Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum

Кадырова, Гузель Дамировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum"

На правах рукописи

КАДЫРОВА ГУЗЕЛЬ ДАМИРОВНА

АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ЯДЕРНОГО Я ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ГЕНОМОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА РАСОРУИиМ

03.01.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

Казань, 2011.

4848498

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН и в отделе сельскохозяйственной биотехнологии ГНУ ТатНИИСХ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кочиева Елена Зауровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт зернобобовых и крупяных культур

Защита состоится 9 июня 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан « & » _2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Кудрявцев Александр Михайлович

доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гречиха является одной из важнейших продовольственных культур, обладающей высокой питательной и лечебно-профилактической ценностью. Белки плодов гречихи по питательности полноценнее белка злаков и приближаются к белкам бобовых культур. Кроме того, плоды гречихи обладают высокими диетическими свойствами благодаря повышенному содержанию в составе крупы легкорастворимых фракций белка, незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот, витаминов, особенно рутина, и минеральных солей.

Род Fagopyrum Mill. (Гречишные) относится к семейству Polygonaceae. Из 17 видов Fagopyrum культивируются только два: гречиха посевная (F. esailentum) и гречиха татарская (F. tataricum). Генофонд культурных видов Fagopyrum, отличается небольшим морфо-биологичесюш разнообразием [Fesenko el al, 2001,Yamane el al., 2004]. Он сравнительно слабо исследован и выявление генетического потенциала гречихи, в тон числе по различным хозяйственно-ценным признакам (фармакологическим и адаптивным свойствам, экологической устойчивости) является особенно актуальным.

В связи с этим разработка биохимических методов идентификации полиморфизма ядерной и цитоплазматической ДНК последовательностей геномов и селекционно-значимых генов как культивируемых, так и дикорастущих видов имеет большую значимость для исследований прикладного характера, направленных на расширение биоразнообразия культивируемых видов гречихи с улучшенными качественными и урожайными свойствами. Данные, полученные при исследовании информативных участков ядерной и цитоплазматической ДНК, могут широко использоваться как при определении уровнен межвидовой и внутривидовой вариабельности нуклеотидных последовательностей, так и при создании видовых и сортовых ДНК-маркеров для паспортизации сортов и линий гречихи.

Помимо культивируемых видов, род Fagopyrum включает 15 диких видов, большинство из которых открыты и описаны лишь в конце 90-х годов прошлого столетия. Поэтому для некоторых видов до конца не определены филогенетические отношения и таксономический статус. Как известно, эволюционные исследования, таксономические классификации базируются на использовании данных о вариабельности нуклеотидных последовательностей ДНК таксонов. Однако, что касается видов Fagopyrum, эта тема остается недостаточно изученной. Так, большая часть биохимических и молекулярных исследований генома была сфокусирована в основном на анализе культивируемых видов гречихи [Eggum el al., 1980, Kreft et al., 2002, Bourbouze el al., 2008], в то время как вариабельность ДНК последовательностей остальных видов исследована слабо.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выявление вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК геномов видов рода Fagopyrum.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Определить уровни межвидового и внутривидового полиморфизма ядерной ДНК представителей рода Fagopynm методом AFLP анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей.

2. С использованием нескольких систем мультилокусного маркирования (RAPD, ISSR, AFLP) провести анализ внутривидового полиморфизма ядерной ДНК культурных видов гречихиF.esculentum и F.îataricum.

3. Провести SSR анализ полиморфизма отдельных микросателлитных ДНК-локусов образцов видов F, escuientum, F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum. Определить аллельные варианты микросателлитных локусов и частоты их встречаемости у видов и образцов Fagopyrum.

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК гречихи. Охарактеризовать ранее не исследованные последовательности спейсерных участков (trnL-truF, psbA-tmH, tmT-trnY) и интрона гена rpS16 хпДНК Fagopyrum и оценить возможность их использования в таксономических и филогенетических исследованиях.

5. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК (ген coxl и b/с интрона гена nadl) видов Fagopyrum. Определить уровни внутривидового и межвидового полиморфизма последовательностей анализируемых образцов.

6. На основе комплексного анализа нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК провести сравнительную оценку филогенетических отношений анализируемых представителей рода Fagopyrum.

Научная новизна. Впервые с использованием нескольких систем мультилокусного маркирования проанализирована последовательность ядерной ДНК представителей Fagopyrum. Определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма дикорастущих и культурных видов гречихи, включая сорта отечественной селекции. Впервые исследовано внутрисортовое разнообразие F. escuientum и показан высокий уровень полиморфизма ДНК отечественных сортов, сравнимый с разнообразием дикорастущих форм этого вида Получены видо-, образец- и сортоспецифичные ДНК фрагменты.

Анализ 11 микросателлитных ДНК-локусов гречихи показал высокую специфичность проанализированных праймерных пар к представителям группы cymosum. Каждый локус охарактеризован числом идентифицированных аллельных вариантов, частотами их встречаемости у исследованной группы образцов и уровнем аллельного полиморфизма (PIC). Для каждого исследованного сорта и образца рода Fagopyrum установлена микросатедпитная формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генэтического паспорта.

Впервые проведен анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной (спейсерные участки tmT-trnY, trnL-tmF, psbA-trnH, интрон гена rpS16) и митохондриальной (ген coxl и

b/c интрон гена пас//) ДНК гречихи. Для каждого вида были выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели, которые могут использоваться для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма представителей рода Fagopyrum на разных таксономических уровнях. Впервые на примере последовательностей интрона хлоропластного гена rpSló и Ь/с интрона митохондриального гена nadl определены вторичные структуры автосплайсирующихся интронов группы II у видов Fagopyrum; определены границы всех шести доменов интрона и их основные функционально-значимые мотивы.

Практическая значимость. Данные о межвидовых и межсортовых различиях нуклеотидных последовательностей могут быть использованы для подбора родительских форм в скрещиваниях и идентификации сортов, анализе гибридов и определении сортовой чистоты семенного материала.

Положения, выносимые на защиту:

1. межвидовой и внутривидовой полиморфизм последовательностей ядерной ДНК дикорастущих и культивируемых видов рода Fagopyrum.

2. аллельные варианты и частоты встречаемости микросателлитных локусов у представителей рода Fagopyrum.

3. вариабельность нуклеотидных последовательностей хлоропластной и митохондриальной ДНК геномов как критерий таксономической и филогенетической характеристики вида.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены и докладывались на IX Международном конгрессе по геномике растений PlantGEM (Istanbul, 2011), на 11-м международном симпозиуме по гречихе «Advances in buckwheat research» (Orel, 2010), на 2-м международном конгрессе «Molecular Phylogenetics» (Moscow, 2010), на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), на Всероссийской конференции «Инновационное развитие агропромышленного комплекса» (Казань, 2009), на Всероссийской конференции «Повышение эффективности растениеводства и животноводства - путь к рентабельному производству» (Казань, 2008), на научно-практической конференции «Генетика и селекция растений» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ из них 3 - в рецензируемых научных журналах

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ISO печатных страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 наименований. Работа содержит 2?таблиц и ^рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Была составлена коллекция 62 образцов Fagopyrum, представляющая 17 видов и охватывающая основные ареалы произрастания и культивирования гречихи. Дикорастущие виды F. cymosum, F. homotropicum, F. gracilipes,

F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F.pleioramosum, F. statice, F.gilesii, Fjinshaense, F. urophyllum были любезно предоставлены проф. О. Ониши Универстета Киото (Япония) и И.Н. Фесенко ГНУ ВНИИЗБК. Образцы культивируемых видов F. esculentum и F. tataricum получены из коллекции ГНУ ГНЦ РФ ВИР; сорта F. esculentum из ТатНИИСХ (Казань) и ВНИИЗБК (Орел). В анализ в качестве внешней группы был включен представитель рода Rheum L. семейства Polygonaceae.

Выделение тотальной растительной ДНК производили на основании стандартной методики [Edwards et al, 1991] с дополнительной депротеинезацией смесью фенол/хлороформ. AFLP-, RAPD- и ISSR-анализы проводили по стандартным методикам [Vos et al., 1995, Williams et al, 1990]. SSR анализ микросателлитных ДНК-локусов и последующую статистическую обработку данных проводили согласно Konishi et al, 2006. Все амплифицированные фрагменты секвенировали с использованием как прямого, так и обратного праймера на ABI 310 cappilary DNA Analyzer (Центр «Биоинженерия» РАН), Выравнивание и анализ последовательностей проводили с помощью программы MEGA 3 [Kumar, 2004]. Статистический анализ проводили с использованием методов максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML), объединения соседей (Neighborhood-Joining, далее NJ) и максимальной парсимонии (Maximum Parsimony, далее MP) в программах MEGA 3 [Kumar, 2004] и PAUP 4.0Ы0 [Swofford, 2002], а также Байесовского подхода (Bayesian Inference, BI) в программе MrBayes v3.0b3 [Huelsenbeck, Ronquist, 2001], методом UPGMA с использованием коэффициента Nei-Li (TREECON). Эволюционные модели для анализов выбирали в программе Modeltest 3.04 [Posada, Crandal, 1998]. При BI анализе создавали 1 миллион генераций цепей Маркова, отбирая пробы каждой сотой генерации. Устойчивость филогенетических деревьев в NJ и MP анализах оценивали методом бутстрепа по 1000 репликам.

Результаты и обсуждение

Молекулярный аналш ядерного генома Fagopyrum. Впервые для оценки вариабельности ядерной ДНК применен подход с использованием нескольких систем мультилокусного маркирования ДНК последовательностей (RAPD, ISSR, AFLP), позволяющих анализировать межвидовую и внутривидовую вариабельность функционально различных (уникальных, умерено- и высокоповторяющихся) областей генома.

AFLP маркирование генома Fagopyrum. В AFLP-анализ были взяты образцы ДНК 58 представителей рода Fagopyrum, двух филогенетических групп: cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum, F. giganteum) и urophyllum (F. gracilipes,F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F, lineare, F. urophyllum). Bee исследуемые виды были представлены 1-23 образцами из различных мест произрастания. Были подобраны AFLP комбинации фермент/праймер, позволяющие выявлять полиморфизм ДНК образцов гречихи, и пригодные для использования при оценке генетического разнообразия видов Fagopyrum. Наилучшие результаты дала комбинация эндонуклеаз EcoRI/Msel. Всего при

использовании пяти комбинаций праймеров (Е12/М55, Е35/М52, Е35/М59, Е35/М61, Е41/М61) выявлено 746 полиморфных АРЬР-фрагментов ДНК гречихи, что составило 99.1% от общего числа доступных для анализа фрагментов (рис. 1).

Рис.1. АР LP-спектры видов Fagopyrum с праймерной комбинацией Е41/М61 (6% полиакриламидный гель). Обозначения: дорожки 1-6 виды филогенетической группы cymosum; 7-16 виды группы urophyllurn (приведен фрагмент геля; стрелками указаны видоспецифичные фрагменты, прямоугольниками - фрагменты для комплекса видов).

В результате проведенного AFLP-анализа каждый вид и образец гречихи охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов, при этом было получено 245 видоспецифичных ДНК фрагментов и 5 фрагментов, характерных для комплексов видов.

Значения генетических различий (genetic distances, GD) последовательностей ядерного генома между видами филогенетических групп cymosum и urophyllurn находились в пределах от 0.19 (F.cymosum/F. giganteum - F. urophyllurn) до 0.33 (F. esculenium -F. rubifolium). Значения генетического различия для видов группы urophylhim находились в пределах от 0.15 (F. gracilipes - F. capillatum, F. callianthum - F. macrocarpum) до 0.30 (F. rubifolium -F. leptopodum/F. lineare). Этот же показатель для группы cymosum был несколько ниже и находился в пределах от 0.01 (F. giganteum ~ F. cymosum) до 0.22 (F. esculenium F. cymosum).

Дендрограмма, построенная на основании генетических различий последовательностей ядерной ДНК, выявила четкую дифференциацию всех анализируемых видов Fagopyrum на два кластера (рис.2). Первый кластер сформировали виды Fagopyrum, образующие филогенетическую группу cymosum (F. esculenium. F. homotropicum, F. tataricum. F. cymosum, F. giganteum), второй - виды группы urophyllurn (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leplopodum, F. limare, F. urophyllurn). Полученные данные подтвердили результаты Ohnishi О. (1998) и Yamane et al. (2003), предложивших разделить виды Fagopyrum на две филогенетически-эволюционные группы cymosum и urophyllurn.

Внутри кластера cymosum выделились два основных субкластера, Первый субкластер объединил виды F. tataricum/F. cytnosum/F. giganteum. второй образовали видов F. esculenium и F. homotropicum. Формирование единой клады образцами видов F. tataricum и F. cymosum (100% ИБ) свидетельствует об их близком филогенетическом родстве, поддерживая предположение о возможности происхождения F'■ tataricum от F. cymosum [Yamane et al., 2003].Внутри группы urophyllurn также можно выделить субкластеры F. gracilipes/F. capillatum/F. rubifolium; F. urophyllum/F. lineare и F. callianthum'F. macrocarpum/F. leplopodum (рис. 2).

Группа

Рис. 2. Дендрограмма, отражающая различия видов Fagopyrum на основе данных AFLP-анализа с использованием метода UPGMA (TREECON) (в узлах обозначены индексы бугстрепа)

Графики факторного анализа основных компонент (PCO) (рис. 3) соответствовали кластеризации на дендрограмме и выявили большую близость F. esculentum к F. homotropicum, а F. tataricum к F. cymosum'F. giganteum.

Ä \ группа wopliyiium

группа cymosum R. tunguiicum

Фактор 1

Рис. 3. 2-факторный (А) и 3-факторный (Б) PCO анализ основанный на данных AFLP маркирования и отражающий степень родства видов Fagopyrum (PCO описывает 76% (А) и 81% (Б) полиморфизма).

Интересно, что все анализируемые виды группы urophyllum показали большее генетическое родство с представителем рода Rheum, чем виды группы cymosum. Это, возможно, объясняется тем, что они менее интенсивно эволюционировали от общего предка гречихи. В то время как виды группы cymosum (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum), по всей видимости, выделились в отдельную группу намного раньше и начали эволюционировать достаточно интенсивно.

Молекулярный анализ полиморфизма ДНК последовательностей культивируемых видов гречихи. Помимо анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей дикорастущих видов гречихи н выявления филогенетических связей у представителей рода Fagopyrum, отдельный интерес представлял анализ внутривидового полиморфизма ДНК у представителей двух культивируемых видов гречихи посевной F. esculentum (8 дикорастущих образцов, 14 сортов отечественной селекции) и гречихи татарской F. tataricum (23 дикорастущих образца). Для выявления внутривидовой вариабельности ядерного генома применяли три метода мультилокусного анализа: AFLP, RAPD и IS SR.

