Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм белков семян у видов и сортов гречихи Fagopyrum Mill.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм белков семян у видов и сортов гречихи Fagopyrum Mill."

На правах рукописи

ЛАЗАРЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ СЕМЯН У ВИДОВ И СОРТОВ ГРЕЧИХИ FAGOPYRUMMILL.

03 00 12 - Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UU3D59062

Санкт-Петербург- 2007

003059062

Работа выполнена в лаборатории биохимии Всероссийского научно-исследовательского института зернобобовых и крупяных культур (Орел) в 20032006 гг

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Павловская Нинель Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гаврилюк Инна Павловна

доктор биологических наук Шнеер Виктория Семёновна

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Аграрный Университет

Защита состоится «29» мая 2007 г. в 10 часов на

заседании Диссертационного Совета Д 006 041 01 при Государственном научном центре Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им НИ Вавилова по адресу 190000 г Санкт-Петербург, ул Большая Морская, 44, факс (812)311-87-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им Вавилова

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гречиха - ценнейшая культура, используемая для производства крупы и муки Ее возделывание отмечено на всех континентах, но основные площади под этой культурой сосредоточены в Китае, России и Украине Род Fagopyrum Mill включает в себя более 15 видов, произрастающих главным образом на Юго-Востоке Китая (Yasui et al, 1998) Среди них четыре имеют практическое значение F esculentum (гречиха обыкновенная) и F tataricum (гречиха татарская) возделываются для получения урожая зерна F homotropicum и F cymosum могут служить донорами дополнительной изменчивости для возделываемых видов (Fesenko IN et al, 2001, Yamane К et al, 2004)

Запасные белки семян - хорошо известный класс молекулярных маркеров, нашедших применение для решения вопросов филогенетического родства между таксонами, а также для идентификации и паспортизации селекционных достижений, что важно для селекции, семеноводства и защиты авторских прав (Конарев В Г , 2001) Полиморфизм белков обладает всеми положительными качествами морфологической изменчивости, отражающей определенные свойства вида или биотипа, сформированные в ходе эволюции

Известны результаты ряда исследований белков семян зарубежных сортов гречихи (Bonafaccia G , I Kreft, 1994, Cepkova Р , V Dvoracek, 2006) Сведения о составе и степени полиморфизма белков у сортов гречихи, созданных в России, а также белках видов, перспективных для вовлечения в селекционный процесс, отсутствуют Они необходимы для совершенствования методов селекции, сортового и семенного контроля гречихи

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительная оценка полиморфизма белков семян четырех видов рода Fagopyrum - F esculentum, F homotropicum, F tataricum и F cymosum, хорошо изученных в филогенетическом отношении, а также изучение возможностей паспортизации на основе белковых формул селекционных сортов гречихи обыкновенной

В задачи исследований входило

- подборка методов выделения, очистки и электрофоретического разделения белков семян,

- оценка полиморфизма по электрофоретическим спектрам белков семян селекционных сортов F esculentum,

- оценка полиморфизма F homotropicum, F tataricum и F cymosum по спектрам белков семян,

- определение межвидовых различий

Научная новизна. Впервые исследован полиморфизм семян у видов и сортов гречихи У диких видов полиморфизм незначителен, но виды четко различаются Имеются видоспецифичные компоненты Видоспецифичные компоненты родительских диплоидных видов обнаружены в белках амфидиплоида

Изучен генетический контроль одного из полипептидов Показано его моногенное наследование

Высокая степень полиморфизма выявлено, у сортов культурного подвида гречихи У них обнаружено более 200 типов спектров глобулинов семян Число типов спектров колебалось у сортов от 58 до 78 Более половины типов спектров сортоспецифичны Это позволяет разработать подходы к идентификации и паспортизации сортов гречихи по составу полипептидов глобулина семян

Практическая значимость. Показана возможность использования полиморфизма белков семян для установления видовой принадлежности коллекционных образцов Получены данные о полиморфизме ряда селекционных сортов гречихи обыкновенной по белкам семян, что в перспективе может быть использовано в качестве дополнительного критерия для их идентификации Составлены паспорта сортов селекции ГНУ ВНИИ ЗБК Богатырь, Молва, Баллада, Скороспелая 86, Дикуль, Дождик, Девятка

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II съезде общества биотехнологов России (Москва, 2004), на научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, 2004), на 90М международном симпозиуме по гречихе (Prague, Czech Respublic, 2004), на региональной конференции «Вторые чтения, посвященные памяти Ефремова Степана Ивановича» (Орел, 2006)

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав, выводов и практических рекомендаций Список литературы, включает 201 наименований работ, из них 105 на иностранных языках Диссертация изложена на 120 страницах, включает 14 таблиц и 18 рисунков

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучаемые виды были представлены следующими образцами

1 F esculentum - сортами, выведенными в Орловской области (ВНИИЗБК, Шатиловская станция) в разное время (Богатырь, Молва, Баллада, Скороспелая 86, Дикуль, Дождик, Девятка), а также диким подвидом F esculentum subsp anees traie — образец С9015 из коллекции университета Киото, произрастающим в горах на юге Китая

2 F tataricum представлен 72 образцами из коллекции ВНИИ растениеводства им H И Вавилова, образцом из коллекции лаборатории генетики ВНИИЗБК ALP (местная популяция из Алтайского края) и образцом дикого подвида F tataricum subsp potanini C9119 из коллекции университета Киото

3 F cymosum - диплоидные С9057 и С9143 из коллекции университета Киото, тетраплоидный к-4231 из коллекции ВИР

4 F giganteum образец к-119 из коллекции ВИР, представляют собой амфидиплоид созданный Кротовым А С , Драненко Е Т в 1973 году

5 F homotropicum - образцы C9139 и C9606 из коллекции университета Киото

Белки из свежеразмолотых семян экстрагировали трис-глициновый буфером рН8,3 Глобулины выделяли из экстракта диализом против дистиллированной воды Белки диссоциировали до субъединиц добавление^ среду додецилсульфата натрия Для восстановления межполипептидных дисульфидных связей использовали р-меркаптоэтанол Выделяли и анализировали белки из 200 индивидуальных семян каждого исследованного образца и сорта

Для разделения белков применили электрофорез в 10% полиакриламидном геле в диссоциирующей системе (Laemly, 1970)

Для характеристики и регистрации позиции белков на электрофореграммах использовали набор белков-метчиков молекулярных масс фирмы Sigma и белок семян сои Нумерацию компонентов спектра осуществлялась в соответствии с «соевой» шкалой Интенсивность компонентов спектра оценивали как 1 -слабый, 2 - интенсивный и 3 - очень интенсивный Относительную подвижность полипептидов анализировали по «соевой» шкале (Конарев В Г , 2000)

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ СЕМЯН FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH. И F. HOMOTROPICUM OHNISHI. ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАЙОНИРОВАННЫХ СОРТОВ ГРЕЧИХИ ОБЫКНОВЕННОЙ

Изменчивость селекционных сортов F. esculentum subsp. esculentum

Культурный подвид F esculentum представлен в работе сортами созданные в Орловской области в разное время (Богатырь, Молва, Баллада, Скороспелая 86, Дикуль, Девятка, Дождик) Сорт Богатырь - представитель местной культивируемой популяции, другие сорта имеют более сложную родословную

При позерновом анализе семян исследованных сортов гречихи обнаружено большое число типов спектров, различные по составу и интенсивности компонентов (табл 1) Во всех типах спектров электрофоретические компоненты распределены в зоне с относительной молекулярной подвижностью от 6 до 112 по «соевой» шкале Эти компоненты с молекулярной массой от 17,5 до 65 kDa В спектрах имеются две группы интенсивных компонентов Одна с подвижностью от 32 до 62 единиц, другая от 78 до 87 Анализ выделения диализом глобулинов, положение этих компонентов в спектре и их молекулярная масса позволяют идентифицировать эти компоненты как кислые (32-62) и основные компоненты (78-87) 13S запасного глобулина гречихи (рис 1)

Большая часть компонентов спектров оказались общими для проанализированных зерновок Только для 9 интенсивных компонентов обнаружен эффект присутствия/отсутствия Они встречаются с разной частотой в зерновках различных сортов (табл 2)

65 кОа

38

Е1

45 кОа —

46

45

43

40

25 кОа

+

87

Рисунок - 1 «Информативные» компоненты спектра белков семян сортов гречихи.

Таблица 1 Полипептидный состав белков семян сортов р е$си!еп1ит

Характеристика компонентов спектра

Относительная подвижность 6 7 12 14 16 17 18 19 20 22 24 25 27 28 30

Интенсивность 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Продолжение таблицы 1

32 33 34 37 38 40 42,5 43 45 46 47,5 48 49,5 52 53 54 56 58 61 62

3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 1 1 1 3 2 2 2 3 2 2

Продолжение таблицы 1

65 67 72 75 77 78 79 82 84 86 87 90 94 95 97 102 107 112

1 1 1 1 1 2 1 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2

Таблица 2 Частота встречаемости «информативных» компонентов в спектрах белков семян сортов F еясикшит

Компоненты спектра Частота встречаемости элементов спектра у сортов гречихи в %

Богатырь Молва Скороспелая 86 Баллада Дождик Девятка Дикуль

32 27,8 ± 3,2 29,6 ±3,3 _| 32,3 ± 3,3 11,1* ±2,2 16,7* ±2,6 95,5* ± 1,5 31,3 ±3,3

34 93,9 ± 1,7 64,7 ± 3,4 94,4 ± 1,6 62,6 ±3,4 66,7 ± 3,4 86,9 ± 2,4 61,6 ±3,5

37 100 92,9 ± 1,8 93,9 ± 1,7 95,5 ± 1,5 100 66,2* ± 3,4 92,4 ± 1,9

38 44,4 ±3,5 38,9 ±3,5 22,2 ± 3,0 22,2 ±3,0 55,6 ±3,5 48,5 ± 3,6 50 ± 3,6

40 100* 83,3* ± 2,7 38,9* ± 3,5 94,4* ± 1,6 65,7 ± 3,4 46,5* ± 3,5 61,1* ± 3,5

43 82,8 ± 2,7 42,4 ± 3,5 55,6* ± 3,5 45,0 ±3,5 66,7* ± 3,4 89,4* ± 2,2 33,3* ± 3,4

45 83,3 ± 2,7 66,7 ± 3,4 72,2 ± 3,2 44,4* ± 3,5 82,3 ± 2,7 86,4 ± 2,4 55,6* ± 3,5

46 95,0* ± 1,6 68,7 ±3,3 75,8 ±3,1 55,6* ± 3,5 77,8 ± 3,0 98,0* ± 1,0 72,2 ± 3,2

87 81,8* ± 2,7 8,3* ± 2,0 35,3 ± 3,4 37,0 ±3,4 53,7 ±3,5 49,1 ±3,6 94,4* ± 1,6

* компоненты, по частоте встречаемости которых сорта достоверно идентифицируются в данном наборе сортов

Различия по частоте встречаемости некоторых компонентов спектра в сортовых популяциях позволяют идентифицировать сорта, хотя некоторые из них, например Молва, Скороспелая 86 и Дождик выделяются по частотам только двух компонентов

Идентификация сортов путем сравнения с сортом-эталоном

Для упрощения анализа получаемых результатов нами был предложен и протестирован подход к идентификации различий между сортами, основанный на получении ряда достоверных положительных, отрицательных и нулевых (или недостоверных) различий частоты встречаемости соответствующих компонентов у испытуемого сорта и сорта-эталона В качестве эталона может быть использован любой произвольно выбранный сорт в этой работе был взят наиболее распространенный в настоящее время в России сорт Дикуль В таблице 3 представлены результаты такого анализа Видно, что получаемый таким образом ряд «плюсов», «минусов» и «нулей» уникален для каждого сорта, независимо от его морфотипа, и может быть использован в качестве биохимического паспорта

