Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ТКАНИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ, УСТОЙЧИВЫХ К КИСЛЫМ ПОЧВАМ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ТКАНИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ, УСТОЙЧИВЫХ К КИСЛЫМ ПОЧВАМ"

Я-Ъ З^Л

На правах рукописи

ЩУПЛЕЦОВА Ольга Наумовна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ТКАНИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ, УСТОЙЧИВЫХ К КИСЛЫМ ПОЧВАМ

Специальность: 03.00.23 — биотехнология 06.01.05 — селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в лаборатории генетики Зонального научно-исследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого,

Научные руководители: доктор биологических наук, академик РАСХН профессор B.C. Шевелуха; доктор сельскохозяйственных наук, член-корреспондент РАСХН H.A. Разина.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.ВЗагос-кнна, кандидат сельскохозяйственных наук В.А. Мнхкельман.

Ведущая организация—Научно-исследовательский институт сельского хозяйства центральных районов Нечерноземной зоны Российской Федерации.

Зашита диссертации состоится «_»_2003 г. в_

часов на заседании диссертационного совета Д. 220.043,10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49, отдел защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г. И. Карлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одним из неблагоприятных факторов в Нечерноземной зоне является повышенная кислотность почв, негативное влияние которой на урожай сельскохозяйственных культур усиливается наличием в этих почвах подвижного алюминия, дефицитом азотного и фосфорного питания, а также низким уровнем естественного плодородия. Площадь кислых почв в этой зоне России составляет 40 млн. га сельскохозяйственных угодий или 80 % от обшей площади пашни. Из всех основных зерновых культур ячмень больше всего подвержен алюмоки слому стрессу.

Отрицательное действие алюминия сказывается па важнейших процессах жизнедеятельности растений: нарушается корневое питание растений, на клеточном уровне алюминий вытесняет кальций, нарушая тем самым целостность клеточных мембран, подавляется митотическая активность клеток корня, снижается интенсивность дыхания и т. д.

Одним из рациональных путей снижения негативного влияния токсичности кислых почв является создание толерантных сортов, способных противостоять стрессовым факторам. Перспективным путем создания сортов, устойчивых к ионам НГ и А11+ является клеточная селекция, благодаря повышенной чувствительности изолированных тканей к указанным факторам к резкому повышению уровня наследственной изменчивости.

В настоящее время разработаны эффективные методы получения и культивирования каллусных линий с последующей регенерацией растений для многих сельскохозяйственных культур, имеющих хозяйственно-ценные признаки. Однако зерновые культуры, среда них особенно ячмень, трудно поддаются культивированию и регенерации in vitro.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание исходных форм ярового ячменя, устойчивых к алюмоки слому стрессу методом клеточной селекции и использование их в классической селекции.

Для достижения поставленной цели-необходимв-быя^ решить следующие

„М11Ц, ЦИБ МСХА

задачи! ч __..

[юнд "аучнойритвратуры

• оптимизировать условия культивирования каллусных культур и получения регенерантов ячменя in vitro;

- определить летальные и сублетальные концентрации ионов водорода и алюминия на каждом из этапов развития каллусной кулыуры;

- разработать метод отбора устойчивых к алюмокислому стрессу каллусных л и кий ячменя;

- оценить адаптивную и ре генерационную способность каллусных линий различных генотипов в селективных условиях;

- получить алюмотолерантные регенерангы и оценить их в лабораторных, вегетационных и полевых опытах;

- использовать алюмотолерантные регенераты ячменя в селекции этой культуры;

Научная новизна. Разработали и предложены методы оценки адаптивной и ре генерационной способности каллусных линий различных генотипов ячменя. Установлены летальные и сублетальные концентрации ионов Н* и Al3* на всех этапах развития каллусной культуры. Предложена оптимальная схема для отбора алюмотолерантных каллусных линий и получения растеннй-регенерантов в массовом количестве. Изучено влияние различных концентраций и кратности внесения ионов алюминия в культуре in vitro на количественные признаки полученных регенерантов. Выявлено, что повторная регенерация ячменя из каллусной ткани на селективной алюмокислой среде обеспечивает существенное повышение устойчивости регенерантов к ионам водрода и алюминия. Показано преимущество регенерантов in vivo по степени адаптнрован-ности к неблагоприятным условиям по сравнению с растениями исходных сортов и гибридов.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработан метод отбора алюмоустопчивых каллусных линий ячменя. Получены в массовом количестве устойчивые к ионам Н* и Al1* регенерангы ярового ячменя как исходный материал для последующей селекции. Предложены к использованию различные схемы отбора каллусной культуры в зависимости от

особенностей генотипа в дальнейших селекционных задач. Выявлено влияние жестких ,схем клеточной селекции на хозяйственно-ценные признаки регене-рантов. Выделены и переданы селекционерам Северовосточного НИИСХ перспективные по устойчивости к ионам Н* н А13+ рсгенерантные линии ячменя.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию НПО "Татарстан" (Казань, 1995), на 3-м Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пушнно, 1995), на научно-практической конференции "Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы" (Киров, 2001), на международной научно практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения академика Н.В. Рудницкого (Киров, 2002).