При AFLP маркировании было получено 252 полиморфных фрагмента ДНК видов F. tataricum и F. esculentum. Анализируемые виды отличались по уровню полиморфизма Так, для вида К esculentum из 8 образцов, взятых в анализ, для трех были получены специфичные спектры. В случае F. tataricum индивидуальные AFLP спектры были получены для 7 из 23 образцов. Также, для 4 селекционных сортов (Скороспелая 86, Молва, Богатырь, Баллада) были получены специфичные AFLP фрагменты, которые могут быть преобразованы в SCAR маркеры данных сортов.

RAPD анализ 47 представителей Fagopyrum позволил детектировать 132 полиморфных ДНК фрагмента гречихи длиной от 330 до 2000 п.н. В результате каждый образец был охарактеризован уникальным набором фрагментов. Всего было выявлено 12 фрагментов специфичных для представителей вида F. esculentum, 10 -для представителей вида F. tataricum. Семь ДНК фрагментов отличали генотипы отдельных сортов. Выявленные уникальные фрагменты, также как и в случае AFLP, впоследствии могут быть использованы для разработки геномспецифичных ДНК маркеров сортов и видов гречихи.

Метод исследования микросателлитных и межмикросателлитных последовательностей (ISSR) приводил к амплификации 89 полиморфных фрагментов ДНК. Также для каждого образца были получены уникальные спектры и ряд родо- и образецспецифичных ISSR фрагментов

На основе полученных RAPD, ISSR и AFLP данных были рассчитаны коэффициенты попарных генетических расстояний (GD), которые показали, что уровень межсортовых различий F. esculentum был весьма высок (0.060.30) и соответствовал диапазону вариабельности ДНК дикорастущих образцов F. esculentum (0.10-0.28) из Японии, Китая, Непала, что говорит о широкой генетической основе отечественных сортов посевной гречихи. Внутривидовой полиморфизм F. tataricum, представленного образцами из

разных регионов мира, оказался более чем в два раза ниже (GD 0.01-0.17) и был сравним с данными анализа генома 11 популяций F. tataricum (GD 0.020.11), исследованных ранее [Sharma et al, 2002],

Существование таких различий в уровнях вариабельности ДНК у двух культурных видов гречихи связано, по всей вероятности, с более узкой генетической основой F. tataricum, обусловленной самоопылением, а также возможно разницей во времени возникновения видов. Считается, что F. tataricum представляет собой сравнительно молодой вид, возникший в результате утраты системы самонесовместимости и быстрого формирования репродуктивной изоляции от предполагаемого предкового вида [Yamane etal., 2003]. Аллогамия, самонесовместимость и преобладание перекрестного опыления у F. esculentum, по всей видимости, способствовали поддержанию высокого уровня внутрипопуляционной и внутрисортовой гетерогенности, а локальность распространения стародавних сортов гречихи определили отмечаемый высокий уровень межсортового и популяционного разнообразия гречихи F. esculentum.

Анализ полиморфизма микросателлитных SSR локусов видов и сортов Fagopyrum. В дополнение к проведенному мультилокусному анализу, была определена вариабельность последовательностей отдельных микросателлитных локусов ядерной ДНК видов и образцов Fagopyrum. Было исследовано 11 SSR локусов гречихи, отобранных из микросателлитной библиотеки F. esculentum [Konishi et al., 2006]. Для семи SSR локусов (Fes 1303, Fes 1840, Fes 1368, Fes 1585, Fes 2644, Fes 3177, Fes 3331) при амплификации были получены фрагменты ожидаемой длины. Как и предполагалось, в связи с высокой специфичностью разработанных SSR праймеров, амплификация наблюдалась только у представителей видов группы cymosum.

Характеристика полиморфизма микросателлитных локусов. Микросателлитньш ДНК-локус Fes 1840 у видов группы cymosum был полиморфным и представлен 6 аллельными вариантами (рис.4).

F. hometroplcum F. esculentum (сорта) F. eiculentum (образцы)

|~Г~ 2 3 4 ' J_ "6 7 8 9 10 И 12 13 14 1J 16 17 18 19 20 II 22 23 1A 21'

A В В À.....À С В D A D D С E E С D A A D С A В A F A

Рис. 4. Аллельные варианты локуса Fes 1840 3 образцов F. homotropicum, 14 сортов и 8 образцов F. esculentum (6% полиакриламидный гель). Обозначения: А, В, С, D, E, F -аллельные варианты.

Анализ частот встречаемости каждого аплельного варианта микросателлитного локуса Fes 1840 определялся как отношение количества сортов и образцов, имеющих данный аллельный вариант, к общей выборке. Наиболее представленный у анализируемых образцов был аллельный вариант А (36%), наиболее редкий - аллельный вариант F (4%) (табл. 1).

Коэффициенты информативности PIC локуса Fes 1840 для полного набора образцов группы cymosum составил 0.77. PIC для образцов F. esculentum не превышал 0.71, для сортов отечественной селекции 0.77, а

для образцов F. homotropicum значение PIC было на уровне 0.45, что соответствовало данным Konishi et al. (2006) для этого локуса. Полученные результаты электрофоретического анализа аллельных вариантов микросателлитов в 6% ПААГе были подтверждены секвенированием.

Табл. 1. Полиморфизм последовательностей SSR-локусов 49 сортов и образцов Fagopyrum

Локус Число детектированных аллельных вариантов Частота встречаемости аллельного варианта, % Коэффициен тИС

Fes 1840 6 А - 36%, В,С - 16%, D - 20%, Е - 8%, F - 4% 0.77

Fes 2644 6 А - 14.3%, В -20.4%, С - 28.6%, D - 16.3%, Е - 12.2%, 0.81

Fes 1303 18 A,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,0,P,R,S - 5.3%, В,С -10.5% 0.94

Fes 1585 4 А - 27.3%, В - 45.5%, С - 22.7%, D - 4.5% 0.67

Fes 3177 11 А- 31.8%, B,C,D,E,F - 9.1%, G,H,I,J,K - 4.5% 0.85

Fes 1368 16 А - 47.9%. В,С - 8.3%, D - 6.3%JE,F - 4.2%, &HJJ.KXM.N.O.P-2.1% 0.75

Fes 3331 14 А - 57.5%, В,С - 7.5%, DJEí,G,H,I,J,K,L,M,N - 2.5% 0.66

Было показано, что каждый из аллельных вариантов содержал ожидаемый микросателлит (§а)в, длина которого у исследованных образцов варьировала, и определялась числом повторяющихся единиц микросателлитной последовательности (рис. 5).

fea)»

.ЛеыйхчЬштШ^ (gab

l^im^iMñ

Рис. 5. Примеры

& (ga)«

вариабельности повтора (ga)s.j в последовательносга микросателлитного ДНК-локуса Fes 1840 видов Fagopyrum в программе Chromas 1.45

Анализ остальных отобранных микросателлитных ДНК-локусов Fes 1303, Fes 1368, Fes 1585, Fes 2644, Fes 3177, Fes 3331 проводили по аналогичной схеме.

Таким образом, анализ вариабельности отобранных нами семи микросателлитных локусов у 49 сортов и образцов гречихи выявил 75 аллельных вариантов. Максимальное число аллельных вариантов было идентифицировано для локуса Fes 1303 (18), минимальное - для локуса Fes 1585 (4). Коэффициент PIC взятых в анализ SSR локусов для исследованных сортов и образцов рода Fagopyrum варьировал от 0.66 (Fes 3331) до 0.95 (Fes 1303). Для каждого исследованного сорта и образца рода Fagopyrum установлена SSR формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

Анализ полиморфизма последовательностей хлоропластиой ДНК видов Fagopyrum. Для исследования нуклеотидных последовательностей пластома 17 видов гречихи был проведен детальный анализ и впервые охарактеризованы 4 ранее неисследованные области пластома, включающие

нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров trnL-trnF, psbA-trnH, trnT-tmY и интрона гена rpSló.

Полиморфизм последовательностей спенсера trnL-trnF. В анализ межгенного участка trnL-trnF были взяты 29 образцов анализируемых видов Fagopyrum, а также образец Rheum australe, взятый в качестве внешней группы. В анализируемом наборе вариабельными оказались 67 нуклеотидных сайтов, что составило 16.1% от всей длины выровненной последовательности.

Длина спейсера варьировала от 406 п.н. (виды группы urophyllum, за исключением F. lineare) до 381-382 п.н (виды группы cymosum). Длина trnL-trnF участка у Rheum australe была наиболее короткой и составила 328 п.н. (рис.6).

Рис.6. Результаты амплификации спейсерного участка ипЬ-ггпР (М - ДНК маркер 1500-100 п.н.). '

Внутренняя область спейсера всех анализируемых образцов рода Fagopyrum характеризовалась присутствием большого числа повторов, число и локализация которых варьировала у представителей разных видов (рис.7).

Так, например, пентануклеотид ААОАв у пяти видов (Р. еясикпшт, Р. ЬотоП-оркит, Р. ¡шапсит, р. стопит, Р. giganteum), образующих группу сутовит встречается два раза, в то время как у представителей группы игорЬуИит эта же последовательность повторялась четырежды, причем, дважды в том же положении, что у образцов группы сутовит.

Также у видов сутотт были выявлены две протяженные делеции: ТАТОАОТААТААТАТОТ в положении 156 и СТТОАААА в положении 124.

2п iyasfi

у аидац

дэа

.ЗУ V

"■У

»заааа

даа

laanatfa aiutgt

ISO

ttíiaa hÎV

265 303

^^^Cymomm group

(F.escuuntum, 390 F. komoirojpicurfi)

_ Cymosum group

(F.tataruum, F.cymosum, 390 F.giganieum)

otat titg ¡¡^

*-*gagta3 aatatgt

_ Urophyllum tfroup

(F.gracilipts, F.O'qxllatum,

®-265 303 31? 353-Щ— gStSZT*™""*

F.UfiCafodui^FjirophyUumi

124 146 Stat tatg м'ам» (Шиш maaaK-

WW Urophyllum group

265 303 31 ? 363 390 (F.liium*)

124

Rheum дар.

245 31? 353

Рис,7. Схема межгенного спейсера ¡гпЬ-тгР у представителей рода Ра§оругит, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции; цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера)

Интересно отметить, что обе они фланкированы короткими инвертированными повторами (GTAT и ТТА соответственно), что, по всей вероятности, может говорить о рекомбинационном механизме образования этих делеций.

Помимо инделей, межгенные участки tmL-trnF анализируемых видов Fagopyrum были насыщены нуклеотидными заменами специфичными, как для отдельных видов, так и для групп видов cymosum и urophylhm.

Полиморфизм последовательностей спейсера psbA-trnH. Длина psbA-trnH спейсера варьировала от 435 п.н. (F. esculentum) до 473 п.н. (F. тасгосагрит). Длина участка psbA-trnH у представителя рода Rheim составила 460 п.н. Вариабельными были 123 нуклеотидных сайта (22.2 %).

Представители разных видов Fagopyrum характеризовались своими специфичными наборами инделей и замен (рис.8).

1 Сутпхнт group

-—-(F.esadaUum,

И' ЭМ ' . , ,

F. komotropicum)

Сутожш group

jgfo_' -" (FMuiam,

iff tltcc

шЬ- -«м cctta sttcc

alacatdaalteoaalaa rjf aaaoaaaam

F.cymosum, F.gigaatam)

Iropkyllum grrmp

Tsi 553 да ' эй "" Meam щ>.

Рис.8. Схема межгенного участка psbA-trnH у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерция; цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера)

Как и в случае последовательности спейсера tmL-tmF был выявлен ряд нуклеотидных замен, по которым различались группы видов cymosum и urophyllum. Помимо этого для представителя рода Rheum были выявлены нуклеотидные замены, которые были сходными либо с группой cymosum, либо с группой urophyllum Наибольшим количеством видоспецифичных точковых замен характеризовалась спейсерная область представителей видов F. esculentum, F. homotropicum, F, tataricum, наименьшим - F. rubifolium.

Помимо нуклеотидных замен в последовательности данного спейсера у видов рода Fagopyrum были выявлены индели (рис. 8).

Так, у всех образцов Fagopyrum и Rheum tanguticum в положении 394-п.н. находилась протяженная АТ-богатая инсерция. Данная вставка по длине варьировала от 69 п.н. у представителей группы urophyllum рода Fagopyrum до 104 п.н. у Rheum tanguticum. При анализе вставки было показано, что инсерция по местоположению внутри psbA-tmH спейсера была одинакова и начиналась с 394 нуклеотида, но интересно то, что по первичной последовательности она различалась и, таким образом была специфичной для определенных видовых групп (рис.9).

нуклеотидные последовательное т и <п.н.}

Рис.9. Фрагмент, выровненной нуклеотидной последовательности спейсерного участка psbA-trnH у представителей видов Fagopyrum

Кроме того, было показано, что хотя psbA-trnH спейсер пяти видов группы cymosym по последовательности и длине был сходен, но по двум инделям и по специфичным нуклеотидным заменам группа cymosum четко разделялась на две подгруппы: первая включала виды F. esculentum и F. homotropicum, вторая - F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum.

Полиморфизм последовательностей спейсера trnT-trnY. Размеры спейсера trnT-trnY варьировали от 665 п.н. (F. tataricum) до 871 п.н. (F. callianthum), т.е. различия составляли 206 нуклеотидов, тогда как длина этого же участка у представителя рода Rheum достигала 1146 п.н. В анализируемом наборе вариабельными оказались 126 нуклеотидных сайтов, что составило 13.9% от всей длины выровненной последовательности.

У .Y-

\7V

Р.яевuletium, P.fuifHPtropicti»!

167 20Й 326

Рис. 10. Схема межгенного участка ¡тТ-П-пУ у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делений (треугольниками обозначены инсерции; цифрами - положения нуклеотидов от начала спейсера)

Межгенный спейсер (тТ-тгУ у Ра^оругит оказался высоко полиморфным и характеризовался протяженными АТ-богатыми инсерциями,

которые встречались по всей последовательности спейсера (56-843 п.н.) за исключением его 5' - и 3' - концевых участков (рис. 10).

При анализе нуклеотидной вставки в положении 276 было показано, что эта инсерция по последовательности отличалась у видов группы су топит и urophyllum. Так, инсерция представителей группы urophyllum по длине составила 131 п.н., а виды группы cymosum характеризовались семинуклеотидной вставкой YTTATCA (рис. 11). Представитель рода Rheum так же характеризовался инсерцией (156 п.н.) в положении 276.

Рис. 11. Фрагмент выровненной нуклеотидной последовательности межгенного спейсера tmJ-tmY у представителей видов Fagopyivm

Кроме инсерций, некоторые виды характеризовались наличием видоспецифичных делений. Так, у все образцов вида F. lataricum детектировалась делеция участка 456-501 п.н., которая присутствовала у всех остальных видов группы cymosum (рис. 11).

Помимо инсерций и делеций хпДНК все виды Fagopynm характеризовались нуклеотидными видоспецифичными заменами. Хотелось бы особо отметить, что в результате анализа внутривидовой вариабельности спейсера tmT-tmY для видов F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum были впервые выявлены различные образецспецифичные гаплотипы хпДНК.