Таблица 3 Информативность ряда частот компонентов при сравнении сортов с

эталоном (сорт Дикуль)

Компонен ты спектра Сорта

Богатыр ь Молва Скороспелая 86 Баллада Дождик Девятка

32 0 0 0 - - +

34 + 0 + 0 0 +

37 + 0 0 0 + -

38 0 - - - 0 0

40 + + - + 0 -

43 + + + + + +

45 + + + - + +

46 + 0 0 - 0 +

87 - - - - - -

Обозначения (+) - положительная, (-) - отрицательная, (0) - недостоверная разница между значениями испытуемого сорта и эталона

Биотипный состав селекционных сортов

Всего у проанализированных в этой работе сортов выявлено 202 биотипа Из них 42 встречались одновременно в двух сортах, 21 - в трех, 7 - в четырех и 5 - в пяти Число выявленных биотипов составило 58 у Скороспелой 86, 78 -Баллады, 70 - Молва, 68 - Дождик Частота встречаемости в сортовой популяции самого распространенного биотипа составила от 4,81% (для Баллады) до 10,66% (для Дикуля) Более половины биотипов у каждого сорта можно отнести к

«уникальным», специфичным только для этого сорта Наибольшее число «уникальных» биотипов у сорта Баллада (36)

Сортовая специфичность состава спектров более отчетливо проявилась при исключении из анализа спектров с частотой встречаемости до 1% Из полученных данных следует, что сорта Дикуль и Скороспелая 86 имеют наибольшее, по сравнению с другими сортами, число общих компонентов, что может свидетельствовать об их большой генетической близости

Электрофоретическая характеристика белков семян гречихи К сясШеШит эиЬзр. апсеМга1е

Электрофоретическое разделение белков семян показало, что суммарный белковый спектр Г еъайеШит виЬзр е.чси1еп1ит состоят из 38 компонентов, имеющих аналоги (по подвижности и интенсивности) в спектре подвида F езсЫеМит БиЬвр апселтйе, среди них 10 - очень интенсивных (32, 33, 40, 42,5, 43, 45, 46, 82, 84, 86) и 14 - интенсивных (37, 53, 54, 61, 62, 78, 90, 94, 95, 97, 99, 102, 107, 112) Различия по интенсивности выявлены для компонентов 34, 38, 47,5,48,49,5, 52, 56, 58, 65, 67, 72, 75, 77, 79

В спектра .Р еэсиЫпШт БиЬвр апссх!га1е имеются очень интенсивные компоненты - 31,41,44 и интенсивные компоненты (57, 59, 64) отсутствующие в спектре Р е$си1еШит БиЬвр еяси1епШт Изменения в интенсивности наблюдались для компонента 34 - очень интенсивный в спектре Р ехси\еп1ит БиЬвр езсикпШт и интенсивные у ^ е.чсп1епШт яиЬвр апсе.$1га1е Изменения в интенсивности выявлены для компонентов 47,5, 48, 49,5 - очень интенсивные у спектра Р ехси1епШт виЬБр апсех/га/е и слабоинтенсивные в спектре Р еясШепШт, а также 38, 52 и 58 - более интенсивные в спектре еясикШит яиЬэр е5си1епШт, по сравнению с таковыми у Г е.?си!еп1ит виЬвр яисе.у/га/е В спектре Р езси\еп1ит БиЬБр апсен1га\е выявлено два дополнительных (по сравнению с Б езси1епШт зиЬяр езайепШт) интенсивных компонента (68, 74) с молекулярной массой менее 25 кОа В свою очередь, у Р еясгйепШт виЬвр ехси1епШт имеется один очень интенсивный компонент - 87, не встречающийся в спектре Р ехсикпШт яиЬБр апсе.ч!га!е Различия по интенсивности выявили для компонентов 65, 67, 72, 75, 77, 79 - среднеинтенсивные в спектре Р е,чси1епШт БиЬвр апсех!га1е и слабоинтенсивные у Р ехса1епШт виБвр еясШеШит

Внутривидовая изменчивость К ИотоГгоркит ОЬпкМ.

В спектре образца С9606 компоненты 29 и 30 отличаются большей интенсивностью, а 32 компонент слабоинтенсивный по сравнению с С9139 В спектре образца С9139 имеется очень интенсивный компонент - 42,5, отсутствующий в спектре С9606 В свою очередь, у образца С9606 выявлен дополнительный (по сравнению с С9139) интенсивный компонент - 55 У образца С9606 обнаружены два очень интенсивных - 76, 87 и два интенсивных компонента - 68, 100, не выявленные в спектре С9139 с молекулярной массой менее 25 кБа В диапазоне с молекулярной массой менее 25 кОа выявили изменения в интенсивности компонентов 61, 62, 94, 102 (интенсивные в спектре

С9139 и слабоинтенсивные у С9606) и 67, 69 (интенсивные в спектре С9606 и слабо интенсивные у С9139) (рис, 2).

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 2 - Спектры белкой семян вида Иото!горкит (1-3 - образец С9139, 46 - образец С9606) и 1 - Г. ехсикпшт виЬзр. Шси1еп1ит.

Сравнение Р. езси1еШит и К /юпкпгоркыт (С9139)

В спектре И. еваЛеМит имеются очень интенсивные компоненты — 34, 45, 87 и интенсивные компоненты (38, 53), отсутствующие в спектре С9139. Выявлены изменения в интенсивности компонентов 32 и 33 (более интенсивные в спектре Р. ехсикпШт. чем у образца С9139). В спектре образца С9139 четыре дополнительных {по сравнению с Р. езси1епШт) очень интенсивных компонента - 39, 47, 50, 5 1, 59 (рис. 2),

Сравнение К е.чсикшит и К 1юто1гор'1сит (С9606)

В спектре Р е$си1еп1шп наблюдаются очень интенсивные компоненты - 34, 42,5, 45 и интенсивные (38, 53) не встречающиеся в спектре образца С9606 В свою очередь, у образца С9606 обнаружены очень интенсивные компоненты 29, 39, 47, 50, 51 и интенсивные компоненты - 55, 59, не встречающиеся в спектре Р еъаЛепШт Изменения в интенсивности выявлены у компонентов 30 - очень интенсивный в спектре С9606 и слабоинтенсивный в спектре F с$си\еп1ит, 32 и 33 - очень интенсивные в спектре Р ехса1епШт и слабоинтенсивные у С9606 В белковом спектре Р еясикпШт компоненты 37, 43, 58, 61, 62 отличаются большей интенсивностью, по сравнению с С9606 В спектре С9606 три дополнительных (по сравнению с Р екайепШт) интенсивных компонента -68, 69, 100 и один очень интенсивный компонент - 76 с молекулярной массой менее 25 кСа В диапазоне с молекулярной массой менее 25 кБа белкового спектра Р езси1епШт компоненты 86, 94, 102 отличаются большей интенсивностью, а 67 компонент слабоинтенсивный по сравнению со спектром образца С9606 (рис 2)

ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ КТАТАШСиМ САЕ11Т]Ч. И ксумояим МЕ181Ч.

Полиморфизм РЛМапсит по электрофоретическим спектрам белков

семян

Проанализировали 72 образца подвида Р 1а1апсит виЬэр Шапсит и 1 - Т7 (Шапсит зиЬвр ро1атт Суммарный спектр Б (Шапсит включает в себя 46 компонентов, среди которых можно выделить 9 интенсивных и 8 очень интенсивных Для спектра этого вида характерно достаточно четкое разделение на три блока интенсивно и очень интенсивно окрашенных компонентов Эти блоки включают компоненты с относительной подвижностью 1) 36 и 37, 2) 48 49 50 52 54 55 и 3) 82 84 86 87 (рис 3) Полностью спектр вида представлен в таблице 4

Внутривидовая изменчивость Р Шапсит сводится к наличию/отсутствию одного очень интенсивного компонента в нижней части спектра (позиция 87 на «соевой» шкале) Этот компонент характерен для образцов азиатского происхождения к-17 (Китай), к-87 (Индия), к-56 (Непал), к-80 (Индия) В спектре образца к-98, поступившего в коллекцию ВИР из Швеции, также обнаружен компонент 87, что скорее всего свидетельствует о его азиатском происхождении (это согласуется с результатами анализа по другим признакам) В спектре образца С9119, представляющего дикий подвид Р 1а1апсит виЬвр ро(атт, этот компонент не обнаружен

1 2 3

Рисунок 3 — Электроферетический спектр белков семян Р. шшпеит (к-17).

Генетический контроль различий в электрофор?тическом спектре белков семян РЛМаггсит

Генетический анализ проведен на Материале гибридов между линиями к-17 и к-66. Анализировали индивидуальные семена. Собранные с гибрида И, (к-66 х к-17), то есть первое расщепляющееся поколение. Получено расщепление по наличию компонента 87. Гипотеза о моногенном наследовании различий не отвергается с вероятностью 59 %, следовательно, нарушение синтеза соответствующего полипептида связано с единичной мутацией.

Таблица 4 Полипептидный состав белков семян Р 1а1апсшп

Характеристика компонентов белкового спектра

Относительная 7 8 10 12 15 16 19 22 25 26 28 29 30 32 36 37 39 43 46 48 49

подвижность

Интенсивность 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 3 3

Продолжение таблицы

50 52 54 55 57 58 61 62 65 66 67 69 71 75 79 80 82 84 86 87 90 94 99 102 112

2 3 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3 2 2 2 2 2

Тест на аллелизм мутаций Г Л. subsp. tataricum и F.t. subsp. potanini

Нарушение синтеза компонента 87 могло произойти один или несколько раз за время существования вида F tataricum Если отсутствие этого компонента в спектрах разных линий связано с независимыми мутациями, вероятно, что эти мутации затрагивают разные локусы, и тогда возможно получение рекомбинантов, синтезирующих «потерянный» полипептид Был проведен тест на аллелизм мутантных генов, нарушающих синтез полипептида с относительной подвижностью 87 у двух образцов разного географического происхождения, представляющих разные подвиды

Анализировали спектры индивидуальных семян, собранных с гибрида Fi (ALP х С9119) Ни в одном из 68 проанализированных спектров гибридных семян не обнаружено компонента 87 Следовательно, мутации, нарушающие синтез этого полипептида у представителей двух подвидов, аллельны

Представленные данные позволяют частично воспроизвести филогению исследованных образцов Предком татарской гречихи принято считать F tataricum subsp potanini, то есть подвид, несущий признак «обязательное опадение плодов» Устойчивость к опадению — рецессивный признак, а, следовательно, мутантный (Fesenko IN, 2006) Устойчивые к опадению плодов линии, в спектре которых отсутствует компонента 87, мутантны по двум признакам Гипотетический предок всех линий татарской гречихи должен был бы нести доминантные аллели в локусах, контролирующих опадение семян и синтез белка, формирующего компонент спектра с относительной подвижностью 87 В спектре единственного изученного нами образца F tataricum subsp potanini С9119 компонент 87 отсутствует Следовательно, этот образец не может рассматриваться как непосредственный предок линий, в спектрах которых этот компонент присутствует

Ни один из устойчивых к опадению образцов, синтезирующих компонент 87, в свою очередь не может быть непосредственным предком какой либо опадающей линии (в том числе С9119) Таким образом, пока не идентифицирован образец, который соответствовал бы гипотетическому «дикому типу» по двум признакам, один из которых имеет ключевое таксономическое значение