Публикации« По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов н методов исследования, а также из пяти глав экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 119 страницах машинописного текста, включая 27 таблиц и 17 рисунков и фотографий. Список использованной литературы включает 204 наименования, из которых 117 зарубежной литературы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились с 19S9 по 2002 год вЗНИИСХ Северо-Востока (г. Киров). В качестве неходкого материала для исследований были использованы сорта и гибриды ячменя, предоставленные лабораторией селекции и первичного семеноводства ячменя. Выбор объектов происходил с учетом рекомендаций селекционеров и определялся перспективностью в селекционном отношении. Использовались как устойчивые, так и неустойчивые формы, обладающие комплексом хозяйственно-ценных признаков, но снижающих продуктивность в условиях повышенного содержания в почве ионов водорода и алюминия. В работе было использовано около 50 гнбридоп и сортов ярового ячменя отечественной и зарубежной селекции. Эксплэнтами для получения каллусов

служили незрелые зародыши, изолированные на 12-16 лень после опыления. Культивирование каллусов проводили поэтапно на четырех средах, имеющих общую минеральную основу по прописи Мурасиге и С куга (МБ), но различающихся фитогормональным составом. Индукцию первичной каллусной ткани осуществляли в течение 2-4 недель на среде Мв с добавлением 2,4-Д в концентрации 2-8 мг/л. Для увеличения общей биомассы кадлусную ткань пассировали на свежую среду МЭ со сниженным содержанием 2,4-Д до I мг/л. Для регенерации растений каллусные культуры в возрасте 5-7 недель переносили на среду того же минерального состава, но содержащей следующие фито гормоны: I мг/л кинетина или зеатина, 0,5 мг/л р-индолилуксусной кислоты, 0,1 мг/л гиб-берелловой кислоты. После достижения регенерантамн высоты 2-3 см, растения переносили на среду С 0,5 нормы минеральных солей и не содержащую фито-гормоны. В фазе 2-3 листьев регенеранты высаживали в сосуды с почяосмесью и помещали в хлимакамеру с заданным режимом.

Для создания фона, имитирующего токсические условия кислых почв, в среду с низким уровнем рН дополнительно вводили, на различных этапах развития каллусных линий, сульфат алюминия - А13($С>4)) х 18 Н;0 в заданных конце1ГГрациях. Уровень кислотности варьировал в пределах: от 3,0 до 6,0 рН. Плотную или желеобразную среду получали, используя смесь агара и желатина (6 г и 12 г соответственно), которая желировалась в кислых условиях. При огборе устойчивых клеточных линий на алюмотолерантность применяли различные схемы (табл.1).

Оценка полученных регенераитоа на устойчивость к ионам Н и Л1 проводилась в водной культуре, в вегетационных и полевых опытах, в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории селекции и первичного семеноводства ячменя ЗНИИСХ Северо-Востока (родина, 1995; Родина, Солодянкнна, 1999).

Таблица 1

Условные обозначения схем отбора алюмотолерактних каллусных линий

Схема селективного отбора Концентрация ионов AlJi на питательных средах, мг/л

MS I MS 2 MS 3

мг/л мМ мг/л мМ

К-20-К без селективного агента 20 0,74 0 0

К-40-К 40 1,48 0 0

К-К-40 0 0 40 1,48

К-40-40 40 1,48 40 1,48

К-40-20 40 1,48 20 0,74

К-20-40 20 0,74 40 1,48

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1 .Оптимизация условий культпвировання каллусных лиши! и получений регенерантов ячменя in vitro

Hi литературных источников известно, что на процессы каллусогенеза и морфогенеза влияет размер, вочраст, генотип первичного экспланта; условия культивирования каллусных культур и регенерантов. На начальном этапе проведенных исследований выявлен оптимальный размер эксплантнруемых зародышей (1-М мм), что соответствует 12-16 дню после их оплодотворения; установлена сортоспецифнчность реакции изученных генотипов на изменение гормонального состава среды; сокращена на 15-38 дней продолжительность вегетационного периода регенерантов ячменя в зависимости от скороспелости до-норных растений.