Полиморфизм последовательностей интрона гена rpS16. Размеры интрона rpSlö у представителей рода Fagopyrum варьировали от 744 п.н. (F. тасюсагрит) до 819 п.н. (F. homotropicum), при этом вариабельными оказались 68 нуклеотидных сайтов, что составило 8.2% от всей длины выровненной последовательности.

У всех видов Fagopyrum были выявлены свои специфичные наборы нуклеотидных замен, которые можно использовать в дальнейшем для идентификации этих видов гречихи. Также некоторые виды характеризовались видоспецифичными инделями (рис. 12). Так, например, у всех представителей рода Fagopyrum в положении 661-732 по выровненной последовательности находилась инсерция, которая по длине варьировала от 20 п.н. у группы urophyllum до 67 п.н. у F. escuientum и F. homotropicum. При анализе этой вставки было показано, что ее первичная последовательность различна у различных видов гречихи (рис. 12).

F. escuf&ntum

F. hamotropicum

F.tataricurrr, F-cymositm. F.giçiantotJm

F. erra ofHpaa, F. oapMatum. F.mbltotlum

F. caWmrrthum F. ma orooarpum F. /»ptopxxJum

F. urophyllum Rheum ssp

Рис. 12. Схема интрона /р516 у представителей рода Рсц>оругит, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции; цифрами -положения нуклеотидов от начала спейсфа)

Общая дендрограмма, построенная на основании анализа нуклеотидных последовательностей четырех областей хп ДНК показала, что все образцы, взятые в исследование, разделились на два четких кластера (рис, 13).

■ ем/ь/кян

■ ^игорйуй/тСОгвг

/шеюя гшат

ьГийтт '^и/йютомго

Группа urophy lum

i(PW*>«CS»!J

fmtStsMJ»

fmarn

■¡¿щЯтШ

О;;

■.¿ГхЩвШП

"-тфст «ИпСИ! ок,№ крюриМпШ ктФ>ст fjMOffl

I |кр||1М)|

Группа ymosurr

Ищи/тШ

ftoertmOUi

ДОЮ

РЩттШ

FfUtimmOSil

FnmtpiCCK

FmcimmCHttS

гг.РоШтШ

^'faiumam Fmtomm»от» fmtowiflfl FmtàiialW fmiumStt FmtolmW FmèeeW ftemnpieimOIB

ËFMtmmmcm FirnmptmCHit Fhùm шшШ

Fimmmcrn

_rj, FmimpomiCiM

13 FOUЙМИМ CK!i fuami»» FaxnaU Fmmad

■ Fuma m

■ Ft/nouH

■ FqnmlHi

■ mm

Группа cymo. sum

оЛёЬЯСШ! ftxéttmiun«mt htuàtmlW F гхиЬшп 101 FaiiàrimM fmtomlQ F ва*пип Ш

ИлторlUWlfSIJÎ

Fhmliwkmm flmmpIcmCM ■ш'шкя/МШЙК "нкшрйМСВК

f Mil» il

I шмитЯ

flânai ti

fqnraemCiiy

fWWéuiiifM

fcjeeraîl

FcrmmUJI

Рис.13. MP(A)- и Bayes (Б) дендрограммы, построенные на основе данных анализа нуклеотидных последовательностей спейсеров tmL-trnF, psbA-trnH, trnT-tmY и интрона гена rpSlô хлоропластной ДНК, показывающие различия видов Fagopyrum (в узлах обозначены индексы бутстрепа (А), индексы Байеса (Б))

Представители видов F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum (группа cymosum) объединились в первый кластер. Виды F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F, callianihum, F. macrocarpimi, F. leptopodum, F. lineare, F. pleioramosum, F. statice, F. gilesii, F. jinshaensc, F. urophyUum (группа urophyUum) образовали второй кластер. Внутри первого кластера выделились два четких субкластера, поддерживающиеся высокими значениями бутстрепа. Виды F. esculentum и F. homotropicum образовали первый субкластер, тогда как второй субкластер образовали виды F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum. Полученные нами данные совпадают с результатами, приведенными в работе Y. Yasui и О. Ohnishi (1998 а, Ь) по анализу последовательности хцЦНК (спейсер rbcL-accD ) и ядерной ДНК ( последовательность ITS).

Внутри второго кластера, объединяющего виды группы urophytum отдельный субкластер образовали виды F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium. Также вместе кластеризовались F.pleioramoswn/ F. macrocarpum/F- callianthum, F. statice/F. leptopodum и F. lineare/F. urophyUum. Bm.F.gilesii образовал отдельную ветвь.

Таким образом, был проведен анализ вариабельности последовательностей хлоропластной ДНК генома 29 образцов 17 видов Fagopyrum. Впервые были охарактеризованы последовательности спейсерных участков (trnL-trnF, psbA-trnH, írnT-trnY) и интрона гена rpS¡6. В среднем для каждого образца было проанализировано 3026 п.н. и, таким образом, всего было получено и проанализировано 75650 п.н. хлоропластного генома представителей 17 видов гречихи. Для каждого вида гречихи были выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели, которые могут быть использованы для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма пластома Fagopyrum на разных таксономических уровнях. Для видов F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum были впервые выявлены гаплотипы.

Анализ вторичной структуры uiunpoua rpS16 представителей Fagopyrum. Хлоропластный ген rpSló кодирует рибосомный белок S16 и его интрон относится к группе нитронов П типа, которые способны к автономному сплайсингу и считаются эволюционными предшественниками эукариотических интронов [Keating et al., 2010]. Хотя интрон rpSló широко использовался в филогенетических исследованиях, функционально значимые для сплайсинга элементы первичной и вторичной структуры интрона описаны только для нескольких растений (Nicotiana tabacum, Aralia chinensis и Allium sp) [Michel etal, 1989, Downie and Katz-Downie, 1999, Ryzhovattfa/., 2009]. Поэтому представлялось интересным охарактеризовать вторичные структуры rpSI6 у видов гречихи, В результате анализа вторичной структуры интрона rpSló у представителей рода Fagopyrum были определены границы всех шести доменов интрона и их основные функционально-значимые мотивы (рис. 14). Последовательности доменов Ш и V были полностью консервативны у всех видов Fagopyrum, что согласуется с функциональным значеним этих областей для сплайсинга РНК, Наиболее вариабельными были

домены I и IV. Так в последовательности домена IV, помимо нуклеотидных замен, были детектированы 8 инделей, различающихся по длине от 2 до 67 нуклеотидов, при этом некоторые из них были ассоциированы с АТ-богатыми повторами. В домене I была идентифицирована семи нуклеотидная делеция в С-петле у /л тасгосагрит и Г. сарШашт. В последовательности домена П только у Р. игорИуИит была выявлена двухнуклеотидная делеция, в то время как остальные последовательности были инвариантны. .12 п

ЕВ52 группа сут< АТТАТАТ

Р. тасгосагрит 42 п.н. делеция

Р.Нпе¿. ААААТ Оелеция | "

Р. 1ерЮр<и!ит ААСААА делеция

Г. саШапШт Г. тасгосагрит САвАТ делеция

VI/ |ГГ""'

У -<Л

Рис. 14. Вторичная структура ире-мРНК интрона гена гр81б у представителей рода Fagopyrum (цифрами обозначены основные домены, буквами - субдомены и мотивы, стрелками показала локализация делений)

Анализ полиморфизма последовательностей митохондриального генома видов Fagopyrшtu В данной работе был также впервые проведен анализ вариабельности последовательностей митохондриальной ДНК гречихи, оценен внутривидовой, межвидовой и межродовой полиморфизм и на основе полученных данных выявлены межвидовые филогенетические отношения. Для исследования митохондриального генома гречихи был выбран ген сох 1 и Ь/с интрон гена пасИ, относящийся к группе II интронов. Для проведения сравнительного анализа в исследование были взяты те же 29 образцов ¡<а%оругшп, что и для анализа хпДНК.

Впервые была определена последовательность гена сох 1 Длина выровненной последовательности составила 555 п.н. В анализируемом наборе вариабельными оказались 27 нуклеотидных сайтов, что составило 4.9% от всей длины выровненной последовательности.

Впервые было показано, что ген сох] у Ра^оругит не содержал интрон. Также впервые была определена последовательность Ь/с интрона гена па<11. Размеры интрона варьировали от 1217 п.н. у представителей видов

F. (ataricum, F. cymosum и F, giganteum до 1239 п.н. у образцов вида F. capillatum. Последовательность b/c интрона гена nadl видов Fagopynim была GA-богата и характеризовалась наличием небольшого количества нуклеотидных замен 17 нуклеотидных сайтов (1.4%). В результате анализа внутривидовой вариабельности b/с интрона nadl мтДНК для вида F. esculentum были впервые выявлены митотипы.

Помимо нуклеотидных замен при анализе интрона nadl у видов рода Fagopynim и рода Rheum также были обнаружены индели (рис. 15).

Су/пснит groujp (F. rscui*.-nU/щ. К homvtropicumi

Cymosum group (F. taJaricMot, f. cymosum. F. ei^qiummj

Urophyllum group (F-emaUfaa, F.ruMfnUum, F.cbMianzhum,

784 Г.тажсшрвт, P.UpU^dam,

F.unopkyUMW

UrophyUum group

iFrapilUaumi

UropkyUum gtvH*

Рис. 15. Схема интрона nadl у представителей рода Fagopyrum, показывающая локализацию инсерций и делеций (треугольниками обозначены инсерции; цифрами -положения нуклеотидов от начала спейсера)

У всех анализируемых видов рода Fagopynim в положении 784 от начала интрона была обнаружена вставка (422 п.н.). Интересно, что у Rheum tanguticum в том же положении инсерция была вдвое короче (206 п.н.) и отличалась по первичной последовательности. Внутри этой вставки у видов Fagopyrum хотелось бы отметить последовательность AGAAA в положении 949. У всех видов группы cymosum данный пентануклеотид присутствовал в последовательности один раз. У всех анализируемых видов группы urophyllum последовательность AGAAA была повторена тандемно, кроме вида F. capillatum, у которого этот пентануклеотид повторялся трижды (рис. 15). Помимо инсерций для некоторых видов рода Fagopyrum были выявлены свои специфичные делеции. Так, виды F. lalaricum. F. cymosum и F. giganteum характеризовались делецией 6-нуклеотцдной последовательности TTGAAC в позиции 707, тогда как у всех остальных анализируемых видов групп cymosum и urophyllum рода Fagopyrum и у Rheum tanguticum данная последовательность присутствовала (рис. 15).

На основе выявленного полиморфизма последовательности гена сох] и b/с интрона nadl мтДНК были построены дендрограммы, которые показали четкую кластеризацию видов на две группы.

Один кластер объединил все виды, относящиеся к группе cymosum, второй кластер образовали виды группы urophyllum. Анализ митохондриального генома так же, как анализ хлоропластного генома показал четкую дифференциацию группы cymosum на два субкластера: один

субкластер объединил виды Р. еяси1епШт и Г. кото^оркит, второй -Р. ?аШпсит, Р. сутозит и Р. giganteum. В то же время группа игоркуИит не разделилась на субкластеры, которые были выявлены при анализе хлоропластной ДНК. Таким образом, полученные данные позволили определить возможные направления эволюции мтДНК видов гречихи. Было показано, что последовательность Ь/с интрона пас11 может быть использована для таксономических и филогенетических исследований гречихи.

Анализ вторичной структуры последовательность Ь/с интрона гена пас11 представителей Fagopyrшn. Ь/с интрон гена пас//, также как интрон грБ16, относится к группе интронов II типа.

Р0-

шг-.í.

Е85

APVa

долопнигтпьная

Fagopyrum escui&ntum

Fagopyrum urophyllum

Рис.16. Вариабнльность вторичной структуры домена I Ь/с интрон гена ñadí у представителей рода Fagopyrum. (буквами обозначены,- субдомены и мотивы)

Анализ вторичной структуры Ь/с интрона гена nadl у видов Fagopyrum позволил определить границы всех доменов и основные функционально-значимые мотивы. Также как и в случае интрона rpsló, у всех видов Fagopyrum последовательности доменов III и V были полностью консервативны, что согласуется с их функциональной важностью. Наиболее вариабельными были домены I и IV. Так в последовательности домена I, помимо б нуклеотидных замен, было показано отсутствие последовательности a-мотива у представителей F. urophyllum (рис. 16). Домен IV был наиболее полиморфным и, помимо замен, было выявлено 5 различных инделей, как видоспецифичных (делеция TCTAGAGAGG у F. lineare, инсерция AGAAAAGAAA у F. capillatum), так и специфичных для групп видов (инсерции AAAGAAGGAGG у группы urophyllum, ААСТТ - у группы cymosum).

Комплексный анализ полиморфизма последовательностей хлоропластной и митохондриальной ДНК видов Fagopyrum.

Заключительным этапом оценки внутривидового и межвидового полиморфизма хлоропластной и митохондриальной ДНК, выявления филогенетических отношений и определения возможных направлений эволюции ДНК последовательностей Fagopyrum явилось проведение

комплексного анализа геномной ДНК гречихи. На основании данных о вариабельности хпДНК и мтДНК NJ-, МР- и ML методами были построены общие дендрограммы, которые в основном совпадали по типу кластеризации видов'в целом (рис. 17). Все виды, взятые в анализ, на дендрограммах выделились в два четких кластера, первый кластер образовали виды группы cymosum (F, esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymasunu F. giganteum). Второй кластер - виды группы urophyllum (F. gracilipes, F. capillatum, F. mbifolium, F. ccillianthum, F. macrocarpum, F. lepiopodum. F. lineare, F. pleioramosum, F. s(atice, F. gilesii, F. jinshaensc, F. urophylhm). Эти данные полностью подтвердили результаты Ohnishi О. (1998) и Yamane et al. (2003) по разделению всех видов рода Fagopyrum на две филогенетически-эволюционные группы cymosum и urophyllum.

ffipmáMCQW -[oj&piMJMCttft

l^fftiKWwtcanflé

Гpynní urophylU

Группа cymosum

lPh*ic»CQ№ 1Ш.