Аллелизм мутаций, выключающих синтез компонента 87 у представителей двух подвидов, может свидетельствовать о возможности непосредственного филогенетического родства между ними

Различия электрофоретических спектров белков семян образцов

F.cymosum

F cymosum представлен в работе тремя образцами одним тетраплоидным из Индии и двумя диплоидными из Юго-Восточного Китая (провинция Сычуань)

Спектр белков двух диплоидных образцов С9057 и С9143 идентичны Между диплоидными и тетраплоидным образцами выявлены различия (рис 4)

В спектре тетраплоидного образца имеются интенсивные компоненты - 36, 46, 47,5 отсутствующий в спектрах диплоидных образцов Различия по интенсивности выявлены для компонента 37, интенсивного в спектре образца к-4231 и слабоинтенсивного у диплоидных образцов У С9057 и С9143 выявлены два дополнительных (по сравнению с тетраплоидным образцом) интенсивных (107, 112) и один очень интенсивный (87) компоненты с молекулярной массой менее 25 Ша Наблюдается большая интенсивность компонентов 73 и 75 у С9057 и С9143, по сравнению с тетраплоидным образцом

Таким образом, несмотря на ограниченность числа изученных образцов, выявлено существование у Р суто.чит внутривидовой изменчивости состава запасных белков семян, выявляемой электрофорезом в полиакриламидном геле

Различия видов К ¡Мапсит (к-17) и сутозит (к-4231, С9057) по электрофоретическим спектрам белков семян

Сравнение спектров двух видов показывает их значительное сходство, как по подвижности, так и по расположению большинства интенсивных и очень интенсивных компонентов

В спектре Р ¡Шапсит обнаружено 31 компонент имеющий аналоги (по подвижности и интенсивности) в спектрах тетраплоидного образца к-4231 Различия по интенсивности выявили по компонентам 50, 55, 67, 79, 80, 90

В спектре тетраплоидного образца Р сутояит обнаруживается интенсивный компонент - 36 и слабоинтенсивный компонент - 43, характерный для Р ЮШпсит, но не характерные для диплоидных образцов Р сутоэнт (рис 4) Различия по интенсивности выявлено у 37 компонента — интенсивный в спектре Р /Шапсит, к-4231 и слабоинтенсивный у диплоидных образцов В спектре тетраплоидного образца Р сутохит обнаруживается слабоинтенсивный компонент — 43, характерный для Р 1а1аг1сит, но не характерный для диплоидных образцов Р сутовит Различия по интенсивности выявлено для компонента 46 — интенсивный в спектре к-4231 и слабоинтенсивный у Р !а1апсит, и отсутствует в спектре у диплоидных образцов Компонент 55 - интенсивный в спектре Р /шапсит, слабоинтенсивный в спектре к-4231 и отсутствующий в спектре диплоидных образцов В диапазоне с молекулярной массой менее 25 кБа в спектре тетраплоидного образца Р суто.чит обнаруживается очень интенсивный компонент - 87, встречающийся для Р IШапсит, но не характерный для диплоидных образцов С9143, С9057

Полученные экспериментальные данные подтвердили, что виды Р ¡Мапсит и Р сутояит филогенетически близки

25Ма

ИТ

I ! 3 4 5 6 7 3 9

Рисунок 4 - Спектры белков семян Р. ииапсит (к-17) (1-3) и Р. сутозит (4-6 к-4231 и 7-9 С9143).

Электрофоретнческне спектры белков семян искусственного амф ИДИ плои да Р. цщтиеит

Искусственный вид Р. giganteum синтезирован в результате гибридизации искусственно полученного тстраплоидного образца Р. 1а1апсит с тетраплоидным образцом р. сутояшп естественного происхождения. Таким образом, это амфидиплоид, геном которого включает в себя по два генома каждого из этих видов.

Р. ^(¡»¡еит интересен в данном случае тем, что он является константным гибридом (Иекепко Ш. с! а1., 2001; Фесепко И.М., 2002).

В спекгре Р. аШеит присутствует большинство компонентов спектров родительских видов Г. ¡Мстсит и Р. сутозит. Таким образом, за время самостоятельного существования этих видов в их генетических системах не произошло изменений, способных заметно повлиять па согласованность их взаимодействия в одном генотипе (рис. 5).

65 kDa 45 kDa

25 kDa

1 ! 3 4 5 S 7 3 9

Рисунок 5 -Спектры белков семян F. tataricum (к-17) (1-3), F. cymosum (k-423 I) (4-6), F. giganteum (к-119) (7-9).

Время независимого друг от друга существования F. tataricum и F. cymosum (для сравнения был взят наиболее близкий к F. tataricum образец F. cymosum из Тибета) по оценкам К. Y a mane et al. (2004) составляет около 1,8 Миллиона лет. За это время виды сильно диверг провали но ряду признаков. В частности, произошел переход от многолетнего образа жизни, характерного для F. cymosum, к однолетнему, а также переход от перекрестного опыления, ассоциированного с гетероморфной системой несовместимости, к самоопылению на основе еомостилии (Yasui Y,, Ohnishi О., 1998; Fesenko I.N., 2005).

На примере этих двух видов мы наблюдаем также изменение генетической системы, контролирующей синтез белков семян. За see время существования вида F. tataricum закрепилась всего одна мутация. Тогда как у F. cymosum в отдельных формах исчезли компоненты общие с F. tataricum, в то же время появилось ряд новых белков.

Сравнительный анализ F, esculentum и F. tataricum

Анализ состава полипептидов в белке семян вида F. tataricum выявил 22 компонента, имеющие аналоги (по подвижности и интенсивности) в спектре вида F, esculentum, среди них три очень интенсивные и шесть интенсивных (рис.5). Различия по интенсивности выявили для компонентов

32, 43, 46. 48. 54, 58,61,62.

В спектре F. esculentum имеется два очень интенсивных компонента -

33, 34, отсутствующих в спектре F. tataricum. Компонент 32 - очень интенсивный в спектре F. esculentum и слабоинтенсивный у F. tataricum. В

спектре Г. с^си/еп/ит четыре дополнительных {по сравнению с Р. /сИапсыт) очень интенсивных компонента - 40, 42,5, 45, 52 и три интенсивных - 38, 53, 56. В свою очередь, в спектре Р. /аШпсит имеется очень интенсивный компонент 49, не встречающийся в спектре Р. езси1епШт. В белковом спектре Р. е.чси1епШт компоненты 43, 46, 58, 61, 62 отличаются большей интенсивностью, а Компонент 48 - слабо интенсивный по сравнению с таковым у Р. /аШпсит. В спектре Р. еисикпШт четыре дополнительных (по сравнению с Р. !а1апсит) интенсивный компонента с молекулярной массой менее 25 кДа - 78, 95, 97, 107, В спектре Р, Шапсит выявлено также три интенсивных - 36, 50. 55 и одиннадцать слабоинтенсивных компонента, отсутствующие в спектре И, е$си1еМигП. В свою очередь, у Р. е$сы1епшт обнаружено одиннадцать слабоинтенсивных компонентов- 6, 14, 17, 18, 20, 24, 27, 47,5, 49,5, 72, 77, не встречающихся в спектре Р. (Шапсит.

Спектры Р. щси1етит и Р. шапсит контрастно различаются по расположению интенсивных компонентов (рис. 6). При сравнении спектров близких видов, между которыми возможен эффективный обмен генами, настолько контрастных различий не наблюдалось. Следовательно, сравнение белковых спектров позволяет достаточно надёжно оценивать степень филогенетического родства между видами в пределах рода.

65 Ш

45 кОа

25 кЭа

12 3 4 5 6

Рисунок-6 Спектры белков семян 1-3 Р. /а/апешп (к-17} и 4-6 Р. еяси/ешит энЬкр. е.чси1еп1ит.

ВЫВОДЫ

1 Электрофоретический анализ белков семян 85 представителей рода Fagopyritm Mill позволяет выявить значительные различия по степени полиморфизма белков у изученных видов Незначительный полиморфизм белков обнаружен у видов F homotropicum, F tataricum, F cymosum У дикорастущей гречихи F esculentum subsp ancestrale не обнаружен полиморфизм белков, тогда как у сортов возделываемой гречихи F esculentum subsp esculentum выявлена высокая степень полиморфизма

2 При электрофоретическом анализе белков семян пяти сортов гречихи (200 семян каждого сорта) выявлено 202 типа спектра белков, различаются по составу компонентов и встречаются с частотой от 0,51% до 10,56 %

3 Сорта различаются по числу биотипов, характеризующиеся определенными типами спектра белка Сорт Скороспелая 86 имеет 58 биотипов, сорт Дикуль — 59, сорт Дождик — 68, сорт Молва — 70 и сорт Баллада - 78 Более половины биотипов у каждого сорта можно отнести к «уникальным», специфичным только для этого сорта Это позволяет

использовать электрофорез белков семян для идентификации и регистрации сортов гречихи

4 Каждый из исследованных сортов охарактеризован по числу биотипов, общих с другими сортами Наибольшее число общих биотипов обнаружено у сорта Дикуль и Скороспелая 86, что свидетельствует о близости этих сортов

5 Спектры белков семян у образцов F homotropicum различаются и, в целом, отличаются от спектров белков семян представителей F esculentum

6 Изменчивость F tataricum по спектрам белков семян минимальна и сводится к наличию/отсутствию в спектре одного компонента- 87 с молекулярной массой менее 25 кДа Такие различия между образцами контролируются моногенно

7 В пределах вида F cymosum обнаружен полиморфизм по белкам семян Диплоидные образцы из провинции Сычуань (Китай) отличаются по спектру запасных белков от тетраплоидного образца из Индии В спектре белков тетраплоидного образца F cymosum из Индии обнаруживаются интенсивные компоненты, которые являются общими с белками F tataricum

8 В электрофоретических спектрах белков семян искусственного амфидиплоида F giganteum обнаружено суммирование спектров F tataricum и F cymosum, хотя интенсивность некоторых из них в спектре амфидиплоида снижена

9 Наибольшее сходство белковых спектров F esculentum и F homotropicum с одной стороны, F tataricum и F cymosum - с другой, согласуется с выводами о филогенетических связях в пределах рода Fagopyrum, сделанными на основе результатов межвидовых скрещиваний

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Рекомендуется использовать электрофоретические спектры белков семян для уточнения видовой принадлежности коллекционных образцов

2 Рекомендуется использовать данные электрофоретического анализа в качестве дополнительного критерия в идентификации селекционных сортов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Лазарева, Т Н Сортовая идентификация и паспортизация гречихи / Т Н Лазарева // Физиологические аспекты продуктивности растений матер н -метод конф - Орел, Орлик, 2004 - Ч 1 - С 246-247

2 Лазарева, Т Н Идентификация генофонда гречихи по белковым формулам / Т Н Лазарева, Н Е Павловская // II съезд общества биотехнологов России тезисы докл ,13-21 окт, 2004 г , М - М , 2004 - С 70-71

3 Lazareva, TN Electrophoresis Spectra of Total Seed Proteins of Artificial Amphidiploid Fagopyrum giganteum Krotov and its Parental Species F tataricum Gaertn and F symosum Meisn / T N Lazareva, IN Fesenko // Advances in Buckwheat Research Proceedings of the 9th International Symposium on Buckwheat August 18-22, 2004 Prague, Czech Republic - Prague, 2004 -С 299-301

4 Лазарева, T H Электрофоретическая изменчивость запасных белков семян гречихи полузонтичной Fagopyrum cymosum Meisn / Т Н Лазарева, И Н Фесенко // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов межрегион науч сб - Воронеж, Вып 8 ВГУ 2006-С 130-132

5 Лазарева, Т Н Анализ изменчивости генофонда Fagopyrum Mill по белкам семян / Т Н Лазарева, И Н Фесенко // Вторые чтения, посвященные памяти Ефремова Степана Ивановича регион сб - Орел, ОГУ, 2006 - С 190-192

6 Павловская, Н Е Влияние сроков хранения на содержание запасных белков в семенах гречихи /НЕ Павловская, И В Горькова, Т Н Лазарева // Хранение и переработка сельхозсырья-2006 -№3 -С 12-15

Отпечатано в «ООО «Инжиниринг Сервис» Санкт-Петербург, ул Казанская, д 7

Подписано в печать 28 04 2007 Формат 60x84Бумага офсетная Усл/печ л 1,25 Заказ № 412 Тираж 100 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лазарева, Татьяна Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Белки семян: функции, эволюция, полиморфизм

1.1 Свойства, функции и классификация белков семян

1.2 Белки семян как генетические маркеры

1.3 Химический состав плодов гречихи

1.4 Белковый комплекс семян гречихи

II. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ 25 ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Условия проведения опытов

2.2 Объекты исследований

2.3 Биохимические методы исследования

III. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ СЕМЯН 38 FAGOPYRUMESCULENTUM MOENCH. И F.