2.Выявление зависимости показателей выживаемости и регс не рационных процессов каллуса ячменя от концентраций ионов Н* и А Г3* на селективных средах Клеточную селекцию начинали с определения летальных и сублетальных концентраций селективного агента в среде. Учитывая биологию кол л у си ой культуры были выделены 3 этапа ее развития: I) индукция; 2) пролиферация; 3) морфогенез. На каждом из этапов была экспериментально определена летальная и сублетальная концентрация нонов Н* и А13*.

Исследования 18 генотипов показали, что при Культивировании изолированных зародышей непосредственно на селективной среде наблюдалось формирование каллусной ткани с сильной оводненностью клеток. Данная каллус-ная ткань характеризовалась в среднем низким уровнем выживаемости (9,27%) и морфогенеза (13,95%) даже в щадящих селективных условиях (АЗ3* 20 мг/л, рН 4,5). Учитывая трудность получения морфогенного каллуса при эксплактировании зародышей сразу на селективную среду - целесообразно создавать стрессовые условия лишь на среде 2, предварительно накопив определенную каллусную биомассу. Л инициацию первичного каллуса следует проводить на питательных средах с нейтральным уровнем рН при отсутствие ионов А1'\

Существенное повышение порога чувствительности к А1-кислому стрессу наблюдалось на втором этапе развития тканевой культуры уже при наличии индуцированного каллуса.

Изучение кислотности среды на развитие каллусиых клеток ячменя проводилось на сорте Эколог, который является самым распространенным по Кировской области (табл.2). Не обнаружена прямая зависимость репарационной способности выживших каллусов от кислотности среды при наличии в ней ионов А1,+.

Таблица 2

Влияние кислотности среды и различной концентрации ионов А1и на жизнеспособность каллусов и регенерацию побегов сорта Эколог

рН А1* мг/л мМ Пассировано каллусов, шт. Выживаемость, % Регенерация, %

6,0 0 0 103 603 25.0

20 0,74 68 43,8 41,6

4,5 30 1.11 69 38,8 24.5

40 1,48 95 36,8 23,2

20 0.74 90 41.5 48,9

4,0-3,8 30 1,11 79 22,0 50,0

40 1,48 90 13,2 24,7

20 0,74 50 7,1 4.8

3,7-3,3 30 1,И 77 1,3 8.6

40 1,48 63 0 0

3,2 и ниже 20 0,74 58 0 0

30 1,11 54 0 0

При постеленном понижении pH от нейтральных значений до 3,3 в присутствии 20-40 мг/л ионов Л!3*, гибель каллусов возрастала от 39,7 до 100%. Несмотря на то, что в диапазоне кислотности 3,7-3,3 выживали отдельные кал-лусные линии (1,3-7,1%). этот уровень кислотности лельзя считать допустимым для отбора, т. к. в этом случае выживало недостаточное для дальнейшего проведения селекции количество каллусных линий.

Оптимальным для отбора уровнем кислотности для сорта Эколог являлся диапазон pH 3,8-4,0. В этих условиях выживало от 13 до 41% каллусных линий в зависимости от концентрации ионов Л13* в среде.

Аналогичные результаты были получены при изучении других i-енотнпов. Уровень кислотности, при котором выживало приемлемое для отбора количество каллусов, совпадал с выявленной экспериментальной кислотностью для сорта Эколог (pH 3,8-4,0).

После определения летального и сублетального уровней кислотности для проведения дальнейших исследований было необходимо выявить рабочие концентрации ионов Л!'* при выявленном pH 3,8-4,0. Была проведена оценка выживаемости и способности к морфогенезу на селективной среде шести контрастных по алгомоустойчнвости генотипов ячменя в диапазоне концентраций ионов алюминия от 0 до 42 мг/л при pH 3,8-4,0. Графики зависимости выживания от концентрации в среде ионов алюминия на основе двулетних наблюдений (рис.1) показывали индивидуальный характер реакции на стресс каждого генотипа. С увеличением селективной нагрузки прослеживалась обшая тенденция к снижению доли выжившего каллуса. Для большинства генотипов летальная доза ионов алюминия составила 40-42 мг/л. 50%-ная гибель каллусной ткани наблюдалась, где стресс-фактор присутствовал в концентрации от 0 до 36 мг/л.

Каллусные линии алюм©устойчивого генотипа Keystone х 457-69 сохранили высокую выживаемость при селективной нагрузке 36 мг/л Л1'\ У генотипов 1357-80 х SV66905, SV66905 х Икар (алюмоустойчивые) и Lulu х Conrad (алюмочувствительный) отмечена 50/о-ная гибель клеток при 20-24 мг/л AIJ\ У

о • « ia м и м «

AJ, »иггл

О

«

« 11 » 30 М «I

At,nrltn

Рис. i. Выживаемость каллуса ячменя на селективных средах с различными концентрациями ионов А1 :

А - Keystone х 457-69; D - Lulu х Conrad

В- 1357-80 xSv 66905; Е - Valeta х Litlu

С - Sv 66905 х Икар; F - Выбор

алюмочувствительных генотипов Valletta х Lulu и Выбор, даже в контрольных условиях, погибало более половины каллусной ткани. При невысоких (10-20 мг/л) дозах ионов A1J* в среде у генотипов Keystone х 457-69 и 1357-80 х SV66905 наблюдался эффект стимуляции: повышение в 1,6-1,9 раза выживаемости каллуса по сравнению с контролем.