-"■kçfyxdBmCOÎÏt

— f jiMICCaj f™ Fênphjtk/v 31 •+ÎJJHtnfibf}ur*a>2tt

Knphfiuv Cûiêl rtu«*»*C02%

tjHonmtvm C9K$ t'aГ ^ «лгселрит CSi »5

p— F «eWrJwf wc«»*JriJ« СШ

— F«K»bnlum4W —'FfscWerri*i»4W —» F «ederrto» 549

— F «ceíwrtort» )«

11—fwc^fcm «40

—-MiDAciffle/rï^cwif C9SÛ6 f Awtefroirèwr C20Í6 ^«»Аит^ ûiSjnW CSÍ3J lítarfampo&nAwCMÜ FiiDifftumSS

f И*теит65 ç j —»f qmwtfift CW54 ■"fjVrtíMffi 109 ~Fцгышп7 f mFqfrtns*in 423i

Группа urophyllum

г*4«»

Hjm,

•»f vu

mгР*мх*СШ

Jlfiù*««»

tr-Fl^^iMCnn J-FffefCttU

Ijifpci^am

i -fn*Mu«CWdl 4 .Ft^HitUtCiSi ЫъЯяшгх»

"mV*)MrtCÍ7tf

•^ЬпЙшСИЯ Fmjotapim СП* Feac/Mifim&tfSê Ffimnemm CfM Fpkhnanm ОШ ,РтрЬ/1кяС9Ш Fmphflhmll f^hfltrntm

fmaMmUl

Группа cymosum

FmciAttimifJf

'•ниЬлюЛЯ ГелМяШ

F hMNttpjcm ClM F (тт*9к«>С|ГЯ f kmctvi'ia* СДО Ff^MtMi '» f

Ftjwmlf

lynia C&HA fUvbmtS fuurttm* rtnrtemU ftxtrim piünnWS Ft*Mafl*p<toWDU5 — fímm

Рис.17. Bayes- (A) н NJ -(Б) дендрограммы, построенные un основании данных анализа последовательностей хпДНК и мтДНК, показывающие различия видов Fagopyrum (в углах обозначены, индексы Байеса (Л) индексы бутстрспа (Н))

Кроме этого в кавдом кластере выделилось по несколько субкластеров. Так, виды первого кластера (группа cymosum) разделились на два субкластера. В первый субкластер объединились виды F. esculentum и F. homotropicum, а во второй F. tataricum, F. cymosum и F. giganteum, что

также подтвердило ранее полученные данные о делении ввдов группы cymosum на две эволюционные ветви [Ohnishi and Matsuoka, 1996; Yasui and О. Ohnishi, 1998]. На дендрограмме, построенной по объединенным данным анализа хп и мт ДНК, виды группы urophyllum формировали несколько подкластеров: первый - F. gracilipes/F. capillatum/F. rubifolium; второй -F. staíice/F, leptopodum и третий - F. macrocarpum /F. pleioramosum /F. calJianíhum. Такой же тип деления на субкластеры показали Т. Ohsako и

0.0hnishi (2000), изучая филогенетические отношения между видами группы urophyllum.

До сих пор остается непонятным систематическое положение трех видов - F. urophyllum, F. lineare и F.gilesii. Оценка филогении методом Байеса выявило вероятное родство видов F. urophyllum и F. lineare. В тоже самое время при использовании метода NJ эти виды, наоборот, образовывали отдельные кластеры, причем кластер F. urophyllum занимал базальное положение по отношению к другим видам группы urophyllum. Ранее , О. Ohnishi и Y. Matsuoka (1996) отмечалось, что вид F. urophyllum, входя в состав филогенетической группы urophyllum по морфологическим признакам может занимать промежуточное положение между группами cymosum и urophyllum. Вид F.gilesii во всех случаях образовывал самостоятельную ветвь и не проявлял сходства с какими-либо видами группы urophyllum. Также хотелось бы отметить, что до 1991 года предком вида F. esculentum считался вид F. cymosum [Campbell, 1976, Nagatomo, 1984]. Однако эта гипотеза согласно данным проведенного маркирования ядерной и цитоплазматической ДНК, скорее всего, несостоятельна. Несмотря на морфо-биологическое сходство F. cymosum и F. esculentum рассчитанные нами коэффициенты генетических различий и сравнение последовательностей хп- и мтДНК показывают, что эти два вида лишь отдаленно родственны. Эти предположения совпадают с данными, приведенными в ряде работ [Kishima et al., 1995; Yasui et al, 1998], и подтверждают, что F. cymosum генетически более близок к виду F. tataricum, чем к F. esculentum, поддерживая возможность происхождения F. tataricum от F. cymosum [Yamane et al., 2003].

Таким образом, нами впервые был проведен комплексный анализ хпДНК и мтДНК видов рода Fagopyrum. Это позволило оценить уровни межвидовой изменчивости как хлоропластной, так и митохондриальной ДНК геномов гречихи. Был обнаружен ряд видоспецифичных нуклеотидных замен и инделей, которые весьма эффективно могут быть использованы для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма генома на разных таксономических уровнях.

ВЫВОДЫ

полиморфизма последовательностей варьирует в пределах 0.19-0.33. Внутривидовой полиморфизм Е Шапсит в два раза ниже, чем у К езсикпШт. Уровень межсортовых различий К е&сиЪпыт соответствует диапазону геномной вариабельности дикорастущих образцов Е евсикпшт 0.10-0.28.

2. Методом ввЛ маркирования у видов группы сутоъит выявлено 75 аллельных вариантов семи микросателитных локусов гречихи;

для каждого локуса определены аллельные варианты, частоты их встречаемости и коэффициенты информативности, для каждого анализируемого генотипа установлена ЗБЛ формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

3. Охарактеризованы последовательности спейсерных участков {ХтЬ-ггпЕ, рфА-ХтН, ОпТ-гтУ) и интрона гена грЯ16 хлоропластной ДНК Fagopyrum:

выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели. выявлены гаплотипы хп ДНК для видов Е ¡готоЬ-оргат, К ШШпсит и К сутозит.

4. Охарактеризованы последовательности гена сох1 и Ь/с интрона гена пас11 митохондриальной ДНК Еа^оругит и определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма:

- показано отсутствие интрона в гене сох1.

идентифицированы видоспецифичные инсерции и деяеции в последовательности интрона Ь/с гена пасН.

5. Определены вторичные структуры автосплайсирующихся интронов группы П у видов Ещоругит хлоропластного гена грЭ16 и Ь/с интрона митохондриального гена пасН :

определены границы шести доменов интрона, их основные функционально-значимые мотивы,

выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели.

6. По результатам комплексного молекулярного анализа проведена сравнительная оценка филогений по ядерному, хлоропластному и митохондриальному геномам. Выявлена значительная дивергенция видов ЕезЫелЬ/т/ЕНотороргсит от ЕЛсИапсит/Е.сутояит и подтверждена близкородственностъ видов Е.яшИсе - Р. 1ер(орос1ит и К тасгосагрит-Е ркюгатозит-Е саШаМИит.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кадырова Г.Д., Кадырова Ф.З., Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. КАР1>-анализ геномного полиморфизма видов и сортов рода Еа%оругит // Экологическая генетика. - 2008. - Т.VI. - №3. - С. 3-10.

2. Кадырова, Г.Д., Кадырова Ф.З., Мартиросян Е.В., Рыжова Н.Н. Анализ геномного разнообразия образцов и сортов гречихи посевной и татарской КБЛ- методом // Сельскохозяйственная биология. - 2010. - №5. - С.42-48.

3. Кадырова, Г Д., Рыжова Н.Н., Кочиева Е.З. Филогенетические отношения у видов Fagopyrum, основанные на данных анализа b/с интрона гена nadl И Вестник МГУ, 2010. - № 4. - С. 162-164.

4. Кадырова ГД, Рыжова Н.Н. Молекулярный анализ геномного и пластомного полиморфизма видов рода Fagopyrum // Материалы научно-практической конф. «Генетика и селекция растений», 8-12 декабря М., 2008.

5. Кадырова ГД, Е.В. Мартиросян, Н.Н. Рыжова Оценка геномного полиморфизма культивируемых видов и сортов Fagopyrum с помощью молекулярных методов // V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров». -М., 21-28 июня 2009г. - часть I. - С. 238.

6. Kadyrova G.D., E.Z. Kochieva Phylogenetic relationships in Fagopyrum species based on nucleotide polymorphism of b/c intron of nadl gene // 2nd Moscow International Conference «Molecular Phylogenetics» (MolPhy-2), Moscow, May 18-21,2010. - 2010. - P. 106

7. Kochieva EZ,, Kadyrova GD., Ryzhova NN. . Variability of plastid and mitochondrial sequences in Fagopyrum species // Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat «Advances in buckwheat research», Orel, July 19-23 2010. - 2010. - P. 265-267.

8. Kadyrova G, Martirosyan E, Ryzhova N. Analysis of nucleotide polymorphism and secondary structure of the rps\6 intron in Fagopyrum species // Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat «Advances in buckwheat research), Orel, July 19-23,2010. - 2010. - P. 329-330.

9. Kadyrova G.D., Kochieva E.Z., Ryzhova N.N. Nucleotide polymorphism and secondary structure of the mitochondrion nadli477 intron in Fagopyrum species. PLANTGEM Istanbul, May 4-7,2011. P.98.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу 420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, КФУ, Отдел аттестации научных кадров, Диссертационный совет Д 212.081.08, Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01

Формат 60/84/16 .Усл..печ 1.0...Бумага офсетная Печать ризографическая .Тираж 100экз. Заказ № Отпечатано о готовых оригинал- макетов 420029 г. Казань ул. Сибирский тр. 34

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кадырова, Гузель Дамировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 Обзор литературы.

1.1 Методы изучения полиморфизма нуклеотидных последовательностей

ДНК растений.

1.1.1 Изучение полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК растений основанного на ПЦР - реакции

1.1.1.1 Метод КАРБ- анализа.

1.1.1.2 Метод АРЬР- анализа.

1.1.1.3 Метод анализа.

1.1.1.4 Метод ББИ- анализа.

1.1.2 Изучение полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК, основанного на детекции полиморфизма точковых замен 8КР.

1.1.3 Изучение полиморфизма нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК растений.

1.1.4 Изучение полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК растений.

1.2 Морфо-биологическая характеристика рода Радоругит.

1.2.1 Описание и внутривидовая классификация культивируемого вида

Fagopyrum езсЫепШт МоепсЬ.

1.2.2 Описание культивируемого вида Разору гит ЬМаНсит (Ь.) СаегЫ.

1.3 Классификация рода Fagopyrum.

1.4 Биохимическая характеристика культивируемых видов Радоругит.

1.5 Центры происхождения, распространение и филогенетические отношения у видов Радоругит.

Глава 2 Материалы и методы.

Глава 3 Результаты и обсуждение.

3.1 Молекулярный анализ ядерного генома Радоругит.

3.1.1 Анализ генома представителей рода Ра^оругит АБЬР методом.

3.1.1.1 Подбор праймерных комбинаций и рестрицирующих эндонуклеаз для проведения АРЬР анализа последовательностей ДНК гречихи.

3.1.1.2 АРЬР-анализ межвидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК Fagopyrum.

3.1.2 Молекулярный анализ полиморфизма ДНК культивируемых видов гречихи Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tataricum.

3.1.2.1 AFLP анализ полиморфизма культивируемых видов гречихи

Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tataricum.

3.1.2.2 RAPD анализ полиморфизма ДНК культивируемых видов гречихи

Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tataricum.

3.1.2.3 ISSR анализ полиморфизма ДНК видов и сортов рода

Fagopyrum.

3.1.3 Комплексный анализ вариабельности ДНК представителей культивируемых видов гречихи Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tataricum с использованием RAPD, ISSR и AFLP методов маркирования.

3.2 Анализ полиморфизма микросателлитных SSR локусов видов и сортов

Fagopyrum.

3.2.1 Тестирование и отбор прайм еров для амплификации микросателлитных локусов гречихи.

3.2.2 Микросателитный анализ видов и образцов группы cymosum.

3.2.2.1 Характеристика полиморфизма последовательности микросателлитного локуса Fes 1840.

3.2.2.2 Характеристика полиморфизма последовательности микросателлитного локуса Fes 2644.

3.2.2.3 Характеристика полиморфизма микросателлитных локусов Fes 1368,

Fes 1585, Fes 1303, Fes 3177, Fes 3331.

3.3 Анализ полиморфизма последовательностей хлоропластного генома видов Fagopyrum.

3.3.1 Полиморфизм последовательностей хпДНК спейсера trnL-trnFу представителей рода Fagopyrum.

3.3.2 Полиморфизм последовательностей спейсераpsbA-trnHу представителей

Fagopyrum.

3.3.3 Полиморфизм последовательностей спейсера trnT-trnYу представителей трот Fagopyrum.

3.3.4 Полиморфизм последовательностей интрона гена rpSló у представителей рода Fagopyrum.

3.3.5 Анализ вторичной структуры интрона rpS16 представителей

Fagopyrum.

3.3.6 Комплексный анализ четырех областей хлоропластного генома

Fagopyrum.

3.4 Анализ полиморфизма последовательностей митохондриального генома видов Fagopyrum.

3.4.1 Анализ вторичной структуры Ь/с интрона nadl представителей

Fagopyrum.

3.5 Комплексный анализ полиморфизма последовательностей хлоропластного и митохондриального генома видов Fagopyrum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum"

Гречиха является одной из важнейших продовольственных культур, обладающей высокой питательной и лечебно-профилактической ценностью. Белки плодов гречихи по питательности полноценнее белка злаков и приближаются к белкам бобовых культур. Кроме того, плоды гречихи обладают высокими диетическими свойствами благодаря повышенному содержанию в составе крупы легкорастворимых фракций белка, незаменимых аминокислот, ненасыщенных жирных кислот, витаминов, особенно рутина, и минеральных солей.

Род Fagopyrum Mill. (Гречишные) относится к семейству Polygonaceae. Из 17 видов Fagopyrum культивируются только два: гречиха посевная (F. esculentum) и гречиха татарская (F. tataricum). Генофонд культурных видов Fagopyrum, отличается небольшим морфо-биологическим разнообразием [Fesenko et al., 2001,Yamane et al., 2004]. Он сравнительно слабо исследован и выявление генетического потенциала гречихи, в том числе по различным хозяйственно-ценным признакам (фармакологическим и адаптивным свойствам, экологической устойчивости) является особенно актуальным.

В связи с этим разработка биохимических методов идентификации полиморфизма ядерной и цитоплазматической ДНК последовательностей геномов и селекционно-значимых генов как культивируемых, так и дикорастущих видов имеет большую значимость для исследований прикладного характера, направленных на расширение биоразнообразия культивируемых видов гречихи с улучшенными качественными и урожайными свойствами. Данные, полученные при исследовании информативных участков ядерной и цитоплазматической ДНК, могут широко использоваться как при определении уровней межвидовой и внутривидовой вариабельности нуклеотидных последовательностей, так и при создании видовых и сортовых ДНК-маркеров для паспортизации сортов и линий гречихи.

Помимо культивируемых видов, род Fagopyrum включает 15 диких видов, большинство из которых открыты и описаны лишь в конце 90-х годов прошлого столетия. Поэтому для некоторых видов до конца не определены филогенетические отношения и таксономический статус. Как известно, эволюционные исследования, таксономические классификации базируются на использовании данных о вариабельности нуклеотидных последовательностей ДНК таксонов. Однако, что касается видов Ра^оругит, эта тема остается недостаточно изученной. Так, большая часть биохимических и молекулярных исследований генома была сфокусирована в основном на анализе культивируемых видов гречихи [Е§§иш е/ а1., 1980, Кгей а1, 2002], в то время как вариабельность ДНК последовательностей остальных видов исследована слабо.