HOMOTROPICUM OHNISHI. ИДЕНТИФИКАЦИЯ РАЙОНИРОВАННЫХ СОРТОВ ГРЕЧИХИ ОБЫКНОВЕННОЙ

3.1 Внутривидовая изменчивость F. esculentum Moench.

3.2 Изменчивость селекционных сортов F. esculentum ssp. 42 esculentum

3.2.1 Различия между сортами по частотам встречаемости 43 «информативных» компонентов

3.2.2 Идентификация сортов путем сравнения с сортом- 46 эталоном

3.2.3 Биотипный состав селекционных сортов

3.3 Внутривидовая изменчивость F. homotropicum Ohnishi

3.4 Различия между F. esculentum Moench. и F. homotropicum 70 Ohnishi.

IV. ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ F. ТА TARICUM GAERTN. И

F. CYMOSUM MEISN.

4.1 Полиморфизм F. tataricum по электрофоретическим 81 спектрам белков семян

4.2 Генетический контроль различий в электрофоретическом 86 спектре белков семян F. tataricum

4.3 Тест на аллелизм мутаций F.t. subsp. tataricum и F.t. subsp. 87 potanini

4.4 Различия электрофоретических спектров белков семян 89 образцов F. cymosum

4.5 Различия видов F. tataricum (к-17) и F. cymosum (к-4231, 90 С9057) по электрофоретическим спектрам белков семян

4.6 Электрофоретических спектры белков семян 91 искусственного амфидиплоида F. giganteum

V. СРАВНЕНИЕ СПЕКТРОВ ИНКОНГРУЕНТНЫХ ВИДОВ 92 F. ESCULENTUMИF. TATARICUM

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм белков семян у видов и сортов гречихи Fagopyrum Mill."

Актуальность темы.

Гречиха - ценнейшая культура, используемая для производства крупы и муки. Её возделывание отмечено на всех континентах, но основные площади под этой культурой сосредоточены в Китае, России и Украине. Род Fagopyrum Mill, включает в себя более 15 видов, произрастающих главным образом на Юго-Востоке Китая (Yasui et al., 1998). Среди них четыре имеют практическое значение. F. esculentum (гречиха обыкновенная) и F. tataricum (гречиха татарская) возделываются для получения урожая зерна. F. homotropicum и F. cymosum могут служить донорами дополнительной изменчивости для возделываемых видов (Fesenko I.N. et al., 2001; Yamane К. et al., 2004).

Запасные белки семян - хорошо известный класс молекулярных маркеров, нашедших применение для решения вопросов филогенетического родства между таксонами, а также для идентификации и паспортизации селекционных достижений, что важно для селекции, семеноводства и защиты авторских прав (Конарев В.Г., 2001). Полиморфизм белков обладает всеми положительными качествами морфологической изменчивости, отражающей определенные свойства вида или биотипа, сформированные в ходе эволюции.

На гречихе был проведен ряд исследований, по изучению белков селекционных сортов (Bonafaccia G., Kreft I., 1994; Cepkova P., Dvoracek V., 2006). При этом были обнаружены только количественные различия по частоте встречаемости некоторых полиморфных компонентов белков. Возможность идентификации по спектрам белков семян сортов, созданных в России, не изучалась. Кроме того, по имеющимся в литературе данным практически невозможно составить представление о внутри- и межвидовой изменчивости белков семян, выявляемой электрофорезом в ПААГ, в пределах крупносемянной группы видов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительная оценка полиморфизма белков семян четырех видов рода Fagopyrum - F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum, хорошо изученных в филогенетическом отношении, а также изучение возможностей паспортизации на основе белковых формул селекционных сортов гречихи обыкновенной.

В задачи исследований входило:

- подборка методов выделение, очистки и электрофоретического разделения белков семян;

- оценка полиморфизма по электрофоретическим спектрам белков семян селекционных сортов F. esculentum\

- оценка полиморфизма F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum по спектрам белков семян;

- определение межвидовых различий.

Практическая значимость. Показана возможность использования полиморфизма белков семян для установления видовой принадлежности коллекционных образцов. Получены данные об изменчивости ряда селекционных сортов гречихи обыкновенной по белкам семян, что в перспективе может быть использовано в качестве дополнительного критерия для их идентификации. Составлены паспорта сортов селекции ГНУ ВНИИ ЗБК Богатырь, Молва, Баллада, Скороспелая 86, Дикуль, Дождик, Девятка.

Научная новизна. Впервые исследован полиморфизм семян у видов и сортов гречихи. У диких видов полиморфизм незначителен, но виды четко различаются. Имеются видоспецифичные компоненты. Видоспецифичные компоненты родительских диплоидных видов обнаружены в белках амфидиплоида.

Изучен генетический контроль одного из полипептидов. Показано его моногенное наследование.

Высокая степень полиморфизма выявлено у сортов культурного подвида гречихи. У них обнаружено более 200 типов спектров глобулинов семян. Число типов спектров колебалось у сортов от 56 до 78. Более половины типов спектров сортоспецифичиы. Это позволяет разработать подходы к идентификации и паспортизации сортов гречихи по составу полипептидов глобулина семян.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на II съезде общества биотехнологов России (Москва, 2004), на научно-методической конференции «Физиологические аспекты продуктивности растений» (Орел, 2004), на 90м международном симпозиуме по гречихе (Prague, Czech Respublic, 2004), на региональной конференции «Вторые чтения, посвященные памяти Ефремова Степана Ивановича» (Орел, 2006).

Публикация результатов исследований. Опубликовано шесть печатных работ.

I. Обзор литературы

Белки семян: функции, эволюция, генетический полиморфизм

1.1 Физические и химические свойства, функции и классификация белков семян

Семя - фиксированная фаза онтогенеза, приспособление для преодоления непригодных для роста и развития условий. Семена, содержат запас метаболитов, необходимый для их прорастания и развития проростка на ранних этапах. В семенах однодольных растений основная масса таких веществ сосредоточена в эндосперме. В зрелых семенах двудольных доля эндосперма незначительна, основную массу составляют семядоли. Семена в большинстве случаев являются основным элементом урожая сельскохозяйственных культур.

Первые данные о том, что белок семян представляет собой сочетание разных компонентов, были получены Т.Б. Осборном (1924), который разделил белки зерна зернобобовых культур по их растворимости на четыре фракции: альбумины, глобулины, проламины и глютелины (у пшеницы - глютенины). Все они - сложные смеси разных белков с преобладанием в каждой фракции определенных компонентов. Фракции альбуминов и глобулинов включают преимущественно ферменты, ингибиторы амилаз и протеиназ, лабильные элементы цитоплазмы и ядра. Во фракции проламинов обнаруживаются также спирторастворимые белки типа альбуминов, в глютелиновой фракции -нуклеопротеиды и другие структурные элементы эндоплазматического ретикулума и хромосом. Определенная часть их образует фракцию остаточных белков, которые извлекаются более крепкими растворами щелочи или после обработки детергентами либо редуцирующими агентами, разрывающими дисульфидные связи.

Поскольку протеины имеют разные функции в семенах, то они могут быть классифицированы на этой основе: а) Ферментативная активность - первичная функция большинства альбуминов и многих глобулинов. В некоторых случаях ферменты могут содержать значительный запас азота, классический пример - уреаза в семенах бобового растения Canalia ens if or mis. Этот фермент включает в себя значительную долю азота. б) Структурная функция. Например, рибосомные белки рибонуклеатического ретикулума и гликопротеины клеточных стенок. Эти белки в целом не охарактеризованы хорошо, но среди них неизвестно ни одного индивидуального компонента, который составлял бы значительную долю от общего белка семян. Многие структурные пептиды, возможно, экстрагируются в глютелиновой фракции, и вносят вклад в разнообразие компонентов, разделяемых SDS-PAGE (Wilson С.М. et al., 1981 (а, б)). в) Запасные белки семян выполняют функцию запасание азота, углерода и, обычно, серы в течение развития семян, и обеспечивают этими элементами проростки.

Собственно запасные белки отличаются по ряду признаков. Они тканеспецифичны, синтезируются позднее других белков, дольше накапливаются и в первую очередь расходуются при прорастании семян. При избытке азота в почве доля запасных белков увеличивается, при недостатке -уменьшается. Синтезируются запасные белки по типу секреторных белков, т. е. на полисомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума (Стрельченко П.П., 1981), и откладываются в белковых телах.

Проламины - высокоспециализированные запасные белки эндосперма зерновки злаков, растворимые в 70%-ном этиловом спирте. В зерне пшеницы и ржи эта группа белков называется глиадинами, ячменя - гордеинами, овса -авенином, кукурузы - зеином и т.д. В семенах других культур, не относящихся к семейству злаков, эти белки не синтезируются.

В зерне различных видов пшеницы содержание глиадина достигает 2040% общего количества белков, т.е. в среднем 4-8% веса семян, а в зерне ржи 25%. Количество авенипа в зерне овса в среднем составляет 15% общего количества белков, зеина в кукурузе около 50%, гордеина в ячмене ~ 35% и т.д.

Проламины зерна - наиболее хорошо изученные белки злаков. В настоящее время установлен их молекулярных вес, изоэлектрические точки, элементарный состав, аминокислотный состав и т.д.

В семенах двудольных, как и в зародыше злаков, преобладают альбумины и глобулины. Они также синтезируются по типу секреторных белков, т.е. в эндоплазматическом ретикулуме запасающих клеток, и откладываются в виде белковых тел. Отличие их от проламинов в морфогенетическом отношении состоит в том, что они образуются в семядолях и контролируются генетическими системами диплоидного ядра.

Альбумины, т.е. белки, растворимые в воде, у большинства культур составляют относительно небольшую долю от общего количества белков в зерне. Концентрация лейкозина - альбумина пшеницы, обычно составляет 4-7% от общего количества белков в зерне, т.е. если в пшенице содержится 16% белка, то лейкозина обычно 0,7-1,2% веса зерна. В зерне кукурузы альбуминов 6 - 14% от общего количества белков, овса - 15%, проса - 12% и ржи - 25%.

