Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum tataricum (L. ) Gaertn

Мухитов, Александр Ринатович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum tataricum (L. ) Gaertn
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum tataricum (L. ) Gaertn"

На правах рукописи

РГ5 од

2 5 £ЕИ

Мухитов Александр Ринатович

ЗЛИЯНИЕ КОЛХИЦИНА НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ И МОРФОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ КАЛЛУСОВ РАвОРУЙЦМ ТАТАРИСиМ (Ц ваеПп

03.00.04 • биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2000

Работа выполнена в лаборатории биохимии клеточной стенки Казанского института биохимии и биофизики Казанского Научного Центра РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Н. И. Румянцева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чиков В.И.

кандидат биологических наук, доцент Малков C.B.

Ведущая организация: Институт биохимии и генетики

Уфимского Научного Центра РАН

Защита состоится фЬ&Си^кА. 2000 г. в_час. на заседании специализированного

совета К 053.29.19 по присуждению учёной степени кандидата биологических наук при Казанском Государственном Универстете (420008, Казань, ул. Кремлевская, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского Государственного Университета (Казань, ул. Кремлевская, 35)

Автореферат разослан "J.4 "¿ЮЯс^Л, 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета /1 канд. биол. наук f „ //>, А. Н. Аскарова

Е5П.Ъ? о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования, проведённые учёными за последние три десятилетия, ярко иллюстрируют, что клеточная стенка и цитоскелет растений вовлечены в регуляцию морфогенеза и биохимическая перестройка этих структур может приводить к высвобождению сигнальных молекул, функционирующих как вторичные мессенджеры (Fry, 1988; Rosette, Karin, 1995; Streuli, 1999). Поддержание определенного размера является необходимым условием для сохранения и реализации клеткой морфогенетического потенциала, и это условие осуществляется вследствие координированного взаимодействия элементов цитоскелета и клеточной стенки (Lloyd, 1980).

Тем не менее, несмотря на то, что клеточная стенка и цитоскелет являются предметом активного изучения, взаимодействие этих двух структур в реализации морфогенетической программы освещено крайне слабо. Одним из наиболее продуктивных подходов к изучению взаимодействия цитоскелета и клеточной стенки может быть использование агентов, разрушающих цитоскелет. Ранее было показано, что колхицин - вторичный продукт Colchicum autumnale L. - вызывает растяжение клеток и разрыхление клеточных агрегатов в суспензионных культурах (Umetsu et al., 1975; Hayashi, Yoshida, 1988; Borkird, Sung, 1991), что косвенно могло свидетельствовать об изменении состава их клеточных стенок.

Колхицин часто используется для индукции полиплоидии, поскольку он разрушает веретено деления, тем самым, препятствуя расхождению хромосом. Кроме того, установлено, что колхицин является мутагеном (Hague, Jones, 1987) и может вызывать изменение транскрипции определенных генов (Rosette, Karin, 1995). Тем не менее, эффект длительного воздействия колхицина на генетическую стабильность малоизучен, хотя проведение таких исследований немаловажно в связи с тем, что колхицин широко используется при получении полиплоидов, межвидовых гибридов и чистых линий многих сельскохозяйственных растений, а также применяется в качестве цитостатического агента в терапии опухолей. Таким образом, важность изучения действия колхицина на клетку определяется не только актуальностью исследования участия клеточной стенки и цитоскелета в процессе морфогенеза, но и широким практическим применением колхицина в биологии и медицине.

Ранее нами было показано (Румянцева и др., 1998), что морфогенные каллусы Fagopyrum tataricum сохраняют характерную морфологию, способность к регенерации и хромосомные числа стабильными в течение длительного культивирования (до 10 лет). Неморфогенные рыхлые клоны возникают в таких каллусах с частотой один случай на 3040 пассажей и могут рассматриваться как спонтанные точковые мутации. Использование такого объекта может быть крайне удобным для изучения индуцированной нестабильности in vitro.

Целью нашей работы было изучить действие колхицина на генетическую стабильность и морфогенную способность каллусов гречихи татарской. Основными задачами этой работы были следующие:

1. Изучить влияние длительного воздействия колхицина на параметры культурального цикла (прирост биомассы, пролиферативная активность), а также на морфолого-гистологические особенности морфогепного и неморфогенного каллусов Fagopyrum tataricum.

2. Исследовать действие колхицина на полисахаридный состав клеточных стенок каллусов с разной морфогенной способностью.

3. Изучить влияние длительного действия колхицина на морфологическую и генетическую стабильность клеток каллусов Fagopyrum tataricum.

4. Изучить влияние колхицина на морфогенную активность каллусов гречихи татарской.

5. Проанализировать белковый состав каллусов с разным морфогенным потенциалом.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование действия колхицина на целый ряд параметров длительно культивируемых каллусных линий Fagopyrum tataricum. Изучено влияние этого ингибитора полимеризации микротрубочек на морфологию, цитогенетику и морфогенную способность каллусных культур, полисахаридный состав их клеточных стенок, а также на спектр синтезируемых белков. Впервые показано, что неморфогенные каллусы более чувствительны к ингибитору сборки микротрубочек колхицину, по сравнению с морфогенными, из-за их неспособности останавливать последующее деление клеток в ответ на нарушение митоза и возникновение аномалий кариотипа (поли- и анэуплоидизация клеток). Впервые показано, что длительное культивирование на среде с колхицином вызывает уменьшение количества пектинов и увеличение количества гемицеллюлоз. Выявлено, что обработка колхицином приводит к нарушению генетической стабильности морфогенного каллуса, индуцируя в нем геномные и хромосомные аберрации. Эта генетическая и морфологическая нестабильность сохраняется в течение многих пассажей на среде без колхицина. Впервые показано, что в отличие от растворимых белков неморфогенного каллуса большинство белков морфогенных каллусов гликозилировано. Каллусы с наибольшим морфогенным потенциалом имеют наиболее богатый спектр гликозилированных белков. Показано, что неморфогенные каллусы гречихи татарской, по ряду признаков (генетическая нестабильность, высокая пролиферативная активность, неспособность клеток к дифференцировке, слабые межклеточные контакты, большая чувствительность к цитостатическому агенту колхицину) аналогичны клеткам опухолей животных. Колхицин вызывает значительное увеличение частоты возникновения клонов неморфогенного каллуса и, таким образом, оказывает на морфогенные каллусы 1речихи действие сходное с канцерогенным действием этого ингибитора на клетки животных. Получена колхицин-резистентная линия каллуса, показано, что она имеет отличия по параметрам цикла культивирования и генетической стабильности от чувствительного к колхицину каллуса.

Теоретическая и прикладная значимость работы. Полученные результаты могут быть полезны для исследователей изучающих проблемы стабильности генома, сомаклональной вариабельности, динамики популяций клеток in vitro, а также роли цитоскелета в морфогенетических процессах и процессах биосинтеза клеточной стенки. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, одна статья находится в печати.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на итоговых конференциях Казанского Научного Центра РАН (1999, 2000), на II съезде Биохимического общества (Москва, 1997), VI Молодежной конф. ботаников (С.-Петербург, 1997, 2000), международном симпозиуме "Molecular Biology for Agriculture" (Ceske Budejovice, 1997), на II(X) Делегатском съезде Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков" (С.Петербург. 1998), на 2-м международном симпозиуме по биотехнологии растений (Kiev, 1998), на 2-й международной конференции "Progress in Plant Science from Plant Breeding to Growth Regulation" (Mosonmagyarovar, Hungary, 1998), VII международном симпозиуме по гречихе (Winnipeg, Canada, 1998), III Респ. научной конф. молодых учёных и специалистов (Казань 1998), на VI съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), XII конгрессе FESPP (Budapesht, Hungary, 2000), на Всероссийском симпозиуме "Клеточная биология на пороге XXI века", (С.-Петербург, 2000), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах, содержит 41 рисунок, 3 таблицы. Состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы из 313 наименований, из них 46 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали каллусные линии, полученные из незрелых зародышей татарской гречихи Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. Морфогенный каллус (линия МК) гречихи татарской представляет собой типичный для этого вида гречихи плотный гетерогенный каллус, состоящий из мягкого каллуса и проэмбриональных клеточных комплексов (Румянцева и др., 1998). Неморфогенный каллус (линия НК) F. tataricum был отселектирован из морфогенного, как спонтанно образовавшийся клон рыхлого каллуса. Каллусы культивировали в темноте, при температуре 25-28°С, на среде RX (Румянцева и др., 1989). Продолжительность одного пассажа составляла 20 суток. В опытах с колхицином колхицин (Sigma) профильтрованный через ультрафильтры Millipore (размер пор 0,22 мкм), добавляли в среду в концентрациях 0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ и 2 мМ. Морфогенный и неморфогенный каллусы культивировали на среде с колхицином 20, 45, 60 и 90 суток, после чего переносили на обычную среду.

Для определения регенерационной способности каллусных культур куски каллуса переносили со среды поддержания (RX) на среды регенерации RXR и MS6r. Регенерационную способность каллусов определяли качественно - по типу морфогенеза, который способен осуществлять каллус.

Прирост биомассы каллусов определяли, взвешивая начальный и конечный вес эксплантов, после чего определяли среднее значение прироста биомассы и ошибку средней (Глотов и др., 1982).

Выделение клеточной стенки проводили по методу Ншлитани с соавт. (Nischitany et al., 1982). Фракционирование клеточной стенки проводили согласно Talmage с соавт. (Talmage et al., 1983).

Анализ моносахаров полисахаридов матрикса и внеклеточных полимеров проводили спектрофотометрическим методом с применением орто-толуидинового реактива (Резников и др., 1982). Статистическую обработку результатов осуществляли по формуле Фиродта (Бернштейн, Каминский, 1975) с помощью компьютерной программы "TOLUIDIN". Изучение полисахаридного состава клеточных стенок каллусов проводили совместно с мне лаборатории биохимии клеточкой стенки Валиевой А. И.

Приготовление цитогенетических препаратов. Каллус фиксировали в фиксаторе Кларка (этанол + уксусная кислота 3:1) и окрашивали 2% пропионовым орсеином ("Serva"). Давленые препараты готовили в 45% молочной кислоте. Препараты анализировали и фотографировали с помощью микроскопа Jenamed (Германия).

Митотический индекс определяли по формуле: МИ =~*100%, где N - общее

количество клеток, а М - число делящихся клеток, при этом учитывалось не менее 5000 клеток наточку фиксации. Результаты обрабатывали статистически (Лакин, 1990).

Для выявления распределения клеток каллусов по классам плоидности подсчитывали хромосомы на 250-300 метафазных пластинках. Интервалы достоверности рассчитывали через критерий Фишера (Глотов, 1982).

Жизнеспособность клеток выявляли с помощью синего Эванса (Evans Blue, Sigma) путём прямого подсчёта интенсивно окрашиваемых клеток.

Проницаемость мембраны клеток каллусов оценивали по изменению количества К+ в инкубационной среде за 1 час (Пахомова, 1999). Измерения К+ проводили на пламенном

фотометре ПФМ (СССР). Определение проницаемости мембраны проводили совместно с с.н.с. лаборатории регуляции клеточного окисления Минибаевой Ф. В.

Дня гистологических исследований материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, с постфиксацией в 1% растворе 0s04 с добавлением сахарозы. После обезвоживания в этаноле, ацетоне и окиси пропилена срезы заключали в эпон. Срезы готовили на ультрамикротоме LKB-8800 ("LKB", Швеция) и окрашивали 1% метиленовым синим. Препараты фотографировали с помощью микроскопа Jenamed (Reichert Jung, Германия).

Для сканирующей электронной микроскопии материал фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде на фосфатном буфере (рН= 7,3) в течение 3 часов. Дофиксацию проводили в 1% OsC>4 на том же буфере 2 часа, обезвоживание - в градиенте спиртов до абсолютного этанола и ацетона. Образцы высушивали в критической точке с последующим напылением золота под вакуумом. Образцы анализировали с помощью сканирующего электронного микроскопа SCAN - 25 S фирмы Jeol.

Выделение и электрофорез ДНК. ДНК из клеток каллусов выделяли по методике Blin and Stafford (1976). Электрофорез тотальной ДНК проводили в 1% агарозном геле по стандартной методике (Маниатис и др, 1984).

Выделение белков проводили по методу Glass et al., (1981). Содержание белка определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976).

Электрофорез белков проводили в 10% полиакриламидном геле по стандартной методике (Laemmli, 1970). Гели окрашивали Кумасси голубым G-250. Отмытые и высушенные гели сканировали и обрабатывали с помощью программ Photoshop 5.0 и Corel Draw 8.0.

Иммуноблоттинг растворимых белков с антителами к тубулину и иммунологическое выявление глихопротеинов. Перенос белков с 12% геля на нитроцеллюлозные мембраны проводили на блоттере BioRad. Иммуноблоттинг тубулина осуществляли с помощью антител к а-тубулину ("Amersheime", USA), конъюгированных со щелочной фосфатазой. Выявление гликопротеинов проводили с использованием китов для иммунодетекции гликопротеинов (Immun-Blot Kit for Glycoprotein Detection, BioRad).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние колхицина на морфолого-гистологические особенности каллусных культур

Ранее нами было показано (Румянцева и др., 1998), что морфогенные каллусы гречихи татарской состоят из проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) и клеток "мягкого каллуса", выполняющих трофические функции. Неморфогенный каллус Fagopyrum tataricum состоит только из клеток паренхимы и его клетки не способны к дифференциации. Для неморфогенного каллуса гречихи татарской характерны также слабые межклеточные контакты и отсутствие плазмодесм. Наши исследования показали, что поверхность проэмбриональных клеточных комплексов морфогенного каллуса покрыта сетью экстраклеточного матрикса (ЭКМ), тогда как на поверхности клеток неморфогенного каллуса ЭКМ не наблюдается. Поверхностная сеть экстраклеточного матрикса представляет собой фибриллярную структуру, которая, по крайней мере, отчасти, имеет белковое происхождение (Dubois, et al., 1991; Samaj et al., 1995; Chapman et al., 2000). Поверхностная сеть экстраклеточного матрикса - структурный маркер, характерный для ПЭКК морфогенных культур и проэмбрио. Таким образом, наличие поверхностной сети экстраклеточного матрикса коррелирует с морфогенной способностью каллусов гречихи татарской.

Наши исследования показали, что колхицин вызывает дезагрегацию и вакуолизацию клеток в про эмбриональных клеточных комплексах морфогенного каллуса. В результате действия колхицина межклеточные контакты в ПЭКК разрушались, клетки приобретали

округлую форму и увеличились в размерах. В каллусе прекратилось образование проэмбриональных клеточных комплексов, что может быть результатом дезшрегации клеток. Дезагрегация, вакуолизация и увеличение размеров клеток в результате действия колхицина были иропорционачьны времени культивирования каллусов на среде с этим агентом. Важно отметить, что на среде с колхицином ь субповерностных клетках каллусов происходило накопление глобулярных белковых телец. Показано, что обработка колхицином может приводить к исчезновению с поверхности клеток проэмбрио Cichorium сети экстраклеточного матрикса (Chapman et al., 2000). Аналогичный эффект колхицина и трифлуралина (ингибитора полимеризации микротрубочек) наблюдали на клетках Drosera rotundifolia (Bobak et el., 1999). Возможно, что на среде с колхицином в клетках морфогенного катлуса гречихи татарской накапливаются именно белки, имеющие отношение к экстраклеточному магриксу, которые в норме транспортируются на поверхность ПЭКК. Накопление этих веществ в клетках является, по-видимому, следствием нарушения их направленного .транспорта к поверхности ПЭКК.

Другим интересным явлением было появление в каллусах клеток с отошедшей от КС плазмалеммой и сжатой цитоплазмой, содержащей ядерный материм. На 8 день встречались лишь единичные клетки с такими признаками. На 16 сутки количество таких клеток составляло 5-7%, а после 24 суток культивирования на среде с колхицином - около 10%.