В связи с этим целью настоящей работы явилось выявление вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК геномов культивируемых и дикорастущих видов рода Fagopyrum.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи: • 1. Определить уровни межвидового и внутривидового полиморфизма ядерной ДНК представителей рода Fagopyrum методом АБЬР анализа вариабельности нуклеотидных последовательностей.

2. С использованием нескольких систем мультилокусного маркирования (ИАРБ, 18811, АБЬР) провести анализ внутривидового полиморфизма ядерной ДНК культурных видов гречихи Р.еясикпШт и Т7.1а1аг1сит.

3. Провести ББЯ анализ полиморфизма отдельных микросателлитных ДНК-локусов образцов видов Р. еБсЫепЫт, Р. котоКорюит, Р. (Мапсит и Р. сутозит. Определить аллельные варианты микросателлитных локусов и частоты их встречаемости у видов и образцов Fagopyrum.

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК гречихи. Охарактеризовать ранее не исследованные последовательности спейсерных участков {1гпЬ-1тР, рзЪААгпН, ЬгпТ^тУ) и интрона гена гр§16 хпДНК Fagopyrum и оценить возможность их использования в таксономических и филогенетических исследованиях.

5. Провести анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК (ген сох1 и Ь/с интрона гена пасИ) видов Fagopyrum. Определить уровни внутривидового и межвидового полиморфизма последовательностей анализируемых образцов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кадырова, Гузель Дамировна

выводы

1. Методами мультилокусного анализа у видов Fagopyrum идентифицировано 746 полиморфных ДНК-фрагментов, определены уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности ДНК последовательностей гречихи, из них 245 видоспецифичных фрагментов и 5 фрагментов, характерных для филогенетических групп. Уровень межвидового полиморфизма последовательностей варьирует в пределах 0.19-0.33. Внутривидовой полиморфизм Г. 1а1апсит в два раза ниже, чем у .Р. езсъйеЫит. Уровень межсортовых различий Р. еБсиЫпШт соответствует диапазону геномной вариабельности дикорастущих образцов Р. еяси1епШт 0.100.28.

2. Методом 88Я маркирования у видов группы сутошт выявлено 75 аллельных вариантов семи микросателитных локусов гречихи:

- для каждого локуса определены аллельные варианты, частоты их встречаемости и коэффициенты информативности,

- для каждого анализируемого генотипа установлена 8811 формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

3. Охарактеризованы последовательности спейсерных участков {ртЬ^гпР, рзЬА-ШН, 1гпТ-1гпУ) и интрона гена гр816 хлоропластной ДНК Разору гит'.

- выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели,

- выявлены гаплотипы хп ДНК для видов Р. кото^оргсит, Р. 1а1аг\сит и Р. сутотт.

4. Охарактеризованы последовательности гена сох1 и Ь/с интрона гена пай1 митохондриальной ДНК Fagopyrum и определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма:

- показано отсутствие интрона в гене сох1,

- идентифицированы видоспецифичные инсерции и делеции в последовательности интрона Ь/с гена пасИ.

5. Определены вторичные структуры автосплайсирующихся интронов группы II у видов Fagopyrum хлоропластного гена гр816 и Ь/с интрона митохондриального гена пас11:

- определены границы шести доменов интрона, их основные функционально-значимые мотивы,

- выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели.

6. По результатам комплексного молекулярного анализа проведена сравнительная оценка филогений по ядерному, хлоропластному и митохондриальному геномам. Выявлена значительная дивергенция видов Р.езси1еп(ит/Р. кото^орюит от РЛа1апсит1Р.сутошт и подтверждена близкородственность видов згаИсе-Р. 1ер1оройит и Р. тасгосагрит— Р. р1е 'югатояит- Р. саШаШкит.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые с использованием различных систем молекулярного маркирования проведен комплексный анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматических ДНК Fagopyrum.

С использованием нескольких систем мультилокусного ДНК маркирования (AFLP, RAPD, ISSR) были проанализированы и оценены уровни межвидовой и внутривидовой вариабельности функционально различных ДНК последовательностей генома Fagopyrum. Проведенный AFLP анализ позволил определить уровни межвидового и внутривидового полиморфизма и филогенетические связи у 58 представителей 13 видов рода Fagopyrum. Было идентифицировано 746 полиморфных ДНК-фрагментов генома гречихи. При этом было получено 245 видоспецифичных фрагментов и 5 фрагментов, характерных для групп видов. Было показано, что коэффициенты различий между видами различных филогенетических групп варьирует от 0.19 {F. cymosum/F. giganteum -F. urophyllum) до 0.33 (F. esculentum — F. rubifolium), тогда как этот же показатель внутри групп не превышал 0.30 (для группы urophyllum) и 0.22 (для группы cymosum).

Данные вариабельности первичных последовательностей были использованы для построения дендрограммы, которая показала четкую дифференциацию всех анализируемых видов Fagopyrum на два кластера. В первый кластер объединились все виды группы cymosum, а во второй виды группы urophyllum. Внутри группы cymosum выделялись четкие, быстро дивергирующие подкластеры образцов F. esculentum/F. homotropicum и

F. tataricum/F. cymosum/F. giganteum. Образование единой клады образцами видов F. tataricum и F. cymosum (100% ИБ) свидетельствует об их близком филогенетическом родстве, предположении о возможности происхождения F. tataricum от F. cymosum. Второй кластер объединил виды, формирующие филогенетическую группу urophyllym (F. gracilipes, F. capillatum, F. rubifolium, F. callianthum, F. macrocarpum, F. leptopodum, F. lineare, F. urophyllum) с выделением отдельных субкластеров, родственных видов F. gracilipes -F. capillatum - F. rubifolium и видов F. callianthum — F. macrocarpum — F. leptopodum.

С использованием трех методов мультилокусного ДНК-маркирования AFLP, RAPD и ISSR межвидового, внутривидового и межсортового полиморфизма впервые был проведен комплексный анализ вариабельности 47 дикорастущих образцов и сортов двух культивируемых видов: гречихи посевной и гречихи татарской (8 образцов, 14 сортов F. esculentum и 23 образца F. tataricum). Было получено 473 полиморфных ДНК-фрагмента, включающие помимо видоспецифичных, также сорто- и образецспецифичные фрагменты ДНК. Представители вида F. esculentum характеризовались высоким уровнем генетических различий (GD 0.06-0.30) который соответствовал диапазону геномной вариабельности дикорастущих образцов F. esculentum (0.10-0.28) из Японии, Китая, Непала, что говорит о широкой генетической основе отечественных сортов гречихи посевной. Тогда как внутривидовой полиморфизм ДНК последовательностей F. tataricum, представленного образцами из разных регионов мира, оказался более чем в два раза ниже (GD 0.01-0.17).

Существование таких различий в уровнях геномной вариабельности двух культурных видов гречихи связано, вероятно, с более узкой генетической основой F. tataricum, обусловленной самоопылением, а также временем возникновения видов. Аллогамия, самонесовместимость и преобладание перекрестного опыления у F. esculentum, по всей видимости, способствовали поддержанию высокого уровня внутрипопуляционной/внутрисортовой гетерогенности, а локальность распространения стародавних сортов гречихи определили отмечаемый высокий уровень межсортового и популяционного разнообразия гречихи F. esculentum.

В дополнение к мультилокусному анализу ядерной ДНК был проведен микросателлитный SSR анализ 49 образцов гречихи 4 видов (F. esculentum, F. homotropicum, F. tataricum, F. cymosum). Из 11 ранее разработанных микросателлитных ДНК маркеров для анализа полиморфизма сортов и образцов видов Fagopyrum было отобрано семь (Fes 1303, Fes 1840, Fes 1368, Fes 1585, Fes 2644, Fes 3177, Fes 3331) наиболее информативных. Анализ вариабельности семи микросателлитных локусов у 49 сортов и образцов гречихи позволил выявить 75 аллельных вариантов. Также для каждого локуса были определены частоты встречаемости каждого аллельного варианта и коэффициенты информативности. Максимальное число аллельных вариантов было идентифицировано для локуса

Fes 1303 (18), минимальное - для локуса Fes 1585 (4). Коэффициент PIC, взятый в анализ S SR - локусов для исследованных сортов и образцов рода Fagopyrum варьировал от 0.66 (Fes 3331) до 0.95 (Fes 1303). Для каждого исследованного сорта и образца рода Fagopyrum установлена SSR формула, которая может быть использована для составления молекулярно-генетического паспорта.

Для исследования последовательностей цитоплазматических геномов было отобрано 29 образцов, представляющих 17 видов рода Fagopyrum.

Впервые были охарактеризованы последовательности спейсерных участков trnT-trnY, trnL-trnF, psbA-trnH и интрона гена rpSló хлоропластной ДНК гречихи. Анализ этих четырех ранее неисследованных областей пластома представителей рода Fagopyrum выявил высокий уровень полиморфизма этих участков. Таким образом, показана возможность использования этих участков генома для проведения филогенетических и таксономических исследований у Fagopyrum.

В среднем для каждого образца гречихи было проанализировано 3026 п.н. и, таким образом, всего было получено и проанализировано 75650 нуклеотидных пар хлоропластного генома. Для каждого вида гречихи были выявлены видоспецифичные нуклеотидные замены и индели, которые могут быть использованы для филогенетических и таксономических исследований и выявления полиморфизма пластома Fagopyrum на разных таксономических уровнях и для идентификации видов рода Fagopyrum. В результате анализа межгенного спейсера trnT-trnY для видов F. homotropicum, F. tataricum и F. cymosum были впервые выявлены гаплотипы.

Впервые был проведен анализ вторичной структуры интрона rpS16 у представителей рода Fagopyrum, что позволило определить границы всех шести доменов интрона и их основные функционально-значимые мотивы. Последовательности доменов III и V были полностью консервативны, а домены I и IV были наиболее вариабельными.

Впервые был проведен анализ вариабельности последовательностей митохондриального генома гречихи. Были охарактеризованы два участка мтДНК 17 видов Fagopyrum: фрагмент гена coxl и Ь/с интрон гена nadl. Были определены уровни внутривидового и межвидового полиморфизма анализируемых образцов. Для последовательностей гена coxl был показан мономорфизм и отсутствие интрона. Размеры b/c интрона варьировали от 1217 п.н. у представителей видов F. tataricum, и F. cymosum до 1239 п.н. у образцов вида F. capillatum. Представитель рода Rheum характеризовался наименьшим размером интрона длина, которого составила 1005 п.н. Последовательность Ь/с интрона гена nadl анализируемых видов Fagopyrum характеризовалась наличием небольшого количества видоспецифичных нуклеотидных замен и инделий, а для вида F. esculentum впервые были выявлены гаплотипы. На основе выявленного общего полиморфизма ДНК второго интрона nadl мтДНК были рассчитаны межвидовые генетические расстояния и были построены дендрограммы методами NJ и Байес, демонстрирующие родство исследованных представителей рода Fagopyrum.

Также впервые был проведен анализ вторичной структуры Ь/с интрона гена nadl у видов Fagopyrum и определены границы всех доменов и основные функционально-значимые мотивы. Как и в случае интрона rpslö, у всех видов Fagopyrum последовательности доменов III и V были полностью консервативны,, что согласуется с их функциональной важностью для правильного сплайсинга интрона. Наиболее вариабельными были домены I и IV.

По результатам комплексного молекулярного анализа вариабельности последовательностей ядерной и цитоплазматической ДНК были определены филогенетические отношения у представителей рода Fagopyrum. Проведена, сравнительная оценка филогений по ядерному, хлоропластному и митохондриальному геномам. Выявлена значительная дивергенция видов F. esculentumIF. homotropicum от F. tataricum/F. cymosum и подтверждена близкородственность видов F. statice-F. leptopodum и F. macrocarpum-F. pleioramosum- F. calliantum.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кадырова, Гузель Дамировна, Казань

1. Alvares, I. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference Text. / I. Alvares, J. F. Wendel // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2003. - V. 29. -P. 417-434.

2. Applequist, W. L. Phylogeny of the Madagascan endemic family Didiereaceae Text. / W. L. Applequist, R. S. Wallace // Plant Systematics and Evolution. 2000. -V. 221.-P. 157-166.

3. Bakker, F. T. Mitochondrial and chloroplast DNA-based phylogeny of Pelargonium (Geraniaceae) Text. / F. T. Bakker, A. Culham, C. E. Pankhurst, M. Gibby // American Journal of Botany. 2000. - V. 87(4). - P. 727 -734.

4. Baldwin, B. G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae Text. / B. G. Baldwin // Molecular Phylogenetics and Evolution. 1992. - V. 1. - P. 3-16.

5. Barkman, T. J. Mitochondrial DNA sequences reveal the photosynthetic relatives of Rafflesia, the world's largest flower Text. / T. J. Barkman, S. H. Lim, К. M. Salleh, J. Nais, // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2004. - V.101. -P. 787-792.

6. Becher, S. A. Microsatellites for cultivar identification in Pelargonium Text. / S. A. Becher, К. Steinmetz, К. Weising, S. Boury, D. Peltier, J.-P.Renou, G. Kahl, K. Wolff// Theor. Appl. Genet. 2000. - V. 101. - P. 643 - 651.

7. Bellstedt, D. U. Phylogenetic relationships in Disa based on noncoding trnL-trnF chloroplast sequences: evidence of numerous repeat regions Text. / D. U. Bellstedt, H. P. Linder, E. H. Harley // American Journal of Botany. 2001. - V. 88. -P. 2088-2100.

8. Benali, S. Advances of Molecular Markers Application in Plant Pathology Research Text. / S. Benali //European Journal of Scientific Research. 2011. - V.50. -P.110-123.

9. Bergthorsson, U. Widespread horizontal transfer of mitochondrial genes in flowering plants Text. / U. Bergthorsson, K. L. Adams, B. Thomason, J. D. Palmer // Nature. 2003. - V. 424. - P. 197-201.

10. Bhargava, A. Seed protein electrophoresis of some cultivated and wild species of Chenopodium Text. / A. Bhargava, T.S.Rana, S. Shukla, D.OHRI // Biologia Plantarum. 2005. V. 49. № 4. P. 505-511.

11. Bornet, B. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting Text. / B. Bornet, M.Branchard // Plant Mol. Biol. Rep. 2001. - V. 19. P. 209-215.

12. Borsch, T. Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms Text. / T. Borsch, K. W. Hilu, D. Quandt, V. Wilde, C. Neinhuis, W. Bartholott // Journal of Evolutionary Biology. 2003. - V. 16. -P. 558-576.

13. Bottini, M. C. J. AFLP characterization of natural populations of Berberis (Berberidaceae) in Patagonia, Argentina Text. / M. C. J. Bottini, De Bustos A., Jouve N., Poggio L // Plant Syst. EvoL 2002. - V. 231. P.133-142.