Таким образом, каллусные культуры, индуцируемые сортами контрастными по алюмоустойчивости в полевых условиях, сохранили генотипическую реакцию на стресс в культуре in vitro.

Все тесть изученных генотипов обладали способностью к регенерации в селективных условиях (рис. 2). Прямой зависимости регенерационной способности or концентрации в среде А1,+ не выявлено. Выжившие в селективных условиях каллусные линии большинства генотипов сохранили эту способность в градиенте концентраций от 0 до 40 мг/л, а генотипы 1357-80 х SV66905 и Выбор от 0 до 30-36 мг/л ионов Л1'\ Два генотипа проявили резкое усиление мор-фогенетнческого потенциала при 30 мг/л Л1'" по сравнению с контролем: Valetta х Lulu - почти в 10 раз и Lu!ti х Conrad в 2 раза. Вероятно, н данном случае имеют место геномные изменения мутационного характера в условиях сильного стресса, повлекшие за собой положительные изменения такого признака, как способность к морфогенезу.

Проведение селективного отбора на этапе дифференцированного роста (на среде MS 3) привело к существенному снижению морфогенного потенциала каллусной ткани. Выход регенератов в зависимости от концентрации в среде ионов AI5* снижался в среднем по сортам на 2,8-10,1% по сравнению с контролем. Даже случаи ризогенеза в селективных условиях отмечены в 7-12 раз реже, а гибель каллуса в сравнении с контролем возросла в 2-10 раз. Проведение селективного отбора иа уровне дифференцированного роста каллуса показало, что в присутствие 10-20 мг/л ионов AI'* гибнет 45-49% клеточных популяций, что позволяет считать эту концентрацию ионов AI** сублетадьной на этапе морфогенеза ячменя. Введение в селективную среду более высоких концентраций (30-40 мг/л) ионов AtJ* приводило к некротизации каллу сных линий и пол-

Ig- 100

§ б во

Н 60 Ii«

го

bf^VrfST,

Т.Т .Т. I

О Ю 14 20 24 30 40 42

AI» мг№

I*100 ?? ю

,.,1 ,1 -г т

—f-S—

11 II и

3« Л М,мг(п

Рис. 2. Реген^рационная способность каллуса некоторых генотипов ячменя на селективных питательных средах с различными концентрациями ионов AI3':

А - Keystone х 457-69; D - Lulu х Conrad

В - 1357-80 х Sv 66905; Е - Valeta х Lutu

С - Sv 66905 х Икар; F - Выбор

to

ностью ингибировало регенераннонные процессы в культуре ткани. В результате данного исследования были подобраны оптимальные границы концентраций селективного агента, при которых возможно проводить отбор устойчивых каллус ных линий в достаточном количестве с дальнейшей регенерацией растений на каждом этапе развития каллусных культур:

Первый этап - А11*-20 мг/л, рН 4,5.

Второй этап - А15*-36-40 мг/л, рН 3,8-4,0.

Третий этап - А13+-10-20 мг/л, рН 3,8-4,0.

3.Оптимизации селективных сред с различными концентрациями ионов Н* и А11* для отбора алюмоустойчнвых каллусных культур при различных схемах отбора

С целью оптимизации схемы отбора алюмоустойчивых каллусных линий изучено 7 различных вариантов селективных сред. Средние значения выживаемости и ре генерационной способности в виде диаграммы представлен ы на рисунке 3 (условные обозначения в таблице I).

Создание мягких селективны* условий на втором этапе (К-20-К) практически не снижало выживаемость при падении регенерационной способности в сравнении с контролем в 1,5 раза.

Повышение концентрации ионов А13' в среде в два раза (К-40-К) увеличивало гибель каллусных линий в 2 раза при незначительном снижении регенерационной способности по сравнению с предыдущим вариантом.

Введение на третьем этапе селективного агента высокой концентрации 40 мг/л - (К-К-40) приводило к полной утрате регенерационной способности при невысоком уровне выживаемости.

При двукратном воздействии стресса при постоянном его уровне (К-40-40) выживало чуть менее половины каллусов, количество образовавшихся регенератов не превышало 30% от контроля. В случае ступенчатого лониження селективного давления (К-40-20) уровень выживания вдвое превышал предыдущий вариант при самой высокой регенерационной способности исследуемых

11

вариантов. Ступенчатое повышение стресса (К-20-40) приводило к полной утрате регенерационной способности.

^ 70 -,

Фоны по А1

Рис.З-а. Средняя выживаемость каллусных линий генотипов ячменя при различных фонах по А1л*

ОонЫ по А13*

Рис.З-б. Средняя регснерационная способность каллусных линий генотипов ячменя при различных фонах по А1

Таким образом, сравнительная оценка эффективности различных схем селективного отбора для ряда генотипов показала, что оптимальным вариантом для получения растений-регенерантов является двукратный отбор на средах с

алюминием в сублстальных концентрациях (второй этап- 40мг/л, третий этап -20 мг/л).

4,Оценка адаптивной и реге нерацион пой способностей каллусных линий, полученных от различных генотипов Сравнительный анализ развития каллусной культуры сортов, гибридов и вторичных регенератов родственного происхождения показал, как и предыдущие исследования, решающую роль генотипа в интенсивности адаптационных и морфогенетических процессов. Исследования 15 генотипов выявили преимущество каллусных линий гибридов над сортом по образованию первичного каллуса в 2,5 раз и выживаемости его в селективных условиях в 60 раз. На примере сорта Добрый было показано, что выживаемость и морфогенный потенциал каллусной культуры как регенеранта, так и гибрида достоверно превышали соответствующие показатели исходного сорта (рис.4 а, б). Если в контрольных условиях регенсрационная способность регенеранта была существенно ниже, чем у гибрида, то при жестком стрессе (Л1,ь- 40 мг/л) наблюдалось явное преимущество регенерантной формы над гибридом, хотя отличия но выживаемости в этих жестких условиях для всех трех генотипов отсутствовали.

D данном случае можно предположить, что относительно низкая стабильность геномов гибридных и регенерантных форм по сравнению с сортом приводит, по-видимому, к большей вероятности появления сомаклональной изменчивости адаптивного характера у регенерированных из них растений.

Следует отметить, что преимущество каллусных кулыур регенерантов и гибридов над каллусными линиями, индуцированными сортами, обеспечивает, в дальнейшем, их преимущество в потенциальной продуктивности и п полевых условиях.

При сравнении каллусных культур, индуцируемых сортами, контрастными по алюмоустойчивости в полевых условиях наблюдали сохранение гено типической реакции на стресс в культуре in vitro (рис.5 а, б). Сорта Кумир, Новичок, 999-93 обладали 95-100%-ной выживаемостью к высокой регенерацнонной

Рис. 4-а. Выживаемость каллусных линий различных генотипов ячменя на селективной среде

Рис. 4-6. Регенерационная способность каллусных линий различных генотипов ячменя на селективной среде

способностью в контроле. В селективных условиях каллус неустойчивого сорта Кумир некропизировался на 63,3% и терял способность к регенерации при 10 мг/л А15*, в то время как шпомотолерантные генотипы Новичок, 999-93 сохраняли на уровне каллусной ткани высокую устойчивость к стрессу.

*1, мг/л

Рис.5-а. Гибель каллусных линий контрастных по алюмоу^твЯчиаоати генотипов ячменя на селективной среде различной жесткости

*

н

h isiSL_

о н» го м

Рис.5-6. Регенерационная способность каллусных линий контрастных по алк> моустойчивости генотипов ячменя на селективной среде различной жесткости

5 Лабораторная н палевая оценка ил юмоу стой ч и в ы * ре ген ера кто в ячменя на провокационных н опытных фонах

Полученные в результате щадящего (20 мг/л Alí+) к жесткого (40 мг/л А13+) отборов регенеранты проходили оценку в «одной культуре, в вегетационных и нолевых опытах (табл.3,4). Установлено, что изученные сорта по-разному pea-

-HOfttntO - Кумир

40

al мг/л

гировали на селективный отбор каллусных линий. Регенераты, индуцированные алюмочувствнтельным-генотипом 1245-94, значительно повысили свои адаптационные способности после клеточной селекции в щадяших и жестких условиях (прирост корневой системы в стрессовых условиях увеличился в 3,54,5 раза, обит и продуктивная кустистость в 1,5 раз, количество зерен в колосе на 27%), У устойчивых сортов Новичок и 999-93 при этих условиях отбора значительных сдвигов не наблюдалось, хотя жесткий отбор положительно воздействовал на прирост корневой системы у генотипа 999-93, а шадяшнй - на проективную кустистость обоих сортов. С помощью дисперсионного анализа было выявлено преимущественное влияние генотипа на формирование основных количественных признаков у регенерантов по сравнению с жесткостью отбора каллусных линий.

Таблица 3

Прирост корневой системы регенерантов в водной культуре в зависимости от жесткости отбора каллусных линий (в% от прироста корневой системы исходного генотипа)-2001 г

Схема селективного отбора каллусных линий ЯА-999-93 ЯА-Новичок ИА-1245-94

рН6,0 рН 4,0 А^Юиг/л рНб.О рН4,0 А1'*20мгУЛ рН 6,0 рН4,0 А1)+юигЛ1

жесткий отбор 134,29* 108,20 117,45 77,34* 48,41* 343,75*

щадящий отбор 75,54* 61,48* 59,97* 86,72 114,77* 487,50*

без о!бора 67,93* 46,31* 52,18* 79,69 79,25* 100,00

•Достоверно отличается от исходного генотипа при Р > 095 ЯА-регенерантная форма

1 Установлено, что достоверное изменение количественных признаков может происходить в результате проведения селективного отбора различной жесткости.

Таблица 4

Структура урожая регенератов в вегетационных опытах 2001 гада в зависимости от жесткости отбора каллусных линий (в % от уровня исходного генотипа)

Схема селективного отбора каллусных линий RA-999-93 RA-Ноаичок ¡ RA-1245-94

рНб.О рН 4,0 Al'^Ow/« pH6,0 i рн 6,o Al Murti 1 r pH4,0 А13*20«Сл

Общая кустистость

жесткий отбор 89,74 92,45 128,57* 109,84 204,88* 1 161,76*

щадящий отбор 102.56 139,62* 157,14* 111,48 104,88 1 158,82*

без отбора 85,90* 103,77 138,10* 140,98* 87,80 1 85,29

Продуктивная кустистость

жесткий отбор 90,48* j 87.50 171,43* 87,03 160,00* 148,00*

щадящий отбор 103,17 j 112,50 135,71* 114,71 113,33 120,00

без отбора 96,83 t 100,00 135,09* 88,00 93.33 88,00

Количество зерен в колосе

жесткий отбор 91,89* 9137 1 86,91* 1 76,25* 112,40* 126,91*

щадящий отбор 104,28 105,58 1 108.58 1 94,12 88,95* 101,83

без отбора 103,15 98,22 1 100,43 1 92,29* 95,15 114.07*

Урожайность с делянки

жесткий отбор 88,26 91,67 107,83 1 44,86* 1 104,80 117,24

щадящий отбор 93,26 78,10* 100,26 1 82.00* ¡ 61,65* 95,45

без отбора ) 103,42 90,00 124,00* I 71,71* i 84,42 69,38*

•Достоверно отличается от исходного генотипа при Р > 095 RA-регенерантная форма

Выбор схемы каллусного отбора, определяющей проявление того или иного признака у регенерантов, должен проходить с учетом конкретных селекционных задач: повышение продуктивной кустистости, количества зерен в колосе и т, д. Эти выводы подтверждены в полевых опытах на генотипе 999-93 (табл.5).

Растения, полученные в результате клеточной селекции, имели значительное преимущество по урожайности иа кислых почвах по сравнению с растениями контрольного варианта и исходным сортом (максимальная продуктивность апюмоустойчивых регенерантов - 210-240 г/дел., тогда как у исходных генотипов 150 г/дел.).

Таблица 5

Влияние жесткости отбора на продуктивность линии ЯА-999-93 в условиях полевого опыта 2002 г. (селекционный питомник)_

Схема Количество линий Урожай с делянки

селективного изучено, убрано, О/л средний, % к 51 тах

.отбора шт. шт. г/дел. Биос г/дел

известкованный фон (рН 6,0-6,2; А мг/100 г почвы)

жесткий 112 39 34,8. 186,2 169,2 240

щадящий 39 13 333 177,6 161,5 230 .

без отбора 21 - 3 14,2 163,0 148,1 180

сорт 25 И 44,0 180,0 . 163,6 240

кислый фон (рН 4,1; А1**4Д мг/100 г почвы)

жесткий 161 40 24,8 . 143,7 189,1 210

щадящий 51 12 23,5 167,7 216,7 240- •

без отбора 20 3 15.0 130 171,0 150

сорт 16 3 37,5 135 177.6 150

Изучение группы генотипов родственного происхождения (регенеракты, гибриды, сорго) показало преимущество регенерантов, в большей степени адаптированных к неблагоприятным-условиям, перед сортами и гибридами (табл.6). Установлено, что потенциальная продуктивность регенерантов на кислом фоне с алюминием в 1,5 раза выше, чем у линий гибридного происхождения и сортов.