Глобулины - белки, извлекаемые растворами нейтральных солей, обычно составляют значительно большую часть зерна, чем альбумины. При использовании в качестве растворителей 0,5 - 1 н. растворов Na2S04, K2SO4, КС1 или NaCl, извлекающих глобулины из семян, содержание глобулинов в зерне пшеницы в среднем составляло 20% от общего количества белков, в зерне кукурузы - от 7 до 23%, овса -12 - 24%, ржи - 15 -29%.

Т.В. Osborne и G.F. Campbell (1898) (цит. по Е. Derbyshire et al., 1976) показали, что большая часть белка бобовых - солерастворимые глобулины. Они смогли разделить эту фракцию семян гороха Pisum sativum на две составляющие: легумин и вицилин. Легумин, по сравнению с вицилином, менее растворим в разбавленных солевых растворах. Кроме того, растворы легумина не коагулировали при нагревании, тогда как растворы вицилина коагулировали при 95°С. Химические анализы вицилина и легумина показали, что они содержат 18,04 и 17,4% азота, а также 0,42 и 0,18% серы, соответственно. Т.В. Osborne (1895) продемонстрировал, что аналогичные, хотя и несколько отличающиеся по химическому составу белковые фракции, могут быть экстрагированы из семян других бобовых - Phaseohus vulgaris и Glycine max.

Изобретение ультроцентрифугирования Т. Svedberg и A. Lysholm в 1927 году и электрофореза высокомолекулярных соединений A. Tiselius в 1925 году (Поморцев А.А. и др., 2004), привело к более подробным исследованиям глобулинов семян (Danielsson С.Е., 1949) (цит. по Е. Derbyshire et al., 1976). С.Е. Danielsson (1949) изучил глобулиновую фракцию 34 видов бобовых, и установил, что, с небольшими исключениями, она разделяется на две части с коэффициентами седиментации 7S и 11S. Он соответственно назвал их вицилин и легумин.

Среди исключений, упомянутых выше - акация Acacia longifolia, А. peninervis, A. verticillata и Tritolium repens, в семенах которых обнаружены только 7S глобулины, хотя чувствительность техники, возможно, не позволяет выявить присутствие небольшого количества 11S глобулинов.

Легумины широко распространены у покрытосеменных и голосеменных (Hager К.Р. et al., 1995; Shutov A.D., Baumlein H., 1999). Легумины - обычно гексомеры, мономеры которых состоят из более крупного и более кислого а -полипептида, и более мелкого более щелочного Р - полипептида. Эти два полипептида происходят от единой предковой формы протеина (Dickinson C.D., 1989).

Серологические исследования с использованием иммуноэлектрофореза дали возможность предположить, что вицилин может быть более широко распространен, чем легумин (Kloz J., 1971). В то же время, W.F. Dudman и А. Millerd (1975) изучили белки представителей 11 триб Leguminosae, и показали, что их протеины иммунологически родственны вицилину и легумину (цит. по Е, Derbyshire et al., 1976), однако, в изученных трибах легуминоподобные белки распространены более широко, чем вицилиноподобные.

Глютелины - белки, нерастворимые в воде, в растворах солей и спирте, но растворимые в слабых щелочах. Глютелин пшеницы называется глютенином, его содержание в зерне достигает 25% общего количества белков. Глютелин риса называется оризенином, и на его долю приходится большая часть белков семян. В зерне ржи глютелинов содержится в среднем 17% общего количества белков, в зерне ячменя - 27% и овса - 40%. Физические и химические свойства многих глютелинов злаков в настоящее время довольно хорошо изучены.

Отдельные белковые фракции, экстрагируемые из семян злаков различными растворителями, не являются индивидуальными белками, а представляют собой смесь нескольких белков; из этой смеси электрофорезом, фракционированным осаждением и другими методами могут быть получены индивидуальные белки. Например, С.Е. Danielsson (1949) выделил из семян ячменя альфа- и гамма-глобулины. Свойства этих белков, относящихся к одной и той же фракции, весьма различны, и, в частности, молекулярные веса альфа- и гамма-глобулинов составляли соответственно 29000 и 210000.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Лазарева, Татьяна Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Электрофоретический анализ белков семян 85 представителей рода Fagopyrum Mill, позволяет выявить значительные различия по степени полиморфизма белков у изученных видов. Незначительный полиморфизм белков обнаружен у видов F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum. У дикорастущей гречихи F. esculentum subsp. ancestrale не обнаружен полиморфизм белков, тогда как у сортов возделываемой гречихи F. esculentum subsp. esculentum выявлена высокая степень полиморфизма.

2. При электрофоретическом анализе белков семян пяти сортов гречихи (200 семян каждого сорта) выявлено 202 типа спектра белков, различаются по составу компонентов и встречаются с частотой от 0,51% до 10,56 %

3. Сорта различаются по числу биотипов, характеризующихся определенными типами спектра белка. Сорт Скороспелая 86 имеет 58 биотипов, сорт Дикуль-59, сорт Дождик-68, сорт Молва-70 и сорт Баллада-78. Более половины биотипов у каждого сорта можно отнести к «уникальным», специфичным только для этого сорта. Это позволяет использовать электрофорез белков семян для идентификации и регистрации сортов гречихи.

4. Каждый из исследованных сортов охарактеризован по числу биотипов, общих с другими сортами. Наибольшее число общих биотипов обнаружено у сорто Дикуль и Скороспелая 86, что свидетельствует о близости этих сортов.

5. Спектры белков семян у образцов F. homotropicum различаются и, в целом, отличаются от спектров белков семян представителей F. esculentum.

6. Изменчивость F. tataricum по спектрам белков семян минимальна и сводится к наличию/отсутствию в спектре одного компонента- 87 с молекулярной массой менее 25 кДа. Такие различия между образцами контролируются моногенпо.

7. В пределах вида F. cymosum обнаружен полиморфизм по белкам семян. Диплоидные образцы из провинции Сычуань (Китай) отличаются по спектру запасных белков от тетраплоидного образца из Индии. В спектре белков тетраплоидного образца F. cymosum из Индии обнаруживаются интенсивные компоненты, которые являются общими с белками F. tataricum.

8. В электрофоретических спектрах белков семян искусственного амфидиплоида F. giganteum обнаружено суммирование спектров F. tataricum и F. cymosum, хотя интенсивность некоторых из них в спектре амфидиплоида снижена.

9. Наибольшее сходство белковых спектров F. esculentum и F. homotropicum с одной стороны, F. tataricum и F. cymosum - с другой, согласуется с выводами о филогенетических связях в пределах рода Fagopyrum, сделанными на основе результатов межвидовых скрещиваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется использовать электрофоретические спектры белков семян для уточнения видовой принадлежности коллекционных образцов.

2. Рекомендуется использовать данные электрофоретического анализа в качестве дополнительного критерия в идентификации селекционных сортов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лазарева, Татьяна Николаевна, Санкт-Петербург

1. Айзупиет, И.П. Влияние микроэлементов на урожай и химический состав гречихи / И.П. Айзупиет, С.Я. Кайлиня // Агрохимия. -1965.-№3.-С. 122-126.

2. Алексеева, Е.С. Генетика, селекция и семеноводство гречихи / Е.С. Алексеева, З.П. Паушева. Киев : Высш.шк., 1978. - С. 23-25.

3. Алпатьева, Н.В. Анализ биотипного состава староместных сортов мягкой пшеницы из коллекции ВИР в процессе хранения и репродукции / Н.В. Алпатьева, Н.К. Губарева // Аграрная Россия. 2002. -№ 3. - С. 28-30.

4. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяциях / Ю.П. Алтухов. М.: Наука, 1988. - 328с.

5. Белозерский, М.А. Сравнительное исследование белков диплоидной и тетраплоидной гречихи / А.Д. Белозерский, И.Б. Емцева // Биохимия.- 1970.-Т. 35.-Вып. 1.-С. 152-158.

6. Биохимия культурных растений / М.И. Княгичев. Т. 1. - М.: Сельхозгиз, 1958. - 156 с.

7. Бриггс, Ф. Научные основы селекции растений / Ф. Бриггс, П. Ноулс. М.: Колос, 1972. - 398с.

8. Броваренко, С.У. Содержание микроэлементов в различных сортах гречихи / С.У. Броваренко. Новосибирск, 1968. - С. 4-6.

9. Вавилов, Н.И. Селекция как наука / Н.И. Вавилов // Избр. произв. Л., 1967. - Т. 1. - С. 328-342.

10. Гаврилюк И.П. Электрофорез белков семян в сортовой идентификации овощных культур / И.П.Гаврилюк и др. // Аграрная Россия.-2005.-№2.-С. 13-19.

11. Гаврилюк, И.П. Запасные белки в сортовой идентификации двудольных растений / И.П. Гаврилюк // Тезисы докладов III Международного симпозиума ИСТА. -JL, 1987.-С. 15-18.

12. Голубев, М.И. К вопросу о содержании амилозы и амилопектина в крахмале зерновых продуктов / М.И. Голубев // Тр. Саратовского СХИ.- 1959.-Т. 11. С. 115-117.

13. Демиденко, П. М. Влияние микроэлементов на урожай и качество семян гречихи / П.М. Демиденко, С.Д. Лебедь // Тр. Днепропетровского СХИ. 1972. - Вып. 18. - С. 54-56.

14. Дудкин, М.С. Некоторые свойства крахмала гречихи и их изменение в процессе гидротермической обработки / М.С. Дудкин, С.А. Озолина // Физикохимия крахмалопродуктов: тез. докл. VII Всесоюзного симпозиума. М., 1976.-С. 11-23.

15. Жизлин, Я.М. Технология крупяного проиводства / Я.М. Жизлин.-М.: 1952.-504 с.

16. Жученко, А.А. Эколого-генетические основы адаптивного семеноводства/ А.А. Жученко //Тез. конф. «Семя». -М., 1999. С. 10-49.

17. Зеленская, Я.Г. Характеристика старо-местных форм овса посевного {Avena sativa L.) из коллекции ВИР по полиморфизму авенина / Я.Г. Зеленская и др. // Аграрная Россия. 2004. - № 6. - С. 50-58.

18. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / В.Г. Конарев и др. ; под ред. В.Г. Конарева. -СПб.: ВИР, 2000.- 186 с.

19. Илличевский, Н.Н. Анализ родословных сортов мягкой пшеницы на основе изучения полиморфизма альфа-амилазы / Н.Н. Илличевский, и др. // Генетика. 1995. - Т. 31, № 12. - С. 1650-1654.

20. Каталог впервые предлагаемых к районированию с 1985 года сортов с-х культур и других возделываемых растений ; Гос. комиссия посортоиспытанию с-х культур при М-ве сельского хоз-ва СССР. М., 1984. - 148 с.

21. Каталог впервые предлагаемых к районированию с 1990 года сортов и гибридов с-х культур и других возделываемых растений ; Гасагропром СССР Гос. комиссия по сортоиспытанию с-х культур. М., 1989.-208 с.

22. Каталог мировой коллекции ВИР. Овес (образцы с идентифицированными генами, контролирующими морфологические и хозяйственно-ценные признаки) / И.Г. Лоскутов, В.Е. Мережко. — СПб, 1997.- Вып. 686.-83 с.

23. Кириленко, С.К. Влияние условий выращивания на содержание рутина в зерне гречихи / С.К. Кириленко // Бюллетень НТИ ВНИИЗБК. Орел, 1978. - Вып. 22. - С. 28-29.