14. Bredemeijer, G. M. M. Construction and testing of a microsatellite database containing more than 500 tomato varieties Text. / G. M. M. Bredemeijer, R. J. Cooke, M. W. Ganal, R. Peeters [et al.] // Theor. Appl. Genet. 2002. -V. 105.-P. 1019-1026.

15. Brown, R. N. A genetic map of squash (Cucurbita ssp.) with randomly amplified polymorphic DNA markers and morphological markers Text. / R. N. Brown, J. R. Myers // Am Soc Hortic Sci. 2002. - V. 127. - P. 568-575.

16. Cameron, K. M. On the value of nuclear and mitochondrial gene sequences for reconstructing the phylogeny of vanilloid orchids (Vanilloideae, Orchidaceae) Text. / K. M. Cameron // Annals of Botany. 2009. - V. 104 (3). - P. 377-385.

17. Campbell, C. G. Buckwheat Text. / C. G. Campbell // Evolution of Crop Plants. London. 1976. - P. 235-237.

18. Campbell, C. G. Buckwheat. Fagopyrum esculentum Moench Text. / C. G. Campbell // Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben/International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. 1997. -95 p.

19. Caser, M. Microsatellite-based genetic relationships in the genus Camellia: potential for improving cultivars Text. / M. Caser, D. T. Marinoni, V. Scariot // Genome. 2010. - V.53. - P. 384-399.

20. Cekic, C. The potential of ISSR-PCR primer pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria as a model Text. / C. Cekic, N. H. Battey, M. J.Wilkinson // Theor. Appl. Genet. 2001. - V. 103, -P. 540-546.

21. Chakravarthi, B. K. SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L) Text. / B. K. Chakravarthi, R. Naravaneni //African Journal of Biotechnology. -2006. -V. 5 (9). P. 684-688.

22. Charalampos, A. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) Text. / A. Charalampos, P. J. de Jong //Nuc. Acids Res. 1990. - V.18. - P.6069-6074.

23. Chen, J. AFLP analysis of nephthytis (Syngonium podophyllum.Schott) selected from somaclonal variants Text. / J. Chen, R. J. Henny, P. S. Devanand, C. T. Chao // Plant Cell Rep. 2006. - V. 24. - P. 743-749.

24. Chen, Q.F. A study of resources of Fagopyrum (Polygonaceae) native to China Text. / Q. F. Chen // Botanical Journal of the Linnean Society. -1999. V. 130. -P.53-64.

25. Costa, G. L. Cloning and analysis of PCR-generated DNA fragments Text. / G. L. Costa, A. Grafsky, M. P. Weiner // PCR Methods and Applications. 1994. -V.3. -P.338-345.

26. Couch, J. F. Buckwheat as a source of rutin Text. / J. F. Couch, J. Nagski, C. F. Krenson // Science. -1976. V.103. - P. 2668.

27. Demesure, B. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants Text. / B. Demesure, N. Sodzi, R. J. Petit // Mol Ecol. -1995. V. 4. - P. 129-131.

28. Derda, G. S Isozyme evidence regarding the origins of three allodiploid species of Polytrichastrum (Polytrichaceae, Bryophyta) Text. / G. S. Derda, R. Wyatt // Plant Syst. Evol. 2000. - V.220. - P. 37-53.

29. Duff, R. J. Phylogenetic relationships of land plants using mitochondrial small-subunit rDNA sequenses Text. / R. J. Duff, D. L. Nickrent // Ibid. 1999. - V. 86. -P. 372-386.

30. Dvorak, V. Intraspec variability of natural populations of Phlebotomus sergenti, the main vector of Leishmania tropica Text. / V. Dvorak, J. Votypka, A. M. Aytekin, B. Alten, P. Volf // Journal of Vector Ecology. 2011. - V. 36. - P. 49-57.

31. Ebrahimi, R. Genetic diversity evaluation of wild Persian shallot (Allium hirtifolium Boiss.) using morphological and RAPD markers Text. / R. Ebrahimi, Z. Zamani, A. Kashi // Scientia Horticulturae. 2009. - V. 119. - P. 345-351.

32. Eggum, B.O. The protein quality of buckwheat in comparison with other protein sources of plant and animal origin Text. // Buckwheat. 1980. P.115-120.

33. Enoki, H. SSR analysis of genetic diversity among maize inbred lines adapted to cold regions of Japan Text. / H. Enoki, H. Sato, K. Koinuma //Theor Appl Genet. -2002.-V. 104.-P. 1270-1277.

34. Ercisli, S. Relationships among some cornelian cherry genotypes (Cornus mas L.) based on RAPD analysis Text. / S. Ercisli, E. Orhan, A. Esitken, N. Yildirim, G. Agar // Genet Resour Crop Evol. 2008. - V. 55. - P. 613-618.

35. Esser, K. Genome doubling and pollen tube growth in heterostylous plants Text. / K. Esser // Z. fur ind. Abstammungs und Vererbungslehre. 1953. - V. 85. - S. 2550.

36. Fang, D. Q. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeats markers Text. / D. Q. Fang, M. L. Roose // Theor. Appl. Genet., -1997, — V.95. P.408-417.

37. Fesenko, I. N. Compatibility and congruity ofinterspecific crosses in Fagopyrum / I. N. Fesenko, N. N. Fesenko, O. Ohnishi // Proc. 8th Intl.Symp. Buckwheat at Chunchon. 2001. - V. I. P. 404-410.

38. Ford, O. S. Rose E.A. Long-distance PCR Text. / O. S. Ford II PCR Methods and Applications. 1994. - V.3. - P. 146-161.

39. Freudenstin, J. V. Analysis of mitochondrial nadlb/c intron sequences in Orchidaceae: utility and coding of length-change characters Text. / J. V. Freudenstin, M. W. Chase // Syst. Bot. 2001. - V. 26. - P. 643- 657.

40. Garkava-Gustavsson, L. Genetic diversity in a collection of apple (Malus domestica Borkh.) cultivars as revealed by RAPD markers Text. / L. Garkava-Gustavsson, H. Nybom // International Journal of Horticultural Science. 2007. -V. 13.-P. 1-11.

41. Ghosh, A. SSR Markers Linked to Mite (Polyphagotarsonemus latus Banks) Resistance in Jute (Corchorus olitorius L.) Text. / A. Ghosh, S. Sharmin, S. Islam, M. U. Pahloan, H. Khan IICzech J\ Genet. Plant Breed. 2010. V. 46. P. 64-74.

42. Ghosh, S. Species-specific AFLP markers for identification of Zingiber officinale, Z. montanwn and Z. zerumbet (Zingiberaceae) Text. / S. Ghosh, P.B. Majumder, S. S. Mandi //Genetics and Molecular Research. 2011. -V. 10. - P. 218-229.

43. Gianfranceschi, L. Simple sequence repeats for genetic analysis of apple Text. / L. Gianfranceschi, N. Seglias, R. Tarchini, M. Komjanc, C. Gessler // Theor. Appl. Genet. 1998. -V. 96. P. 1069- 1076.

44. Gielly, L. The use of chloroplast DNA to resolve plant phylogenies: noncoding versus rbcL sequences Text. / L. Gielly, P. Taberlet // Mol. Biol. Evol. 1994. - V. 11.-P. 769-777.

45. Gilbert, J. E. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections Text. / J. E. Gilbert, R. V. Lewis, M. J. Wilkinnson, P. D. S. Caligari // Theor. Appl. Genet. 1999. - V. 98. - P.l 125-1131.

46. Golkar, P. Genetic Variation in Safflower (Carthamus tinctorious L.) for Seed Quality-Related Traits and Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers Text. / P. Golkar, A. Arzani, A. M. Rezaei Hint. J. Mol. Sei. 2011. - V. 12. -P. 26642677.

47. Gross, H. Beitrage zur Kenntnis der Poligonaceae Text. / H. Gross // Bot. Jahrbucher fur Sistematik, Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie. 1913. -B.49. - S.234-339.

48. Guo, J. A single origin and moderate bottleneck during domestication of soybean {Glycine max): implications from microsatellites and nucleotide sequences Text. / J. Guo, Y. Wang, C. Song, J. Zhou, L. Qiu, Y. Wang //Ann Bot. 2010. - V.106. -P. 505-514.

49. Hartmann, S. Phylogenetic origins of Lophocereus (Cactaceae) and the senita cactus-senita moth pollination mutualism Text. / S. Hartmann, J. D. Nason, D. Bhattacharya // American Journal of Botany. 2002. - V. 89. - P. 1085-1092.

50. Hiesel, R. Plant mitochondrial nucleic acid sequences as a tool for phylogenetic analysis Text. / R. Hiesel, A. Von Haeseler, A. Brennicke // Proc. Nat. Acad. Sei. -1994.-V. 91.-P. 634-638.

51. Hipp, A. L. Taxonomy of Hill's oak (Quercus ellipsoidalis E.J. Hill): Evidence from AFLP data Text. / A. L. Hipp, J. A. Weber // Systematic Botany. 2008. -V.33.-P. 148-158.

52. Hosaka, Y. Cell-mediated lysis of heat-inactivated influenza virus-coated murine targets Text. / Y. Hosaka, F. Sasao, R. Ohara. // Vaccine. 1985. - V.3. P. 245251.

53. Ickert-Bond, S. M. Phylogeny and biogeography of Altingiaceae: evidence from combined analysis of five non-coding chloroplast regions Text. / S. M. Ickert-Bond, J. Wen // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2006. - V. 39. - P. 512528.

54. Joshia, C. P. RAPD (random amplified polymorphic DNA) analysis based intervarietal gcnetic relationships among hexaploid wheats Text. / C. P. Joshia, H. T. Nguyen // Plant Science. 1993. - V. 93. - P. 95-103.

55. Karatas, H. Genetic diversity among Turkish local grape accessions (Vi'tis vinifera L.) using RAPD markers Text. / H. Karatas, Y. S. Agaoglu // Hereditas. -2008.-V. 145.-P. 58-63.

56. Karp, A. Molecular techniques in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity. Molecular genetic techniques for plant genetic resourse. Text. /

57. A. Karp, K. Edvards // Report of an IPGRI Workshop, oktober 1995. Rome, Italy -1997.-P.l 1-22.

58. Kelchner, S. A. Group II introns as phylogenetic tools: structure, function and evolutionary constraints Text. / S. A. Kelchner // American Journal of Botany. -2002.-V. 89.-P. 1651-1669.

59. Kelchner, S. A. Molecular evolution and phylogenetic utility of the chloroplast rpll6 intron in Chusquea and the Bambusoideae (Poaceae) Text. / S. A. Kelchner, L. G. Clark // Molecular Phylogenetics and Evolution. 1997. - V. 8. - P. 385-397.

60. Kitabayashi, H. Varietal differences and heritability for rutin content in common buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench Text.:/ H. Kitabayashi, A. Ujihara, T. Hirose, M. Minami. //Jpn J. Breed. 1995. - V. 45. - P. 75-79.

61. Knoop, V. The mitochondrial DNA of land plants: peculiarities in phylogenetic perspective Text. / V. Knoop //Curr Genet 2004. - V.46. - P.123-139. »

62. Kocsis, M. Genetic diversity among twelve grape cultivars indigenous to the Carpathian Basin revealed by RAPD markers Text. / M. Kocsis, L.Jaromi, P. Putnoky // Vitis. 2005. - V. 44. - P. 87-91.

63. Konishi, T. Development and characterization of microsatellite markers for common buckwheat Text. / T. Konishi, H. Iwata, K. Yashiro, Y. Tsumura, R. Ohsawa, Y. Yasui, O. Ohnishi // Breeding Science.- 2006. V. 56. - P. 277-285.

64. Kreft, S. Rutin in buckwheat herbs grown at different UV-B radiation levels: comparison of two UV spectrophotometric and an HPLC method Text. / S. Kreft,

65. B. Strukelj, A. Gaberscik, I. Kreft // J Experimental Botany. 2002. - № 53. -P. 1801-1804

66. Li, Q. Preliminary investigation on buckwheat origin in Yunnan, China Text. / Q. Li, M. Yang //Proc. 5th Int. Symp. Buckwheat, Taiyuan. 1992. - P.44-48.

67. Liu, X. Z. Advance of molecular marker application in the tobacco research Text. / X. Z. Liu, II. Y. Zhang // African Journal of Biotechnology. 2008. - V. 7 (25) - P. 4827-4831.

68. Livingstone, K. D. Genome mapping in Capsicum and evolution of genome structure in the Solanaceae Text. / K. D. Livingstone, V. K. Lackney, J. R. Blauth, R. van Wijk, M. K. Jahn//Genetics. 1999. - V. 152.-P. 1183-1202.

69. Lohne, C. Phylogenese analysis of Nymphaeales using fast-evolving and non-coding chloroplast markers Text. / C. Lohne, T. Borsch, J. H. Wiersema // Botanical Journal of the Linnean Society. 2007. - V. 154. - P. 141-163.

70. Malek, O. RNA editing in biyophytes and molecular phylogeny of land plants Text. / O. Malek, K. Lattig, R. Hiesel // EMBO J. 1996. - V. 15(6). - P. 14031411.

71. Manen, J. F. Phylogeny of Rubiaceae-Rubieae inferred from the sequence of a cpDNA intergene region Text. / J. F. Manen, A. Natali, F. Ehrendorfer // Plant Systematics and Evolution. 1994. - V. 190. - P. 195-211.

72. Marshall, K. Isolation of self-fertile, homomorphic forms in buckwheat, Fagopyrum sagittatum Gilib. Text. / H. Marshall // Crop Sei. 1969. - V. 9. -P.651-653.

73. Mast, A. R. Historical biogeography and the origin of stomatal distributions in Banksia and Dryandra (Proteaceae) based on their cpDNA phylogeny Text. /

74. A. R. Mast, T. J. Givnish // American Journal of Botany. 2002. - V. 89. - P. 1311-1323.

75. Mazza, G. Buckwheat Text. / G. Mazza // Academic Press, Toronto, New York. -1993.-P. 516-521.

76. McKinnon, G. E. An AFLP marker approach to lower-level systematics in Eucalyptus (Myrtaceae) Text. / G. E. McKinnon, R. E. Vaillancourt, D. A. Steane,

77. B. M. Potts // American Journal of Botany. 2008. - V. 95(3). - P. 368-380.

78. Meng, S. W. Phylogeny of Saururaceae based on mitochondrial matR gene sequence data Text. / S. W. Meng, Z. D. Chen, D. Z. Li, H. X. Liang // Journal Plant Res.-2002.-V. 115.-P. 71-76.

79. Miege, E. Recherches sur les principales especes de Fagopyrum Text. / E. Miege. -Paris, 1910.-353 p.

80. Milbourne, D. Isolation, characterisation and mapping of simple sequence repeat loci in potato Text. / D. Milbourne, R. C. Meyer, A. J. Collins, L. D. Ramsay,

81. C. Gebhardt, R. Waugh // Mol. Gen. Genet. 1998. - V. 259. - P. 233-245.

82. Minamiyama, Y. An SSR-based linkage map of Capsicum annuum Text. / Y. Minamiyama, M. Tsuro, M. Hirai // Mol. Breeding. 2006. - V. 18. - P. 157169.