В наших исследованиях было установлено, что в ризосфере некоторых регенерантов отмечается снижение содержания подвижного алюминия в большей степени по сравнению С другими генотипами. Алюмотолерантные сорта, создавая комфортные условия в прикорневой зоне, подщелачивают почвенный раствор до уровня, при котором алюминий становится труднодоступным для растений (рН свыше 4,5): регенераты 1176-94 (рН 4,9), 889-93 (рН 4,73) (табл.7). У выделенных регенерантов по сравнению с другими генотипами наблюдалось наименьшее количество остаточного алюминия в прикорневой зоне (0,93-0,98 мг/100г почвы), что свидетельствует о наличии у ннх активного механизма осаждения подвижных форм алюминия.

Таблица б

Сравнительная урожайность различных групп генотипов в условиях _вегетационного опыта, 2000г. _

Генотипы Масса зерна с 1 растения, г Проду ктнвность, г/дел. Г*

известк. фон кислый фон известк. фон кислый фон s S —

Сорта Гибриды Регенеранты 0,81 1,15 0.73 0,59 0,45 0,72 16,32 27,15 16,27 9,53 7,69 12,57 58,39 28,32 77,26

Среднее 0,89 0,59 19,91 9.87 49.57

НОР« по фактору А (генотип) по фактору В (фон) взаимод. АВ 0,12 0,19 3,00 3,18 4,92

Регенеранты оценивались в ЗНИИСХ Северо-Востока на всех этапах селекционного процесса В конкурсных сортоиспытаниях лаборатории селекции и первичного семеноводства ячменя с 1994 но 1997 гг. более половины (51,962,5%) изученных линий были представлены регенератами.

Таблица 7

Влияние кислотности и содержания Л1** в прикорневой зоне на продук-

тавность генотипов ячменя в почвенной культуре.

Генотип Продуктивность, г/дел рНом. AlJi м г/100 г почвы

Биос-1 7,60 4,76 1,19

Новичок 19,16 4.57 1.17

Кумир 5,18 4,70 U9

RA-Эколог 6.10 4,80 1.71

RA-Добрый 6,14 4,65 1,44

1176-94 19,60 4.90 0.93

889-93 18,44 4.73 0,98

Среднее 11,75 3,90 10,77

НСР 0,22 0,22

г (с урожайн-ю) -0,06 -0,50

Примечание: различия между сортами по изучаемым признакам достоверны.

Таблица 8

Результаты сортоиспытаний устойчивых х ионам Н* и А1Э+ регенераптов ячменя на кислых почвах (рН 4,1; А11* 4,2 мгЛООг почвы), 2002 г.

Урожайность

Генотип Происхождение т/га %к

st Биос-1

Конкурсное сортоиспытание

889-93 RA Абава х Икар . 6.8J 106,7

580-98 (Абава х Викинг) х RA Эколог 6,46 121,4

521-98 RA 102-92 (2114-83 х Добрый) 6,00* 112,8

1155-99 RA Эколог х Кредит 6,66* 112,1

Р-3.52%; НСРЮ.61 т/га

Контрольный питомник

1021-00 RA 173-85 (Valetta х Lulu) 6,07 121,5

1026-00 RA 173-85 (Valetta х Lulu) 5,63 112,9

895-00 Новичок x(RA Лидер X Вятич) - 7,70* 136,2

896-00 Новичок х (RA Лидер х Вятич) 7,55* 134,2

927-00 ' 889-93x981-93 6,96* 130,1

977-00 1245-94 (Риск х Дина) х 889-93 7,30 123,1

983-00 1245-94 (Риск х Дина) 889-93 7,30 123,1

Р=4,19%; НСР=0,24 т/га

•Достоверно отличается от исходного генотипа при Р>095

В настоящее время выделены перспективные регенераитные линии (табл.8). Следует отметить, что кроме самостоятельного использования полученных регенератов, положительные результаты достигаются при вовлечении регенерантов в скрещивания,.например Новичок X (ЯА Лидер х Вятич). Для расширения генетического разнообразия исходных форм перспективно вовлечение в селекционный процесс "двойных" и "тройных" регенерантов, неоднократно прошедших через каллусную культуру.

выводы

1. Выявлены оптимальные условия культивирования каллусных линий и получения регенератов ячменя: установлен оптимальный размер экснланта (I-1,5 мм),'при котором образуется максимальное количество морфогенного каллуса; сокращен период созревания регенератов на 15-38 дней.

2. Определены сублетальные концентрации ионов Н+ и А)5' на каждом этапе развития каллусной культуры, при которых возможен собор устойчивых каллусных линий с дальнейшей регенерацией растений:

первый этап - Al'*-20 мг/л, pH 4,5;

второй этап - Ai1+-36-40 мг/л, pH 3.8-i.O;

третий этап - А13М0-20 мг/л, pH 3,8-4,0.

3. Установлено, что выживаемость каллусных линий при жестких селективных условиях зависит от исходного генотипа растений ячменя.

4. Выявлено, что интенсивность ре генерационных процессов в селективных условиях достоверно определялась генотипом докорного растения и не зависела от алюмоустойчивости каллусных культур.

5. Разработана оптимальная схема oi6opa каллусных линий и получения регенерантов, включающая двукратное введение в среду ионов А(м в субле-тапьных концентрациях, составляющих на этапах недифференцированного роста 40 мг/л, на этапе морфогенеза 20 мг/л.

6. Показано, что в условиях in vitro вторичные регенеранты и гибриды превосходят исходные сорта по адаптационным и морфогенетическим параметрам. Их преимущество сохраняется в полевых испытаниях и выражается в толерантности к алюмокислому стрессу и повышении продуктивности растений.

7. Установлено, что на формирование количественных признаков регенерантов оказывает влияние генотип и схема отбора каллусных линий. Выявлено преимущественное влияние генотипа.

8; Из полученных регенерантов ячменя выделены перспективные (¡юрмы, устойчивые к ионам Н* и A!J+: 889-93 (RA Абава х Икар), 1176-94 (RA Эколог х Кредит), 1021-00 (RA Valetta х I.ulu). 895-00 (Новичок х (RA Лидер х Вятич)) и

другие, сохраняющие высокую потенциальную продуктивность при pH .4,1; концентрации ионов AI1* 4,2 мг/100 г почвы и проходящие оценку на соответствующих этапах селекционного процесса в ЗШШСХ Северо-Востока.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Родина ПЛ., Родии Е.А., Шуплецо&а О.Н., Щенникова И.Н, Клеточная селекция ячменя на устойчивость к эдафи чес кому стрессу // Сельскохозяйственная наука Северо-Востока европейской части России. Селекция и семеноводство: Сборник научных трудов к 100-летию Вятской сельскохозяйственной опытной станции.- Киров, 1995.-TJ.-C.116-123.

2. Родина НА, Шуплецова О.Н. Создание исходного материала для селекции ячменя на устойчивость к кислым почвам-методом культуры ткани // Тез. научно-практической конф. ."Теоретические и прикладные проблемы генетики и селекции и семеноводства зерновых культур" 24-27 марта 1998г.- Нем-чиновка 1, Моск. обл.,1998.-С.63,

3. Шуплецова О.Н., Родина H.A., Широких И.Г. Способ получения алю-мотолераншых форм ячменя в культуре ткани // Проблемы сельскохозяйственного производства в изменяющихся экономических и экологических условиях. Часть 2 - Агрономия.. Раздел 1: Макриалы международной научно-практической конф, посвященные 25-летию Смоленского с/х института,- Смоленск, 1999.- С.147-149.

4. Широких И.Г., Худякова Т.В., Шуплецова О.Н. Прикладная биотехнология в селекции зерновых культур на устойчивость к графическому стрессу // Материалы 2 международной научной конф. 18-19 октября 2000г. "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии".- М., 2000.- C.I63-164.

5. Широких И.Г., Шуплецова О.Н., Худякова Т.В. Оценка различных показателей, тестирующих устойчивость ячменя к токсичности ионов водорода и алюминия //Доклады РАСХН.- 2001.-Xsl.- СЛЗ-15.

6. Шунпецова О.Н. Создание алюмоустойчивых форм ячменя методами биотехнологии // Материалы научно-практической конф. "Биотехнология на рубеже веков; проблемы и перспективы". Администрация Кировской обл., Вятский госуд. универ-т, группа "Сарториус", Германия-Киров, 2001. - С.82-83.

7. Широких И.Г., Шуплецова О.Н., Родина H.A. Роль генотипа в создании алюмоустойчивых форм ячменя в культуре in vitro // Селекция, семенонод-ство и сортовая технология на Северо-Востоке европейской части России: Сборник научных трудов Зонального ННИСХ Северо-Востока,- Киров, 2001,-С.8-13.

8. Широких И.Г., Широких A.A., Шуплецова О.Н. Прикладная биотехнология и ее теоретическое обеспечение в Северо-Восточном селекционном центре // Биотехнология, экология, медицина: Материалы 3 и 4 международных научных семинаров 2001-2002 гг.- Москва-Кироя "Экспресс", 2002.- С.145-147.

9. Шуплецова О.Н., Широких И.Г., Родина H.A., Щенникова И.Н. Оценка алюмоустойчивости регенерантов ячменя в провокационных условиях // Здоровье - питание - биологические ресурсы,- Т.-1Селекция и семеноводство. Земледелие: Материалы международной научно практической конф., посвященных 125-летию со дня рождения академика Н.В. Рудницкого,- Киров, 2002,-С.244-250.

Объем 1,5 п. л.

Зак.222

Тир. 100 экз.

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44