24. Конарев А.В. Анализ генетической стабильности образцов коллекции мягкой пшеницы в процессе многолетнего поддержания путем многократных репродукций / А.В. Конарев, Н.К. Губарева, Д.Л. Коршохин и др. // Аграрная Россия. 2004. -№ 6. - С. 30-33.

25. Конарев А.В. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства / А.В. Конарев и др. // Цитология и генетика. 2000. - Т. 34, № 2. - С. 91-104.

26. Конарев, А.В. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / А.В. Конарев // Аграрная Россия. 2002. -№3.-С. 4-11.

27. Конарев, А.В. Антигенный состав белков зерна и связи между родами Triticum L., Elytrigia Desf., Elymus L., Agropyron Gaertn. / A.B. Конарев, Т.Н. Васильева, А.В. Бухтеева // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. -1979.-Т. 63, № 3 С. 76-85.

28. Конарев, А.В. Идентификация компонентов в электрофоретических спектрах проламинов злаков из триб Aveneae Dum. и

29. Poeae R. Br. / A.B. Конарев, И.О. Введенская // Докл. ВАСХНИЛ. -1984.-№ 11.-С. 16-18.

30. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений / А.В. Конарев // С.-х. биология, 1998.-№5.-С. 3-25.

31. Конарев, А.В. Использование полиморфизма проламинов в изучении исходного материала и семеноводстве кормовых злаковых трав /

32. A.В. Конарев, И.Н. Перчук, С. Накаяма // Аграрная Россия. 2002. - № 3. -С. 63-65.

33. Конарев, А.В. О свойствах проламинов ежи сборной Dactylis Glomerata L. / А.В. Конарев, И.О. Введенская, С.В. Шляпников // Биохимия.- 1986.-Т. 51, вып. 5,-С. 754-761.

34. Конарев, А.В. Фракционирование и очистка компонентов проламинов Dactylis glomerata L. / А.В. Конарев, И.О. Введенская // С.-х. биология, 1985.-№ 7.-С. 116-120.

35. Конарев, А.В. Характеристика проламинов мятликов и овсяниц / А.В. Конарев, С.П. Примак // Прикл. биохимия и микробиология- 1984.-№6.-С. 751-757.

36. Конарев, В.Г. Белки пшеницы / В.Г. Конарев. М. : Колос, 1980.-350 с.

37. Конарев, В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев. М.: Колос, 1983. - 320 с.

38. Конарев, В.Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений / В.Г. Конарев. Спб.: ВИР, 2001. - 417 с.

39. Конарев, В.Г. Электрофорез зеина как метод идентификации, регистрации и анализа сортов, линий и гибридов кукурузы / В.Г. Конарев,

40. B.В. Сидорова, Г.И. Тимофеева // С.-х. биология. 1990. - № 3. - С. 167177.

41. Крестников И.С. Продуктивность ярового ячменя в зависимости от изоферментного состава супероксиддисмутазы / И.С. Крестников и др. // Докл. ВАСХНИЛ. 1991. - Т. 3. - С. 2-5.

42. Кротов, А.С. Амфидиплоид гречихи Fagopyrum giganteum Krotov sp. Nova. / А.С Кротов, E.T. Драненко // Бюлл. ВИР. 1973. - №30. -С.41-44.

43. Кротов, А.С. Гречиха / А.С. Кротов. M.-JT. : Сельхозгиз, 1963.-284 с.

44. Культурная флора СССР ; под общ. ред. П.М. Жуковского: Т. III . Крупяные культуры (гречиха, просо, рис) ; ред. т. А.С. Кротов. -Л.: Колос, 1975. -С.7-118.

45. Лакин, Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. Изд. 4-е, доп. и перераб. - М.: Выс. шк., 1990. - 352 с.

46. Лейденская, Л.Д. О связи молибдена и цинка с белками различных растений / Л.Д. Лейденская, Э.В. Рудакова. Киев.: УСХА, 1963.- 125 с.

47. Методика проведения лабораторного сортового контроля по группам сельскохозяйственных растений / А.А. Поморцев, и др.. М. : ФГНУ Росииформагротех, 2004. - 96 с.

48. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков и др. ; под ред. А.И. Ермакова. Изд. 3-е., доп. и перераб. - Л. : Агропромиздат., 1987.-430 с.

49. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции / В.Г. Конарева и др.; под ред. В.Г. Конарева. М. : Колос, 1993.-Т. 1 -447с.

50. Мурри, И.К. Биохимия гречихи / И.К. Мурри. // Биохимия культурных растений.-М.: Сельхозиздат, 1958.- Т. 1.-С. 642-693.50.

51. Пснева, Т.Н. Анализ полиморфизма по спектрам секалина в процессе становления сорта озимой ржи Ильмень / Т.И. Пенева и др.. // С.-х. биология. 1998. - № 1. - С. 55-62.

52. Перуанский, Ю.В. Зеиновые формулы самоопыленных линий кукурузы / Ю.В. Перуанский, В.Н. Савин // Доклады ВАСХНИЛ. 1984. -С. 10-11.

53. Поволоцкая, К.Л. Витамины Bl, В2 и РР в зерне и продуктах его переработки / К.Л. Поволоцкая // Биохимия зерна М.: Мир, 1954. -Вып. 2.-С. 54-56.

54. Поморцев А.А. Электрофорез запасных белков как метод сортового контроля у ярового ячменя / А.А. Поморцев и др. // Селекция и семеноводство. 2004. - № 3. - С. 20-28.

55. Поморцев, А.А. Геногеография и закономерности распределения аллельных вариантов в трех гордеинкодирующих локусах ярового ячменя на территории бывшего СССР / А.А. Поморцев и др. // Генетика. 1994. - Т. 30, № 6. - С. 806-815.

56. Поморцев, А.А. Законамерности распределения аллельных вариантов трех гордеин-кодирующих локусов ярового ячменя но территории Российской Федерации / А.А. Поморцев, Б.А. Калабушкин, Е.В. Лялина//Генетика.-2001.-Т. 37, № 11.-С. 1522-1529.

57. Поморцев, А.А. Идентификация шестого локуса, контролирующего синтез гордеина у озимого ячменя / А.А. Поморцев, В.П. Нецветаев, Ф.А. Попереля и др. // Докл. ВАСХНИЛ. 1983. - № 1. - С. 711.

58. Поморцев, А.А. Полиморфизм гордеинов у сортов ярового ячменя / А.А. Поморцев, В.П. Нецветаев, М.П. Ладогина и др. // Генетика. 1994. - Т. 30, № 5. - С.604-614.

59. Поморцев, А.А. Полиморфизм культурного ячменя (Hordeum vilgare) по гордеинам / А.А. Поморцев, В.П. Нецветаев, А.А. Созинов // Генетика. 1985 - Т. 21, № 4. - С. 629-639.

60. Проспект сортов зернобобовых культур, гречихи и проса, созданных селекцентром ВНИИЗБК / РАСХН, ВНИИЗБК. Орел, 1993. -45 с.

61. Результаты селекции гречихи в XII пятилетке. Биологические и технологические свойства районированных по СССР на 1991 год сортов / ВАСХНИЛ, ВНИИЗБК Орел, 1990. - 29 с.

62. Рекомендации по использованию белковых маркеров в сортоиспытании, семеноводстве и семенном контроле / под ред. В.Г. Конарева. М.-Л.: Госагропром СССР, ВИР, 1989. - 20с.

63. Романова Ю.А. Исследование коллекции вида пшеницы Triticum spelta L. по полиморфизму глиадинов / Ю.А. Романова и др. // Генетика. 2001. - Т. 37, № 9. - С. 1258-1265.

64. Салмина, И.С. Идентификация овса по электрофоретическим спектрам авенина / И.С. Салмина, Г.Е. Дягилева // Бюл. ВИР. 1979. - Вып. 92.-С. 41-44.

65. Салук, И.П. Сравнительная характеристика круп и сырья, из которого они приготовлены, по содержанию тиамина и рибофлавина / Салук И.П., Смирнова И. А., Ратникова Н.В. // Товароведение пищевых продуктов. 1973. - Вып. 1. - С. 74-78.

66. Самигулин С.Н. О полиморфных сортах самоопыляющихся культур и их репродукции / С.Н. Самигулин, С.Ю. Рудерман, Т.Н. Дымова // С.-х. биология. 1988. -№ 4. - С. 89-92.

67. Семихов, Р.Ф. Адаптивные типы проламинов, специализированных белков семян злаков / Р.Ф. Семихов, Л.П. Арефьева, О.А. Новожилова // Физиология растений. 2000. - Т. 47, № 3. - С. 303-321.

68. Сидорова, В.В. Идентификация и регистрация сортов, линий и гибридов кукурузы методами электрофореза зеина / В.В. Сидорова, Г.И. Тимофеева, В.Г. Конарев. // Тр. по прикл. бот., ген. и сел. / ВНИИ растениеводства,- Л., 1987.-Т. 114.-С. 61-75.

69. Сидорова, В.В. Использование электрофоретического спектра зеина для прогнозирования гетерозиса у кукурузы / В.В Сидорова, А.В. Конарев, Г.В. Матвеева, Г.И. Тимофеева. // Аграрная Россия. 2004. - № 6, -С. 34-41.

70. Созинов, А.А. Генетические маркеры у растений / А.А. Созинов // Цитология и генетика. 1993. - Т. 27, № 5. - С. 3-14.

71. Созинов, А.А. Использование электрофореза глиадинов в селекции на качество / А.А. Созинов, Ф.А. Попеля, А.И. Стаканова // Вестник с.-х. науки. 1974. -№ 7. - С. 99-108.

72. Созинов, А.А. Картирование локусов Hrd у ячменя (Hordeum vulgare L. emed. Vav. Et Bach.) / А.А. Созинов, В.П. Нецветаев, Э.М. Григорян и др. //Генетика. 1978. - Т. 14, № 9. - С. 16101619.

73. Созинов, А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А. Созинов. М.: Наука, 1985. - 271 с.

74. Соколов, О.А. Качество урожая гречихи / О.А. Соколов -Пущено : ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1983. 263 с.

75. Соколова, С. О разнокачественности формирования зерна в пределах колоса у пшеницы / С. Соколова // Селекция и семеноводство. -1952.-№8.-С. 73-74.

76. Соседов, Н.И. Биохимическая характеристика сортов гречихи из различных районов СССР / Н.И. Соседов, Е.В. Бронштейн // Тр. ВНИИ зерна и продуктов его переработки. М.: ВИИЗ. - 1956. - Вып. 31. - С. 137145.

77. Теоретические основы селекции : T.V : Генофонд и селекция крупяных культур. Гречиха ; под ред. В.А. Драгавцева Н.В. Фесенко, Н.Н. Фесенко, О.И. Романова и др.. СПб.: ГНЦ РФ ВИР, 2006. - 196 с.

78. Фарбер, С.П. 12S глобулины семян в идентификации сортов капусты / С.П. Фарбер. // Доклады РАСХН. 1994. - № 5. - С. 8-10.

79. Фарбер, С.П. Полиморфизм основного запасного белка семян видов рода Brassica L. / С.П. Фарбер, A.M. Артемьева // С.-х. биология. -2000.-№3.-С. 17-23.

80. Фесенко, И.Н. Изменение показателя «число пыльцевых зерен на цветок» при переходе к самоопылению у гречихи / И.Н. Фесенко // Тез. докл. 2-го съезда ВОГиС. СПб., 2000. - Т. 1. - С. 201 -204.

81. Фесенко, И.Н. Получение межвидового гибрида гречихи татарская (4х) х гречиха гиганская / И.Н. Фесенко, JI.B. Голышкин // Известия ТСХА. 1997.- Вып. 1. - С. 201-204.

82. Цветков, И.Л. Полиморфизм изоферментных маркеров и идентификация сортов капусты белокочанной, брюссельской, савойской и броколли (Brassica oleracea L.) / И.Л. Цветков, А.Н. Игнатов, Д.Б. Дорохов // С.-х. биология. 2001. - № 5. - С. 81 -87.

83. Шевчук, Т.Е. Распределение белка в отдельных частях плода гречихи и его серологическая специфичность / Т.Е. Шевчук // Бюл. ВИР-Л. :ВИР, 1979.-Вып. 93.-С. 8-15.

84. Якименко, А.Ф. Гречиха / А.Ф. Якименко. М. : Колос, 1982. -196 с.

85. Ярош, Н.П. Биохимическая характеристика различных видов гречихи по количеству и качеству белков и флавоноидов / Н.П. Ярош. // Биохимия зерна и хлебопечения. 1964 - Вып. 7. - С. 216-227.

86. Abler, B.S.B. Isoenzymatic identification of quantitative trait loci in crosses of elite maize inbreds / B.S.B. Abler, M.D. Edwards, C.W. Stuber // Crop. Sci. 1991. - V. 31, № 2. - P. 267-274.

87. Adachi T. Chloroplast genomes of genus Fagopyrum II. Phylogenetic relation among the main three species / T. Adachi, K. Mizugami, K. Ogura et al. // Jap. J. Breed. 1992. - Vol. 42, № 1. - P.272-273.

88. Allard, R.W. Genetic basis of the evolution of the adapted ness in plants / R.W.Allard // Adaptation in plant Breeding (Ed. P.M.A. Tigerstedt). -1997.-P. 1-12.

89. Almargard, G. Swedish wheat cultivars distinguished by content of gliadins and isozymes / G. Almargard, D. Clapham // Swed. J. Agr. Res. 1975.- № 7. P. 137-142.

90. Ayala, F.J. The mechanisms of evaluation / F.J. Ayala // Sci. Amer.- 1978.-№ 239.-P. 48-51.

91. Biochemical Identification of Varieties.Materials III Inter. Symp. ISTA (Leningrad, 1987) / Eds. Konarev V., Gavriljuk I. Leningrad, 1988. -257c.

92. Blaim, K. Badania und Rutingehalt verschidener alt en Blatter bei Fagopyrum Arten. / K. Blaim, H. Maliszewska - Blaim. // Raczn. - nauk. roln.- 1960. -№ 3. P. 621-629.

93. Blaim, K. Wplyw dlugosci dnia i gibberelliny na zawartsc rutyny i niektorych innych skladnikow w gryce i tatarce / K. Blaim, H. Maliszewska -Blaim. Warszawa, 1971. - Z. 11 - P. 69-81.

94. Boerner, A. Molecular characterization of the genetic integrity of wheat (Triticum aestivum L.) germplasm after long-term maintenance / A. Boerner, S. Chebotar, V. Korzun. // Theor. Appl. Genet. 2000. - Vol. 100. -P.494-497.

95. Boulter, D. Structure and function of the storage proteins of some economically important legume seeds / D. Boulter, E. Derbishire, R. Cra // Abh. Acad. Wiss. DDR. Abt. Math. Naturwiss. Techn. 1978. - № 4. - P. 11-20.

96. Bushuk, W. Whear cultivar identification by gliadin electrophoregrams. I. Apparatus, method and nomenclature / W. Bushuk, R. Zillman // Can. J. Plant Sci. 1978. - № 58. - P. 505-515.

97. Chen, Q.F. Discussion on the origin of cultivated buckwheat in genus Fagopyrum (Polygonaceae) / Q.F. Chen // Proc. 8th Int. Symp. Buckwheat. -2001.-Vol. l.-P. 206-213.

98. Clegg M.T. Patterns of genetic differentiation in the slender wild oat species Avena Barbata / M.T. Clegg, R.W. Allard // Proc. Natl. Acad. Sci. -USA.- 1969.-P. 1820-1824.

99. Cooke, R.J. Modern methods for cultivar verification and the transgenetic plant challenge / R.J. Cooke // Abstrects of 25th International Seeds Testing Congress (15-24 April 1998, Pretoria).-Zurich. 1998.-P. 9-10.

100. Cooke, R.J. The characterization and identification of crop cultivars by electrophoresis / R.J. Cooke // Electrophoresis. 1984. - № 5. - P. 59-72.

101. Craig, I.L. Avena canadensis: Morphological and electrophoretic polymorphism and relationship to the A. magna / I.L. Craig, B.E. Murray, T. Rajhathy. // Can. J. Genet. Cytol. 1974. - Vol. 16. - P. 677-689.

102. Czaja, Т.Н. Starkekorner als Phasenobjekte / Т.Н. Czaja. // Starke. 1966.-Vol. 18, №6.-P. 37-43.

103. Dalgalarroondo, M. Subunit composition of the globulin fraction of rape seed {Brassicc napus L.) / M. Dalgalarroondo, J.-M. Robin, J.-L. Azanza // Plant. Sci. 1986. - Vol. 43. - P. 115-124.

104. Damidaux, R. Mise en enedence de relations applicables en selection entre electrophoregrame des gliadines et les proprietes viscoelastiques du glutin de Triticum durum Desf / R. Damidaux et al. // C. r. Acad. Sci. D. -1978.-№287.-P. 701-704.

105. Danielsson, C.E. Seed globulins of the Gramineae and Leduminoseae / C.E. Danielsson // Biochem. J. 1949. - Vol. 44. - P. 387-400.

106. Darmency, H. Biochemical data on blackgrass prolamines and their importance for taxonomic purposes / H. Darmency, J. Landry, J. Moose. // Biochem. Syst. Ecol.- 1981.- №9.-P. 171-174.

107. Das, M.L. Isolation and chemical characterization of bound niacin in cereal grains / M.L. Das, E.C. Gunha. // J. Biol. Chem. 1968. - Vol. 243, № l.-P. 235-341.

108. Derbyshire, E. Legumin and vicilin, storage proteins of legume seeds / E. Derbyshire, D.J. Wright, D. Bouter // Phytochemistry 1976. -Vol. 15.-P. 3-24.

109. Dickinson, C.D. Role of posttranslational cleavage in glycinin assembly / C.D. Dickinson, H.A. Hussein, N.C. Nielsen // Plant Cell. 1989. -№ l.-P. 459-469.

110. Dong H. High molecular weight glutenin genes: effects on quality in wheat / H. Dong et al. // Crop. Sci. 1991. - Vol. 31, № 4. - P. 974-979.

111. Evans, I. Crude protein and sulphyr amino acid contents of some commercial varieties of peas and beans /1. Evans, D. Boulter. // J. Sc. Food Agr. 1980. - Vol. 31, № 3. - P. 238-242.

112. Fesenko, I.N. Compatibility and congruity of interspecific crosses in Fagopyrum / I.N. Fesenko, N.N. Fesenko, O. Ohnishi // Proc. 8th Intl. Symp. Buckwheat at Chunchon.- 2001.- Vol. 1. P. 404-410.

113. Fesenko, I.N. Flower homostyly оiFagopyrum tataricum Gaertn. is determined by minus-alleles of polymeric genes which related to the loci of heterostyly background in F. cymosum Meisn. / I.N. Fesenko // Fagopyrum. -2005. Vol. 22. - P. 7-12.

114. Fesenko, I.N. Non-shattering accessions of Fagopyrum tataricum Gaertn. carry recessive alleles at two loci affecting development of functional abscission layer / I.N. Fesenko // Fagopyrum. 2006. - Vol. 23. - P.7-10.

115. Frey, K. J. Chemical studies on coats. Thiamin niacin, riboflavin and pantothenic acid. / K. J. Frey, G.J. Watson // Cereal Chem. 1950. - Vol. 43, № l.-P. 262-293.

116. Gubareva, N.K. Varietal identification and registration of bread wheat genefond by means of gliadin electrophoresis / N.K. Gubareva, N.V. Gaydenkova // III Int. Sympos. ISTA «Biochemical identification of varieties». -USSR, 1988.-P. 131-134.

117. Hager K-P. Evolution of seed storage genes: Legumin genes of Ginkgo biloba / K-P. Hager, H. Braun, A. Czihal et al. // J. Mol. Evol.- 1995. -Vol. 41.-P. 457-466.

118. Hawtin, G. Genetic resources in breeding fog adaptation. Adaptation in plant Breeding (Ed. P.M.A. Tigerstedt) / G. Hawtin, M. Ivanga, T. Hodgkin. 1997. - P.277-288.

119. Hayward, S. Selection and stability of synthetic varieties of Lolium perenne / S. Hayward, I.B. Abdullah // Theor. Appl. Gen. 1985. - № 70. - P. 48-54.

120. Hinton, J.J. The distribution of vitamin group В in the cereal grains / J.J. Hinton // Brit. J. Nutr. 1968. - № 2. - P. 280-298.

121. Hirata, Y. Variation of seed Proteins in the World Cultivars of Fagopyrum esculentum and F. tataricum / Y. Hirata, K. Ushijima, R. Ohsawa // Current Advances in Buckwheat Research. 1995. - P. 357-364.

122. Hirose, Т. Morphology and identification by isozyme analysis of interspecific hybrids in buckwheat / T. Hirose, A. Ujihara, H. Kitabayashi, M. Minami // Fagopyrum. 1993. - Vol. 13. - P.25-30.

123. Hodgkin, T. Some current issues in the conservation and use of plant genetic resources. Molecular genetic techniques for plant genetic resources / T. Hodgkin. // Rep. of an IPGRI Workshop (October 1995). Rome, Italy, 1997. -P. 3-10.

124. Hoffman, D.L. Inheritance and linkage relationships of morphological and isozyme loci in the A-genome diploid oat / D.L. Hoffman. // Proc. 5th Int. Oat Conf. Can. 1996. - Vol. 2. - P. 330-332.

125. Howes, N.K. D-genome suppression of gliadin electrophoretic band 45 in hexaploid wheat and effect upon quality / N.K. Howes, M. L. Konacs, E.R. Kerber// Genome. 1990. - Vol. 33, № 3. - P. 395-399.

126. Hussein, K.R.F. Comparison of proteins from wheat kernels by various electrophoretic methods in polyacrylamide / K.R.F. Hussein, H. Stegemann // Ztschr. Acker Pflanzenbau. 1978. - Bd. 146. - P. 68-78.

127. International Rules for Seeds Testing. Rules 1996. Verification of species and cultivar. Seed Sci. & Technol., 1996, 24 (Supplement). 1996. -Vol. 34.-P. 253-270.

128. Johns, C.O. The globulin of buckwheat Fagopyrum fagopyrum / C.O. Johns, L.H. Chernoff// J. Biol. Chem. 1918. - Vol. 34, № 2. - P. 439445.

129. Jones J.C. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by network of European laboratories / J.C. Jones, K.J. Edwards, S. Castaglione et al. // Molec. Breed. 1997. -№ 3. - P. 381-390.

130. Kaejalainen, R. Environmental and genetic variation in protein content of peas under northern growing conditions and breeding implication / R. Kaejalainen, S. Kortet // J. Agr. Sci. Finl. 1987. - Vol. 59, № 1. - P. 1 -9.

131. Kayashita, J. Muscle hypertrophy in rats fed on a buckwheat protein extract / Kayashita J., Shimaoka I., Nakajoh et al. // Biosci Biotechnol Biochem. 1999. - Vol. 63, № 7. - P. 1242-1245.

132. Kiesel, A. Beitrag zur des Glutencaseins des Buchweizens / A. Kiesel // Hoppe-Seyler's Zeitschrift Physiol. Chem. 1922. - Vol. 118. - P. 301303.

133. Kloz, I Legumin, vicilin and proteins similar to the seeds of some species of the Viciaceae family (a comparative serological study) / I. Kloz, V. Turkova // Biol. Plant. 1963. - Vol. 5. - P. 29-34.

134. Kreft, I. Ethnobotany of buckwheat / I. Kreft, K.J. Chang, Y.S. Choi, C.H. Park // Seoul: Jinsol Publishing Co. 2003. - P. 12-87.

135. Kreis, M. Structure and evolution of see proteins / M. Kreis et al. // Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology. 1985. - № 2. - P. 253317.

136. Kujla, V. Felderbse, bier walker die ganze Blattspreite in Ranken ungewandelt ist / V. Kujla // Archivum Socictafis Zoologicae Botanical Technical. -Vanomo, 1953. P. 44-45.

137. Kumar, K.K. Characterization of storage protein from selected varieties of foxtail millet (Setaria italica L.) Beauv / K.K. Kumar, K.P. Parameswaran // J. Sc. Food Agr. 1998. - Vol. 77, № 4. - P. 535-542.

138. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriofage / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227, №4. - P. 680-685.

139. Lin, R.F. Preliminary division of cultural and ecological regions of Chinese buckwheat / R. Lin, Y. Tao, X. Li // Proc. 5th Intl. Symp. Buckwheat. -1992.-Part l.-P. 29-35.

140. Masarona, K. Evaluation of gliadin blocks of durum wheat Triticum durum Desf. by graphical method / K. Masarona, S. Masar // Ved. Pr. VU rastl. vyrolby Piestanoch. Oblin., struk., krmov. 1991. - № 24. - P. 150162.

141. Molecular biological aspects of applied botany, genetics and plant breeding. Theoretical basis of plant breeding. St.-Petersburg : VIR, 1996. -Vol. 1.-228 p.

142. Muntz, K. Moglichkeiten zur Verbesserung der Proteizusammensetzungbei grobkornigen Leguminosen / K. Muntz // Tagungsber. Akad. Landwirschaftswiss. DDR. 1984. -№ 225. - P. 91-100.

143. Murray, D.R. A storage role for albumins in pea cotyledons / D.R. Murray // Plant. Cell and Environ. 1979. - Vol. 2, № 3. - P. 221-226.

144. Nevo, E. Genetic variation in natural populations: patterns and theory /Е. Nevo // Theor. Pop. Biol. 1978. -№ 13. - P. 121-177.

145. Ohnishi, O. Cultivated buckwheat species and their relatives in the Himalaya and Southern China / O. Ohnishi // Proc. 4th Int. Symp. on Buckwheat. -Orel: USSR, 1989.-P. 562-575.

146. Ohnishi, O. Discovery of new Fagopyrum species and its implication for the studies of evolution of Fagopyrum and of the origin of cultivated buckwheat / O.Ohnishi // Proc. 6th Intl. Symp. Buckwheat. 1995. -Vol. 1.-P.175-190.

147. Ohnishi, O. Evaluation of world buckwheat varieties from the view points of genetics, breeding and the origin of buckwheat cultivation / O. Ohnishi //Proc. 3rd Intl. Symp. Buckwheat at Pulawy. 1986.-Part l.-P. 198-213.

148. Ohnishi, О. Evaluation of world buckwheat varieties from the view points of genetics, breeding and the origin of buckwheat cultivation / O.Ohnishi // Proc. 3rd Intl. Symp. Buckwheat at Pulawy. 1986. - Part 1. - P. 198-213.

149. Ohnishi, O. Geographical distribution of allozymes in natural population of wild tartary buckwheat / O.Ohnishi // Fagopyrum. 2000. - Vol. 17.-P. 29-34.

150. Ohnishi, O. Search for the wild ancestor of common buckwheat. 3. The wild ancestor of cultivated common buckwheat, and of tartary buckwheat / O.Ohnishi // Econ. Botany. 1998. - Vol. 52. - P. 123-133.

151. Osborne T.B. The proteids of barley / T.B. Osborne // J. Am. Chem. Soc. 1895. - Vol. 17. - P. 539-567.

152. Osborne T.B. The Vegetable Proteins / T.B. Osborne // Longmans, Green & Co. 1924.- 154 p.

153. Ostergaard, H. Gultivar identification by means of isoenzymes / H. Ostergaard, G. Nielsen. IIZ. Pflanzenzuchtung. 1981. -№ 87. - P. 121-132.

154. Payne, P.I. The genetics of gliadin and glutenin, the major storage proteins of the wheat endosperm / P.I. Payne et al. // Qual. Plant Foods Hum. Neht. 1982. - № 31. - P. 229-241.

155. Perez de la Vega. Plant genetic adapted ness to climatic and edaphic environment / Perez de la Vega // Adaptation in plant Breeding / ed. P.M.A. Tigerstedt. 1997. - Vol. 4, № 7. - P. 27-38.

156. Pomeranz, Y. Amino acid composition of buckwheat / Y. Pomeranz, G.S. Robbins // J. Agr. Food Chem. 1972. - Vol. 20, № 2. - P. 270274.

157. Pomeranz, Y. Amino acid composition of maturing wheat / Y. Pomeranz, K.F. Finney, R.C. Hoseney // J. Sci. Food Agr. 1966. - Vol. 17, № 3.-P. 485-492.

158. Pomeranz, Y. Protein content and amino acid composition of maturing buckwheat / Y. Pomeranz, H.G. Marshall, G.S. Robbins et al. // Cereal Chem. 1975. - Vol. 52. - P. 479-485.

159. Rang, A. Variability and correlation studies on yield components and protein content and protein content and their implication in selection in chickpea / A. Rang, T.S. Sandhu, B.S. Bhuller //J. Res. Punjab Agr. Univ. -1980. Vol. 17, № 4. - P. 345-349.

160. Rapi, J. Obsah bielkovin v hrachu a jeho premenlivost z hldiska moznosti zvysovania podielu bielkovin v semene novych odrud / J. Rapi, P. Zlamal // Genet. Slecht. 1982. - Vol. 18, № 1. - P. 55-64.

161. Revelli, M. Studie experimentall sul contenute in vitamine doll gruppo Bad in farro / M. Revelli // Minerva Ditol. 1968. - Vol. 8. - P. 78.

162. Romanova, O. Northern populations of tartary buckwheat with respect to day length / 0. Romanova // Proc. 9lh Intl. Symp. Buckwheat at Prague.-2004.-P. 173-178.

163. Rumyantseva N. Interspecific hybridisation in the genus Fagopyrum using in vitro embryo culture / N. Rumyantseva, N. Fedoseeva, G. Abdrakhmanova et al. // Proc. 6th Intl. Symp. Buckwheat. 1995. - Vol. l.-P. 211-220.

164. Samimy, C. Overcoming the barrier to interspecific hybridization of Fagopyrum esculentum with Fagopyrum tataricum. / Samimy C., Bjorkman Т., Siritunga D. et al. // Euphytica. 1996. - Vol. 91. - P.323-330.

165. Schulze, A. Variability of an Austop-Hungarian landrace or barley (Hordeum vulgare L) electrophoretic analisis of the hordeins of the Vienna sample or 1877 / A. Schulze, A. Steiner, P. Ruckenbauer // Varrieties and Seeds.- 1994.-№ 7.-P. 193-197.

166. Schwemhe, K.D. The structure of the 12S globulin from rape seed (Brassica napus L.) / K.D. Schwemhe, B. Raab, P. Plietz et al. // Die Nahrung.- 1983.-Vol. 27.-P. 165-175.

167. Seifter, B. Analysis of thiamine in planta bean by gas chromatography of the sulfite cleavage product / B. Seifter, G. Miller. // J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1954. - Vol. 2. - P. 6-8.

168. Shultz, A. A preliminary servey of the vitamin В content of American cereals / A. Shultz, L. Atkine, C.N. Frey // Chem. 1971. - Vol. 18, № l.-P. 26.

169. Shutov, A.D. Origin and evolution of seed storage globulins, in: Casey R., Shewry P.R.,(Eds), / A.D. Shutov, H. Baumlein // Seed proteins, Kluwer Academic Publishers ITP. London, 1999. - P. 543-561.

170. Shutov, A.D. Seguence peculiarity of Gnetalean legumin-like seed storage proteins / A.D. Shutov, H.Braun, Y.U. Chesnokov et al. // J. Mol. Evol. 1998.-№47.-P. 486-492.

171. Size classified cereal starch granules: pat. № 3901725 127-32 / J. Bond, Roglos, J. Salter -26.VII. 1975. 3 p.

172. Sure, B. Nutritive value of proteins in buckwheat and their role as supplements to proteins in cereal grains / B. Sure // J. Agr. Food Chem. 1955. -Vol.3, №9.-P. 793-795.

173. Suvorova, G.N. Obtaining of interspecific buckwheat hybrid (Fagopyrum esculentum Moench x Fagopyrum cymosum Meisn.) / G.N. Suvorova, N.N. Fesenko, M.M. Kostrubin // Fagopyrum. 1994. - Vol. 14-P.13-16.

174. Use of prolamine polymorphism in studing genetic resourses of forage grasses // Genetic Resoures and Crop Evolution. 1995. - Vol. 42. - P. 197-209.

175. Wang, Li. Research and development of new products from bitterf hbuckwheat /, Li.Wang, T. Qgura // Proc. 6 Int. Symp. on Buckwheat. Japan, 1995.-P. 873-879.

176. Wang, Y.J., Campbell C. Buckwheat production, utilization and research in China / Y.J.Wang // Fagopyrum. 2004. -Vol. 21. - P. 123-133.

177. White, J.W. Experiments with buckwheat / J.W. White, F.J. Holben, A.C. Richer // Agr. Exp. St. Bull. 1951. - Vol. 4. - P. 403-407.

178. Williamson, J.A. Electrophoretic variation in esterase of three varieties of oats (Avena sativa). / J.A. Williamson, R.A. Kleese, J.R, Snyder. // Nature. 1968. - Vol. 220, № 1. - P. 134-137.

179. Wilson C.M. The extraction and seperation of barley glutelins and their relationship to other endosperm proteins / C.M. Wilson, A.J. Faulks, P.R. Shewry et al. //J. Exp. Bot. 1981. - Vol. 32. - 1287-1293 (a).

180. Wilson, C.M. Maize endosperm proteins compared by sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing / C.M. Wilson, P.R. Shewry, B.J. Miflin // Cereal. Chem. 1981. - Vol. 58. - P. 275-281 (6).

181. Woo, S.H. Interspecific hybrids with Fagopyrum cymosum in the genus Fagopyrum. / Woo S.FI., Wang Y.J., Campbell C.G. // Fagopyrum. 1999. -Vol. 16. - P.13-18.

182. Yamane, K. Speciation of Fagopyrum tataricum inferred fromthmolecular data / Yamane К., K. Tsuji and O. Ohnishi // Proc. 9 Intl. Symp. Buckwheat at Prague. 2004. - P. 317-322.

183. Yasui, Y. Evolutionary processes of Fagopyrum inferred from the• • • • thmolecular phylogenetic analyses / Y. Yasui, O. Ohsako, O. Ohnishi // Proc. 71.tl. Symp. Buckwheat. 1998. - Part 6. - P. 50-60.