Показано (Pont-Lezica et al., 1993), что отделение плазмалеммы от клеточной стенки

может являться следствием разрушения сайтов адгезии, в формировании которых

принимают участие, как микротрубочки. так и микрофиламенты цитоскелета. Сайты адгезии клеточной стенки и плазмалеммы образованы трансмембраппыми белками, к внутреннему домену которых прикреплены элементы

цитоскелета, а внешний домен закреплен внутри клеточной стенки. На клетках животных показано, что нарушение связей интегральных белков плазматической мембраны с экстрак л еточ н ым м а три ксом приводит к

программированной клеточной смерти (ИКС) (Bates et al., 1994; Frish, Fransis, 1994). Можно предположить, что действие колхицнна привело к разрушению сайтов адгезии КС с плазмалеммой. Результатом этого явилось отделение плазмалеммы от КС, и, возможно, программированная клеточная смерть. В

м кг/м г 350 -300 -250 -200 150 100 50 О

КС

ц,

□ Контроль Икояхицин 0,5 мМ Околхицин 2 мМ

Уроновые сумма кислоты

Иколхицин 0,25 «М ЕЗколхицин 1 мМ

□ Контроль Иколхицин 0,5 мМ И колхицин 2 мМ

Уроновые кислоты Иколхицин 0,25 мМ В колхицин 1 мМ

сумма

Рис. 1. Влияние колхицина на содержание полисахаридов в клеточной стенке морфогенного каллуса. А - пектиновая фракция, Б - фракция гемицеллюлоз.

пентозы

неморфогенном каллусе контакт между клетками значительно слабее, чем в морфогенном. На среде с колхицином наблюдалась ещё более сильная дезагрегация клеток и увеличение их размеров. На 8-е сутки появились клетки с отошедшей от клеточной стецки цитоплазмой (признаками, похожими на происходящие при программированной клеточной смерти). Накопление в клетках белковьк телец не наблюдалось.

Поскольку форма растительной клетки зависит как от цитоскелета, так и от клеточной стенки, мы решили исследовать полисахаридный состав клеточных стенок-каллусов, Ранее было показано (Яитуаг^еуа е: а1., 1998), что культивирование морфогенных каллусов Еа^оругшп 1а1агчсит на среде с 0,25 мМ колхицина приводит к некоторому снижению количества пектинов в клеточной стенке. В данной работе мы исследовали влияние разных концентраций колхицина (0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ и 2 мМ) на полисахаридный состав КС каллусов. Наши исследования показали, что при добавлении в среду культивирования колхицина в КС морфогенного каллуса снижалось количество пектиновых веществ. Это снижение происходило главным образом за счёт нейтральной фракции полисахаридов. Количество гемицеллюлоз и целлюлозы в КС на среде с колхицином увеличилось (Рис. 1). Эти изменения коррелировали с изменением морфологии

клеток, составляющих культуру. Анализируя полученные нами результаты, можно предположить, что дезагрегация клеток ПЭКК может объясняться либо

ОКонтроль

□ колхицин 0,5 мМ

□ колхицин 2 мМ

Иколхицин 0,25 мМ Вколхицин 1 мМ

нарушением

матриксных

клеточной

деградацией

пектинов в

срединной

срединная

транспорта полисахаридов к стенке, либо и метаболизацией клеточной стенке и пластинке, поскольку пластинка состоит

главным образом из пектинов (Ishii, 1981; Moore et al., 1986; Fry, 1988). Увеличение же количества гемицеллюлоз может быть связано не с увеличением их синтеза, а с изменением характера их связей с полимерами клеточной стенки после деградации пектинов, и как следствие - с более легкой экстракцией гемицеллюлозных молекул. По-видимому, изменение полисахаридного состава КС под действием колхицина является активным процессом и связано с распадом и модификацией матриксных полисахаридов, что в свою очередь определяется изменением активности

ферментов, локализованных в клеточной стенке.

В неморфогенном каллусе на среде с колхицином количество пектиновых веществ не изменилось существенным образом при концентрации

мкг/мг КС

600 500 400 300 200 too

□ Контроль Нколхицин 0,5 мМ СЗкопхицин 2 мМ

ы Уроновые су кислоты

Иколхицмн 0.25 мМ Вколхицин 1 мМ

Рис. 2. Влияние колхицина на содержание полисахаридов в клеточной стенке неморфогенного каллуса. А - фракция пектинов, Б - фракция гемицеллюлоз.

колхицина 0,25 мМ. При остальных концентрациях количество пектинов снизилось: при 0,5 мМ за счёт уроновых кислот, а при концентрациях 1 мМ и 2 мМ за счёт уроновых кислот и нейтральных полисахаридов. Количество гемицеллюлоз увеличилось только при концентрации 0,25 мМ, причем менее значительно, чем в случае морфогенного каллуса (Рис. 2). Содержание целлюлозы в клеточной стенке изменилось лишь в пределах ошибки средней. Таким образом, были выявлены отличия в характере изменений полисахаридного состава клеточных стенок морфогенного и неморфогенного каллусов. Можно предположить, что в неморфогенном каллусе нарушен каскад событий, при котором разрушение элементов цитоскелета запускает процессы метаболизации полисахаридов клеточной стенки. Изменение же состава пектинов при концентрациях колхицина 0,5мМ-2мМ связано, скорее всего, с процессами тотальной деградации клеточных стенок, вероятно, объясняемой некрозом клеток неморфогенного каллуса, так как известно, что одно и то же вещество может индуцировать апоптоз при низких концентрациях и некроз-при высоких (Harmon et al., 1990).

2. Влияние колхиннна на параметры культурального цикла и цитогенетнческую изменчивость в морфогенных и неморфогенных каллусах

2.1. Эффект колхицина на динамику жизнеспособности клеток, прирост биомассы и пролиферативную активность каллусов

Наши исследования выявили значительные различия между морфогениым и неморфогенным каллусами гречихи по чувствительности к колхицину. Морфогенный каллус (линия МК), даже после длительного культивирования на среде с колхицином (до 3-х месяцев), сохраняет высокий процент жизнеспособных клеток, тогда как неморфогенный каллус (линия НК) погибает практически полностью после 15-20 суток культивирования на среде с колхицином.

Различия в чувствительности к колхицину у морфогенного и неморфогенного каллусов показывает также анализ действия колхицина на прирост биомассы каллусов за пассаж. На средах с колхицином мы наблюдали увеличение прироста сырого веса морфогенного каллуса за счёт увеличения оводнённости клеток. Для неморфогенного каллуса мы наблюдали совершенно иную картину влияния колхицина на прирост биомассы, чем в случае морфогенного каллуса. При всех концентрациях колхицина происходило значительное ингибирование прироста веса каллуса.

Ранее нами было показано, что морфогенный и неморфогенный каллусы F. tataricum отличаются по динамике митотического индекса (МИ) (Румянцева и др., 1998). Кривая пролиферативной активности МК, в отличие от НК, имеет многовершинный вид, что может свидетельствовать о более сложном характере культуралыгого цикла у это го каллуса. По-видимому, это связано со сложной структурой МК и с разнообразием типов клеток в нём. Образование новых ПЭКК сопровождается активацией деления эмбриогенных клеток. Культуральный цикл неморфогенного каллуса характеризуется одним пиком пролиферативной активности в ходе пассажа, что отражает более простую, по сравнению с МК, структуру этого каллуса. При культивировании морфогенного каллуса на среде с колхицином, при всех прийенённых нами концентрациях, наблюдалось исчезновение вторичных пиков пролиферативной активности. Зависимость величины МИ от концентрации ингибитора МТ имела сложный характер: при концентрациях колхицина 0,25 мМ и 1 мМ максимум МИ возрастал, по сравнению с контролем, а при 0,5 мМ и 2 мМ -мало отличался от контроля. На среде с колхицином у неморфогенного каллуса наблюдалась та же зависимость величины МИ от концентрации ингибитора в среде, что и для морфогенного каллуса. Интересно, что в опытных вариантах мы отмечали появление нехарактерных для неморфогенных катлусов вторичных пиков митотической активности. Повышение МИ в каллусах на среде с колхицином, по сравнению с контролем может быть

i о

следствием стимуляции деления клеток колхицином или мегафазйою блока 8 последнем случае значение МИ возрастает не вследствие увеличения иро.шферативиой мешвиосш, а » результате накопления в культуре клеток, находящихся, на стадии метафайл. Auaain кривых МИ при концеиграоиях колхицина 0,25 мМ. 0.5 мМ. Î мМ я 2 мМ позволяет предположить, что оба вышеупомянутых кути повышения МИ имеют место, но их проявлешю зявисиг m концентрации ингибитора. Наибилее яркое отличие эффектов колхнаакз на И К я M К -исчезновение у МК вторичных инков митотической активности, тогда как у WK. «зоборог. такие пики ветоши. Исчезновение вторичных киков митотчеекой юсшаюсти у МК может быть обусловлено нарушением цикла воспроизведения И'ЗКК в морфогенцом каллусе. Появление у H (С агоркчных киков МИ ка среде с колхицином в ипгервале от две«здцатых суток до копия паеоажа может объясняться стимуляцией деления клеюк колхицином ил» селекцией в пользу клеток, ошалшощих большей устойчивосшо к колхицину, по сравнению с основной массой клеток в популяции,

2.2. Действие колхицина на цшотенетичеекие характеристики каллусов

Кприогт гречиха тзгарсал! нредставлен 16 хромосомами. Морфогскныс ка.ыусы ¡речи»! татарской характеризуются высокой стабильностью цитогенетических признаков: на протяжении 12 лег культивирования 90-98 <!■<> их клеток имеют дш»л««дкый. а 2-Ю % клеток - гаппойдиыв набор хромосом. Неяорфогемный каллус ирслстляс» смСмй микеоилоидиук) клеточную иопуляцию с модальными классами плоидиосги 2n. Зп и -4« (Румянцева и др., fWS).

Для определения изменения плотности культуры «од действие« колхшаша мы фиксировали каддус в двух временных точках - 5 и 15 сучок. Первая точка харшаеричуег пачатмше этапы полиплоидшации культуры (на этой стадии наибольшее число клеток проходит !-3 деления}, а вторая - стадию «ашегения полиплоидных клеток (в этой точке большинство иршатферапшно-актеных клеток уже лрошди через .митоз). Втора.« топка фиксации интересна по следу тодиш соображениям. Как известно. нарушение хода клеточного цикла может приводить к блоку последующих делений метки, причём такой блок характерен да» яормаяьвых клеток (то есть, для клеток с ненарушенным механизмом контроля генетической стабильности) - у животных такие клетки ¡теле повреждения не вступаю/ и деление и нередко негнбеюг по механизму шгоптоза ¡Новиков и др.. 1996). В том случае, если, механизмы контроля генетической стабильности повреждены, то клетки не останавливают деление в ответ на нарушения клеточного цикла, а продолжают делиться, накапливая нарушения, что хара&терш для трансформированных клеток животных. Таким образом, исследование етеиеии нолилжэддиэпруюшеш эффекта кояхшшна па МК и ПК может проянгь свеч на причину ратной чувствительности клеток, этих каллусов и колхицину.

Наши исследования показали, что колхицин оказывает на иеморфогеяный каллус более значительный полиплоиличируктщий эффект, чем ha морфогеяяьЖ. Так. ¿сводная часть полиплоидных клеток морфогенного каллуеа на среде с колхншшом относилась к классам Зп и (Рис. 3). Общее число клеток пдоидиостью от 5 до Sn не превышаю 5 % ш первой точке фиксации к 15% па второй. Высодаволиплоидные клетки (>8п) на первой точке фиксации не наблюдались, а на второй их доля не превышала 3% (Рис. 4}. lipis всех концентрациях колхишша около 50 % клеток морфогеииого кадд)са ка первой точье фиксации и не менее 35% клеток ка второй сохранили динлондный набор хромосом. До;-¡я клеток с мпкроящшп быта пропорциональна конаен грации ингибитора, и ас превышали а максимуме 4% три 2 мМ кодхнадшл в среде культивирования) {Рис. ?} К концу пассажа доля клеток е микроядрамп при seex концентрациях козчипика снижалась, '-по .может свидетельствовать об их «шнинашш,

В клетках неморфот синего каллуса на среде с колхицином значительно возрастала доля клеток высоких уровней нлоидноети (5-8 п >8n) íPsic. 5, 6). Особенно значительно

юо

| 80 | 60

<5 40 Р 20

? 0

(колхицин ], мМ

□ п Е32п 0>2п

юо т—~г

Г I 1 ^ 5 (1 1 Г

0 0,25 0,5 1 2

[колхицин], мМ

□ п П2п 0>2п

Рис. 3. Изменение плоидности клеток морфогенного каллуса под действием колхицина. А - 5 суток, Б - 15 суток. А

0,25

0,5

1 2

[колхицин], мМ

^ 70 * 60 е 50

§ Ю га 30

0 20

1 Ю 1 0

0,25

Е,

0,5

1 2 [колхицин], мМ

□ 3-4п И5-8П □>8п

Рис. 4. Распределение полиплоидных клеток морфогенного каллуса в зависимости от концентрации колхицина. А - 5 сут, Б - 15 сут.

юо

60 40

20 О

0,25

0,5

1 2

[колхицин], мМ

100 80 60 40 20 О

-Ш

0,25

0,5

1 2 [колхицин], мМ

□ 2п 0>2п

Рис. 5. Изменение плоидности клеток неморфогенного каллуса под действием колхицина. А - 5 суток, Б -15 суток.

70 60 -50 -40 30 20 10 О

т.

0,25 0,5 1 2

[колхицин], мМ

03-4п И5-8п ЕЭ>8п

70 60 50 40 -30 20 10 -0

[Ь

1=-

0,25 0,5 1 2

[колхицин], мМ

□ 3-4п И5-8п Р>8п

Рис. 6. Распределение полиплоидных клеток неморфогенного каллуса в /0. зависимости от концентрации колхицина. А - 5 сут, Б - 15 сут.

возрастала доля таких клеток при концентрациях 1 и 2 мМ - до 48 % (из них 28% - >8п) и 73 % (из них 57 % - >8п), соответственно. На среде с колхицином доля клеток с микроядрами у НК также была значительно большей, чем у МК (Рис. 7), причём при концентрациях 1 и 2 мМ образование микроядер носило массовый характер и к 20-25 суткам 80-90 % клеток каллуса содержало микроядра (до 50 на клетку), причем, в отличие от МК, доля клеток с микроядрами к концу пассажа увеличивалась.

Интересно отметить, что на первой точке фиксации, при концентрациях колхицина 0,5 мМ, 1 мМ и 2 мМ мы наблюдали увеличение числа гаплоидных клеток, что является нехарактерным для колхицина эффектом. Гаплоидные клетки могли образоваться в результате неравноценных или многополюсных митозов, или вследствие амитотических делений, которые мы наблюдали в клетках каллуса на среде с колхицином.

время культивирования (сут) контроль -»-НК 0,25 мМ колх

—Ф—МК контроль —О-МКО.25 мМ колх -±-НК 0,5 мМ колх -*-НК 1 мМ колх

—Л—МК 0,5 мМ колх —*-МК1мМколх -ж-НК2мМколх

—О— МК2мМ колх

Рис. 7. Образование микроядер в клетках морфогенного (А) и неморфогенного (Б) каллусов на среде с колхицином.

Таким образом, клетки неморфогенного каллуса на среде с колхицином достигли значительно более высокой степени полиплоидизации, чем морфогенные. Это свидетельствует о том, что клетки морфогениых каллусов проходили на среде с колхицином 1-2 аномальных митоза, после чего прекращали деление, тогда как клетки неморфогенных каллусов продолжали в этих условиях активно делиться. Показано, что неспособность клеток животных останавливать митоз в ответ на нарушение клеточного цикла является следствием повреждения механизмов контроля клеточного цикла (Туровец и др., 2000; ТпеШ е1 а1., 1996). Причём, такая особенность характерна для опухолевых клеток. Таким образом, можно предположить, что клетки неморфогенного каллуса, в отличие от клеток морфогенного, обладают нарушенным механизмом контроля клеточного цикла и генетической стабильности клетки.

3. Постэффекты колхицина на морфологию, генетику и морфогенную способность

каллусов

3.1. Постэффект длительного воздействия колхицина на морфологические и цитогенетические признаки каллусов После культивирования на среде с колхицином и перемещения на обычную среду морфогенные каллусы гречихи возобновили свой рост в виде отдельных клонов. Каллусы, подвергавшиеся воздействию колхицина в течение 30-90 суток, в последующих пассажах

оказались морфологически нестабильными. При этом наблюдалась тенденция к образованию каллусной ткани более рыхлой консистенции, чем в контроле. На каллусах, подвергавшихся действию колхицина, не образовывались ПЭКК. После 2-4 пассажей на обычной среде, МК образовывал клоны рыхлого каллуса, сходного по морфологии с неморфогеняым каллусом Fagopymm lataricunj. При этом в клетках наблюдались различные нарушения клеточного цикла: образование микроядер и многоядерных клеток, нарушения кариокинеза, хромосомные аберрации типа мостов, фрагментов и отставаний хромосом, а также фрагментация хромосом и диминуция хроматина (Рис. 8).