83. Mirali, N. Genetic diversity and relationships in some Vicia species as determined by SDS-PAGE of seed proteins Text. / N. Mirali, S. El-Khouri, F. RIZQ, // Biologia Plantar ion. 2007. V. 51. №. 4, P. 660-666.

84. Moreno, S. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm Text. / S. Moreno, J. P. Martin, J. M. Ortiz // Euphytica. 1998. - V.101, - P.l 17-125.

85. Mudibu, J. Genetic Analysis of a Soybean genetic pool using ISSR marker: effect of gamma radiation on genetic variability Text. / J. Mudibu, K. K. C. Nkongolo, M. Mehes-Smith, A. Kalonji-Mbuyi // Plant Breeding and Genetics. 2011.

86. Mummenhoff, K. Chloroplast DNA phylogeny and biogeography of Lepidium (Brassicaceae) Text. / K. Mummenhoff, H. Brüggemann, John L. Bowman // American Journal of Botany. -2001. -V. 88(11). P. 2051-2063.

87. Murai M. Diffusion routes of buckwheat cultivation in Asia revealed by RAPD makers Text. / M. Murai, O. Ohnishi // Proc. 6th Int. Symp. on Buckwheat in Shinshu. 1995. - V. I-III. - P. 163-173.

88. Murai M. Population genetics of cultivated common buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench. X. Diffusion routes revealed by RAPD markers Text. / M. Murai, O. Ohnishi//Genes Genet. Syst.- 1996.-V.U.-P.211-218.

89. Muthusamy, S. Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) landraces Text. / S. Muthusamy, S. Kanagarajan, S. Ponnusamy // Electronic Journal of Biotechnology. 2008. -V.ll.

90. Nagaoka, T. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers Text. / T. Nagaoka, Y. Ogihara //Theor. Appl. Genet. 1997. - V.94. - P.597-602.

91. Nagatomo, T. Scientific considerations on Buckwheat Text. / T. Nagatomo // Saba no Kagaku,Tokyo, 1984.

92. Naghski, J. Effects of agronomic factors on the rutin content of buckwheat Text. / J. Naghski, J. F. Couch, J. W. Taylor, W. J. Sando, J. W. White, F. J. Holben, J. B. Washko // Technical builtin in USDA. 1955. - V. 1132. - P. 1-50.

93. Nakai, T. A new classification of Linnean Polygonum Text. / T. Nakai // Rigakkai. 1926.-V. 24.-P. 289-301.

94. Nakao, S. Transmittance of cultivated plants through Sino-Himalayan rout Text. / S. Nakao //Fauna and Flora Research Society. Kyoto, 1957. P. 397-420.

95. Nasu, S. Search and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNP) in rice and establishment of SNP markers. DNA Text. / S. Nasu, J. Suzuki, K. Ohta, K. Hasegawa, I. Yui //Res. 2002. - V.9. P. 163-171.

96. Nei, M. Analyses of gene diversity in subdivided populations Text. / M. Nei // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. -V. 70. - P. 3321-3323.

97. Ohnishi, O. A memorandum on the distribution of buckwheat species in Tibet and the Himalayan hills: has buckwheat crossed the Himalayas? Text. / O. Ohnishi //Fagopyrum. 1993a. - V.13. - P. 3-10.

98. Ohnishi, O. Cultivated and wild buckwheat in eastern Tibet. Text. / O. Ohnishi, T. Konishi//Fagopyrum.-2001.-V. 18.-P. 3-8.

99. Ohnishi, O. Discovery of new Fagopyrum species and its implications for the study of evolution of Fagopyrum and of the origin of cultivated buckwheat Text. / O. Ohnishi // Proc 6th Int Symp on Buckwheat. 1995. - V. 1. - P. 175-190.

100. Ohnishi, O. Discovery of wild ancestor of common buckwheat Text. / O. Ohnishi // Fagopyrum. -1991. V. 11. - P. 5-10.

101. Ohnishi, O. Isozyme variation in common buckwheat Fagopyrum esculentum and its related species Text. / O. Ohnishi // Proc. 2nd Int. Symp. Buckwheat, Miyazaki. -1983 -P. 39-50.

102. Ohnishi, O. On the origin of cultivated buckwheat Text. / O. Ohnishi // Proceedings ofthe 9th International Symposium on Buckwheat, Prague. — 2004. -P. 16-21.

103. Ohnishi, O. Population genetics of cultivated common buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench. V. Further studies on allozyme variability in the Indian and Nepali Himalaya Text. / O. Ohnishi, T. Nishimoto // Jpn. J. Genet. 1988. - V. 63. -P. 51-66.

104. Ohnishi, O. Reccnt progress of the study on wild Fagopyrum species Text. / O. Ohnishi // Proc. 8th Intl. Symp. Buckwheat at Chunchon. 2001. - P. 218-224.

105. Ohnishi, O. Search for the wild ancestor of buckwheat. I. Description of new Fagopyrum (Polygonaceae) species and their distribution in China and Himalayan hills Text. / O. Ohnishi // Fagopyrum. -1998a. V.15. - P.18-28.

106. Ohnishi, O. Search for the wild ancestor of buckwheat. II. Taxonomy of Fagopyrum (Polygonaceae) species based on morphology, isozymes and cpDNAvariability Text. / O. Ohnishi, Y. Matsuoka // Genes Genet. Sys. 1996. - V.71. -P. 383-390.

107. Ohnishi, O. Wild buckwheat species in the border area of Sichuan, Yunnan and Tibet and allozyme diversity of wild Tartary buckwheat in this area Text. / O. Ohnishi // Fagopyrum. 2002. - V. 19. - P. 3-9.

108. Ohsako, T. Intra- and interspecific phylogeny of wild Fagopyrum (polygonaceae) species based on nucleotide sequences of noncoding regions in chloroplast DNA Text. / T. Ohsako, O. Ohnishi //Amer. J Bot. 2000. - V. 87. - P. 573-582.

109. Ohsako, T. New Fagopyrum species revealed by morphological and molecular analyses Text. / T. Ohsako, O. Ohnishi // Genes and Genet. Syst. 1998. - V. 73. -P. 85-94.

110. Ohsako, T. Two new Fagopyrum (Polygonaceae) species F.gracilipedoides and F.jinshaense from Yunnan, China Text. / T. Ohsako, K. Yamane, O. Ohnishi //Genes and Genet. Syst. 2002. - V. 77. - P. 399-408.

111. Oliveira, R. P. RAPD markers in linkage maps of Citrus / R. P.Oliveira, C. I. Aguilar-Vildoso, M. Cristofani, M. A. Machado // Genetics and Molecular Biology. 2004. - V.27. - P. 437-441.

112. Parmar, P. Genetic Diversity and DNA Fingerprint Study of Tomato Discerned by SSR Markers Text. / P. Parmar, V. P. Oza, V. Chauhan, A.D. Patel, K. B. Kathiria, R. B. Subramanian //Biotechnology and Biochemistry. 2010. - V. 6. P. 657-666.

113. Patzak, J. Comparison of RAPD, STS, ISSR and AFLP molecular methods used for assessment of genetic diversity in hop (Humulus lupulus L.) Text. / Patzak J // Euphytica. -2001. V. 121.-P. 9-18.

114. Pellmyr, O. The phylogeny of yuccas Text. / O. Pellmyr, K. A. Segraves, D. M. Althoff, M. Balcazar-Lara, J. Leebens-Mack // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2007. - V. 43. - P. 493-501.

115. Pesole, G. Evolution of the nad3-rpsl2 gene cluster in angiosperm mitochondria: comparison of edited and unedited sequences Text. / G. Pesole, L. Ceci [et al.] // J.Mol.Evol. 1996. - V. 42. - P. 447-452.

116. Pleines, T. Phylogeographic implications of an AFLP phylogeny of the American diploid Hordeum species (Poaceae: Triticeae) Text. / T. Pleines, F. R. Blattner // Taxon. —2008. V. 57(3). - P. 875-881.

117. Porter, J. M. Phylogenetic relationships of Polemoniaceae: Inferences from mitochondrial nadlB intron sequences Text. / J. M. Porter, L. A. Jonson // Aliso. — 1998.-V. 17(2).-P. 157-188.

118. Powell, W. Polymorphism revealed by simple sequence repeats Text. / W. Powell, G. C. Machray, J. Provan // Trends in plant science. 1996. - V. 1(7). - P. 215-221.

119. Powell, W. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis Text. / W. Powell, M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey, A. Rafalski // Molecular Breeding. 1996. - V. 2(3).-P. 1380-3743.

120. Prevost, A. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars Text. / A. Prevost, M. J. Wilkinson // Theor Appl Genet. 1999. - V.98. -P. 107-112.

121. Prince, J. P. Construction of a molecular linkage map of pepper and comparison of synteny with tomato Text. / J. P. Prince, E. Pochard, S. D. Tanksley // Genome. -1992.-V.36.-P. 404-417.

122. Prince, J. P. Restriction fragment length polymorphisms and genetic distance among Mexican accession of Capsicum Text. / J. P. Prince, F. Loaiza-Figueroa, S. D. Tanksley // Genome. 1992. - V. 35. - P. 726-732.

123. Procunier, J. D. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in hexaploid wheat and high throughput 8NP detection by invader operation system Text. / J. D. Procunier, M. Gray, M. Liakat Ali et al. // Plant &Animal Genoms XI Conf., San Diego, 2003.-P. 251.

124. Qiu, Y.L. The gain of three mitochondrial introns identifies liverworts as the earliest land plants Text. / Y. L. Qiu, Y. Cho // Nature. 1998. - V. 394. - P. 671674.

125. Renner, S. S. Circumscription and phylogeny of the Laurales: evidence from molecular and morphological data Text. / S. S. Renner // American Journal of Botany. 1999,-V. 86.-P. 1301-1315.

126. Rongwen, J. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification Text. / J. Rongwen, M. S. Akkaya, A. A. Bhagwat, U. Lavi, P. B. Cregan // Theor. Appl. Genet. 1995. - V. 90. - P.43-48.

127. Ronse Decraene, L. P. Generic limits in Polygonum and related genera (Polygonaceae) on the basis of floral characters Text. / L. P. Ronse Decraene, J. R. Akeroyd // Botanical Journal of the Linnean Society. 1988. - V.98. - P. 321371.

128. Saliba-Colombani, V. Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome Text. / V.Saliba-Colombani, M. Causse, L. Gervais, J. Philouze // Genome. 2000. - V.43. P. 29-40.

129. Sando, W. J. Buckwheat culture Text. / W. J. Sando // Farm bull. Washington, 1956.-V. 2095.-23p.

130. Schonenberg, J. Molecular phylogeny and floral evolution of the Penaeaceae, Oliniaceae, Rhynchocalycaceae, and Alzateaceae (Myrtales) Text. / J. Schonenberg, E. Conti // American Journal of Botany. 2003. - V. 90. - P. 293309.

131. Sharma, T. R. Species relationships in Fagopyrum revealed by PCR-based DNA fingerprinting Text. / T. R. Sharma, S. Jana // Theor Appl Genet. 2002. - V. 105. -P. 306-312.

132. Shaw, J. Chloroplast DNA phylogeny and phylogeography of the North American plums {Prunus subgenus Prunus section Prunocerasus; Rosaceae) Text. / J. Shaw, R. L. Small // American Journal of Botany. 2005. - V. 92. - P. 2011-2030.

133. Sica, M. ISSR markers show differentiation among Italian populations Asparagus acutifolius L. Text. / M. Sica, G. Gamba, S. Montieri [et al.] //BMC Genetics. -2005. T.6. - V. 17.

134. Sofalian, O. Study the genetic diversity of wheat landraces from northwest of Iran based on ISSR molecular markers Text. / O. Sofalian, N. Chaparzadeh, A. Javanmard. M. S. Hejazi Hint. J. Agri. Biol. -2008.- V.10. -P.465.

135. Soltis, D. E. Contribution of Plant molecular systematics to studies of molecular evolution Text. / D. E. Soltis, P. S. Soltis // Plant Molec. Biol. 2000. - V. 42(1). -P. 45-75.

136. Somers, D. J. Minpng single-nucleotide polimorphisms from hexaploid wheat ESTS Text. / D. J. Somers, R. Kirkpatrick, M. Moniva, A. Walsh // Genome. -2003.-V. 49.-P. 431-437.

137. Steeh, M. Molecular circumscription of the hornworts (Anthocerotophyta) based on the chloroplast DNA trnLtrnF region Text. / M. Stech, D. Quandt, W. Frey // Journal of Plant Research. 2003. - V. 116. - P. 389-398.

138. Steele, K. P. Phylogenetic analyses of Polemoniaceae using nucleotide sequences of the plastid gene matK Text. / K. P. Steele, R. Vilgalys // Systematic Botany. -1994.-V. 19.-P. 126-142.

139. Stegeman, H. Refrospect on 25 years of cultivar identification by protein patterns and prospects for the futureText. / H. Stegeman // Proc. ISTA symposium on biochemical tests for cultivar identification. Conbridge, 1983. P. 20 31.

140. Steward, A. N. The Polygonaceae of eastern Asia Text. / A. N. Steward // Contributions from Gray Herbarium of Harvard University. 1930. - V. 88. - P.I— 129.

141. Stuart, M. Analysis of genetic diversity through AFLP, SAMPL, ISSR.and RAPD markers in Tribulus terrestris, a medicinal herb Text. / M. Stuart, S.' Das, P. R. Srivastava // Plant cell reports. 2008. - V. 27(3). - P. 519-528.

142. Sungkaew, S. Non-monophyly of the woody bamboos (Bambuseae; Poaceae): a multi-gene region phylogenetic analysis of Bambusoideae s.s. Text. / S. Sungkaew, C.M. Stapleton, N. Salamin, T. R. Hodkinson //J Plant Res. 2009. - V.122. P. 95108.

143. Suzuki, T. On the rutin contents in buckwheat and their distribution in Japanese. [Text] / T. Suzuki, H. Sakurada, H. Meguro, H. Suzuki, T. Sakagami, A. Ujihara // New Food Industry. 1987. - V. 29(6). - P. 29-32.

144. Tantasawat, P. SSR analysis of soybean {Glycine max (L.) Merr.) genetic relationship and variety identification in Thailand Text. / P. Tantasawat, J. Trongchuen, T. Prajongjai, S. Jenweerawat, W. Chaowiset // AJCS. 2011. - V. 5. -P. 283-290.

145. Teneva, A. Molecular markers in animal genome analysis / A. Teneva // Biotechnology in Animal Husbandry. — 2009. V. 25. P. 1267-1284.

146. Thomas, M. R. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (STSs) Text. / M. R. Thomas, N. S. Scott // Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 86. -P. 985-990.

147. Torada, A. SSR-based linkage map with new markers using an intraspecific population of common wheat Text. / A. Torada, M. Koike, K. Mochida, Y. Ogihara //Theor. Appl. Genet. 2006. - V. 112. - P. 1042-1051.

148. Tsuji, K. Phylogenetic relationships among wild and cultivated Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaert.) populations revealed by AFLP analyses Text. / K. Tsuji, O. Ohnishi // Genes Genet. Syst. 2001. - V.76. - P. 47-52

149. Tsuji, K. Search for Fagopyrum species in eastern Tibet. Text. / K. Tsuji, Y. Yasui, O. Ohnishi // Fagopyrum. 1999. - V. 16. - P. 1-6.

150. Tsvetoukhine V. Le sarrasin et ses possibilities d'amélioration Text. / V. Tsvetoukhine // Annales de amelioration des plantes. Paris, 1952. V. 1. - P. 99115.

151. Van, K. Discovery of SNPs in Soybean Genotypes Frequently Used as the Parents of Mapping Populations in the United States and Korea Text. / K. Van, E.-Y. Hwang, M. Y. Kim, H. J. Park, S.-H. Lee, P. B. Cregan //Hered. 2005. - V. 96. -P. 529-535.

152. Velkova-Jordanoska L. RAPD Analysis of Genetic Variations in Barbus Peloponnesius (Pisces, Cyprinidae) from River Vardar Text. / L. Velkova-Jordanoska, V. Kostov, G. Kostoski, S.Stojanovski // Balwois. 2010.P.1-8.

153. Vignal, A. A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics Text. / A. Vignal, D. Milian, M. Sancristobal, A. Eggen // Genetic Selection and Evolution. 2002. - V. 34. P. 275-305.

154. Yos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Text. / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, Van de Lee, M. Homes, A. Filters, J. Pot, J. Paleman, M. Kuiper, M. Zabeau // Nucleic Acids Research. 1995. - V. 23 (21). - P. 44074414.

155. Wang, D. G. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome Text. / D. G. Wang, J.-B. Fan, C.-J. Siao // Science. 1998. -V. 280. - P. 1077-1082.

156. Wang, G. (C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism in soybean, Glycine max (L.) Merr. Text. / G. Wang, R. Mahalingam, H.T. Knap // Theor Appl Genet. 1998, - V. 96, - P.1086-1096.

157. Wanntorp, L. Phylogeny of Gunnera Text. / L. Wanntorp, H. E. Wanntorp, B. Oxelman, M. Kallerjo // Plant Systematics and Evolution. 2001. - V. 226. - P. 85107.

158. Warwick, S. I. AFLP-based molecular characterization of Brassica rapa and diversity in Canadian spring turnip rape cultivars Text. / S. I. Warwick, T. James, K. C. Falk // Plant Genetic Resouces. 2008. - V. 6 (01). - P. 11-21.

159. Welsh, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers Text. / J. Welsh, M. McClelland//Nucl. Acids Res. 1991. -V. 18. - P.7213-7218.

160. Williams, J. G. K. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Text. / J. G. K. Williams, A. R. Kubelik, K. J. Livak [et.al.] // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 6531-6535.

161. Wolf, P. G. Evaluation of atpB nucleotide sequences for phylogenetic studies of ferns and other pteridophytes Text. / P. G. Wolf // American Journal of Botany -1997. V. 84. - P. 429-1440.

162. Wolfe, A. D. Assessing hybridizatoin in natural populations of Pestemon (Scrophulariaceae) using hypervariable inter-simple sequence repeat (ISSR) bands Text. / A. D. Wolfe, Q-Y. Xiang, S. R. Kephard // Mol. Ecol. 1998. - V. 7. - P. 1107-1125.

163. Wolff, K. PCR markers distinguish Plantago majer subspecies Text. / K. Wolff, M. Morgan-Richards // Theor. Appl. Genet. 1998. - V.96. - P.282-286.

164. Woo, S.H. Interspecific hybrids with Fagopyrum cymosum in the genus Fagopyrum Text. / S. H. Woo, Y. J. Wang, C. G. Campbell // Fagopyrum. 1999. - V. 16. -P.13-18.

165. Wu, K.-S. Detection of microsatellite polymorphism without cloning Text. / K.-S. Wu, R. Jones, L. Danneberger, P. A. Scolnik // Nucl. Acids Res. 1994. - V. 22.-P. 3257-3258.

166. Wunsch, A. Cultivar identification and genetic fingerprinting of temperate fruit tree species using DNA markers Text. / A. Wunsch, J. I. Hormaza // Euphytica. — 2002. -V. 125. P. 59-67.

167. Wunsch, A. Molecular characterisation of sweet cherry {Prunus avium L.) genotypes using peach .Prunus persica (L.) Batsch. SSR sequences [Text] / A. Wunsch, J. I. Hormaza // Heredity. 2002. - V.89. - P.56-63.

168. Xiang, G. J. Phylogenetic analysis based on chloroplast atpA gene sequences from Phyllostachys propinqua. Text. / G. J. Xiang, P. T. Liang, T. Zheng, Z. Lan, H. C. Zhong, Y. ICai//Journal of Southwest Forestry University. 2009. - V. 29. P. 31-36.

169. Yamane, K. Intraspecific cpDNA variation of diploid and tetraploid perennial buckwheat, Fagopyrum cymosum (Polygonaceae) Text. / K. Yamane, Y. Yasui, O. Ohnishi // Amer.J.Bot. 2003. - V.90. - P. 339-346.

170. Yamane, K. Phylogenetic relationships among natural populations of Perennial buckwheat, Fagopyrum cymosum Meisn. revealed by allozyme variations Text. / K. Yamane, O. Ohnishi // Genetic Resources and Crop Evolution. 2001. - V. 48. -P.69-77.

171. Yamane, R. Speciation of Fagopyrum tataricum inferred from molecular data / K. Yamane, K. Tsuji, O. Ohnishi // Proc. 9th Intl, Symp.Buckwheat at Prague. 2004. -P. 317-322.

172. Yang, P. Phylogenetic relationships of eleven Kobresia accessions from the Tibetan plateau Text. / P. Yang, H. Zheng, S. Larson, Y. Miao, T. Hu //African Journal of Biotechnology. 2010. - V. 9. P. 3359-3367.

173. Yano, O. Phylogeography of the Japanese common sedge, Carex conica complex (Cyperaceae), based on chloroplast DNA sequence data and chromosomal variation Text. / O.Yano, H. Ikeda, T. Hoshino //American Journal of Botany. 2010. - V. 97.-P. 1365-1376.

174. Yasui, Y. Interspecific relationships in Fagopyrum (Polygonaceae) revealed by the nucleotide sequences of the rbcL and accD genes and their intergenic region Text. / Y. Yasui, O. Ohnishi // American Journal of Botany. 1998a. - V. 85. - P. 1134— 1142.

175. Yasui, Y. Phylogenetic relationships among Fagopyrum species revealed by the nucleotide sequences of the ITS region of the nuclear rRNA gene Text. / Y. Yasui, O. Ohnishi // Genes and Genetic Systems. 1998b. - V. 73. - P. 201-210.

176. Ye, N. G. Classification, origin and evolution of genus Fagopyrum in-China Text. / N. G. Ye, G.Q. Guo // Proc. 5th Int. Symp. Buckwheat at Taiyuan. 1992. - P. 1928.

177. Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification Text. / E. Zietkiewicz, A. Rafalski,

178. D. Labuda // Genomics. 1994. - V. 20. - P. 176-183.

179. Алексеева, E. С. Генетика, селекция и семеноводства гречихи Текст. /

180. E. С. Алексеева, 3. П. Паушева. Киев : Выща школа, 1988. - 207с. - ISBN 511-000256-8.

181. Антонов, А. С. Геносистематика растений Текст. / А. С. Антонов // ИКЦ «Академкнига». М., 2006. - 293 стр.

182. Баталин, А. Ф. Культурные сорта гречихи Текст. / А. Ф. Баталин // Земледельческая газета. СПб, 1881. -№11-13.

183. Бочкарёва, JI. П. Анализ структуры растения гречихи Текст. / JI. П. Бочкарёва. Черниговцы, 1994. - 45с.

184. Вавилов, Н. И. Центры происхождения культурных растений Текст. / Н. И. Вавилов. Л.: Наука, 1967. - Т. 1. - С. 88-202.

185. Гринкевич, Н. И. Некорневая подкормка микроэлементами метод повышения эффективности лекарственного сырья Текст. / Н. И. Гринкевич, В. В. Ковальский, М. Ф. Грибовская //Агрохимия. - 1969, - № 10, - С.72-82.

186. Даниленко, FI. Г. Миры геномов органелл Текст. / Н. Г. Даниленко // Мн.: Технолопя, 2003. 494стр.

187. Елагин, И. Н. Возделывание гречихи Текст. / И. Н. Елагин, Г. М. Соловьев. -М.: Сельхозгиз, 1951. 120с.

188. Елагин, И. И. Возделывание гречихи Текст. / И. Н. Елагин. М. : Россельхозиздат, 1966. - 191 с.

189. Жуковским, П. М. Культурные растения и их сородичи Текст. / П. М. Жуковский. -Л: Колос, 1971. -751с.

190. Запрометов, М. И. Метаболизм фенольных соединений в растениях Текст. / М. Н. Запрометов // Биохимия. 1977. - Т.42. -№1. - С.3-20.

191. Кадырова, Г. Д. RAPD-анализ геномного полиморфизма видов и сортов рода Fagopyrum Г. Д. Кадырова, Ф. 3. Кадырова, Н. Н. Рыжова, Е. 3. Кочиева // Экологическая генетика. 2008, - Т.VI, - вып.З, - С. 3-10.

192. Кадырова, JI. Р. Морфология вегетативных и репродуктивных органов растений Fagopyrum esculentum Moench ssp. vulgare Stolet Текст. : дис. . канд. биол. наук 03.00.05. / Л. Р. Кадырова ; Казанский, гос. ун-т. -Казань, 2004.-216 л.

193. Кадырова, Ф. 3. Селекция гречихи в Республике Татарстан Текст. : дис. . д.с.-х. наук . / Ф.З. Кадырова ; Казань, 2003. - 243 л.

194. Кирилленко, С. В. Влияние сортовых особенностей на биохимические свойства зерна гречихи Текст. : дис. . канд. биол. наук / С. В. Кириленко ; ВИР.-Л., 1978.- 111 л.

195. Клыков, А. Г. Изучение исходного материала гречихи с целью создания сортов с высоким содержанием рутина Текст. : автореф. дис. . канд. с.-х. наук / А. Г. Клыков. — Благовещенск, 2001. — 21с.

196. Комаров, В. JI. Происхождение культурных растений Текст. / В. JI. Комаров //-М.-Л., 1938.-205 стр.

197. Конарев, В. Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений / В. Г. Конарев. Спб.: ВИР, 2001.-417 с.

198. Кротов, А. С. Гречиха Fagopyrum Mill Текст. // Культурная флора СССР. T.III. Крупяные культуры (гречиха, просо, рис) / А. Н. Кротов. - Л. : Колос, 1975.-С. 7-118.

199. Кротов, А. С. Гречиха Текст. / А.С.Кротов. М. : Россельхозиздат, 1963. -255с.

200. Кротов, А. С. Из истории возделывания гречихи Текст. / А.С.Кротов. М. 1962. - С.415-456.

201. Кузнецова, О.И. Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с помощью молекулярных RAPD- и ISSR-маркеров Текст. / О. И .Кузнецова, О. А. Аш, Г. А. Хартина, С. А. Гостимский // Генетика. 2005. -Т.41. - №1. - С.60-65.

202. Лаханов, А. П. Морфофизиология и продукционный процесс гречихи. Текст. / А. П. Лаханов, В. В. Коломейченко, Н. В. Фесенко, Г. В. Наполова, Р. С. Музалевская, В. И. Савкин, А. И. Фесенко. Орел, 2004. -433с.

203. Лозина-Лозинская, А. С. Гречиха Текст. / A.C. Лозина-Лозинская ; Флора СССР. М.-Л.: АН СССР, 1936. -Т. V. -С. 702-704.

204. Мансурова, В. В. Сравнительная кариология двух видов гречихи Текст. /

205. B. В. Мансурова // ДАН СССР, М.-Л., 1948. Т.61. - №1.- С.119-122.

206. Маргна, У. Влияние экзогенного азота на накопление флавоноидов в проростках гречихи Текст. / У. Маргна, JI. Ланей, Э. Маргна, М. Оттер, Т. Вайньяре //Изв. АН ЭССР. 1974. - Т. 23. -№ 4. - С. 298-303.

207. Мурри, И. К. Биохимия гречихи Текст. / И. К. Мурри. М., Ссльхозиздат, 1958. -Т. 1,.-С. 642-693.

208. Нечаев, А. П. Липиды зерна Текст. / А. П. Нечаев. М., Колос, 1975. - 290с.

209. Салтыковский, А. И. О классификации посевной гречихи (Fagopyrum esculentum Moench) и каемчатой гречихи (.Fagopyrum emarginatum Roth) Текст. / А. И. Салтыковский // Доклады АН СССР. 1940. - Т. 26. - №2.1. C.186-187.

210. Соколов, O.A. Качество урожая гречихи Текст. / O.A. Соколов. ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, 1983. - 263с.

211. Столетова, Е. А. Гречиха Текст. / Е. А. Столетова. Л.: Сельхозгиз, 1958.

212. Суворова, Г. Н. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill., установленное на основе RAPD-анализа Text. / Г. Н. Суворова, X. Фунатсуки, Ф. Терами // Генетика. 1999. - Т.35. - №12. -С.1659-1664.

213. Фесенко, Н. В. Гречиха Текст. / Н. В. Фесенко, Н. Н. Фесенко, О. И. Романова, Е. С. Алексеева, Г. Н. Суворова ; Теоретические основы селекции растений. СПб. : ГНЦ РФ ВИР, 2006. - 196 с.

214. Фесенко, Н. В. Селекция и семеноводство гречихи Текст. / Н.В. Фесенко. М. : Колос. 1983.- 191 с.

215. Хлёсткина, Е. К. SNP маркеры: методы анализа, способы разработки и сравнительная характеристика на примере мягкой пшеницы Text. / Е. К. Хлёсткина, Е. А. Салина //Генетика. - 2006. - Т.42. - № 6. - С. 725-736.

216. Яцентюк, С.П. Эволюция Lycopodiaceae по результатам секвенирования спейсерных последовательностей генов хлоропластной рРНК Текст. / С. П. Яцентюк, К. М. Вальехо-Роман, Т. X. Самигуллин, Н. Викстрем,256с.

217. А. В. Троицкий //Генетика. 2001. - V. 37. - Р. 1274-1280.

Информация о работе

Кадырова, Гузель Дамировна
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей ядерного и цитоплазматического геномов представителей рода Fagopyrum - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы