клеточные стенки регулируют скорость роста клеток, сохраняют целостность клеточного содержимого, обеспечивают автономность функциональной деятельности каждой клетки. Они играют роль в регуляции роста и дифференциации клеток. Однако характер взаимодействия различных компонентов клеточных стенок определен лишь в общих чертах, а динамика изменений состава клеточных стенок, связанная с процессами роста и дифференциации клеток, изучена лишь в единичных работах и требует многостороннего, глубокого изучения. Использование культивируемых клеток и тканей высших растений в экспериментах, связанных с изучением роли клеточных стенок в процессах роста и морфогенеза, - один из наиболее многообещающих подходов. Однако эксперименты, проводимые на каллусных и суспензионных культурах имеют определенные ограничения, связанные с гетерогенностью системы и изменением ее физиолого-генетических характеристик с течением времени культивирования. Использование каллусных культур, сохраняющих стабильные морфологические, цитогенетические и биохимические характеристики при длительном культивировании in vitro, может позволить преодолеть подобные ограничения и расширить возможности методологического поиска.

Цель проводимых исследований - выявить различия в составе клеточных стенок морфогенных и неморфогенных каллусов гречихи в процессе роста и морфогенеза. В связи с этим в задачи исследований входило:

1. Изучить морфологические и цитогенетические характеристики каллусов с различной способностью к морфогенезу.

2. Исследовать состав клеточных стенок морфогенных и неморфогенных каллусов и выявить особенности распределения лигнина в клеточных стенках.

3. Провести анализ полисахаридов, выделяемых в среду культивирования каллусами с различной способностью к морфогенезу.

4. Изучить влияние различных условий культивирования на морфологию каллусов, состав клеточных стенок (полисахариды, лигнин) и активность пероксидаз в морфогенных и неморфогенных каллусах.

5. Изучить влияние колхицина на морфологию каллусов, отличающихся по способности к морфогенезу, состав их клеточных стенок и на состав внеклеточных полимеров.

Научная новизна работы. Впервые многосторонне охарактеризованы каллусы с различной регенерационной способностью. Определены особенности роста культур, их морфологические, цитогенетические отличия, состав клеточных стенок. Показано, что морфогенный каллус выделяет в среду культивирования большее количество полисахаридов и белков, чем неморфогенный. Анализ внеклеточных полисахаридов выявил, что в морфогенном каллусе внеклеточные полисахариды обогащены нейтральными сахарами и связаны большим количеством диферуловой кислоты. Изучена динамика состава клеточных стенок (полисахариды, лигнин) морфогенного и неморфогенного каллусов в различных условиях культивирования. Выявлено, что культивирование каллусов на свету на каплусогенной среде вызывает увеличение содержания пектиновых веществ в обоих типах каллусов, свет также стимулировал образование гемицеллюлоз, целлюлозы и лигнина в неморфогенном каллусе. Обнаружено, что культивирование неморфогенного каллуса на среде с БАП приводило к уменьшению размеров клеток, что сопровождалось изменением полисахаридного состава клеточных стенок и усилением лигнификации тканей, которая коррелировала с повышением активности ковалентно-связанной пероксидазы. В морфогенном каллусе образование почек сопровождалось увеличением содержания пектинов и уменьшением содержания гемицеллюлоз. Впервые показано, что нарушение межклеточных контактов и разрыхление ПЭКК при культивировании морфогенного каллуса на среде с 0,25 мМ колхицином может быть связано с изменением структуры пектинов срединной пластинки и гликопротеинов экстраклеточного матрикса.

Теоретическая и практическая значимость работы. Известно, что гречиха является культурой, регенерация растений в которой представляет определенные трудности. Полученные нами данные о морфологических и биохимических особенностях культур гречихи с различным морфогенным потенциалом могут представлять интерес для специалистов, занимающихся изучением процессов морфогенеза in vitro, и могут быть использованы в генетических, биотехнологических и селекционных исследованиях в качестве экспресс-тестов для ранней идентификации в селекции культур, способных к регенерации.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на Итоговой научной конф. Казанского института биологии (1997), конф. молодых ученых и специалистов (Казань, 1996, 1997), на VI мол. конф. ботаников (С.-Петербург, 1997), IV Всеросс. конф. "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, 1997), на Междунар. симп. "Молекулярная биология в сельском хо-

зяйстве" (Чехия, 1997), на VII Междунар. конф. "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда".(Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, 1 работа принята к печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов работы и их об-сужения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков. Список использованной литературы включает 182 наименования, из них 38 на русском языке. Приложение содержит с? фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследований использовали каллусные культуры, • полученные из незрелых зародышей татарской гречихи (Fagopyrum tataricum (L.). Gaertn). Для экспериментов были использованы каллусы морфогенных (3, 33, 14) и немор-фогенных (2, 3) линий. Культуры поддерживали на среде RX (Румянцева и др., 1989), регенерацию проводили на среде RXR (среда RX, в которой изменяли содержание гормонов: 6-БАП - 2,2 мг/л, ИУК - 0,18 мг/л). Для проведения опытов с колхицином добавляли к среде RX (стерилизовали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,25 мкм) раствор колхицина в конечной концентрации 0,25мМ.

Для проведения цитогенетических исследований каллусные ткани фиксировали и окрашивали раствором пропионового орсеина. Для определения митотического индекса анализировали 20000 клеток на давленных препаратах. Числа хромосом подсчитывали на 50-70 метафазных пластинках. Цитогенетические исследования были проведены совместно с аспирантом лаборатории биохимии клеточной стенки Мухитовым А. Р.

Подготовка материала для электронной микроскопии. Образцы фиксировали 2% раствором КМп04 и, после обезвоживания в этаноле, ацетоне и окиси пропилена, заключали в эпон. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-8890 (LKB - Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронных микроскопах ЭМ-200 и JEM-100EX (Jeol, Япония). Электронно-микроскопические исследования были выполнены совместно с н.с. лаборатории биохимии клеточной стенки Агеевой М.В.

Азтофлуоресцентное детектирование лигнина проводили на свежих срезах каллусов, замороженных с помощью жидкого азота, согласно методике Харриса и

Хартли (Harris, Hartley, 1976). Препараты просматривали под люминесцентным микроскопом Люмам И1.

Для выделения внеклеточных полимеров отделяли агар от среды культивирования в системе из двух пробирок с фильтром из Miracloth на центрифуге (6000g, 10 мин.). К фильтрату добавляли этанол до конечной концентрации 80% и оставляли на ночь для осаждения полимеров.

Выделение и фракционирование клеточных стенок проводили по методу Ни-шитани с соавт. (Nischitany et al., 1982).

Анализ моносахаров полисахаридов матрикса и внеклеточных полимеров проводили спектрофотометрическим методом с применением орто-толуидинового реактива (Резников и др., 1982).

Анализ фенольных соединений проводили методом ГЖХ в условиях, описанных Хартли (Hartley, 1971) на хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором. Использовали стеклянную разделительную колонку, заполненную 4% СЕ - 52 на носителе Chromosorb W (100-120 меш.). ГЖХ-анализ фенольных кислот был проведен совместно с с.н.с. лаборатории клеточной стенки Яблоковой Е.В.

Содержание белка определяли по степени связывания с красителем Кумас-си голубым G-250 по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). Калибровочную кривую стоили по альбумину из человеческой сыворотки.

Относительное содержание лигнина определяли по методике Витмора (Whitmore, 1978). Спектры поглощения сканировали на спектрофотометре Specord М-40 (" Karl Zeiss", Германия) при длине волны 240 - 420 нм.

Метод определения активности пероксидазы основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени (Ермаков, 1987). Оптическую плотность измеряли при 470 нм (максимум поглощения тетрагваякола). При приготовлении различных фракций пероксидаз использовали метод Иевиныша (Иевиныш, 1990).

Опыты проводили в 3-5 биологических повторностях, состоящих из 3-6 аналитических, экспериментальный материал обработан статистически (Глотов, 1982, Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Особенности роста, морфологии и хромосомного состава каллусных культур гречихи татарской с разной регенерационной способностью

Гистологические и цитологические исследования позволили выявить ряд структурных особенностей, характерных для морфогенных и неморфсгенных каллусов. Морфогенный каллус - типичная нодулярная культура. Он состоял из участков относительно мягкого каллуса, представленного клетками паренхимного типа и плотных нодулярных структур - проэмбриогенных клеточных комплексов (ПЭКК), состоящих из мелких меристематических клеток с плотной цитоплазмой. Рыхлый не-морфсгенный каллус был отселектирован из морфогенного, представлен крупными сильновакуолизированными клетками паренхимного типа.

Согласно данным хромосомного анализа морфогенные культуры, несмотря на цитологическую гетерогенность, состояли, главным образом, из диплоидных клеток

(95-98%), в то время как неморфогенные А каллусные линии представляли собой мик-

соплоидную культуру и содержали клетки различного уровня плоидности (от п до 8п и более).

Анализ митотической активности (рис.1 А) и особенностей роста культур .(рис.1Б) позволил выявить, что основной прирост биомассы неморфогенного каллуса был получен за счет роста клеток растяжением. В противоположность этому в морфогенном каллусе была отмечена прямая зависимость между приростом биомассы и митотической активностью клеток. По-видимому, "нетиличность" кривой нарастания нодулярных каллусов, в которых основной прирост ткани идет за счет деления клеток и без ярко выраженной фазы растяжения, характерной для неморфоген-

■ 1,8 1.6

° 1 л

* 1,4 о»

? 1,2

£ 11 0,8 о

® 0,6

5 0,4 о

£ 0,2

= о

_4_1 -.-2

О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

дни культивирования

5

а с

800

700

600

г^ 3 о 500

400

и га 300

5 о 200

100 0

ю

к

/

к

/

О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования

Рис.1. Изменение митотической активно- ной культуры, можно объяснить воспроиз-

сти (А) и динамика роста (Б) в процессе ием пэкк в ходе купального

роста в темноте на среде ЯХ неморфоген- н '

ного(1) и морфогенного (2) каллусов цикла. F.fэfarict^я^.

2. Особенности состава клеточных стенок каллусных культур гречихи татарской с разной регенерационной способностью

Клеточная стенка растений является высокоорганизованной структурой, состав которой сильно варьирует у различных видов растений, тканей и даже соседних клеток. Сравнение качественного и количественного состава клеточных стенок 1 мес. морфогенных и 2-х недельных неморфогенных каллусов гречихи татарской выявило, что в морфогенных каллусах содержание нейтральных Сахаров в пектиновой фракции всегда было выше, чем в неморфогенных, а соотношение нейтральных Сахаров к кислым было равно 3-4, тогда как в неморфогенных - около единицы (табл.1). В работе Кикучи с соавторами (МкисЫ е1 а1„ 1995) также отмечено более высокое содержание пектиновых веществ в эмбриогенных каллусных культурах моркови по сравнению с неэмбриогенными.

Таблица 1. Содержание пектинов в клеточных стенках морфогенных (МК) и неморфогенных

(НК) каллусов гречихи тата рекой.

линия гексозы, мкг/мг к.с. пентозы, мкг/мг к.с. уроновые кислоты, мкг/мг к.с. НС:УК сумма, мкг/мг к.с.

МК-3 76,61±17,05 58,60±4,57 44,24±5,93 3,06 179,45± 18,66

НК-3 36,07±3,11 46,18±1,72 75,50±4,73 1,09 157,75±2,16

МК-33 46,13±1,4 84,92±2,98 33,50±8,00 3,90 164,55±4,69

НК-2 29,99±1,84 36,59±2,10 57,07±1,21 1,20 123,65±3,41

Примечание. НС-нейтральные сахара, УК-уроновые кислоты, к.с.-кпеточная стенка.

Поскольку уроновые кислоты образуют "скелет" пектиновых молекул, а пенто-зы и гексозы - боковые цепи, то полученные нами данные могут свидетельствовать о наличии большого количества боковых ответвлений в пектиновых молекулах морфогенных каллусов. Кикучи с соавт. (ЮкисЫ е! а1., 1995) предполагают, что "обилие" нейтральных сахарных блоков может играть положительную роль в межклеточном связывании. Кроме того, есть мнение, что нейтральные сахара боковых цепочек пектиновых веществ могут препятствовать спирализации полиуронидов, затрудняющей межмолекулярные взаимодействия (Саламатова, 1983). Таким образом, разветвленная структура пектинов может усиливать их "цементирующую" функцию в срединных пластинках, способствуя тем самым усилению межклеточных контактов в клетках ПЭКК. Действительно, анализ отдельно вычлененных ПЭКК и клеток мягкого каллуса в морфогенной культуре линии 3 выявил, что во фракции пектиновых веществ клеточных стенок ПЭКК содержится большее количество нейтральных Сахаров, чем в пектиновой фракции клеток мягкого каллуса.

Анализ других полисахаридных фракций клеточной стенки выявил, что в не-морфогенных каллусах гречихи содержится в 2-3 раза больше целлюлозы, чем в морфогенных, однако по составу и содержанию гемицеллюлоз культуры практически не имели отличий. Многие исследователи рассматривают клеточную стенку растений как структуру, состоящую из двух взаимодействующих "сетей" - "сети" пектинов и "сети" целлюлозных молекул, прочно связанных с полимерами гемицеллюлоз (Jarvis et al., 1984, Brett, Waldron, 1990, Carpita, Gibeaut, 1993). Различия в составе двух каллусных культур с различным морфогенным потенциалом также могут свидетельствовать в пользу этого положения: в морфогенном каллусе больше пектинов, но меньше целлюлозы, в то время как в неморфогенном - меньше пектинов, но больше целлюлозы.

Таблица 2. Содежание феруловой кислоты, связанной сложно-эфирными связями с полимерами клеточных стенок неморфогенного (НК) и морфогенного (МК) каллусов гречихи татарской, а также отдельных тканей, составляющих МК._

линии гречихи татарской и ткани МК феруловая кислота, мкг/мг клеточной стенки

НК-3 0,145

МК-3 0,403

ПЭКК 0,497

клетки мягкого каллуса 0,054

Сравнительно недавно было выдвинуто (Fry, 1983) предположение о том, что фенольные кислоты, связанные с полимерами клеточной стенки, могут играть важную роль в регуляции растяжимости клеточной стенки, и, следовательно, размеров клеток, сшивая полимеры клеточной стенки поперечными связями. ГЖХ-анализ выявил, что в клеточных стенках морфогенного каллуса содержание феруловой кислоты выше, чем в неморфогенном (табл.2). Известно, что ПЭКК, состоящие из мелких меристематических клеток, имеют тесные межклеточные контакты. Анализ клеточных стенок отдельно вычлененных ПЭКК и клеток мягкого каллуса морфогенной культуры выявил, что высокое содержание феруловой кислоты в клеточных стенках морфогенного каллуса обусловлено тем, что именно в клеточных стенках меристематических клеток содержится больше феруловой кислоты, чем удлиненных парен-химных клетках мягкого каллуса (табл.2). Эти результаты согласуются не только с мнением, что феруловая кислота участвует в процессе растяжения клеток (Kamisaka etai., 1990; Tan et al., 1991), но и с предположением, что ферулизированные полисахариды могут быть вовлечены в агрегацию клеток (Kato et al., 1994).

Электронномикроскопические исследования, проведенные с использованием специфического окрашивания на лигнин, и автофлуоресцентный анализ выявили различную локализацию лигнина в клеточных стенках морфогенного и неморфоген-

ного каллусов. В неморфогенном каллусе лигнин локализован в срединной пластинке, в морфогенном каллусе лигнин обнаружен, главным образом, в клеточных стенках и срединных пластинках клеток мягкого каллуса, и незначительно - в углах эм-бриогенных клеток ПЭКК.

Известно, что культивируемые in vitro растительные клетки выделяют в среду культивирования полисахариды и гликопротеины, которые могут контролировать процессы их жизнедеятельности. Сравнение количества и состава зкстраклеточных белков и полисахаридов выявило, что морфогенные каллусы секретируют большее количество полимеров в среду культивирования (табл.3), при этом внеклеточные полисахариды морфогенных каллусов содержат значительные количества нейтральных Сахаров, тогда как полисахариды неморфогенных обогащены уроновыми кислотами.

Таблица 3. Содержание белков и полисахаридов, секретируемых морфогенным (МК) и не-морфогенным (НК) каллусами гречихи татарской в среду культивирования, мкг/мг клеточной стенки _ _ _ _ _ _ _

Линия Белки Сахара

гексозы пентозы уроновые к-ты сумма

МК-3 0,880±0,002 15,04±0,45 12,40+0,40 0,82±0,28 28,25±0,71

нк-з 0,330±0,007 6,56±0,47 6,78±0,33 4,81+0,51 18,15±0,98

Примечание. Уроновые к-ты - уроновые кислоты.

ГЖХ-анализ фенольных кислот, связанных с внеклеточными полимерами, выявил, что морфогенный каллус выделяет в среду культивирования полимеры, связанные в основном диферуловыми мостиками, тогда как в неморфогенном каллусе содержание диферуловой кислоты в 6 раз ниже. Общее содержание фенольных соединений, связанных с внеклеточными полимерами, было примерно в 2 раза больше в морфогенном каллусе, чем в неморфогенном.

Таким образом, каллусы гречихи татарской с различным регенерационным потенциалом отличаются друг от друга не только по цитогенетическим и морфологическим характеристикам, но и по биохимическим показателям. Морфогенные каллусы содержат большее количество пектинов, обогащенных нейтральными сахара-ми, и феруловой кислоты, связанной с полимерами клеточных стенок, причём наибольшее содержание этих веществ наблюдается в клетках ПЭКК. В неморфогенном каллусе содержится большее количество кристаллической целлюлозы. Морфогенные каллусы выделяют большее количество полимеров в среду культивирования, кроме того, содержание диферуловой кислоты, связанной с внеклеточными.полимерами выше, чем в неморфогенных каллусах. Вероятно, эти особенности морфогенных и неморфогенных каллусов лежат в основе их морфологических различий,

определяя характерные отличия клеток меристемы (мелкие размеры, плотные межклеточные контакты, способность секретировать внеклеточные полимеры, которые, могут являться регуляторными молекулами).

3. Динамика полисахаридного и полифенольного состава клеточных стенок каллусных культур в процессе роста и морфогенеза

Изученные нами особенности состава клеточных стенок отражают лишь биохимические отличия морфогенных и неморфогенных каллусов. Однако известно, что состав клеточных стенок может значительно изменяться в ходе роста и морфогенеза. Поэтому нам было интересно изучить динамику состава клеточных стенок в ходе культурального цикла и при развитии морфогенетических процессов in vitro. Мы использовали три варианта культивирования: 1. среда для роста каллусов RX, темнота; 2. среда RX, свет; 3. среда регенерации RXR, свет. Среда RX,темнота.

К 6 дню культивирования (начало фазы линейного роста) в пектиновой фракции клеточных стенок неморфогенного каллуса увеличивалось количество уронсвых кислот и снижалось содержание нейтральных Сахаров (рис.3). Японскими исследователями на примере суспензионной культуры клеток моркови было показано, что в фазу деления клеток происходит синтез высокомолекулярных пектинов, содержащих нейтральные сахара, а в фазу растяжения клеток и после нее увеличивается содержание низкомолекулярных кислых полиуронидов (Asamizu et al., 1984). Ранее этими же авторами было выявлено, что во время фазы растяжения увеличивается активность специфических гликозидаз, связанных с клеточной стенкой (Asamizu et al., 1981). Физиологическая роль этих изменений не ясна, но, по-видимому, может существовать связь между увеличением содержания уроновых кислот и "старением" ткани. Содержание лигнина и гемицеллюлоз в течение всего периода пассажа изменялось незначительно.

В морфогенном каллусе гречихи сильно варьировал и качественный, и количественный состав полисахаридных фракций в течение всего культурального цикла в темноте. Однако в пектиновой фракции морфогенного каллуса соотношение нейтральных Сахаров к уроновым кислотам всегда было выше единицы (в отличие от неморфогенного) и становилось максимальным (3:1) на 12 и 21 дни культивирования (рис.3). Кроме того, в это время происходило снижение содержания лигнина (рис.5), и эти процессы коррелировали с образованием новых ПЭКК.

а и 5 о а. го

о

5

ю

12Г 100 80 60 40 20

300 250 200 150 100 50

..И

О 3 6 9 12 15 18 21

0.3 6 9 12 15 18 21 24 27

дни культивирования

дни культивирования

—♦—1 —•—2 —А—з

—♦—1 —•—2 —А—3

Рис.2. Динамика роста неморфогенного (А) и морфогенного (Б) каллусов гречихи, культивируемых в темноте на среде 1ЧХ (1), на свету на среде ЯХ (2), на свету на среде РХР (3).

Среда ЕЧХ, свет.

Выращивание на свету (вариант 2) не изменяло морфологии неморфогенного каллуса, но вызывало частичную дифференциацию ПЭКК (образование волосквид-ных выростов и терратом) в морфогенном. В обеих культурах в первую половину пассажа свет ингибировал прирост биомассы, а затем оказывал стимулирующий эффект (рис.2). Анализ состава клеточных стенок неморфогенного каллуса выявил, что свет увеличивал содержание пектинов, гемицеллюлоз, целлюлозы и лигнина (рис.3-5). Пролонгированное по сравнению с темновым вариантом увеличение содержания пектинов, можно связать с более медленным вступлением в фазу растяжения клеток, культивируемых на свету по сравнению с их культивированием в темноте. Так, до 9 дня культивирования наблюдали логарифмическую фазу роста, с 9 по 12 - фазу линейного роста (рис.2), тогда как в 1 варианте культивирования не-морфогенный каллус вступал в фазу растяжения клеток уже после 6 дней культивирования. Известно, что свет заметно активирует ферменты фенольного метаболизма (Запрометов, 1996) и поступление субстрата в клетки и использование его в синтезе структурных полисахаридов (Лозовая, 1987), по-видимому, этим можно объяснить увеличение лигнина и гемицеллюлоз.

Однако при культивировании морфогенного каллуса на свету содержание гемицеллюлоз снижалось по сравнению с темновым вариантом. Известно, что геми-целлюлозы являются пулом запасных веществ (Родионова и др., 1996), поэтому снижение количества гемицеллюлоз в морфогенном каллусе можно связать с образованием терратом и волосковидных выростов. Содержание пектинов в морфогенном каллусе увеличивалось по сравнению с вариантом 1, при этом к концу пассажа

увеличивалась доля уроновых кислот (рис.3), что коррелировало с процессами нарушения воспроизведения ПЭКК и старения культуры. Среда ИХИ. свет

Наиболее значительные изменения в морфологии каллусов наблюдали при переводе каллусов на среду (4X14 , используемое в ней соотношение гормонов было оптимальным для индукции морфогенеза в культивируемых тканях гречихи (Румянцева и др., 1989). Морфогенный каллус на среде регенерации формировал на 6-12 день многочисленные зеленые почки и активно наращивал биомассу (рис.2). Геммогенез сопровождался активным синтезом пектиновых молекул, снижением ге-мицеллюлоз (как и в варианте 2 при образовании терратомных почек) и увеличением целлюлозы (рис.3,4).

Культивирование неморфогенного каллуса на среде с БАП приводило к снижению скорости роста по сравнению с каллусом, выращиваемым на среде 1ЧХ (рис.2). Неморфогенный каллус становился более плотным, размеры клеток уменьшались в два раза, при этом дифференцировки (даже на уровне гистогенеза) не наблюдали. К 21 дню культивирования неморфогенный каллус полностью дегенерировал и погибал. Следует отметить, что содержание пектинов и гемицеллюлоз в клеточных стенках неморфогенного каллуса к 6 дню культивирования резко увеличивалось, а затем резко падало (рис.3, 4). Процесс уплотнения ткани неморфогенного каллуса сопровождался увеличением содержания лигнина (рис.5) и повышением активности ковалентно-связанной пероксидазы. Можно предположить, что в данных условиях культивирования в неморфогенном каллусе возникает несбалансированность между биосинтезом лигнина и активной поверхностью для его отложения в виде полисахаридных матриц в клеточной стенке. Накапливаясь в избыточном количестве промежуточные продукты синтеза лигнина могли привести к дегенерации и гибели культуры. Кроме того, к концу пассажа неморфогенного каллуса резко падало содержание нейтральных Сахаров и увеличивалась доля уроновых кислот во фракции пектинов (рис.3), что также совпадало с процессами старения и деградации ткани. Известно, что во время деградации активируются многие гидролитические ферменты, что приводит к изменению структуры клеточной стенки. Вероятно, при длительном культивировании неморфогенного каллуса на среде с БАП также может происходить деградация матриксных полимеров клеточных стенок.

О 3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования

-♦- 1 -»-2 —1—3 -*-4

О

О 3 6 91215 18 21 2427 дни культивирования -♦-1 -»-2 —ж—3 -Х-4

3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования —♦—I —9—2 —а— 3 —X—4

250 200 150 100 50 t^

.0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования —1 —•—2 —А—3 X 4

g.5 . 150 я-с Ч

Я I * 100

0 3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования -♦-1 —2 —а— 3 —X— 4

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования -♦-1 —ф—2 —а—3 —X—4

Рис.3. Моносахаридный состав пектиновых фракций клеточных стенок неморфоген-ного (А) и морфогенного (Б) каллусов гречихи, культивируемых в различных условиях: I - в темноте на среде RX; II - на свету на среде RX; III - на свету на среде RXR; 1- гексозы; 2- пентозы; 3- уроновые кислоты; 4- сумма пектиновых полимеров

400

350

300"

о

eg SC 250

а га X La S 200

ге и "с ж 150,

2 100

50 t

0 1

О 3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования

♦—1 —•—2 —а—з х 4

3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования —♦—1 —в—2 —ж—3 X 4

Б

О 3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования —♦—1 —»—2 —А— 3 —4

А

3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования . — ♦—1 —•—2 —а—3 >( 4

Б

О 3 6 9 12 15 18 21 дни культивирования -♦—1 —•—2 —а—3 X 4

3 6 9 12 15 18 21 24 27 дни культивирования

—♦ —1 —•—2 —4—3 X 4

Рис.4. Моносахаридный состав гемицеллюлозных фракций клеточных стенок не-морфогенного (А) и морфогенного (Б) каллусов гречихи, культивируемых в различных условиях: I - в темноте на среде RX; II - на свету на среде RX; III - на свету на среде RXR; 1- гексозы; 2- пентозы; 3- уроновые кислоты; 4- сумма полимеров

А

1,2

1

• 0,8

0,6

0,4

0 3 6 9 12 15 18 21

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

дни культивирования

дни культивирования

—1 —»—2 —а—з

—♦—1 —»—г —а—з

Рис.5. Динамика относительного содержания лигнина в клеточных стенках неморфогенного (А) и морфогенного (Б) каллусов, культивируемых в темноте на среде 1ЧХ(1), на свету на среде [ЧХ (2), на свету на среде (3)

Поскольку в описанном опыте мы фиксировали вегетативные почки и каллус вместе, то в следующем опыте, провенном с двумя морфогенными культурами, мы использовали раздельную фиксацию каллусной ткани с регенерировавшими почками и каллусной ткани, не образовавшей вегетативные почки. Анализ полисахаридно-го состава клеточных стенок выявил, что именно в каллусах с зелеными участками содержится много пектинов, обогащенных нейтральными сахарами. Таким образом, можно предположить, что БАП ощутимо влияет на синтез матриксных полисахаридов (главным образом, пектинов) клеточных стенок именно тех клеток, которые дифференцировались, но не клеток каллуса, который поддерживал процесс преобразования ПЭКК в вегетативные почки и побеги.

Подводя итоги, можно заключить, что в процессе роста каллусных культур происходят изменения во всех изученных нами (полисахариды, лигнин) компонентах клеточной стенки и эти изменения зависят от особенностей воспроизведения тканей, составляющих эти культуры. Так, в неморфогенном каллусе, состоящем только из паренхимных клеток и увеличивающим биомассу, главным образом, за счет роста клеток растяжением, изменения в полисахаридном составе клеточных стенок происходят только в период активного деления клеток. В морфогенном каллусе процессы дифференциации клеток (новообразование ПЭКК) сопровождались увеличением соотношения нейтральных Сахаров к кислым в пектиновой фракции и снижением содержания гемицеллюлоз и лигнина, при этом нами было показано, что именно клеточные стенки ПЭКК содержат меньше лигнина и больше пектинов, обогащенных

нейтральными сахарами. Морфологические изменения неморфогенного каллуса (уменьшение размеров клеток и уплотнение ткани) сопровождались изменением в содержании матриксных полисахаридов и резким увеличением лигнина, при этом никакого морфогенетического ответа (даже на уровне гистогенеза) обнаружено не было. В то время как в морфогенном каллусе образование волосковидных выростов и терратом (культивирование на свету) или геммогенез (культивирование на среде с БАП) сопровождалось увеличением содержания пектинов и уменьшением гемицел-люлоз.

5. Влияние ингибиторов цитоскелета на морфологию каллусных культур, состав их клеточных стенок и состав внеклеточных полимеров

В последние годы большое внимание уделяется изучению взаимодействия цитоскелета и клеточной стенки в процессах дифференциации клеток. Одним из подходов при изучении таких взаимодействий является ингибиторный анализ. Известно, что колхицин, связызаясь с гетеродимерами, препятствует полимеризации микротрубочек цитоскелета. При воздействии достаточно мощных доз колхицина (0,1-1мМ) уже на 2-3 сутки исследователи наблюдали изменение формы клеток и дальнейшую дезагрегацию суспензионных и каллусных культур (Hayashi, Yoshida, 1988, Borkird, Sung, 1991). Мы наблюдали аналогичный эффект при культивировании морфогенных каллусов на среде с 0,25мМ колхицином. Клетки принимали сферическую протопластоподобную форму, каллусы становились более рыхлыми. Уже к 7 дню культивирования на среде с колхицином процент каллусов с ПЭКК снижался со 100 до 25?уа к 21-30 дню практически был равен нулю. Наряду с морфологической увеличивалась и цитогенетическая гетерогенность каллусов. В культурах, выращиваемых на среде с колхицином, было отмечено увеличение полиплоидных и анеуп-лоидных клеток, а также - хромосомных нарушений, в том числе наличие большого количества микроядер в обеих культурах. Это свидетельствует о том, что 0,25мМ колхицин оказывал воздействие на митоз и цитокинез в каллусных культурах гречихи татарской.

Как показывают наши результаты 20-дневное культивирование на среде с 0,25мМ колхицином привело к достоверному снижению (1=0,99) выхода клеточных стенок из ткани морфогенного каллуса, кроме того, происходили существенные изменения в составе самих клеточных стенок морфогенных каллусов. Наблюдали снижение количества пектинов (главным образом, за счет изменений в содержании нейтральных Сахаров) (рис.6) и тенденцию к увеличению доли гемицеллюлоз и целлюлозы. При культивировании неморфо-генного каллуса на среде с колхицином мы не наблюдали каких-либо изменений в составе клеточных стенок (рис.6). Возможно, это связано с тем, что микротрубочки разных клеток (паренхимные, мери-стематические) и микротрубочки, участвующие в разных процессах в клетке, имеют разную стабильность (С1еагу, Ногс)тап, 1988). Показано, что предшественники клеточной стенки транспортируются в цистернах и пузырьках аппарата Гольджи к месту синтеза клеточной стенки, где происходит Са2+-зависимый процесс слияния мембран. Движение везикул направляется микротрубочками, при этом число везикул в цитоплазме превышает число сливающихся везикул, следовательно, скорость слияния везикул может являться процессом, регулирующим секрецию компонентов клеточной стенки (МоП11со1е, 1984).

Известно, что нейтральные сахара, которые образуют боковые цепочки пектиновых молекул и участвуют в межклеточных взаимодействиях (ЮкисЫ е1 а1., 1995), присоединяются к галактуроновой оси в последнюю очередь в пузырьках аппарата Гольджи или даже непосредственно в клеточной стенке (в(асЬе1т а1., 1990). Возможно, что нейтральные сахара пектинов при разрушении микротрубочек фрагмо-пласта выделяются в среду культивирования. Интересно, что в неморфогенном каллусе, в котором агрегация клеток и межклеточные взаимодействия ослаблены, изменений в составе матриксных полисахаридов при культивировании с колхицином не наблюдали. Таким образом, можно предположить, что разрушение (или недостаточное количество) микротрубочек, ответственных за транспорт пектиновых молекул, может быть одной из причин ослабления межлеточных контактов в морфоген-

Рис.6 Влияние колхицина на содержание пектинов в клеточных стенках неморфогенных (НК) и морфоген-иых (МК) каллусов гречихи татарской. 1 - гексозы, 2 - пентозы, 3 - уроновые кислоты.

ных культурах, культивируемых на среде с 0,25мМ колхицином, и может лежать в основе морфологических изменений клеток, приводящих к снижению морфогенного потенциала каллусных культур.

Нами было отмечено, что при выращивании морфогенного каллуса на среде с колхицином через 20-30 дней на среде культивирования вокруг кусочков каллуса

образуются желто-коричневые ореолы, однако при культивировании неморфогенного каллуса на среде с колхицином образования таких ореолов не наблюдали. Анализ внеклеточных полимеров выявил, что морфогенный каллус при выращивании на среде с колхицином выде-

Рис.7 Влияние колхицина на содержание внекле- ляет большее количество полиметочных полисахаридов, продуцируемых неморфо-

генными(НК) и морфогенными (МК) каллусами Ров в среду культивирования, чем

гречихи татарской. при культивировании на среде без

колхицина (табл.4, рис.7). Количество внеклеточных полимеров, выделяемых не-морфогенным каллусом, было значительно меньшим по сравнению с морфогенным и при культивировании на среде с колхицином снижалось. Анализ гидролизатов внеклеточных полимеров морфогенного каллуса позволил выявить, что при культивировании на среде с колхицином, морфогенный каллус выделяет полимеры с высоким содержанием нейтральных Сахаров.

Таблица 4. Влияние колхицина на содержание белков, секретируемых морфогенным (МК) и неморфогенным (НК) каллусами в среду культивирования _

Линия Содержание экстраклеточных белков, мкг/мг клеточной стенки

1 2

МК-3 0,880±0,002 1,700±0,102

НК-3 0,330+0,007 0,163±0,005

Примечание. 1- среда Р?Х; 2- среда КХ с 0,25мМ колхицина.

Однако, поскольку количество нейтральных Сахаров в полимерах, выделяемых в среду культивирования морфогенным каллусом под действием колхицина было значительно большим, чем их уменьшение в клеточной стенке, мы предположили, что часть нейтральных Сахаров может иметь гликопротеиновое происхождение. К ним в первую очередь могут относиться обогащенные нейтральными сахарами арабиногалактановые белки, которые локализованы преимущественно на поверхности клеток, в межклетниках и срединной пластинке. Анализ содержания белков, выделяемых в среду культивирования каллусами, позволил выявить, что на среде с

В контроль О опыт

колхицином морфогенный каллус выделяет большее количество белков, чем в контроле, неморфогенный же каллус на среде с колхицином секретирует даже меньшее количество белков, чем на среде без колхицина. Недавно было показано, что араби-ногалактановые белки являются регуляторными молекулами, необходимыми для формирования ПЭКК (Kreuger, van Holst, 1993): С помощью электронной сканирующей микроскопии получены прямые доказательства того, что ПЭКК покрыты хорошо развитой сетью веществ экстраклеточного матрикса (Samaj et al., 1995), в которых существенная роль отводится арабиногалактановым белкам (Samaj et al., 1997).

Б заключение хочется отметить, что при разрушении микротрубочек антими-тотическими ядами, как и в результате холодового воздействия, могут "освобождаться" факторы транскрипции, включающие работу специфических генов (Rosette, Karin, 1995). В нашем случае это могут быть гены каких-либо специфических ферментов (например, гликозидаз), "отщепляющих" нейтральные сахара от молекул пектинов и/или гликопротеинов. Изменения в структуре этих полимеров приводят к нарушению межклеточных взаимодействий: разрушению срединных пластинок и экстраклеточного матрикса, следствием чего является формирование сферических клеток, исчезновение ПЭКК и разрыхление морфогенного каллуса. На наш взгляд, дальнейшее изучение взаимодействий элементов цитоскелета и клеточной стенки является необходимым для понимания молекулярно-кпеточных основ морфогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Показаны морфологические и цитогенетические различия между каллусами с различной регенерационной способностью. Морфогенный каллус состоит из ПЭКК и клеток мягкого каллуса, неморфогенный - только из паренхимных, сильно вакуо-лизированных клеток. Основной хромосомный класс морфогенного каллуса является диплоидным, в то время как клетки неморфогенного каллуса имеют хромосомные числа от п до 8п.

2. Выявлены различия в составе клеточных стенок каллусов с различной регенерационной способностью. Морфогенные каллусы содержат большее количество пектинов, обогащенных нейтральными сахарами, и феруловой кислоты, связанной с полимерами клеточных стенок, причем наибольшее содержание этих веществ наблюдается в клетках ПЭКК. В неморфогенном каллусе содержится большее количество кристаллической целлюлозы.

3. Впервые показано, что морфогенный каллус выделяет в среду культивирования большее количество полисахаридов и белков, чем неморфогенный. Анализ внеклеточных полисахаридов выявил, что в морфогенном каллусе внеклеточные полисахариды обогащены нейтральными сахарами и связаны большим количеством диферуловой кислоты.

4. Выявлено относительно равномерное распределение лигнина в клеточных стенках неморфогенного каллуса (срединные пластинки). В морфогенном каллусе лигнин обнаружен в углах клеточных стенок проэмбриогенных клеточных комплексов и в клеточных стенках и срединных пластинках клеток мягкого каллуса.

5. Выявлено, что культивирование каллусов на свету на каллусогенной среде вызывает увеличение содержания пектиновых веществ в обоих типах каллусов, свет также стимулировал образование гемицеллюлоз, целлюлозы и лигнина в немор-фогенном каллусе.

6. Образование вегетативных почек и побегов при выращивании морфогенного каллуса на среде с БАП сопровождалось увеличением содержания пектиновых веществ и снижением количества гемицеллюлоз.

7. Обнаружено, что культивирование неморфогенного каллуса на свету на среде регенерации вызывало изменение в морфологии и скорости роста культуры, что сопровождалось усилением лигнификации каплусных тканей и кратковременным увеличением количества матриксных полисахаридов, однако морфогенетического ответа даже на уровне гистогенеза не наблюдали.

8. Изучение спектров различных форм пероксидаз выявило корреляцию усиления синтеза лигнина в неморфогенном каллусе с существенным увеличением активности ковалентно-связанной пероксидазы.

9. Впервые показано, что нарушение межклеточных контактов и разрыхление ПЭКК при культивировании морфогенного каллуса на среде с 0,25 мМ колхицином может быть связано с изменением структуры пектинов и гликопротеинов экстраклеточного матрикса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Федосёева Н.В., Самохвалова H.A., Яблоков'а Е.А. Биохимические и цитоморфологические особенности культивируемых каллусов растений с разной способностью к морфогенезу// Цитология.- 1996.- Т.38.- №2,-С.244-245.

2. Valieva A.l„ Ryzhkov S.A., Rumyantseva N.I. Differences in cell wall composition between buckwheat morphogenic and nonmorphogenic calli// Abstr. of Annual symp. "Physical-chemical basis of plant physiology".- Penza, 1996,- P.75-76.

3. Валиева А.И., Румянцева Н.И. Особенности полисахаридного и полифенольного состава клеточных стенок каллусов с различным морфогенным потенциалом// Тез. II Республик, конф. молодых ученых и специалистов.- Казань, 1996.- С.52.

4. Rumyantseva N.. Vaiieva A., Samokhvalova N., Ryzhkov S., Yablokova E. Lignin changes in buckwheat callus influenced by various culture conditions// Abstr. of 10th FESPP Congress "From molecular mechanism to the plant: an integrated approach".-Florence, Italy, 1996,- P.15-16.

5. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Мухитов A.P., Лукина Ю.А., Лозовая В.В. Влияние колхицина на полисахаридный состав каллусов с разной морфогенной способностью//Тез. докл. II съезда Биохимического общества^ Москва, 1997, ч.И,- С.529-531.

6. Валиева А.И., Мухитов А.Р., Румянцева Н.И. Особенности роста и динамика полисахаридного состава клеточных стенок морфогенного каллуса татарской гречихи//

ч

Тез. докл. VI Молодежи, конф. ботаников,- С.-Петербург, 1997. С.45-46.

7. Валиева А.И., Румянцева Н.И. Влияние света на полисахаридный состав клеточных стенок каллусов татарской гречихи // Тез. докл. VI Молодежи, конф. ботаников.- С.-Петербург, 1997. С.46.

8. Валиева А.И., Румянцева Н.И., Лозовая В.В. Динамика полисахаридного состава клеточных стенок каллусов татарской гречихи с различным морфогенным потенциалом // Сб. статей IV Всероссийской конф. "Структура и динамика молекулярных систем",- Йошкар-Ола - Казань-Москва, 1997, Ч.З.-.С.56-60.

9. Rumyantseva N.. Valieva A., Mukhitov A., Lukina Yu., Lozovaya V. The influence of colchicine on cell .wall composition of calli with different morphogenic ability// Abstr. of Symp. Molecular Biology for agriculture.- Ceske Budejovice, 1997,- P.93.

10.Rumyantseva N., Valieva A., Samokhvalova N., Mukhitov A., Ageeva M., Lozovaya V. The peculiarities of lignification of cell walls of buckwheat calli with different morphogenic ability// Abstr. of VII Intern. Conf. " In vitro plant cells biology, biotechnology and germplasm preservation".- Moskow, 1997. P.160.

11.Валиева А.П., Румянцева Н.И. Полисахаридный состав клеточных стенок каллусов в процессе морфогенеза // Тез. Ill Республик, конф. молодых ученых и специалистов,-Казань, 1997.

12.Румянцева Н. И., Валиева А. И., Самохвалова Н. А., Мухитов А. Р., Агеева М. В., Лозовая В. В. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу// Цитология, в печати.