Степень генетической нестабильности в морфогенном каллусе зависела от продолжительности его культивирования на среде с колхицином. Каллус, находившийся на среде с колхицином 20 суток, к 4-му пассажу на обычной среде восстановил исходное распределение клеток по плоидности, и в нём не наблюдалось образование клонов рыхлого каллуса, тогда как после более длительного культивирования каллусы в последующих пассажах имели значительную долю делящихся полиплоидных клеток и образовывали клоны рыхлого каллуса. Этот факт может свидетельствовать о том, что с повышением длительности действия колхицина на клетки увеличивается степень повреждения в них механизмов, контролирующих стабильность генома.

В результате постэффектов колхицина на каллусы, мы получили коллекцию линий каллусов, состоящую из нескольких линий рыхлого каллуса (обозначенные К-3, NC-65 и К-2), а также нескольких линий гетерогенного каллуса (обозначенных К-45, К-60, К-90 и NS). Как показали наши исследования, все рыхлые каллусы оказались сходными с линией НК не только по морфологии, но и по цитогенетическим особенностям: они представляют собой миксоплоидные клеточные популяции с модальными классами плоидности 2п, Зп и 4п. Каллусы линий NS, К-45, К-60 и К-90 также имеют существенную долю полиплоидных клеток, но в них главным модальным классом является 2п.

Колхицин применяется в биологии для получения полиплоидных форм растений, фертильных амфидиплоидов при отдаленной гибридизации, а также дигаплоидов. В ряде работ показано, что колхицин обладает постэффектом на генетическую стабильность в культурах клеток, и в полученных при его использовании полиплоидных формах растений (Dolezel, Binarova, 1989; Hague, Jones, 1987, Марьяхина и др., 1990). Наши исследования показали, что колхицин вызывает значительное увеличение генетической нестабильности в каллусах гречихи татарской, причём эта нестабильность проявляется как постэффект колхицина в последующих после обработки пассажах и выражается в увеличении частоты хромосомных аберраций и нарушений клеточного цикла.

3.2. Постэффект колхицина на морфогенную способность каллусов.

Наши исследования показали, что на безгормональной среде с колхицином (0,25 мМ) морфогенный каллус не способен к морфогенезу. Непосредственно после пассирования на среде с колхицином морфогенные каллусы гречихи татарской также оказались не способными к морфогенезу, хотя активно наращивали биомассу.

После того как обработанные колхицином каллусы прошли несколько пассажей на среде без колхицина, мы отмечали изменение их морфологии и выделили несколько морфотипов каллуса. Все каллусы оказались различными по морфогенному потенциалу. Глобулярный каллус линии NS оказался способным на безгормональной среде только к ризогенезу. Плотные камусы линий К-45, К-60 и К-90 (полученные в результате действия колхицина на МК в течение 45, 60 и 90 суток, соответственно) оказались способными только к гистогенезу (образование трахеид). Они в каждом пассаже образовывали клоны рыхлого каллуса, и после 15-20 пассажей полностью переродились в рыхлый каллус.

Рыхлые каллусы линий К-45-2, NC-65 и К-45-3, образовавшиеся на каллусах в результате постэффектов колхицина (К-2 и К-3 были отселектированы из К-45, aNC-65 - из NS), также как и НК, оказались неспособными к морфогенезу. Однако, у одной из этих

Рис. 8 Постэффект колхицина на к-<псм морфснеииого кш)са Рмощтнт Mariana. А -фрашелтааия хромосом {Ув. Б - отставание хромосомы (Уз. 300Х,>. В -

образование фрагментов хромосом {Ув. 50ОХ ). Г - дкминуцйя хроматина Í У». ) 250Х

каллусных линяй - К-3 сохранилась способность к гистогенезу - на безгормональной среде в этом каллусе появляются трахеидные элементы.

Таким образом, в результате культивирования на среде с колхицином морфогенные каллусы гречихи татарской утратили способность к эмбриоидогенезу и геммогенезу, а способность к ризогенезу и гистогенезу у них сохранилась.

Поскольку колхицин вызвал высокую степень генетической нестабильности в каллусах, то можно было предполагать, что линии каллусов, полученных под действием этого ингибитора гетерогенны но признаку экспрессии генов, а, следовательно, и по спектру синтезируемых белков. Экспериментальная дестабилизация генома действием колхицина позволила нам получить серию линий каллуса, различающихся по морфогенной способности: NS, К-45-3, LS, НК-2. Кроме того, в нашем распоряжении находилась каллусная линия 34, образовавшаяся в ходе селекции клеток in vitro, способная к образованию аномальных почек. Мы использовали несколько линий каллусов с различным морфогенным потенциалом: МК (способный к органо- и эмбриоидогенезу), NS (способный к ризогенезу), 14 (способный к образованию почек и трахеид), К-45-3 и LS (рыхлые культуры, способные к образованию трахеид), ряд неморфогенных каллусов (ПК, К-2, CR4, NC-65), представленных только паренхимными клетками.

Спектрофотометрический анализ содержания белков показал, что каллусы с разным морфогенным потенциалом отличаются по содержанию растворимых белков (Табл.3). Морфогенные каллусы содержат большее количество белков, по сравнению с неморфогенными, и каллусами, сохранившими способность к образованию трахеид, что также наблюдали в каллусах риса (Chen, Luthe, 1987), кофе (Yuffa et al., 1994), цикория (Boyer et al., 1993) и пшеницы (Rajyalakshmi, 1991). Большее содержание растворимых белков в морфогенных каллусах (в 5-10 раз), по сравнению с неморфогенными. может свидетельствовать о более активном статусе морфогенного каллуса, а также о связи между количеством растворимых белков и наличием определённых тканей в каллусе. Так, наибольшее количество белков имели культуры, содержащие ПЭКК, и меристематические очаги, представленные клетками с плотной цитоплазмой.

Для того чтобы определить отличия каллусов с разным морфогенным потенциалом на молекулярном уровне, было проведено электрофоретическое разделение белков SDS-ПААГ. Однако существенных различий между белковыми спектрами выявлено не было. Обращает на себя внимание факт большей экспрессии белка 71 кДа в эмбриогенном каллусе, 74 кДа, 55 кДа, 40 кДа, 38 кДа, 36 кДа в морфогенных каллусах. Следует отметить, что присутствие специфичных, или более экспрессируемых белков в области 4044 кДа отмечалось ранее в эмбриогенных культурах (Slay et al., 1989; Chen, Luthe, 1987). Сделано предположение, что именно эти белки являются необходимыми для процесса соматического эмбриогенеза (Sung, Okimoto, 1981;Pedroso et al., 1995).

Поскольку наличие определенных гликозилированных форм белков может быть критичным для поддержания эмбриогенного статуса каллусных культур (De Jong, 1992), мы решили сравнить спектры гликозилированных форм белков каллусов, обладающих разным морфогенным потенциалом. Проведенные исследования показали, что неморфогенные каллусы содержат незначительное количество гликозилированных белков, тогда как большая часть белков морфогенных каллусов (в особенности эмбриогенного) гликозилирована. Кроме того, наши исследования выявили, что каллусы с наибольшим морфогенным потенциалом имеют наиболее богатый спектр гликозилированных белков, причем, если все морфогенные каллусы имеют общие гликозилированные формы в области 30-32 кДа, то эмбриогенный каллус имеет дополнительные гликозилированные белки в области 34 кДа и 20-22 кДа(Рис. 9).

Наиболее интересным нам представляется факт специфической экспрессии гликозилированного белка 34 кДа в эмбриогенном каллусе. По молекулярной массе этот

белок близок к хитиназе, специфическая экспрессия которой показана в ходе соматического эмбриогенеза (De Jong, 1992).

29 —»

20 —» 14 —\

11В —> 97 —f 84 —> 66 —>

55 —> -

45 —>

36 —>

29 —>

14 —>

•Л

} : -

Рис. 9. Спектр гликозилированных белков каллусов с разной морфогенной способностью. А: I - неморфогснный каллус, 2 - эмбриогенный каллус. Б: I -Эмбриогенный каллус, 2 - каллус, способный к геммогенезу, 3 - ризогенный каллус (линия КБ), 4 - неморфогснный каллус (линия СЯ4). с> -эмбриоспецифические белки, * - белки, характерные для морфогенных

каллусов.

4. Получение колхицин-резистентной линии каллуса Г. (а1апсиш и её характеристика

4.1. Получение линии каллуса, устойчивого к ингибитору Поскольку в качестве одного из постэффектов колхицина на культуры Р. 1а1апсиш мы наблюдали значительное увеличение в них морфологической и генетической нестабильности, мы предположили, что нестабильность затрагивает не только геномный и хромосомный, но и генный уровень. В этом случае представлялось возможным использовать предполагаемый высокий фон мутаций для получения резистентной к колхицину линии каллуса. Мы поместили морфологически и генетически нестабильный (образующий в каждом пассаже клоны рыхлого каллуса) каллус линии N8, полученный действием колхицина на МК (0,25 мМ, 65 суток), на среду с тем же ингибитором (1 мМ). Более высокая концентрация колхицина была использована с целью увеличить давление селектирующего фактора на клетки. После 30 суток культивирования, на каллусе линии N8

образовался клон рыхлого каллуса, способный к росту на среде с 1 мМ колхицина. При этом сам глобулярный каллус линии NS, а также все клоны рыхлого каллуса, предсуществовавшие на нём до пересадки на среду с колхицином, погибли. Каллус резистентный к колхицину был обозначен CR4.

4.2. Свойства колхицин-резистентного каллуса линии CR4

По морфологии колхицин-резистентный каллус был сходен с рыхлым неморфогенным каллусом гречихи, не способным к росту на среде с колхицином. Также как н НК, каллус линии CR4 состоял из крупных вакуолизированных клеток паренхимного типа.

Проведённые нами исследования показали, что CR4 отличается по ряду параметров культурального цикла от МК и НК гречихи татарской. Так, продолжительность пассажа у CR4 составлял всего 10-12 суток, тогда как для НК была характерна продолжительность пассажа 18-20 суток. Причём прирост биомассы CR4 за его пассаж (12 суток) превышал таковой у НК за характерный для этой линии пассаж (18 суток) на 20%. При этом максимум митотического индекса у НК и CR4 был одинаков. Поскольку, пролиферативная часть пассажа у CR4 была короче, чем у НК, то можно было предположить, что столь значительный прирост массы у CR4 был обусловлен меньшей продолжительностью клеточного цикла у CR4, по сравнению с НК. Интересно также отметить, что колхицин-резистентный каллус при пересадке на среду без колхицина на первом пассаже рос значительно хуже, чем на среде, содержащей колхицин. Если предположить, что микротрубочки CR4 более стабильны, чем у МК и НК, то замедленный рост каллуса линии CR4 на среде без колхицина может объясняться сдвигом динамики МТ в сторону полимеризации на среде без ингибитора. Отсутствие в среде колхицина выполняет в этом случае роль МТ-стабшизирующего агента.

По цитогенетическим характеристикам CR4 оказался ближе к неморфогенным каллусам и представляет собой миксоплоидную популяцию клеток. Отличительной чертой линии CR4 является отсутствие клеток плоидностью выше 5п. Возможно, это результат селекции в пользу клеток низких уровней плоидности, как более быстро делящихся. Кроме того, для каллуса линии CR4 была характерна очень высокая частота хромосомных аберраций (мосты и фрагменты хромосом), достигавшая в период с 1 по 20 пассаж 80%, а с в последующие пассажи 35-40 %. Для сравнения: у НК частота аберраций составляла 5-10%, у МК - 1 -2 %, а у каллуса линии NS, из которого CR4 был отселектирован, 5-8%. К морфогенезу каллус CR4 оказался не способен: на среде регенерации он, также как и НК, погибает.

По полиеахаридному составу клеточной стенки CR4 несколько отличался от сходного с ним по морфологии НК. При этом, отличия по пектинам и гемицеллюлозам носили количественный характер: в клеточной стенке CR4 их было значительно меньше, чем у НК.

Нередко устойчивость к различным агентам, в том числе антимитотическим, обеспечивается путём экстра- или интрахромосомной амплификации генов, придающих клеткам свойство резистентности (Хесин, 1984; Fojo et al., 1985; Gros et al., 1986; Roninson et al., 1986). Наши исследования показали, что в клетках колхицин-устойчивого каллуса не содержится миникольцевых фрагментов ДНК или более крупных экстрахромосомных включений (гетерохроматиновых глыбок или фрагментов хромосом), характерных для колхицин-устойчивых линий клеток (Копиин, Гудков, 1982). Еще одним подтверждением того, что устойчивость к колхицину каллуса CR4 не связана с экстрахромосомной амплификацией генов, является тот факт, что CR4 не теряет свойства резистентности к колхицину после длительного (более 20 пассажей) культивирования этого каллуса на среде без колхицина. Таким образом, если в колхицин-резистентном каллусе гречихи и имеет место амплификация "генов устойчивости", то она происходит интрахромосомно. Косвенным свидетельством возможности такой амплификации является высокий процент хромосомных аберраций в клетках линии CR4: как известно, повторяющиеся

последовательности ДНК в хромосоме часто оказываются вовлеченными в кроссинговер между сестринскими хроматидами, что приводит к дестабилизации генома (Хесин, 1984).

Устойчивость к ингибиторам цитоскелета может обеспечиваться следующими механизмами:

1. Путем понижения проницаемости мембраны (Хесин, 1984);

2. Синтезом ферментов, инактивирующих молекулу ингибитора (Хесин, 1984);

3. Сверхсинтезом ингибируемого компонента;

4. Путём синтеза изоформ тубулина с низким сродством к ингибитору, или придающих микротрубочкам свойства повышенной стабильности (Schibler, Huang, 1991; Baird et al., 1997).

5. Высокоэффективными MAP (Microtubule associated proteins) (Billger, et al., 1991) и посттрансляционной обработкой тубулина.

6. Путём синтеза белков, удаляющих ингибитор из клеток (Borkird, Renee Sung, 1991; Johnstone et al., 2000; Juliano, Ling, 1976; Kartner et al., 1983).

Наши исследования показали, что на среде с колхицином чувствительный к колхицину неморфогенный каллус и колхицин-резистентный каллус не отличались друг от друга ни по величине мембранной проницаемости для К+, ни по её динамике в ходе пассажа. Показано, что в плазматической мембране локализуются элементы тубулинового цитоскелета (Isenberg, Niggli, 1998). Эти элементы участвуют в организации специфических доменов плазматической мембраны (Isenberg, Niggli, 1998). Антитубулиновыс агенты приводят к удалению тубулина из мембранной фракции (Laporte et al., 1993). Колхицин также может изменять текучесть мембран и влиять на подвижность мембранных компонентов (Wunderlich, Muller, 1973). Таким образом, увеличение проницаемости мембраны клеток для ионов калия может объясняться нарушением структуры мембраны из-за удаления из неё тубулиновых компонентов. Для проверки 2-й, 5-й и 6-й возможностей мы провели исследование фракции растворимых белков каллусов линий НК и CR4. SDS-PAGE не выявил у этих каллусов различий между спектрами синтезируемых растворимых белков. Для проверки 3-й и 4-й возможности мы провели блот-гибридизацию растворимых белков каллуса с антителами против а-тубулина. При этом мы наблюдали одинаковое мечение тубулина НК и CR4.

Таким образом, наши биохимические данные позволяют заключить, что устойчивость каллуса линии CR4 к колхицину не связана со сверхсинтезом тубулина. Мы также не наблюдали перекрёстной устойчивости каллуса линии CR4 к оризалину. На среде с оризалином в клетках CR4 наблюдалось образование микроядер. Мы также не обнаружили никаких специфичных для CR4 белков, по крайней мере, во фракции растворимых белков. Наиболее вероятной причиной устойчивости может быть сверхэкспрессия белков плазматической мембраны, обеспечивающих её непроницаемость для колхицина.

а <5 2 Рис. 10. Иммуноблоттинг с

антителами к а-тубулину 54 —^ »—•»-.п растворимых белков

колхицин-резистентного (1) и чувствительного к колхицину (2) каллусов.

Заключение

Таким образом, проведённые нами исследования показали, что колхицин при длительном действии оказывает сильное дестабилизирующее влияние на геном, и генетическая нестабильность, индуцированная колхицином, проявляется в последующих после обработки колхицином пассажах каллуса. Вызываемая действием колхицина дестабилизация генома делает этот антитубулиновый агент эффективным инструментом для индуцирования мутаций, но может ограничить его применение для получения полиплоидов. Как было показано (Марьяхина и др., 1990), вегетативное потомство полиплоидных форм чеснока, полученных в результате обработки колхицином, отличались высокой частотой вариабельности признаков и аномалиями кариотипа.

Кроме того, наши исследования показали, что морфогснные и неморфогенные каллусы Р. 1а1апсит сильно отличаются по чувствительности к колхицину. При обсуждении причин разной чувствительности этих каллусов к колхицину, необходимо учесть различную природу этих каллусов. Рыхлый неморфогенный каллус гречихи принципиально о тличается по свойствам клеток как от эмбриогеяного каллуса, так и от каллусов плотной консистенции с редуцированным морфогенным потенциалом. Клетки последних способны к дифференцировке и гистогенезу - образованию элементов проводящей ткани (трахеид), а иногда и к органогенезу. Клетки же неморфогенного каллуса гречихи по ряду признаков подобны клеткам опухолей животных. К числу таких признаков относятся неспособность клеток к дифференцировке, слабые межклеточные контакты, высокая пролиферативная активность. Важно отметить также и то, что раковые клики гораздо менее устойчивы ко всем агентам, затрагивающим клеточный цикл, по сравнению с нормальными клетками, что определяется их высокой пролиферативной активностью. Нормальные клетки при нарушении хода клеточного цикла останавливаются на 0(Дл1-фазе и в дальнейшем, если повреждения серьёзные, не вступают в деление (ТпеШ й а1., 1996; Новиков, 1996; Туровец и др., 2000). Трансформированные клетки, в отличие от нормальных клеток, не блокируются на стадии и продолжают деление. В результате, они накапливают мутации и нарушения метаболизма, что в конечном итоге приводит к их гибели. Неморфогенный каллус FagopyrlIm 1а1апсшп проявил в нашей работе значительно меньшую устойчивость к колхицину - агенту серьёзно нарушающему клеточный цикл, по сравнению с морфогенным каллусом. При этом на среде с колхицином в морфогенном каллусе пролиферация клеток после короткого периода активации подавлялась. Неморфогенный каллус в этих условиях продолжал делиться.

Полученные нами данные позволяют предположить, что клетки морфогенного каллуса, в отличие от клеток неморфогенного, обладают ненарушенным механизмом контроля генетической стабильности клетки, и способны прекращать деление при повреждении. У НК даже клетки с явно несбалансированным геномом (высокополиплоидные клетки) продолжают делиться, тогда как у МК высокополиплоидные клетки если и образуются, то в деление больше не вступают. В дальнейшем они, по-видимому, погибают, возможно, по механизму апоптоза, так как мы наблюдали цитологические картины очень сходные с таковыми, описанными при программированной клеточной смерти. Полученные нами данные свидетельствуют о различиях в эффектах колхицина на морфогенный и неморфогенный каллусы гречихи, аналогичных описанным для реакции нормальных и раковых клеток животных на повреждающее действие химических препаратов (ТпеШ е! а1., 1996; Новиков, 1996; Туровец и др., 2000). Таким образом, неморфогенный каллус может рассматриваться как совокупность клеток, у которых нарушены механизмы контролирующие деление, способность к дифференцировке и генетическую стабильность. Именно эти механизмы нарушены у раковых клеток животных.

Хорошо известно, что колхицин обладает канцерогенным действием на клетки животных. Он вызывает трансформацию клетки и превращение её в опухолевую.

Конкретный механизм этого явления до копна не ясен, однако есть свидетельства, что клетки опухолей имеют отличия в строении цитоскелета (в особенности цитоскелета ядра), по сравнению с нормальными клетками. Более того, вещества, способные вызвать реверсии раковых клеток к норме, не оказывают такого эффекта при ингибировании полимеризации микротрубочек колхицином (Puck, Krystoshek, 1992). Таким образом, для сохранения нормального статуса клетки необходима определённая организация цитоскелета (по-видимому, наиболее важна правильная организация хроматина, в установлении которой участвуют микротрубочки). Действие колхицина значительно повысило частоту образования клонов рыхлого каллуса - такие клоны образовывались в каждом последующем пассаже на обычной среде на протяжении 40-45 пассажей. Таким образом, учитывая аналогию неморфогенных каллусов гречихи татарской с клетками опухолей животных, можно полагать, что колхицин оказывает на каллусные культуры эффект, сходный с его канцерогенным действием на клетки животных.

ВЫВОДЫ

1. Длительное воздействие колхицина приводит к существенным изменениям морфологии морфогенного каллуса F.tataricum: разрыхлению его структуры и исчезновению проэмбриональных клеточных комплексов. На клеточном уровне эти изменения сопровождаются вакуолизацией клеток, потерей межклеточных контактов и гибелью части клеток с признаками, характерными для программируемой клеточной смерти.

2. Впервые показано, что длительное культивирование на среде с колхицином вызывает значительное изменение полисахаридного состава клеточных стенок морфогенных каллусов: уменьшение количества пектинов и увеличение количества гемицеллюлоз.

3. Обработка колхицином приводит к нарушению генетической стабильности морфогенного каллуса, индуцируя в нем геномные и хромосомные аберрации. В колхицин-обработанных каллусах значительно увеличивается частота появления рыхлых неморфогенных клонов (4-5 клонов на пассаж, в то время как в контроле она составляет 1 клон на 30-40 пассажей). Эта генетическая и морфологическая нестабильность сохраняется в течение многих пассажей на среде без колхицина.

4. В результате экспериментальной дестабилизации генома морфогенного каллуса получена рыхлая колхицин-резистентная линия, отличающаяся от чувствительных к колхицину каллусов более коротким циклом культивирования и высокой частотой хромосомных аберраций. Устойчивость катлуса к колхицину не связана с экстрахромосомной амплификацией генов.

5. Все клоны морфогенного каллуса, отобранные после воздействия колхицином, проявляют меньшую морфогенную активность по сравнению с контролем. Установлено, что неморфогенные и частично морфогенные клоны (способные к проявлению отдельных форм морфогенеза) содержат меньше растворимых белков по сравнению с морфогенным каллусом. Впервые показано, что в отличие от растворимых белков неморфогенного каллуса большинство белков морфогенных и частично морфогенных каллусов гликозилировано. Каллусы с наибольшим морфогенным потенциалом имеют наиболее богатый спектр гликозилированных белков.

6. Впервые обнаружено, что неморфогенные каллусы менее устойчивы к колхицину, по сравнению с морфогенными, из-за их неспособности останавливать последующее деление клеток в ответ на нарушение митоза и возникновение аномалий кариотипа (поли- и анэуплоидизация клеток).

7. Неморфогенные каллусы гречихи татарской, по ряду признаков (генетическая нестабильность, высокая пролиферативная активность, неспособность клеток к дифференцировке, слабые межклеточные контакты, повышенная чувствительность к колхицину) аналогичны клеткам опухолей животных. Колхицин вызывает значительное увеличение частоты возникновения клонов неморфогенного каллуса и. таким образом,

оказывает на морфогенные каллусы гречихи действие сходное с канцерогенным действием этого ингибитора на клетки животных.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Румянцева Н.И., Валиева А.И., Мухитов А.Р., Лукина Ю.А., Лозовая В.В. Влияние колхицина на полисахаридный состав клеточных стенок каллусов с разной морфогенной способностью // Тез. докл. II съезда Биохимического общества.- Москва, 1997, ч.П.-С.529-531.

2. Валиева А.И., Мухитов А.Р., Румянцева Н.И. Особенности роста и динамика полисахаридного состава клеточных стенок морфогенного каллуса татарской гречихи // Тез. докл. VI Молодежи, конф. ботаников,- С.-Петербург, 1997. С.45-46.

3. Rumyantseva N., Valieva A., Mukhitov A., Lukina Yu., Lozovaya V. The influence of colchicine on cell wall composition of calli with different morphogenic ability Abstr. of Symp. Molecular Biology for agriculture.- Ceske Budejovice, 1997,- P.93.

4. Мухитов A.P., Румянцева Н.И. Влияние колхицина на цитогенетичеекую стабильность каллусов гречихи Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. // Тезисы H(X) Делегатского съезда Русского ботанического общества "Проблемы ботаники на рубеже ХХ-ХХ1 веков" С.Петербург. 1998, с. 126.

5. Mukhitov A., Rumyantseva N. The influence of colchicine on mitotic dynamics in calli of Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn. having different morphogcnic ability // Abstr. 2-nd Int. Symp. on Plant Biotechnology Kiev, 1998 P.91.

6. N. Rumyantseva, Yu. Lukina, A. Mukhitov. Identification of embryogénie callus types lor long-term maintenance and regeneration from Fagopyrum species // Abstr. Int. 2-nd Conference on Progress in Plant Science from Plant Breeding to Growth Regulation .199S. Mosonmagyarovar, Hungary, P.78.

7. Румянцева H. И., Валиева А.И., Самохвалова H. А., Мухитов А. Р.. Агеева М.В., Лозовая В.В. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу // Цитология. - 1998. - Т.40. - N 10.-е. 835 -842.

8. Rumyantseva N.I., Valieva A.I,, Mukhitov A.R. The effect of colchicine on morphogenic and non-morphogenic calli of buckwheat // Cell Biology International. - 1998. - V. 21. - N 12. - p. 891 - 892.

9. Valieva A.I., Rumyantseva N.I., Mukhitov A.R. Alterations in cell wall polysaccharide composition of buckwheat calli with different morphogenic ability // Proc. VII Int. Symp. on Buckwheat.- Winnipeg, Canada, 1998. Section V. P.83-87.

10. Лукина Ю.А., Мухитов A.P., Румянцева Н.И. Гистологические и цитогснетические особенности каллусных культур двух видов гречихи // Тез. Ш Респ. Научная конф. Молодых учёных и специалистов. Казань 1998., с. 29-30.

11. Rumyantseva N.I., Valieva A.I., Mukhitov A.R. The influence of colchicine on cell wall composition of buckwheat calli having different morphogcnic ability // Proc. Vll Int. Symp. on Buckwheat.- Winnipeg, Canada, 12-14 Aug.1998. Section V. P.88-96.

12. Лукина (Костюкова) Ю.А., Мухитов A.P., Шишкина Ю.М., Румянцева Н.И. Морфологические и цитогенетические особенности длительно культивируемых каллусов Fagopyrum esculentum (Moench.) // Тез. VI съезда Общества физиологов растений России (Москва, ИФР РАН), 1999, С.622.

13. Мухитов А. Р., Румянцева Н. И. Индуцированная колхицином генетическая и морфологическая нестабильность каллусных культур Fagopyrum tataricum // Тезисы VU Молодёжной конференции ботаников. - С.-Петербург, 2000. - С. 138.

14. Mukhitov A. R., Gogolev Yu. V., Minibayeva F. V., N. 1. Rumyantseva N. I. Establishment and characterization of colchicine-resistant callus of Fagopyrum tataricum // Abstr. XII FESPP Congress 2000, P. 30.

15. Мухитов A. P., Румянцева H. И. Индукция колхицином морфологической и

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мухитов, Александр Ринатович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Цитоскелет клетки. Структура и функции.

1.1.1. Структура тубулиновых компонентов цитоскелета.

1.1.1.1. Тубулин - базовый элемент микротрубочек.

1.1.1.2. Полимеризация микротрубочек.

1.1.1.3. MAP - регуляторные элементы микротрубочек.

1.1.1.4. МТ-структуры растительной клетки.

1.1.2. Функции тубулинового цитоскелета.

1.1.3. Колхицин - один из инструментов для исследования цитоскелета.

1.2. Клеточная стенка растений.

1.2.1. Функции клеточной стенки.

1.2.2. Взаимодействие клеточной стенки и цитоскелета.

1.2.3. Арабиногалактановые белки - сигнальные молекулы растительной клетки.

1.3. Особенности растительной клетки при культивировании in vitro.

1.3.1. Состояние in vitro - клетки в искусственных условиях.

1.3.2. Динамика клеточных популяций в культуре.

1.3.3. Генетика растительной клетки in vitro.

2. Материалы и методы.

2.1. Объект исследования.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Определение регенерационной способности культур.

2.4. Определение прироста биомассы каллусов.

2.5. Определение поли- и моноеахаридного состава клеточных стенок каллусов.

2.5.1. Выделение клеточной стенки.

2.5.2. Фракционирование клеточной стенки.

2.5.3. Определение содержания моносахаридов во фракциях пектинов и гемицеллюлоз.

2.6. Приготовление цитогенетических препаратов.

2.7. Определение митотической активности и хромосомных чисел.

2.8. Определение жизнеспособности клеток.

2.9. Определение проницаемости мембраны клеток.

2.10. Приготовление препаратов для гистологических и электронно-микроскопических исследований.

2.11. Выделение и электрофорез ДНК.

2.12. Выделение и электрофорез белков.

2.13. Иммуноблоттинг растворимых белков с антителами к тубулину и иммунологическое выявление гликопротеинов.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Влияние колхицина на морфолого-гистологические особенности каллусных культур.

3.2. Влияние колхицина на параметры культурального цикла и онтогенетическую изменчивость в морфогенных и неморфогенных каллусах.

3.2.1 Эффект колхицина на динамику жизнеспособности клеток, прирост биомассы и пролиферативную активность каллусов.

3.2.2. Действие колхицина на цитогенетические характеристики каллусов.

3.3. Постэффекты колхицина на морфологию, генетику и морфогенную способность каллусов.

3.3.1. Постэффект длительного воздействия колхицина на морфологические и цитогенетические признаки каллусов.

3.3.2. Постэффект колхицина на морфогенную способность каллусов.

3.4. Получение колхицин-резистентной линии каллуса

F. tataricum и её характеристика.

3.4.1. Получение линии каллуса, устойчивого к ингибитору.

3.4.2. Свойства колхицин-резистентного каллуса линии CR4.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum tataricum (L. ) Gaertn"

Актуальность исследования

Исследования, проведённые учёными за последние три десятилетия, ярко иллюстрируют, что клеточная стенка и цитоскелет растений вовлечены в регуляцию морфогенеза и биохимическая перестройка этих структур может приводить к высвобождению сигнальных молекул, функционирующих как вторичные мессенджеры (Fry, 1988; Streuli, 1999). Поддержание определенного размера является необходимым условием для сохранения и реализации клеткой морфогенетического потенциала, и это условие осуществляется вследствие координированного взаимодействия элементов цитоскелета и клеточной стенки (Lloyd, 1980).

Ранее нами было показано (Румянцева и др., 1998), что морфогенные каллусы Fagopyrum tataricum сохраняют характерную морфологию, способность к регенерации и хромосомные числа стабильными в течение длительного культивирования (до 10 лет). Неморфогенные рыхлые клоны возникают в таких каллусах с частотой один случай на 30-40 пассажей и могут рассматриваться как спонтанные точковые мутации. Использование такого объекта может быть крайне удобным для изучения индуцированной нестабильности in vitro.

1. Изучить влияние длительного воздействия колхицина на параметры культурального цикла (прирост биомассы, пролиферативная активность), а также на морфолого-гистологические особенности морфогенного и неморфогенного каллусов Fagopyrum tataricum.

4. Изучить влияние колхицина на морфогенную активность каллусов гречихи татарской.

5. Проанализировать белковый состав каллусов с разным морфогенным потенциалом.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование действия колхицина на целый ряд параметров длительно культивируемых каллусных линий. Изучены аспекты действия разных концентраций этого ингибитора полимеризации микротрубочек на морфологию, цитогенетику и морфогенную способность каллусных культур, полисахаридный состав клеточных стенок в них, а также на спектр синтезируемых белков. Впервые показано, что неморфогенные каллусы более чувствительны к ингибитору сборки микротрубочек колхицину, по сравнению с морфогенными, из-за их неспособности останавливать последующее деление клеток в ответ на нарушение митоза и возникновение аномалий кариотипа (поли- и анэуплоидизация клеток). Впервые показано, что длительное культивирование на среде с колхицином вызывает значительное изменение полисахаридного состава клеточных стенок морфогенных каллусов: уменьшение количества пектинов и увеличение количества гемицеллюлоз. Выявлено, что обработка колхицином приводит к нарушению генетической стабильности морфогенного каллуса, индуцируя в нем геномные и хромосомные аберрации. Эта генетическая и морфологическая нестабильность сохраняется в течение многих пассажей на среде без колхицина. Впервые показано, что в отличие от растворимых белков неморфогенного каллуса большинство белков морфогенных каллусов гликозилировано. Каллусы с наибольшим морфогенным потенциалом имеют наиболее богатый спектр гликозилированных белков. Показано, что неморфогенные каллусы гречихи татарской, по ряду признаков (генетическая нестабильность, высокая пролиферативная активность, неспособность клеток к дифференцировке, слабые межклеточные контакты, большая чувствительность к цитостатическому агенту колхицину) аналогичны клеткам опухолей животных. Колхицин вызывает значительное увеличение частоты возникновения клонов неморфогенного каллуса и, таким образом, оказывает на морфогенные каллусы гречихи действие сходное с канцерогенным действием этого ингибитора на клетки животных. Получена колхицин-резистентная линия каллуса, показано, что она имеет отличия по параметрам цикла культивирования и генетической стабильности от чувствительного к колхицину каллуса.

Положения, выносимые на защиту. 1. Длительное воздействие колхицина приводит к разрыхлению структуры морфогенного каллуса F. tataricum, что коррелирует с изменением полисахаридного состава клеточных стенок этого каллуса: уменьшается количество пектинов и увеличивается количество гемицеллюлоз.

2. Культивирование на среде с колхицином индуцирует морфологическую и генетическую нестабильность в морфогенном каллусе, которая сохраняется в течение многих пассажей на среде без колхицина.

3. Все клоны морфогенного каллуса, отобранные после воздействия колхицином, проявляют меньшую морфогенную активность по сравнению с контролем. Неморфогенные и частично морфогенные клоны (способные к проявлению отдельных форм морфогенеза) содержат меньше растворимых белков по сравнению с морфогенным каллусом. В отличие от растворимых белков неморфогенного каллуса большинство белков морфо генных и частично морфогенных каллусов гликозилировано. Каллусы с наибольшим морфогенным потенциалом имеют наиболее богатый спектр гликозилированных белков.

4. Неморфогенные каллусы более чувствительны к колхицину, по сравнению с морфогенным и, из-за их неспособности останавливать последующее деление клеток в ответ на нарушение митоза и возникновение аномалий кариотила (поли-и анэушюидизация клеток).

5. Неморфогенные каллусы гречихи татарской, по ряду признаков аналогичны клеткам опухолей животных. Колхицин вызывает значительное увеличение частоты возникновения клонов неморфогенного каллуса и, таким образом, оказывает на морфогенные каллусы гречихи действие сходное с канцерогенным действием этого ингибитора на клетки животных.

6. Колхицин-резистентная линия каллуса гречихи татарской отличается от чувствительных к колхицину каллусов более коротким циклом культивирования и высокой частотой хромосомных аберраций. Устойчивость каллуса к колхицину не связана с экстрахромосомной амплификацией генов.

1.Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мухитов, Александр Ринатович

выводы

1. Длительное воздействие колхицина приводит к существенным изменениям морфологии морфогенного каллуса Р^апсит: разрыхлению его структуры и исчезновению проэмбриональных клеточных комплексов. На клеточном уровне эти изменения сопровождаются вакуолизацией клеток, потерей межклеточных контактов и гибелью части клеток с признаками, характерными для программируемой клеточной смерти.

4. В результате экспериментальной дестабилизации генома морфогенного каллуса получена рыхлая колхицин-резистентная линия, отличающаяся от чувствительных к колхицину каллусов более коротким циклом культивирования и высокой частотой хромосомных аберраций. Устойчивость каллуса к колхицину не связана с экстрахромосомной амплификацией генов.

-1306. Впервые обнаружено, что неморфогенные каллусы менее устойчивы к колхицину, по сравнению с морфогенными, из-за их неспособности останавливать последующее деление клеток в ответ на нарушение митоза и возникновение аномалий кариотипа (поли- и анэуплоидизация клеток). 7. Неморфогенные каллусы гречихи татарской, по ряду признаков (генетическая нестабильность, высокая пролиферативная активность, неспособность клеток к дифференцировке, слабые межклеточные контакты, повышенная чувствительность к колхицину) аналогичны клеткам опухолей животных. Колхицин вызывает значительное увеличение частоты возникновения клонов неморфогенного каллуса и, таким образом, оказывает на морфогенные каллусы гречихи действие сходное с канцерогенным действием этого ингибитора на клетки животных.

Заключение

Таким образом, проведённые нами исследования показали, что колхицин при длительном действии оказывает сильное дестабилизирующее влияние на геном, и генетическая нестабильность, индуцированная колхицином, проявляется в последующих после обработки колхицином пассажах каллуса. Вызываемая действием колхицина дестабилизация генома делает этот антитубулиновый агент эффективным инструментом для индуцирования мутаций, но может ограничить его применение для получения полиплоидов. Как было показано (Марьяхина и др., 1990), вегетативное потомство полиплоидных форм чеснока, полученных действием колхицина, отличались высокой частотой вариабельности признаков и аномалиями кариотипа.

Кроме того, наши исследования показали, что морфогенные и неморфогенные каллусы Р. 1а1апсит сильно отличаются по чувствительности к колхицину. При обсуждении причин разной чувствительности этих каллусов к колхицину, необходимо учесть различную природу этих каллусов. Рыхлый неморфогенный каллус гречихи принципиально отличается по свойствам клеток как от эмбриогенного каллуса, так и от каллусов плотной консистенции с редуцированным морфогенным потенциалом. Клетки последних способны к дифференцировке и гистогенезу - образованию элементов проводящей ткани (трахеид), а иногда и к органогенезу. Клетки же неморфогенного каллуса гречихи по ряду признаков подобны клеткам опухолей животных. К числу таких признаков относятся следующие:

1. Неспособность клеток к дифференцировке: неморфогенный каллус представлен исключительно клетками паренхимного типа, не чувствительными к внешним сигналам развития - добавление гормонов, индуцирующих дифференцировку клеток и морфогенез в морфогенных каллусах, не дают такого отклика у неморфогенного каллуса. Как известно, у раковых клеток в результате мутаций в онкогенах нарушены механизмы, определяющие судьбу клетки, поэтому они не способны к дифференцировке (Терци, 1972);

2. Слабые межклеточные контакты: клетки НК не имеют плазмодесм (Румянцева и др., 1998) и значительно дезагрегированы. В опухолях животных адгезионные межклеточные контакты нарушены (СЬг^ойт, БешЬ, 1999);

3. Высокая степень генетической нестабильности: НК представляет собой миксоплоидную клеточную популяцию, в нём высок процент анэуплоидных клеток и более высокая частота хромосомных аберраций, по сравнению с МК. Генетическая нестабильность один из основных признаков трансформированных клеток животных. Для них характерен высокий процент хромосомных аберраций (Новиков, 1996, Терци, 1997);

4. Высокая пролиферативная активность: рост НК лимитируется только наличием в среде питательных веществ и митогенных факторов (гормонов). У клеток опухолей животных жизненный цикл клетки трансформирован, по сравнению с нормальными клетками: они практически бессмертны и непрерывно делятся (Терци, 1997).

Важно отметить также и то, что раковые клетки очень чувствительны ко всем агентам, затрагивающим клеточный цикл, что определяется их высокой пролиферативной активностью. Нормальные клетки при нарушении хода клеточного цикла останавливаются на всД^-фазе и в дальнейшем, если повреждения серьёзные, не вступают в деление (ТпеШ е! а1., 1996; Новиков, 1996; Туровец и др., 2000). Трансформированные клетки, в отличие от нормальных клеток, не блокируются на стадии О] и продолжают деление. В результате, они накапливают мутации и нарушения метаболизма, что в конечном итоге приводит к их гибели. На этом свойстве трансформированных клеток основаны методы терапии рака. Неморфогенный каллус Fagopyшm 1а1апсиш проявил в нашей работе значительно большую чувствительность к колхицину - агенту серьёзно нарушающему клеточный цикл. При этом, на среде с колхицином в морфогенном каллусе пролиферация клеток, после короткого периода активации подавлялась. Неморфогенный каллус в этих условиях продолжал делиться. В этом отношении интересен эффект концентрации ингибитора на прирост биомассы неморфогенного каллуса. Наименьшая из использованных нами концентрация колхицина (0,25 мМ) вызвала наибольшее ингибирование прироста биомассы. Однако именно эта концентрация колхицина способствовала наибольшей пролиферативной активности

НК. Таким образом, логично предположить, что гибель клеток НК на среде с колхицином сопряжена с его активным делением на этой среде. Полученные нами данные позволяют предположить, что клетки морфогенного каллуса, в отличие от клеток неморфогенного, обладают ненарушенным механизмом контроля генетической стабильности клетки, и способны прекращать деление при повреждении. В этом случае, после аномального митоза клетки МК должны были блокироваться на стадии вь а клетки НК - продолжать делиться, как было показано на линиях клеток человека, одна из которых имела мутации по гену, контролирующему генетическую стабильность (Туровец и др., 2000). У НК даже клетки с явно несбалансированным геномом (высокополиплоидные клетки) продолжают делиться, тогда как у МК высокополиплоидные клетки если и образуются, то в деление больше не вступают. В дальнейшем они, по-видимому, погибают, возможно, по механизму апоптоза, так как мы наблюдали цитологические картины очень сходные с таковыми, описанными при программированной клеточной смерти. У НК явление аналогичное ПКС, имело более массовый характер, и наблюдалось в клетках с большим количеством ядер и микроядер. Таким образом, клетки НК проходили несколько аномальных митозов на среде с колхицином, что и приводило их к гибели. Интересно отметить, что у МК клетки с признаками апоптоза не содержали большого количества ядер и микроядер, как у НК. Вышеизложенное позволяет предположить, что клетки неморфогенного каллуса менее чувствительны к индукции апоптоза, чем таковые морфогенного каллуса. Известно, что трансформированные (раковые) клетки животных менее чувствительны к индукции процесса программированной клеточной смерти, что и позволяет им выживать при повреждениях генома, фатальных для нормальных клеток (Новиков, 1996). В результате, клетки опухолей накапливают большое количество мутаций и аномалий генома. Низкая чувствительность к индукции апоптоза повышает выживаемость клеток при мутациях, но с другой стороны, лишает клетки возможности прекратить пролиферацию и репарировать повреждение. Несмотря на повреждение, клетки опухолей продолжают делиться, и в результате оказываются гораздо более уязвимыми при длительном действии повреждающего агента, чем нормальные клетки, на чём и основана терапия рака с помощью химических препаратов и радиации. Полученные нами данные свидетельствуют о различиях в эффектах колхицина на морфогенный и неморфогенный каллусы гречихи, аналогичных описанным для реакции нормальных и раковых клеток животных на повреждающее действие химических препаратов.

Таким образом, неморфогенный каллус может рассматриваться как совокупность клеток, у которых нарушены механизмы контролирующие деление, способность к дифференцировке и генетическую стабильность. Именно эти механизмы нарушены у раковых клеток животных.

Действие колхицина значительно повысило частоту образования клонов рыхлого каллуса - такие клоны образовывались в каждом последующем пассаже на обычной среде на протяжении 40-45 пассажей. Хорошо известно, что колхицин обладает канцерогенным действием на клетки животных. Он вызывает трансформацию клетки и превращение её в опухолевую. Конкретный механизм этого явления до конца не ясен, однако есть свидетельства, что клетки опухолей имеют отличия в строении цитоскелета (в особенности цитоскелета ядра), по сравнению с нормальными клетками. Более того, вещества, способные вызвать реверсии раковых клеток к норме, не оказывают такого эффекта при ингибировании полимеризации микротрубочек колхицином (Puck, Krystoshek, 1992). Таким образом, для сохранения нормального статуса клетки необходима определённая организация цитоскелета (по-видимому, наиболее важна правильная организация хроматина клетки, в установлении которой участвуют микротрубочки). Кроме того, известно, что один из ключевых моментов превращения нормальной клетки в раковую - изменение чувствительности клетки к индукции апоптоза. Если повреждённая клетка не погибнет по механизму апоптоза, то высока вероятность её превращения в опухолевую. Известно, что общим свойством факторов, вызывающих апоптоз является их способность нарушать клеточный цикл (Ucker et al., 1992). Таким образом, разрушение микротрубочек колхицином, ведущее к нарушению клеточного цикла, может быть селективным фактором отбора клеток наименее чувствительных к апоптозу. В нашей работе применялось длительное действие колхицина на культуры клеток, при котором клетки подвергались мощному давлению селектирующего фактора. Как показали наши исследования, клетки

- 128морфогенного каллуса после прохождения аномальных митозов останавливали деление. После пересадки на среду без колхицина значительная часть каллуса погибала, деление возобновлялось в отдельных участках каллуса. Можно предположить, что клетки, выжившие на среде с колхицином, после пересадки на обычную среду проходили аномальные деления. На клетках животных и грибов показано, что для активизации процесса программированной клеточной смерти после повреждения клетка должна пройти через митоз (Кгитап е! а1., 1991). По-видимому, в последующих после обработки колхицином циклах деления происходил отбор клеток менее чувствительных к индукции апоптоза. В результате, в популяции оставались клетки, наиболее устойчивые к аномалиям генома. У животных такими свойствами обладают клетки, находящиеся на разных стадиях трансформации. Если рассматривать клетки неморфогенного каллуса как аналоги опухолевых клеток животных, то их возникновение в клеточной популяции должно быть следствием событий, аналогичных таковым при трансформации клеток животных. Отбор клеток менее чувствительных к индукции апоптоза, и потому более устойчивых к повреждениям генома, по-видимому, способствовал повышению частоты трансформационных событий в клетках каллусов гречихи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухитов, Александр Ринатович, Казань

1. Бабаева С. А., Петрова Т. Ф., Гапоненко А. К. Полиплоидия и политения в культивируемых in vitro клетках злаков // Генетика. 1995. - Т. 31. - С. 678-683.

2. Бердышев Г. Д., Голда Д. М., Зуй В. Д. и др. Общая и молекулярная генетика: Практикум, Киев.: Вища школа, 1984, 239 с.

3. Бутенко Р. Г., Гусев М. В., Киркин А. Ф. Биотехнология: Клеточная инженерия. -М.: Высшая школа, 1987.

4. Бычкова Г. Ц., Бутенко Р. Г. Синхронизация клеточных делений в суспензионной культуре женьшеня настоящего с помощью 5-аминоурацила // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. — 1978. - С. 17-21.

5. Васильев А. Е. Сравнительная структурно-функциональная характеристика цитоскелета животных и высших растений // Журнал общей биологии. 1996,-Т.57,- №3,- С.293-325.

6. Витанова 3., Влахова М., Денчев П. и др. Сомаклональная изменчивость // Физиология и биохимия культурных растений. 1990. - Т. 22. — С. 419-426.

7. Внучкова В. А. Изучение условий выращивания каллуса томата в пересадочной культуре и его цитологическая характеристика // Культура клеток растений. -Киев: Наукова думка. 1978. - С. 116-119.

8. Глотов Н. В., Животовский J1. А., Хованов Н. В. и др. Биометрия, Л.: 1982, 264 С.

9. Данилина А. Н., Александрова И. В., Данилов А. В. Цитоморфологическое изучение культуры ткани Panax ginseng // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978. - С. 129-133.

10. Ю.Данилина А. Н., Данилов А. В. Митотическая активность популяции клеток культуры ткани Vicia faba // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. -1978.-С. 37-42.

11. П.Дмитриева H. Н. Проблемы регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: 1981. — С. 113-121.

12. Каллак X. И., Ярвекюльг Л. Я. О влиянии 2, 4-D на репродукцию ядер в каллусной культуре гороха // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978.-С. 104-108.

13. Кацитадзе К. П. Цитологические особенности каллусообразования меристемы томатов in vitro // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978. - С. 68-71.

14. Кежелите Д. М. Характеристика популяции клеток Dioscorea deltoidea в суспензионной культуре // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. -1978.-С.57-64.

15. Кунах В. А. Особенности культуры изолированных тканей растений как клеточной популяции в связи с перспективой применения её в генетике и селекции // Экспериментальная генетика растений. Киев: Наукова думка. 1977. -С. 105-112.

16. Кунах В. А. Геномная изменчивость и накопление индолиновых алкалоидов в культуре клеток раувольфии змеиной // Биополимеры и клетка. 1994. - Т. 10. — С.3-30.

17. Кунах В. А., Алпатова Л. К. Динамика митотической активности и плоидности клеток в культуре тканей табака в течение пассажа // Экспериментальная генетика растений. Киев: Наукова думка. - 1982. -С. 79-89.

18. Кунах В. А., Легейда В. С. Цитогенетическое изучение цитокининзависимого штамма культуры клеток табака // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1982. - С. 74-79.

19. Лакин Г. Ф. Биометрия, М.: Высшая школа, 1990.

20. Левенко Б. А., Легейда В. С., Березенко Н. П. и др. Цитогенетическое изучение каллусной ткани из пыльников черешни и земляники // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978. — С. 120-123.

21. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Перевод с англ. М.: Мир 1984, 384 с.

22. Марьяхина И. Я. Изменчивость клеток капусты при выращивании их вне организма // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978. — С. 113116.

23. Марьяхина И. Я., Туголуков В. П., Туголукова Е. И. и др. Морфогенетические осбенности вегетативного потомства полиплоидного чеснока, полученного методом колхицинирования in vitro // Сельскохозяйственная биология. 1990. -№ 1. - С. 144-151.

24. Новиков В. С., Булавин Д. В., Цыган В. Н. Молекулярные механизмы инициации клеточной гибели / Программированная клеточная гибель. Под ред. Новикова В. С., С.-Пб.: Наука, 1996. С. 30-51.

25. Новиков В. С., Ястребов Д. В., Бахтин М. Ю. Генная регуляция апоптоза / Программированная клеточная гибель. Под ред. Новикова В. С., С.-Пб.: Наука, 1996. С. 72-79.

26. Пахомова В. М. Модели стрессовых взаимодействий и общебиологические закономерности. Неспецифичекие и специфические характеристики ответной реакции клеток растений. Казань, 1999ю 150 с.

27. Полевой В. В. Физиология растений. М.: Высшая школа, 1989.

28. Раклявичене Д., Урбонайте Б. Содержание ядерной ДНК в процессе дедифференциации клеток каллуса табака в зависимости от типа ауксина и плоидности экспланта // Физиология и биохимия культурных растений. 1995. -Т. 25. - С. 367-373.

29. Румянцева Н. И., Валиева А. И., Самохвалова Н. А., Мухитов А. Р., Агеева М. В., Лозовая В. В. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу // Цитология. 1998. — Т. 40. - № 10.-С. 835-843.

30. Смирнова Е. А. Организация митотического веретена в клетках высших растений // Физиология растений. 1998. - Т. 45. - №2. - С. 198-207.

31. Соловьян В. Т., Спиридонова Е. В., Кунах В. А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauwolfia serpentina // Генетика. 1994. - Т. 30. - С. 250-254, 399-403.

32. Терци М. Генетика и животная клетка. М.: Мир, 1997. - 296 с.

33. Туровец Н. А., Агапова Л. С., Копнин П. Б. и др. Влияние инактивации опухолевого супрессора p33WG1 на функцию "сверочных точек" клеточного цикла и стабильность генома // Генетика. 2000. - Т. - 36. - № 3. - с. 385-392.

34. Усов А. И., Яроцкий С. В. Раздельное определение гексоз и пентоз при помощи о-толуидинового реагента // Известия АН СССР, сер. Химическая,- 1974,- №4,-С.877-880.

35. Фролова Л. В. Особенности популяций культивируемых клеток // Культура клеток растений. -М.: 1981,- С. 5-13.

36. Фролова Л. В., Шамина 3. Б. Динамика клеточной популяции в культуре ткани V. faba // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. — 1978. — С. 27-32.

37. Хвырлёва Ц. Д., Рыжик М. В., Ананьев Е. В. и др. Деметилирование рДНК в каллусной ткани ячменя, культивируемой in vitro // Докл. АН СССР. 1986. - Т. 290. -№5.-С. 1249-1251.

38. Хесин Р. Б. Непостоянство генома М.: Наука, 1984, 472 с.

39. Шамина 3. Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro // Культура клеток растений. Киев: Наукова думка. - 1978. - С. 80-90.

40. Щербань А. Б. Реорганизация высокоповторяющейся ДНК генома ячменя в условиях культивирования in vitro // Генетика. — 1994. — Т. 30. С. 879-885.

41. Abe H., Funada R., Imaizumi H. et al. Dynamic changes in the arrangement of cortical microtubules in conifer tracheids during differentiation // Planta. 1995. - V. 197. - P. 418-421.

42. Agutter P. S.,SuchIing K. E. Effect of colchicine on mammalian liver nuclear envelope and on nucleo-cytoplasmic RNA transport // Biochem. Biophys, Acta, 1982. - V. 698. - P. 223-229.

43. Amos L. A. Structure of microtubules. In Microtubules. K. Roberts and J. S. Hyams, eds (London: Academic Press, Ltd), P. 1-64.

44. Andrew J. M., Timasheff S. N. Interaction of tubulin with single ring analogues of colchicine // Biochemistry. 1982. - V. 21. - P. 534-543.

45. Ashmore S. E., Gould A. R. Karyotype evolution in a tumor derived plant tissue culture analyzed by Gimsa C-bending // Protoplasma. 1981. - V. 106. - P. 197-308.

46. Ashmore S. E., Shapcott A. S. Cytogenetic studies of H. gracilis in both callus and suspension cell cultures // Theor. and Appl. Genet. 1989. - V. 78. - P. 249-259.

47. Avila J. Microtubule function // Life Sci. 1992. - V. 50. - P. 327-334.

48. Bai!ly E,, Doree M., Nurse P., Bornens M. p34cde2 is located in both nucleus and cytoplasm; part is centrosomally associated at G2/M and enters vesicles at anaphase // EMBO J. 1989. - V. 8. - P. 3985-3995.

49. Baird Wm. V., Yamamoto E., Zeng L. The role of tubulins in dinitroaniline resistance in Eleusine indica // Cell Biol. Int. 1997. - V. 21. - P. 849-852.

50. Baluska F., Parker J. S., Barlow P. W. Specific patterns of cortical and endoplasmic microtubules associated with cell growth and tissue differentiation in roots of maize (Zea mays L.) // J. Cell Sci. 1992. - V. 103. - P. 191-200.

51. Baluska F., Volkmann D., Barlow P. W. Nuclear components with microtubule organizing properties in multicellular eukaryotes: functional and evolutionary considerations // Int. Rev. of Cytol. 1997. - V. 175. - P. 91-135.

52. Baskin T. I., Bivens N. J. Stimulation of radial expansion in Arabidopsis root by inhibitors of actomyosin and vesicle secretion but not by various inhibitors of metabolism // Planta. 1995. - V. 197. - P. 514-521.

53. Baskin T. I., Wilson J. E., Cork A. et al. Morphology and microtubule organization in Arabidopsis roots exposed to oryzalin or taxol // Plant Cell Physiol. 1994. - V. 35. -P. 935-942.

54. Bassell G.J. High resolution distribution of mRNA within the cytoskeleton // J. Cell Biochem. 1993. - V. 52. - p. 127-133.

55. Bayliss M. W. Factors affecting the frequency of tetraploid cells in a predominantly diploid suspension culture of Daucus carota // Protoplasma. 1977. - V. 92. - P. 109115.

56. Beltramo D. M., Alonso A. del C, Barra H. S. Tyrosinated, detyrosinated and acetylated tubulin isotypes in rat brain membranes. Their proportions in comparison with those in cytosol // Mol. Cell. Biochem. 1992. - V. 112. - P. 173-180.

57. Ben'Zeev A., Farmer S. R., Penman S. Mechanisms of regulating tubulin synthesis in cultured mammalian cells // Cell. 1979. - V. 17. - P. 319-325.

58. Berger F., Taylor A., Brownlee C. Cell fate determination by the cell wall in early Fucus development// Science. 1994. - V. 263. - P. 1421-1423.

59. Bergfeld R., Speth V., Schopfer P. Reorientation of microfibrils and microtubules at the outer epidermal wall of maize coleoptiles during auxin-mediated growth // Bot. Acta. 1988.-V. 101.-P. 57-67.

60. Bernd A., Schroder H. S., Zahn R. K., Muller W. E. G. Modulation of the nuclear-envelope nucleoside triphosphatase by poly(A)-rich mRNA and by microtubule protein // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 129. - P. 43-49.

61. Blaustein J. D., Olster D. H. Colchicine induced accumulation of estrogen receptor and progestin receptor immunoreactivity in atypical areas in guinea pig brain // J. Neuroendocrinol. 1993. - V. 5. - P. 63-70.

62. Blin N., Stafford D. W. Isolation of highmolecular-weight DNA // Nucleic Acid Res. -1976. V. 3. - P. 2303.

63. Bolwell G.P. Defense-related proteins in higher plants // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V. 59. - P. 873-907.

64. Bolwell G.P. Dynamic aspects of the plant extracellular matrix // Int. Rev. of Cytol. -1993. -V. 146. P. 261-323.

65. Borkind Ch., Renee Sung Z. Isolation and characterization of colchicine-resistant cell lines of carrot // Physiologia Plantarum. 1991. - V. 82. - P. 109-116.

66. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem.-1976,- V.72.- P.248-254.

67. Bretscher A. Microfilament structure and function in the cortical cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Biol. 1991. -V. 7.-P. 337-374.

68. Brett C.T., Waldron E.K. Physiology and biochemistry of plant cell wall.- Eds. Black M., Cahapman E.J.- London: Unwin Hyman, 1990,- 194p.

69. Brown P. T. H. DNA methylation in plants and its role in tissue culture // Genome. -1989.-V. 31.-P. 7171-729.

70. Brown R. C., Lemmon B. E. Polar organizers in monoplastidic mitosis of hepatics (Bryophita) // Cell Motil. Cytoskel. 1992. - V. 22. - P. 72-77.

71. Cassab G. 1. Arabinogalactan-proteins during the development of soybean root nodules // Planta. 1986. - V. 168. - P. 441-446.

72. Chaban Ch. I., Blume Ya. B., Ripetsky R. T., Kit N. A. Morphogenese effects of light and microtubule-disrupting agents // Cell Biol. Int. 1997. - V. 21. - P. 858.

73. Chapman A., Helleboid S., Blervacq A.-S., Vasseur J., Hilbert J.-L. Removal of the fibrillar network surrounding Cichoium somatic embryos using cytoskeleton inhibitors: analysis of proteic components. // Plant Sei. 2000. V. 150. - P. 103-114.

74. Chasan R. Microtubule and MAPs // Plant Cell. 1993. - V. 5. - P. 995-997.

75. Choi J.H., Sung Z.R. Two-dimentional gel analysis of carrot somatic embiyogenesis proteins. // Plant Mol. Biol. Rep. 1984. - V. 2. - P. 19-25.

76. Chou I.-N., Zaigler J., Rapaport E. Imbalance of total cellular nucleotide pools and mechanism of the colchicine-induced activation // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. -V. 81. - P. 2401-2405.

77. Christofori G., Semb H. The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumor-supressor gene // Trend in biological sciences. 1999. - V. 24. - P. 73-76.

78. Chu B., Snustad D. P., Carter J. B. Alteration of ß-tubulin gene expression during low-temperature exposure in leaves of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1993. - V. 103.-P. 371-377.

79. Cleary A. L., Gunning B. E. S., Wasteneys G. O., Hepler P. K. Microtubule and F-actin dynamics at the division site in living Tradescantia stamen hairs cells // J. Cell Sei. 1992. - V. 103. - P. 977-988.

80. Colasanti J. Cho S.- O., Wick S., Lundaresan V. Localization of the root tip and stomatal complex: association with the predicted division site in premitotic cells // Plant Cell. 1993,-V. 5.-P. 1101-1111.

81. Cordewiner J., Booij H., Van der Zandt H., Van Engelen F., Van Kämmen A., De Vries S. Tunicamicin-inhibited carrot somatic embiyogenesis can be restored by secreted cationic peroxidase isoenzymes // Planta. 1991. - V. 184. P. 478-486.

82. Cyr R. Y., Palevitz B. A. Microtubule-binding proteins from carrot // Planta. 1989. -V. 177.-P. 245-260.

83. DAmato F. The problem of genetic stability in plant tissue and cell cultures / Crop genetic resources for today and tomorrow, ed. Frankel O. H., Hawkes J. G., New York, 1975. P. 333-348.

84. DAmato F. Cytogenetics of differentiation in tissue and cell culture / Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture, ed. Rainert J., Bajaj V. P. S., New York. 1977. - P. 343-463.

85. De Jong, A. J. Cordewener J., Lo Schiavo F. et al. A carrot somatic embryo mutant is rescued by chitinase // The Plant Cell. 1992. - V. 4. - P. 425-433.

86. De Loof A. The electrical dimension of cells: The cell as a miniature electrophoresis chamber // Int. Rev. Cytol. 1986. - V. 104. - P. 251-352.

87. De Loof A., Broek J. V., Janssen I. Hormones and the cytoskeleton of animals and plants // Int. Review of cytology. 1996. - V. 166. - P. 1-57.

88. Ding J. P., Picard B. G. Mechanosensory calcium-selective cation channels in epidermal cells // Plant J. 1993. - V. 3. - P. 83-110.

89. Ding J. P., Sanchez E., Tancinca M., Nathan C. Interaction of bacterial lipopolysaccharide c with microtubule proteins // J. Immunol. 1992. - V. 148. - P. 2853-2858.

90. Dolezel J., Binarova P. The effects of colchicine on ploidy level, morphology and embryogenic capacity of alfalfa suspension cultures // Plant Sci. 1989. - V. 64. - P. 213-219.

91. Du Lieu H., Barbier M. High frequencies of genetic variant plants regenerated from cotyledons of tobacco / Variability in plants regenerated from tissue culture. Ed. Earle E. D., Demarly Y., New York, 1982. 392 pp.

92. Durso N. A., Cyr R. J. A calmodulin-sensitive interaction between microtubules and higher plant homolog of elongation factor Id // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 893905.

93. Edgar B. A., Odell G. M., Schubiger G. Cytoarchitecture and the patterning of fushi tarazu expression in the Drosophila blastoderm // Genes Dev. 1987. - V. 1. - P. 12261237.

94. Edwards E. S., Roux S. J. The influence of gravity and eight gametophytes // Biol. Bull. 1997. - V. 192. - P. 139-140.

95. Emons A. M. C., Derksen J., Sassen M. M. A. Do microtubules orient plant cell wall microfibrills ? // Physiol. Plantarum. 1992. - V. 84. - P. 486-493.

96. Fienberg A. A., Choi J. H., Lubich W. P., Sung Z. R. Developmental regulation of polyamine metabolism in growth and differentiation of carrot culture // Planta. 1984. - V. 162. - P. 532-539.

97. Fincher G. B., Stone B. A., Clarke A. E. Arabinogalactan-proteins; structure, biosynthesis and function // Annu. Rev. Plant Physiol. 1983. - V. 34. - P.47-70.

98. Fojo A., Akiyama S. I., Gotterman M. M., Pastan I. Reduced drug accumulation in multiple drug resistant human KB carcinoma cell lines // Cancer Res. 1985. - V. 45. -P.3002-3007.

99. Fojo A., Whang-Peng J., Gottesman M., Pastan I. Amplification of DNA sequences in human multi drug resistant KB carcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. V. 62. - P. 7661-7664.

100. Fosket D. E., Morejohn L. C. Structural and functional organization of tubulin // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. -V. 43., P. 201-240.

101. Frigerio G., Burn M., Bopp D., Barumgartner S., Noll M. Structure of the segmentation gene paired and the Drosophila PRD gene set as part of a gene network // Cell. 1986. - V. 47. - P. 735-746.

102. Fry S.C. The growing plant cell wall: chemical and metabolic analysis. New York: Longmann scientific and technical.- 1988,- 333p.

103. Fukuda H. Regulation of tubulin degradation in isolated Zinnia mesophyll cells in culture // Plant Cell Physiol. 1989. -V. 30(2). - P. 243-252.

104. Fuller S. D., Kenney J. M., Karsenti E. Centrosomes // Curr. Opin. Str. Biol. -1992. V. 2. - P. 264-274.

105. Garner C. C., Tucher R. P., Matus A. Selective localization of messenger RNA for cytoskeletal protein MAP2 in dendrites // Nature (London). 1988. - V. 336. - P. 674677.

106. Geiger B. Membrane cytoskeleton interaction // Bioch. Biophys. Acta. 1983. - V. 737. - P. 305-341.

107. Gerasimova-Navashina E. N. Additional data on the course of mitosis in the plant cell // Dokl. Acad. Nauk SSSR. 1978. - V. 273. - P. 265-267.

108. Giddings T. H., Staehelin L. A. Microtubule-mediated control of microfibril deposition: a re-examination of the hypothesis. In CW Lloyd, ed, The cytoskeletal basis of plant growth and form. Academic Press, London: 1991. - P. 85-99.

109. Glass W. F., Briggs R. C., Hnilica L. S. Use of lectins for detection of electrophoretically separated glycoproteins transferred onto nitrocellulose sheets // Anal. Biochem. 1981. - V. 115. - P. 219-224.

110. Gmitter F. G., Ling X., Cai Ch., Grosser I. Colchicine induced polyploidy in Citrus embryogenic cultures, somatic embryos, and regenerated plantlets // Plant Sci. 1991. -V. 74.-P. 135-141.

111. Goddard R. H., Wick S. M., Silflow C. D., Snustad D. P. Microtubule components of the plant cell cytoskeleton // Plant Physiol. 1994. - V. 104. - P. 1-6.

112. Gross P., Cropp J., Roninson I., Varshavsky A., Housman D. E. Isolation and characterization of DNA sequence amplified in multi drug resistant hamster calls // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 337-341.

113. Hahne G., Mayer J.E., Lorz H. Embryogenic and callus-specific proteins in somatic embryogenesis of the grass, Dactylis glomerata L. // Plant Sci. 1988. - V. 55. - P. 267-279.

114. Haines F. O., Dicherson R. M., Wilson L., Owellen R. J. Differences in the binding properties of vinca alcaloids and colchicine to tubuline by varying protein sources and methodology. Biochem. Pharmacol. - 1978. - V. 27. - P. 71-76.

115. Han I.- S., Jongewaard I., Fosket D. E. Limited expression of a diverged P-tubulin gene during soybean (Clycine max (L.) Merr.) development // Plant Mol. Biol. 1991. -V. 16.-P. 225-234.

116. Hartwig J. H., Kwiatkowski D. J. Actin-binding proteins // Curr. Opin. Cell Biol. -1991. V. 3. - P. 87-97.

117. Hawes C., Martin B. Deep of plant efcring cells: cytoskeleton and coated pits // Cell Biol. Int. Rep. 1986. - V. 10. - P. 985-992.

118. Hayashi T., Yoshida K. Cell expansion and single-cell separation induced by colchicine in suspension-cultured soybean cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85. - P. 2618-2622.

119. Heald R., Tournebize R, Habermann A., Karsenti E., Hyman A. Spindle assembly in Xenopus levis egg extract: respective role of centrosome and microtubule self-organization // J. Cell Biol. 1997. - V. 138. - P. 615-628.

120. Heath I. B. A unified hypothesis for the role of membrane-bound enzyme complexes and microtubules in plant cell wall synthesis // J. Theor. Biol. 1974. -V.48. - P. 445-449.

121. Heidemann S. R., Sander G., Kirschner M. Evidence of a functional role of RNA in centrioles // Cell. 1977. - V. 10. - P. 337-350.

122. Hesketh J. E., Pryme I. F. Interaction between mRNA, ribosomes and the cytoskeleton //Biochem. J. 1991. - V. 277. - P. 1-10.

123. Hitt A. L., Luna E. J. Membrane interaction with the actin cytoskeleton // Curr. Opin Cell Biol. 1994. - V. 6. - P. 120-130.

124. Hugdahl J. D., Bokros C. L., Hanesworth V. R., Aalund G. R., Morejohn L. C. Unique functional characteristics of the polymerization and MAP binding regulatory domains of plant tubulin // The Plant Cell. 1993. - V. 5. - P. 1063-1080.

125. Hugdahl J. D., Bokros C. L., Morejohn L. C. End-to-end annealing of plant microtubules by the p86 subunit of eukaryotic initiation factor (iso)4F // Plant Cell. -1995.-V. 7.-P. 2129-2138.

126. Hush J. M., Overall R. L. Re-orientation of cortical F-actin is not necessary for ound-induced microtubule reorientation and cell polarity establishment // Protoplasma. 1992,-V. 169.-P. 97-106.

127. Ingold E., Sugiyama M., Komamine A. Secondary cell wall formation: changes in cell wall constituents during the differentiation of isolated mesophyll cells of Zinnia elegans to tracheary elements // Plant Cell Physiol.- 1988,- V.29.- P.295-303.

128. Isenberg G., Niggli V. Interaction of cytoskeletal proteins with membrane lipids // Int. Rev. Cytol. 1998. - V. 178. - P. 73-125.

129. Ishida K., Katsumi M. Effects of giberellin and abscisic acid on the cortical microtubule organisation in hypocotyl cells of eight grown cucumber seedlings // Int. J. Plant Sci. 1992. - V. 153. - P. 155-163.

130. Ishii S. Isolation and characterization of cell wall pectic substances from potato tuber // Phytochemistry. 1981. - V. 20. - P. 2329-2333.

131. Iwata K., Hogetsu T. Arrangement of cortical microtubules in Avena coleoptiles and mesocotyls and Pisum epycotyls II Plant Cell Physiol. 1988. - V. 29. - 807-815.

132. Jefferey W. R. Spatial distribution of mRNA in the cytoskeletal framework of ascidian eggs // Dev. Biol. 1984. - V. 103. - P. 482-492.

133. Jefferey W. R. Localized mRNA and the egg cytoskeleton // Int. Rev. Cytol. -1989. V. 119. - P. 151-195.

134. Juliano R. J., Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in chines hamster ovary cell mutants // Biochem. Biophys. Acta. 1976. - V. 455. - P. 152-162.

135. Jung G., Hellmann A., Wernike W. Changes in the density of microtubular networks in mesophyll cell derived protoplasts of Nicotiana and Triticum during leaf development// Planta. 1993. - V. 190. - P. 10-16.

136. Karecla P. J., Kreis T. E. Interaction of membranes of the Goldgi complex with microtubules in vitro // Eur. J. Cell Biol. 1992. - V. 57. - P. 139-146.

137. Karsenti E., Newport R, Kirschner M. Respective role of centrosome and chromatin in the conversion of microtubule arrays from interphase to metaphase // J. Cell Biol. 1984. - V. 99. - P. 47-54.

138. Kartner N., Riodan J. R, Ling V. Cell surface P-glycoprotein associated with multidrug resistance in mammalian cell lines // Science. 1983. - V. 221. - P. 12851288.

139. Katsuta J., Shibaoka H. The role cytoskeleton and the cell wall in nuclear positioning in tobacco BY-2 cells // Plant Physiol. 1988. V. 29. - P. 403-413.

140. Khawaja S., Gundersen G. G., Bulinski J. C. Enhanced stability of microtubules enriched in detyrosinated tubulin is not a direct function of depolimerization level // J. Cell Biol. 1988. - V. 106. - P. 141-149.

141. Kirchner K., Mandelkow E. M. Tubulin domains responsible for assembly of dimers and protofilaments // EMBO J. 1985. - V. 4. - P. 2397-2402.

142. Kirkeeide E. K., Pryme J. F., Vedeler A. Microfilaments and protein synthesis: Effects of insulin // Int. J. Biochem. 1993. - V. 25. - P. 853-864.

143. Knox J. P. Emerging patterns of organization at the plant cell surface // J. Cell Sci. -1990. -V. 96. P. 557-561.

144. Knox J. P., Sinsteade P. J., Peart J. Et al. Developmentally regulated epitopes of cell surface arabinogalactan-proteins and their relation to root tissue pattern formation //Plant J. 1991. - V. 1.-P. 317-326.

145. Kobayashi Y., Kobayashi I., Funaki Y. et al. Dynamic reorganisation of microfilaments and microtubules is necessary for the expression of non-host resistance in barley coleoptile cells // Plant J. 1997. - V. 11. - P. 525-537.

146. Kopszak S. D., Haas N. A., Hussley P. J., Silflow C. D., Snustad D. P. The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed a-tubulin genes // Plant Cell. -1992.-V. 4.-P. 539-547.

147. Kreuger M., Van Hoist G.-J. Arabinogalactan proteins are essential in somatic embryogenesis of Daucus carota L. // Planta. 1993. - V. 189. - P. 243-248.

148. Kruman J. J., Matylevich N. P., Belltsky J. P. et al. Apoptosis of murine BW5147 thymoma cells induced by dexamethasone and y-irradiation // J. Cell Physiol. 1991. -V. 148. - P. 267-273.

149. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P.680-685.

150. Lambert A.-M. Microtubule-organizing centers in higher plants // Curr. Opin. Cell Biol. 1993. - V. 5. - P. - 116-122.

151. Lang J. M., Eisinger W. R., Green P. B. Effect of ethylene on the orientation of microtubules and cellulose microfibrils of pea epicotyl with polylamellate cell walls // Protoplasma. 1982. - V. 110. - P. 5-14.

152. Laporte K., Rossignol M., Traas J. A. Interaction of tubulin with plasma membrane: tubulin is present in purified plasmalemma and behaves as an integral membrane protein // Planta. 1993. - V. 191. - P. 413-416.

153. Lawrence J. B., Singer R. H. Intracellular localization of messendger RNAs for cytoskeletal proteins // Cell. 1986. - V. 45. - P. 407-415.

154. Lee M., Phillips R.L. The chromosomal basis of somaclonal variation // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1988. - V. 39. - P. 413-437.

155. Levine A., Pennell R. I., Alvarez M. E. et al. Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response // Curr. Biol. 1996. - V. 4. - P. 427-437.

156. Lloyd C. W., Seagull R. W. A new spring for plant cell biology: Microtubules as dynamic helices // Trends Biochem. Sci. 1985. - V. 10. - P. 476-478.

157. Lloyd C. W., Slabas A. R., Powell A. J., Lowe S. B. Microtubules, protoplast and plant cell shape: an immunofluorescent study // Planta. 1980. - V. 147. - P. 500-506.

158. LoSchiavo F., Pitto L., Guiliano G. et al. DNA methylation of embryogenic carrot cell cultures and its variation as caused by mutations, differentiation, hormone and hipomethylating drugs // Theor. Appl. Genet. 1989. - V. 77. - P. 325-331.

159. Luna E. J., Hitt A. L. Cytoskeleton-plasma membrane interactions // Science. -1992.-V. 258.-P. 955-963.

160. Mahfouz M. N., de Boucand M. T., Caultier J. M. Caryologycal analysis of single cell clones of tobacco; relation between the ploidy and the intensity of the callusogenesis // Z. Pflanzenphysiol. 1983. - V. 109. - P. 251-257.

161. Malekzadeh K., Gailard J., Lambert A. M., Vantard M. Molecular and functional characterization of microtubule associated proteins (MAPs) during the cell cycle of higher plant cells // Cell Biol. Int. // 1997. V. 21. - P. 878- 880.

162. Malysheva L. V., Blume Ya. B., Gleba Yu. Yu., et al. In situ hybridization of beta tubulin probes to higher plant chromosomes // Cell Biol. Int. 1997. - V. 21. - P. 880882.

163. Marc J., Sharkey D. E„ Durso N. A., Zhang M., Cyr R. J. Isolation of a 90-kDa microtubule-associated protein from tabacco membranes // Plant Cell. 1996. - V. 8. -P. 2127-2138.

164. Margolis R. L., Wilson L. Addition of colchicine-tubulin complex to microtubule ends: the mechanism of substoichiometric colchicine poisoning // Proc. Natl. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 3466-3470.

165. Mays R. W., Beck K. A., Nelson W. J. Organization and function of the cytoskeleton in polarized epithelial cells: A components of the protein sorting machinery // Curr. Opin. Cell Biol. 1994. - V.6. - P. 16-24.

166. McNay J. W., Chourey P. S., Pring D. R. Molecular analysis of genetic stability of mitochondrial DNA in tissue cultured cells of maize // Theor. Appl. Genet. 1984. -V. 67.-P. 433-437.

167. McRae T. H. Tubulin post translational modification: Enzymes and their mechanisms of actin // Eur. J. Biochem. 1997. - V. 244. - P. 265-278.

168. Mendu N., Silflow C. D. Elevated levels of tubulin transcripts accompany the GA3-iduced elongation of oat intemode segments // Plant Cell Physiol. 1993. - V. 34. - P. 973-983.

169. Merdes A., Ramiar M., Vechio J. D., Cleveland P. W. A complex of NuMa and cytoplasmic dynein is essential for mitotic spindle assembly // Cell. 1996. - V. 87. -P. 447-458.

170. Miller D., Hable Wh., Gottward J. et al. Connections: The hard wiring of the plant cell for perception, signaling, and response // Plant Cell. 1997. - P. 2105-2117.

171. Mineyuki Y. The preprophase band of microtubules: its function as a cytokinetic apparatus in higher plants // Int. Rev. Cytol. 1999. - V. 187. - P. 1-49.

172. Mineyuki Y., Murata T., Wada M. Experimental obliteration of the preprophase band alters the site of cell division, cell plate orientation and phragmoplast expansion in Adiantum protonemata. J. Cell Sci. - 1991. V. 100. - P. 551-557.

173. Mineyuki Y., Yamashita M., Nagahama Y. p34cdc2 kinase homologue in the preprophase band // Protoplasma. 1991. - V. 162. - P. 182-186.

174. Mitsui H., Yamaguchi-Scinozaki R., Shinozaki K., Nishikava K., Takahashi H. Identification of a gene family (kat) encoding structure of Kat A. // Mol. Gen. Genet. -1993.-V. 238.-P. 361-368.

175. Mizuno K. Inhibition of gibberelin-induced elongation, reorientation of cortical microtubules and change of isoform of tubulin in epicotyl segments of azuki bean by protein kinase inhibitors // Plant Cell Physiol. 1994. - V. 35. - P. 1149-1157.

176. Mizuno K., Suzaki T. Effects of anti-microtubule drugs on in vitro polymerisation of tubulin from mung beans // Bot. Mag. Tokyo. 1990. - V. 103. - P. 435-448.

177. Moore P. J., Darvill A. G., Albersheim P., Staehelin A. L. Immunogold localization of xyloglucan and rhamnogalacturonan I in the cell walls of suspension cultured sycamore cells // Plant Physiol. 1986. - V. 82. - P. 787-794.

178. Moore P. J., Swords K. M. M., Lynch M. A., Staehelin L. A. Spatial organization of the assembly pathways of glycoproteins and complex polysaccharides in the Goldgy apparatus of plants// J. Cell Biol. 1991. - V. 112. - P. 589-602.

179. Morejohn L. C. The molecular pharmacology of plant and microtubules. In CW Lloyd, ed, The cytoskeletal basis of plant growth and form. Academic Press, London: 1991.-P. 29-43.

180. Morejohn L. C., Bureau T. E., Tocchi L. P., Fosket D. E. Tubulin from different higher plant species are immunologically non-identical and bind to colchicine differently // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 1440-1444.

181. Morejohn L. C., Bureau T. E., Tocchi L. P., Fosket D. E. Resistance of Rosa microtubule polymerization to colchicine results from a low-affinity interaction of colchicine and tubulin // Planta. 1987. - V. 170. - P. 230-241.

182. Muller W. E. B., Bernd A., Schroder H. C. Modulation of poly(a)+ mRNA-metabolizing and transporting systems under special consideration of microtubule protein and actin // Mol. Cell Biochem. 1983. - V. 53/54. - P. 197-220.

183. Murashige T., Nakano R. Chromosome complement as a determinant of the morphogenetic potential of tobacco cells // Am. J. Bot. 1967. - V. 54. - P. 963-970.

184. Nakayasu H., Berezney R. Nuclear matrins: Identification of the mayor nuclear matrix proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 10312-10316.

185. Nick P. Signaling to the microtubular cytoskeleton in plants // Int. Rev. Cyt. 1998. - V. 184. - P.33-80.

186. Nick P., Bergfeld R., Schäfer E. et al. Unilateral reorientation of microtubules of the outer epidermal wall during photo- and gravitropic curvature of maize coleoptiles and sunflower hypocotyls// Planta. 1990. - V. 181. - P. 162-168.

187. Nick P., Furuya M., Schäfer E. Do microtubules control growth in tropism ? Experiments with maize coleoptiles // Plant Cell Physiol. 1991. - V. 32. - P. 873-880.

188. Nick P., Godbole R., Wang Q. Y. Probing rice gravitropism with cytoskeletal drugs and cytoskeletal mutants // Biol. Bull. 1997. - V. 192. - P. 141-143.

189. Nick P., Yatou O., Furuya M., Lambert A. M. Auxin-dependent microtubule responses and seedling development are affected in a rice mutant resistant to EPC // Plant J. 1994. - V. 6. - P. 651-663.

190. Niggli V., Burger M. M. Interaction of the cytoskeleton with the plasma membrane // J. Membr. Biol. 1987. - V. 100. - P. 97-121.

191. Nothnagel E. A. Proteoglycans and related componenys in plant cells // Int. Rev. Cytol. 1997. - V. 174. - P. 195-291.

192. Oakley B. R. Gamma-tubulin: the microtubule organizer ? // Trend Cell Biol. -1992.-V. l.-P. 1-5.

193. Okamura S. Effects of colchicine, griseofulvin and caffeine on cell shape and septum formation of cultured carrot cells in suspension // Cell Struct. Func. 1979. - V. 4. - P. 11-22.

194. Otto A. M. Microtubules and DNA replication // Int Rev. Cytol. 1987. - V. 109. -P. 113-158.

195. Pachter J. S. Association of mRNA with the cytoskeletal framework: Its role in the regulation of gene expression // Crit. Rev. Eucariotic Gene Expression. 1992. - V. 2. -P. 1-18.

196. Pedroso M.C., Pais M.S. Factors controlling somatic embryogenesis cell wall changes as an in vivo marker of embryogenic competence // Plant Cell Tissue and Organ Culture.- 1995,- V.43.- №2,- P. 147-154.

197. Pennel R. I., Janniche L., Kjellbom P., et al. Developmental regulation of a plasma membrane arabinogalactan protein epitope in oilseed rape flowers // Plant Cell. 1991. -V. 3. - P. 1317-1326.

198. Pennell R. I., Lamb Ch. Programmed cell death in plants // The Plant Cell. 1997. -V. 9.-P. 1157-1168.

199. Pichett-Heaps I. D., Northcote D. H. Cell division in the formation of the stomatal complex of young leaves of wheat // J. Cell Sci. 1996. - V. 1. - P. 121-128.

200. Pokrywka N. J., Stephenson E. K. Microtubules mediate the localization of bicoid RNA during Drosophila oogenesis // Development. 1991. - V. 115. - P. 55-66.

201. Pollard T. D., Almo S., Quirk S., Vinson V., Latterman E. E. Structure of actin-binding proteins: Insights about function at atomic resolution // Annu. Rev. Cell Biol. -1994. V. 10. - P. 207-249.

202. Pont-Lezika R. F., McNally J.G., Pickard B. G. Wall-to-membrane linkers in onion epidermis: some hypothesis // Plant, Cell and Env. 1993. - V. 16. - P. 111-123.

203. Puck Th. T., Krystosek A. Role of the cytoskeleton in genome regulation and cancer // Int. Review of Cytology. 1992. - V. 132. - P. 75-109.

204. Raha D., Sen K., Biswas B. B. cDNA cloning of beta-tubulin gene and organization of tubulin genes of Vigna radiata (mung bean) genome // Plant Mol. Biol. 1987. - V. 9. - P. 565-571.

205. Rajasekaran K., Hein M. B., Davis G. C. et al. Endogenous growth regulations in leaves and tissue cultures of Pennisetum purpureum Schum. // J. Plant. Physiol. 1987. - V. 130(1). - P. 13-25.

206. Ramagopal S. Barley proteins associated with tissue differentiation // J. Plant Physiol. 1989. - V. 134. - P. 395-405.

207. Ravindra R., Grosvenor C. E. Involvement of cytoskeleton in polypeptide hormonal secretion from the anterior pituitary lobe: A review // Mol. Cell Endocrinol. 1990. -V. 71.-P. 165-176.

208. Rebagliati M. R., Weeks D. L., Harvey R. P., Melton D. A. Identification and cloning of localized material mRNAs from Xenopus eggs // Cell. 1985. - V. 42. - P. 769-777.

209. Remade C. The cytoskeleton // Belg. J. Zool. 1992. - V. 122. - P. 3-16.

210. Riodan J. R., Ling V. Genetic and biochemical characterization of multidrug resistance // Pharmac. Ther. 1985. - V. 28. - P. 51-75.

211. Ris H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded section // Cell Biol. 1985. - V. 100,- P. 1474-1487.

212. Robards A. W., Lucas W. J. Plasmodesmata // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. - V. 26. - P. 13-29.

213. Roland J. C., Reis D., Vian B. et al. Morphogenesis of plant cell walls at the supramolecular level: internal geometry and versatility of helicoidal expression // Protoplasma. 1987. - V. 140. - P. 75-91.

214. Roninson I. B., Chin J. E., Choi K., et al. Isolation of mrd DNA sequences amplified in multidrug resistant KB carcinoma cells // 1986. V. 83. - P. 4538-4552.

215. Ruff E. C. Genetics of microtubule systems // J. Cell Biol. 1984. - V. 99. - P. 110.

216. Samuels A. L., Giddings T. H., Staehelin L. A. Cytokinesis in tobacco BY-2 and root tip cells A new model of cell plate formation in higher plants // J. Cell Biol. -1995. - V. 130. - P. 1345-1357.

217. Sawin K. E., Endow S. A. Meiosis, mitosis, and microtubule motors // Bio Essays. 1993.-V. 15.-P. 399-407.

218. Schellenbaum P., Vantard M., Peter C., Fellous F., Lambert A.-M. Co-assembly properties of higher plant microtubule-associated proteins with purified brain and plant tubulins // Plant J. 1993. - V. 3. - P. 253-260.

219. Schibler M. J., Huang B. The colR4 and colR15 beta-tubulin mutations in Chlamydomonas reinhardtii confer altered sensitivities to microtubule inhibitors and herbicides by enhancing microtubule stability // J. Cell Biol. 1991. - V. 113. - P. 605614.

220. Seagull R. W. The plant cytoskeleton // CRC Crit. Rev. Plant Sci. 1989. - V. 8. -P. 473-497.

221. Serlin B. S., Ferrel S. The involvement of microtubule in chloroplast rotation in the alga Mougeotia // Plant Sci. 1989. - V. 60. - P. 1-8.

222. Serpe M. D., Nothnagel E. A. Effects of Yariv phenylglycosides on Rosa cell suspensions: evidence for the involvement of arabinogalactan-proteins in cell proliferation // Planta. 1994. - V. 193. - P. 542-550.

223. Singer R. H. The cytoskeleton and mRNA localization // Curr. Opin. Cell. Biol. 1992.-V. 4.-P. 15-19.

224. Singer R H., Longevin G. L., Lawrence I. B. Ultrastructural visualization of cytoskeletal mRNAs and their associated proteins using double-label in situ hybridization // J. Cell Biol. 1989. - Y.108. - P. 2343-2353.

225. Singh B. D., Harvey B. L. Cytogenetic studies on gaplopappus gracilis cells cultured on agar and in liquid media // Cytologia. 1975. - V. 40. - P. 347-354.

226. Sivers A., Heinowizc Z. Gravireception und das Cytoskelett // Acta Leopold. -1994. v. 40. P. 257-266.

227. Smertenko A., Blume Y., Viklicky V., Drabel P. Exposure of tubulin structural domains in Nicotiana tabacum microtubule probed by monoclonal antibodies // Eur. J. Cell Biol. 1997. - V. 72. - P. 104-112.

228. Snustad D. P., Haas N. A., Kopszak S. D. The small genome of Arabidopsis contains at least nine expressed p-tubulin genes // Plant Cell. 1992. - V. 4. - P. 549556.

229. Sree Ramulu K., Verhoeven H. A., Dijkhuis P. Mitotic dynamics of micronuclei induced by amyprophosmetil and prospects for chromosome-mediated gene transfer in plants // Theor and Appl. Genet. 1988. - V. 75. - P. 575-584.

230. Srivastava L. M., Sawhney V. K., Bonettemaker M. Cell growth, wall deposition, and correlated fine structure of colchicine-treated lettuce hypocotyl cells // Can. J. Bot. 1977. -V. 55. - P. 902-917.

231. Stacey N. J., Roberts K., Knox J. P. Patterns of expression of the JIM4 arabinogalactan-protein epitope in cell cultures and during somatic embryogenesis in Daucus carota L. // Planta. 1990. - V. 180. - P. 258-292.

232. Stephens R. E. Chemical differences distinguish ciliary membrane and axonemal tubulins // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 4716-4723.

233. Stephens R. E. Membrane tubulin // Biol. Cell. 1986. - V. 57. - P. 95-98.

234. Stephens R. E., Olezko-Szuts S., Good M. J. Evidence that tubulin forms an integral membrane skeleton in molluscan gill cilia // I. Cell Sci. 1987. - V. 88. - P. 527-535.

235. Steward O., Banker G. A. Getting the message from the gene to the synapse: Sorting and intracellular transport of RNA in neuron // Trends Neurosci. 1992 -V. 15 -P. 180-186.

236. Stirn S., Jacobsen H.J. Markers proteins for embryogenic differentiation patterns in pea callus // Plant Cell Rep. 1987. - V. 6. - P. 50-54.

237. Stirn S., Mordhorst A.P., Fuchs S., Lorz H. Molecular and biochemical markers for embryogenic potential and regenerative capacity of barley (Hordeum vulgare L.) cell cultures // Plant Sci. 1995. - V. 106. P. 195-206.

238. Stoppin V., Vantard M., Schmit A.-C. et al. Isolated plant nuclear surface in higher plants has centrosome-like activity // Plant Cell. 1994. - V. 6. - P. 1099-1106.

239. Streuli C. Extracellular matrix remodelling and cellular differentiation // Curr. Opin. In Cell Biol. 1999. - V. 11. - P. 634-640.

240. Strome S. Determination of cleavage planes // Cell. 1993. - V. 72. - P. 3-6.

241. Sundell C. L., Singer R. H. Requirement of microfilaments in sorting of actin messenger RNA // Science. 1991. - V. 253. - P. 1275-1277.

242. Sung Z.R., Okimoto R. Embryogenic proteins in somatic embryogenesis of carrot // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. - P. 3683-3687.

243. Takeuchi Y., Komamine A. Changes in the composition of cell wall polysaccharides of suspension-cultured Vinca rosea cells during culture // Physiol. Plant.- 1978,-V.42.-P.21-28.

244. Tiezzi A., Moscatelli A., Cai G., Bartalesi A., Cresti M. An immunoreactive homolog of mammalian kinesin in Nicotiana tabacum pollen tubes // Cell Motil. Cytoskel. 1992. - V. 21. - P. 132-137.

245. Tombes R. M., Peloquin J. G., Borisy G. G. Specific association of an M-phase kinase with isolated mitotic spindles and identification of two of its substrates as MAP4 and MAP1B. // Cell Reg. 1991. - V. 2. - P. 861-874.

246. Torrey J. G. Kinetin as trigger for mitosis in mature endomitotic plant cells // Exp. Cell Res. 1961. - V. 23. - P. 281-299.

247. Toyomasu T., Yamane H., Murofushi N, Nick P. Phytochrome inhibits the effectiveness of gibberellins to induce cell elongation in rice // Planta. 1994. - V. 194. - P. 256-263.

248. Ucker D. S., Obermiller P. S., Eckhart W. et al. Genome digestion is a dispensable consequence of physiological cell death mediated by cytotoxic T-lymphocytes // Mol. Cell Biol. 1992. - V. 12. - P. 3060-3069.

249. Umetsu N., Ojima K., Matsuda K. Enhancement of cell separation by colchicine in cell suspension cultures of soybean // Planta. 1975. - V. 125. - P. 197-200.

250. Utrilla L., De la Torre C. Loss of microtubular orientation and impaired development of prophase bands upon inhibition of RNA synthesis in root meristem cells // Plant Call Rep. 1991. - V. 9. - P. 492-495.

251. Van Hengel A. Chitinases and arabinogalactan proteins in somatic embryogenesis / 1998., Thesis. Wageningen, 180 p.

252. Van Hoist G.-J., Clarke A. E. Organ specific arabinogalactan-proteins of Licopersicon peruvianum (Mill.) demonstrated by crossed electrophoresis // Plant Physiol. 1986. - V. 80. - P. 786-789.

253. Van Hoist G.-J., Klis F. M. Hydroxyproline glicosides in secretory arabinogalactan-proteins of Phaseolus vulgaris L. // Plant Physiol. 1981. - V. 68. - P. 979-980.

254. Vandecandelaere A., Martin S. R, Schilstra M. I., Bayley P. M. Effects of the tubulin-colchicine complex on microtubule dynamic instability // Biochemistry. -1994.-V. 33. P.2792-2801.

255. Vanden Broek J., De Loof A., Cellaerts P. Electrical-ionic control of gene expression // Int. J. Biochem. 1992. - V. 24. - P. 1907-1916.

256. Vantard M., Levilliers N., Hill A-M., Adoutte A., Lambert A-M. Incorporation of Paramecium axonemal tubulin into higher plant cells reveals functional sites of microtubule assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 8825-8829.

257. Vaughn K. C., Harper J. D. I. Microtubule-organizing centers and nucleating sites in band plants // Int. Rev. Cytol. 1998. - V. 181. - P. 75-149.

258. Vemuri M. C., Raju M. N., Malkota S. K. Recent advances in nuclear matrix function // Cytobios. 1993. - V. 76. - P. 117-128.

259. Vogelmann Th. C., Bassel A. R, Miller J. H. Effect of microtubule-inhibitors on nuclear migration and rhizoid formation in germinating fern spores (Onoclea sensibilis)// Protoplasma. 1981. - V.109. - P. 295-316.

260. Wada B. Mitotic cell studies based on in vivo observations VIII. The evolution of mitotic spindles in eucaryota: A negation of the breakdown of the nuclear membrane // Cytologia. 1976. -V. 41. - P. 153-175.

261. Wada M., Murata T., Schibata M. Changes in microtubule and microfibril arrangement during polarotropism in Adiantum protonemata // Bot. Magazine. 1990. -V. 103. - P. 391-402.

262. Walbot V., Cullis Ch. A. Rapid genomic change in higher plants // Ann. Rev. Plant Physiol. 1985. - V. 36. - P. 367-396.

263. Walker L. M., Sack F. D. Amyloplasts as possible statoliths in gravitropic protonemata of the moss Ceratodon purpureum // Planta. 1990. - V. 181. - P. 71-77.

264. Wick S. M. The preprophase band. In CW Lloyd, ed, The cytoskeletal basis of plant growth and form. Academic Press, London: 1991. - P. 231-244.

265. Willemur R., et al. A-tubuline gene family of maize (Zea mays L.): evidence for two ancient a-tubulin genes in plants // J. Mol. Biol 1992. - V. 227. - P. 81-96.

266. Wunderlich F., Muller R. Direct evidence for a colchicine-induced impairment in the mobility of membrane components // Science. 1973. - V. 182. - P. 1136-1138.

267. Yamamoto E., Zeng L. Baird W. V. a-tubulin missence mutations correlate with antimicrotubule drug resistance in Eleusinia indica // Plant Cell. 1998. - V. 10. - P. 297-308.

268. Yasuhara H., Sonobe S., Shibaoka H. Effects of taxol on the development of the plate and of the phragmoplast in tobacco BY-2 cells // Plant Cell Physiol. 1993. - V. 34.-P. 21-29.

269. Yeoman M. M., Forche E. Cell proliferation and growth in callus cultures // Int. Rew. f Cytol. 1980. - V. 6. - P. 1-24.

270. Yuffa A.M., Garcia E.G., Nieto M.S. Comparative study of protein electrophoretic patterns during embryogenesis in Coffea arabica cv Catimor // Plant Cell Reports. -1994. V. 13. P. 197-202.

271. Zandomeni K., Schopfer P. Mechanosensoiy microtubule reorientation in the epidermis of maize coleoptiles subjected to bending stress // Protoplasma. 1994. - V. 182. - P. 96-101.

272. Zhu J.-K., Bressan R. A., Hasegawa P. M. Loss of arabinogalactan-proteins from the plasma membrane of NaCl-adapted tobacco cells // Planta. 1993. - V. 190. - P. 221-226.

Информация о работе

Мухитов, Александр Ринатович
кандидата биологических наук
Казань, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние колхицина на генетическую стабильность и морфогенную активность каллусов Fagopyrum tataricum (L. ) Gaertn - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы