Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Миграция эпидермальных клеток человека в культуре

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Миграция эпидермальных клеток человека в культуре"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

/

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи УДК 576.5

ВОРОТЕЛЯК Екатерина Андреевна

МИГРАЦИЯ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ

03.00.11 эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Директор Института — академик Н.Г.Хрущов)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Василий Васильевич Терских

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Виктор Иванович Миташов Доктор биологических наук, профессор Юрий Сергеевич Ченцов

Ведущее учреждение

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

Защита диссертации состоится 18 марта 1998 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д002.85.01 при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: г.Москва, ул.Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Интитута биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, 26)

Автореферат разослан // февраля 1998 года.

Ученый секретарь дисссртационного совета „

кандидат биологических наук

л Е.В. Волина

Актуальность проблемы

Интактный эпителий необходим для выживания любого многоклеточного организма. Эпителий - это самый первый барьер, защищающий организм от воздействий внешней среды и поддерживающий внутренний гомеостаз. Постоянное обновление путем активной репаративной системы - один из важнейших механизмов поддержания целостности эпителия. Клеточная адгезия, миграция и пролиферация - важнейшие составляющие этого процесса. Направленная миграция эпителиальных, клеток чрезвычайно важна в таких событиях как эмбриональное развитие, заживление ран, регенерация органов, метастазирование опухолей. Большую группу морфогенетических процессов в эмбриогенезе представляют перемещения эпителиальных слоев, например, при гаструлгации амфибий и в эмбриогенезе рыб (Solnica-Krezel, 1995). В эпителиальных тканях взрослых организмов также отмечаются постоянные перемещения клеток, в частности происходит постоянная миграция эпидермальных кератиноцитов из базального слоя, где происходит размножение клеток, в супрабазальные слои (Dover, Potten, 1988). Наиболее типичным примером миграции эпителиальных клеток у эмбрионов и взрослых организмов является заживление pair (McMinn, Pritchard, 1972).

Миграция клеток происходит в результате сбалансированного взаимодействия клеток с субстратом и с другими клетками. Для понимания механизмов эпителизации раневой поверхности представляет интерес комплексное изучение роли факторов роста, компонентов межклеточного матрикса и межклеточных взаимодействий в миграции эпидермальных кератиноцитов человека.

Поскольку при регенерации эпителия одновременно происходит миграция и пролиферация клеток, представляет несомненный интерес изучение взаимосвязи этих двух процессов.

Изучение закономерностей миграции кератиноцитов является необходимым для понимания процессов заживления поврежденного эпидермиса, метастазирования опухолевых клеток эпидермалыюго происхождения и миграции клеток в онтогенезе.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение закономерностей миграции эпидермальных кератиноцитов человека в культуре и взаимосвязи процессов миграции и пролиферации. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучение морфологии и характера миграции колоний первичных кератиноцитов человека и клеток А-431 эпидермоидной карциномы человека.

2. Изучение ультраструктурных особенностей мигрирующих колоний кератиноцитов.

3. Определение пролиферативной активности клеток в мигрирующих колониях кератиноцитов.

4. Выяснение соотношения характера миграции и пролиферативной активности в колониях клеток А-431.

5. Изучение характера миграции эиидермальных клеток в условиях подавления пролиферации.

6. Исследование влияния физиологически активных агентов на пролиферацию и миграцию клеток А-431 в "рану", нанесенную на клеточный монослой.

7. Изучение эффекта компонентов внеклеточного матрикса на миграцию эпидермальных клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. Изучены

закономерности формирования и миграции кластеров эпидермальных клеток человека в культуре. Показано, что мигрирующие колонии теряют радиальнук симметрию и приобретают характерную морфологию, которая является признаком миграции. Методом компьютерной морфометрии проведен анали: количественных параметров, описывающих форму эпидермальных колоний дисперсии и элонгации. При активации миграции колоний статистичесет достоверно увеличиваются оба этих параметра, характеризующие степеш поляризации колоний. Показано, что мигрирующие колонии неоднороднь по составу. Клетки в разных частях колонии различаются но морфологии Впервые изучены ультраструкгурные особенности мигрирующих колоши эпидермальных кератиноцитов человека. Струю-ура мигрирующих колони! отличается от таковой энидермалыгого пласта. В процессе миграцш происходит сегрегация клеток в зависимости от степени их дифференциации Установлено, что наименее дифференцированные кератиноцитс располагаются в центре колонии, тогда как ведущий край состоит из боле дифференцированных клеток, которые формируют ламеллиподии. Такш образом, показано, что на определенной стадии дифферецциаци: кератиноциты приобретают повышенную подвижность. Исследован распределение пролиферирующих клеток в мигрирующих колония кератиноцитов методом авторадиографии. Анализ полутонких срезов колони эпидермальных кератиноцитов человека показал, что все меченые клетк были расположены в ведущем крае колонии, причем эти клетки имел ламеллиподии. Таким образом, синтез ДНК отмечается в той части колони кератиноцитов, где клетки проявляют признаки миграции.

Проанализирован также характер пролиферации клеток эпидермоидно карциномы в колониях после остановки и реинициации миграцш Направление движения этих колоний не определяется неравномерность пролиферации клеток в разных частях колонии, однако, в целом подвижной

клеточного кластера зависит от пролиферативной активности всех клеток колонии. Для анализа взаимосвязи пролиферации и миграции в эпидермалъных клетках изучена способность к миграции клеток линии А - 431 с разным лролиферативным потенциалом. Были получены смешанные колонии, состоящие из нормально пролиферирующих клеток и клеток, обработанных митомицином С. Выяснено, что клетки, неспособные к пролиферации, никогда не располагаются на ведущем крае колонии. Таким образом, показано, что пролиферативный потенциал клетки влияет на ее способность к миграции. В модели мтрации клеток в рану in vitro исследовано влияние факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса на миграцию клеток эпидермоидной карциномы А-431. Показано, что эпидермальныи фактор роста (EGF), фактор роста кератиноцитов и инсулин стимулируют миграцию этих клеток. В то же время, эти факторы роста не влияли на синтез ДНК. Таким образом, на модели миграции в рану была обнаружена диссоциация процессов пролиферации и миграции.

Кроме этого, было найдено, что клетки А-431 способны к миграции в среде без сыворотки и митогенов. Эту миграцию мы назвали базальной. Было выяснено, что базальный уровень миграции сохраняется в клетках после подавления пролиферации путем обработки их митомицином С. Однако такие клетки перестают реагировать на присутствие EGF. Таким образом, подавление пролиферации ведет к потере клеткой способности к EGF-стимулированной миграции. Показано, что базальный уровень миграции практически полностью подавляется обработкой сурамином.

Впервые была изучена миграция эпидермальных клеток под трехмерным коллагеновым гелем. Эта модель имитирует миграцию клеток in vivo под слоем некротичеких тканей при заживлении ран и ожогов. Проведена компьютерная морфометрическая оценка контрольных и помещенных под гель колоний первичных кератиноцитов. При культивировании под гелем уменьшаются дисперсия и элонгация, характеризующие степень поляризации колоний. В то же время мшрация клеток А-431 под гелем существенно стимулируется. Однако, стимулирующий эффект коллагенового геля на миграцию клеток А-431 проявляется только в присутствии сыворотки.

Эмбриональные фибробласты человека, заключенные в гель, в среде с сывороткой не влияют на динамику миграции. В отсутствие сыворотки наличие фибробластов приводит к откреплению клеток А-431 от подложки и их адгезии к коллагеновому гелю. Следовательно, в присутствии фибробластов в бессывороточной среде происходит изменение поляризации клеток А-431.

Таким образом, были изучены основные закономерности миграции эпидермальных клеток в культуре, выяснены взаимоотношения процессов миграции и пролиферация. Полученные данные вносят вклад в понимание

клеточных механизмов миграции кератиноцитов in vitro, влияния различных факторов на этот процесс.

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых Института биологии развития РАН (1996), Московском семинаре по клеточной биологии (1997), Международной конференции Ассоциации по изучению регенерации (Кельн, 1997), Межлабораторных семинарах Института биологии развития (1996, 1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ и 2 находятся в печати

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения и выводов. Работа изложена на/^Алраницах машинописного текста и содержит.:?, ^фотографий, .3... рисунков и .¿..таблиц.

Список цитируемой литературы включает*!-? ?. работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование зпидермальных кератиноцитов (ЭКЦ)

человека

Фрагменты кожи помещали в 0,25% раствор трипсина и инкубировали при 4 °С в течение 16-20 ч. После этого эпидермис отделяли от дермы и проводили дотрипсинизацию кусочков эпидермиса в 0,125% растворе трипсина в течение 10 мин при температуре 37°С. Действие трипсина останавливали добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки осаждали центрифугированием при 600 об/мин в течение 3 мин. Суспензию ЭКЦ вносили в культуральные сосуды в смеси сред DMEM:F12 с 10% эмбриональной телячей сыворотки (ЭТС) с добавлением инсулина (5 мкг/мл. Sigma), изопротеренола (106 М, Sigma), эпидермального фактора роста ( 1С нг/мл, Sigma).

Получение колоний клеток А-431

Для получения мигрирующих колоний клетки А-431 высевали i концентрации 103 клеток на 1 мл среды Игла с 10% ЭТС в чашки Петри, i которые помещали покровные стекла.

Электронно-микроскопическое исследование колоний ЭКЦ Материал фиксировали 2,5%-ным раствором глутаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере (pH 1,2-1,А) с добавлением сахарозы, дофиксировали 1%-ным раствором осмиевой кислоты на том же буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон-аралдит методом плоско-параллельной заливки. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, после чего исследовали в электронном микроскопе JEM-100CX:11.

Радиоавтографическое исследование пролиферации клеток в колониях

эпилермадьтмх клеток Колонии эпидермальных клеток, предварительно проинкубированные с 3Н-тимидином (1 мкКи/мл; уд. акт. 48,6 Ки/моль), фиксировали в 70% этаноле. Затем препараты промывали в 96% этаноле и высушивали. После этого наносили фотоэмульсию типа М, расплавленную при 37 °С, и экспонировали в темноте в течение 25 сут. Затем препараты проявляли в проявителе D-19 (5мин), промывали в дистиллированной воде и фиксировали в 40% растворе гипосульфита натрия в течение 7,5 мин. Полученные препараты окрашивали красителем Гимза или гематоксилином.

Для изучения распределения пролиферирующих клеток в колониях ЭКЦ эмульсию наносили на полугонкпе срезы, наклееннные на предметные стекла. Препараты экспонировали в течение 40 дней.

Морфометрический анализ колоний Форму колоний исследовали на базе лаборатории механизмов канцерогенеза Онкологического научного центра РАМН им.Н.Н.Блохина с любезного разрешения д.м.н. Ю.М.Васильева по методу, разработанному в работе Данна и Брауна (Dunn & Brown, 1986). Анализируемые колонии были зафиксированы и окрашены. Их контуры с помощью фотоувеличителя были перенесены на бумагу и затем введены в компьютер с помощью специальной координатной пластины (Summagraphics, Bitpad 2).

Получение смешанных колоний клеток А-431 Клетки А-431 культивировали в течение 7 сут. в полной питательной среде, содержащей 3Н-тимидин (0,3 мкКи/мл). Затем клетки обрабатывали митом ицином С (20 мкг/мл) в течение 2 ч. После этого клетки снимали раствором трипсина и Версена и смешивали с клетками интакгной культуры в соотношении 3:1. Клеточную суспензию некоторое время слегка перемешивали для предотвращения осаждения клеток и для образования клеточных сфероидов. После этого суспензию высевали в чашки Петри с

покровными стеклами для получения колоний. Через 72 ч культуры фиксировали и проводили радиоавтографическое исследование как описано выше.

Определение интенсивности синтеза ДНК в клетках эпидермоидной

карциномы А-431

Для определения интенсивности синтеза ДНК культуры инкубировали в среде с 3Н-тимидином (1 мкКи/мл) в течение 24 ч или импульсно (0,5 ч; 1 ч; 2ч). После окончания инкубации клетки дважды промывали раствором Хэнкса, а затем дважды обрабатывали 5% раствором трихлоруксусной кислоты при 4 °С в течение 10 мин. Клетки лизировали в 0,1N NaOH и вносили п сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность включившегося там ид ш га определяли на счетчике.

Для определения синтеза ДНК в клетках пласта после нанесения раны культуры инкубировали с 3Н-тимидином (1 мкКи/мл) в течение 1 ч сразу же после нанесения раны, через 24 и 48 ч после этого. После окончания инкубации культуры фиксировали в 70% спирте и проводили радиоавтографическое исследование как описано выше.

Определение относительного количества клеток в культурах Клетки Л-431 инкубировали в течение 5 сут. в 96-луночных планшетах в среде Игла с 10% ЭТС и с различными концентрациями исследуемого вещества. После окончания инкубации клетки дважды промывали раствором Хэнкса и фиксировали 2,5% раствором глутаральдегида в течение 1 ч при 4 °С. Затем клетки промывали водой и окрашивали красителем Гимза в течение 3 ч при 37 °С во влажной камере, после чего снова промывали водой и элюировали смесью спирта и фосфатного буфера (1:1) в течение 30 мин Оптическую плотность раствора определяли на спектрофотометре при длине волны 620 нм.

Определение скорости миграции эпидермальных клеток в рану Клетки А-431 вносили в чашки Петри в концентрации 150 тыс/мл (1,5 ш на чав1ку) в среде Игла с 10% ЭТС. Через 24 ч среду меняли на Игла бе: сыворотки и инкубировали в течение 72 ч. После этого пластмассовьи* шпателем удаляли часть клеточного монослоя в центре чашки. Ширин; получавшейся "раны" в среднем составляла 2,5 мм. Затем культуры дваждь промывали раствором Хэнкса и вносили свежую бессывороточную среду содержащую исследуемое вещество. Скорость миграции определяли, измеряз ширину раны с помощью окуляр-микрометра сразу же после нанесения раш и через 24, 48 и 72 ч.

Выделение коллагена из хвостов крыс

Коллаген 1 типа получали из сухожилий хвостов крыс. После ампутации хвосты погружали в 70% этанол на 1-2 ч. Затем отделяли сухожилия и помещали их в раствор уксусной кислоты 1:1000. Коллаген экстрагировали при перемешивании в течение 48 ч при 4° С, после чего раствор центрифугировали при 2500 об/мин в течение 2 ч при 4 °С.

Приготовление коллагенового геля

Стерильный 0,34М раствор №ОН соединяли с концентрированной (хЮ) питательной средой Игла или 199 в соотношении 1:2 и на каждые 100 мл смеси добавляли 100 мг глутамина и 9 мл 7,5% бикарбоната натрия. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена в уксусной кислоте в соотношении 1:4, после чего помещали на лед для предотвращения быстрой желатинизации. В некоторых экспериментах в гель вносили эмбриональные фибробласты человека в концентрации 100 тыс/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. МИГРАЦИЯ КОЛОНИЙ ПЕРВИЧНЫХ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ

1.1. Морфология колоний, характер миграции.

В процессе формирования многослойного эпидермального пласта в культуре из первичных ЭКЦ человека наблюдается стадия роста, на которой кератиноциты приобретают способность к активной миграции в составе многоклеточных колоний.

Прикрепившиеся ЭКЦ сначала образуют мелкие колонии, которые со временем увеличиваются в размерах, сливаются и образуют многослойный эпидермальный пласт. К 7-14 сут. культивирования образуются колонии, содержащие несколько тысяч клеток, которые приобретают характерную поляризованную форму и начинают активно мигрировать. Типичные колонии имеют выгнутый (ведущий) и вогнутый (ведомый) края. Средняя скорость миграции составляет 20 мкм/ч, однако, она может зна'гательно колебаться в зависимости от размера колоиии и условий культивирования. Направление движения колоний в одном культуральном флаконе может бьггь самым различным. За время менее б ч колонии могут изменить направление движения на 45

В культуре кератиноцитов проходят одновременно процессы пролиферации и дифференцировки. Поэтому мигрирующие колонии состоят из нескольких (от 3 до 7) слоев клеток, образовавшихся за счет вертикальной миграции

дифференцированных кератиноцитов. Наблюдаются также различия морфологии клеток разных частей колонии. Ведущий край колонии образов; мелкими плотно расположенными клетками, которые интенсив! окрашивались гематоксилином и эозином. Противоположный край колош состоит из крупных слабо окрашенных клеток, расположенных в один ело При увеличении размеров колонии до 3 мм и более ведомый край и цен" колоний приобретают разнородное строение: кластеры мелких плоп расположенных интенсивно окрашенных клеток чередуются с крупны* бледно окрашенными клетками. В это время миграция колоний замедляете колонии сливаются друг с другом, образуя сплошной эпидермалъный пласт.

1.2. Ультраструктура мигрирующих колоний кератиноцитов

Электронно-микроскопическое исследование мигрирующих колош покззало, что они представляют собой многослойные эпителиальна структуры, а составляющие их кератиноциты различаются по свое» тонкому строению и характеру межклеточных связей в зависимости I локализации в разных участках колоний.

Собственно краевая зона колонии представлена 1-2 слоями оче] крупных клеток, располагающихся перпендикулярно направлению мигращ колонии и окаймляющих эпителиальный пласт. На основан! ультраструктурных признаков эти клетки могут быть отнесены высокодифференцированным элементам с ярко выраженными признакам деградации. Эти клетки могли оказаться впереди колонии в результа дифференциации и, как следствие, перехода в супрабазальное положени Вероятно, они не участвуют в процессе миграции, а пассивно переносят! колонией. Сходные высокодифференцированные кератиноциты бьи обнаружены на краю раны (ОЛоппе Ы а1., 1981).

Однако большая часть клеток переднего края представлена мен дифференцированными кератиноцитами, удлиненной, реже округлой форм Они отделены друг от друга межклеточными пространствами значительно размера и формируют пласт, содержащий не более 3-4 слоев клетс Кератиноциты базального слоя контактируют с субстратом лиг незначительной частью своей поверхности. Прикрепившаяся к субстра клетка, как правило, образует очень длинный тонкий отросп (ламеллиподию), направленный в сторону движения колонии и короткий -противоположную. Основная часть этой клетки с ядром располагается : втором слое пласта, контактируя своей базальной поверхностью с таким : отростком следующей за ней клетки. В зоне контакта кератиноцитов субстратом полудесмосомы не обнаружены. Отсутствие полудесмос< наблюдается также во время миграции эпителия роговицы (К1юс1ас1ои51 е1 а

1968). Кроме ламеллиподий, кератиноциты образуют многочисленные короткие отростки, направленные в разные стороны, с помощью которых клетки контактируют друг с другом. Десмосомы немногочисленны. По тонкому строению клетки данного типа практически не отличаются от малодифференцированных эпидермоцитов, описанных в эпидермисе мыши (Fusenig, Worst, 1975 ). Они имеют большое ядро с крупными ядрышками. Гранулярный эндоплазматический ретикулум развит хорошо, в цитоплазме присутствуют многочисленные рибосомы, митохондрии, а также тонофиламенты, локализующиеся изолированно или собранные в пучки небольшого размера. В одном случае мы наблюдали расположение центросомы впереди ядра по направлению к ламсллиподии, что характерно для мигрирующих клеток (Kupfer et al., 1982). Встречаются делящиеся клетки.

Следует также отметить, что в данном случае описанные клетки являются базальными скорее по положению на субстрате, так как, все же, являются более дифференцированными по сравнению с истинно базальными клетками эпидермиса, расположенными в центре колонии. По структуре и функциональной активности эти клетки, вероятно, сопоставимы с суирабазальными клетками эпидермиса. Есть данные, что супрабазальные клетки, вероятно, могут принимать активное участие в процессе миграции (Zieske et. al., 1989).

В средней части колонии эпителиальный пласт состоит из 5-6 слоев клеток, располагающихся строго параллельно субстрату.

Слабодифференцированные базальные кератиноциты не образуют сплошного слоя, а собраны в группы из 5-7 клеток. Это крупные клетки удлиненной формы с многочисленными короткими отростками, которые на основании улътраструктурных признаков (крупное ядро с ядрышком, степень развития органелл, большое число тонких тонофиламентов) могут быть отнесены к малодифференцированным элементам. Все вышележащие слои представлены очень длинными и сильно уплощенными клетками. У таких кератиноцитов, как правило, отсутствуют ядра, органеллы деградированы, в цитоплазме много собранных в крупные пучки тонофибрилл . В этой зоне пласта базальные кератиноциты контактируют друг с другом с помощью отростков, а с вышележащими клетками - немногочисленными десмосомами. В супрабазальных слоях десмосомы являются основной формой контакта. Их количество увеличивается при переходе клеток в вышележащие слои. В отдельных участках колонии базальный и вышележащие слои разделены значительным межклеточным пространством. Наличие значительных межклеточных промежутков и небольшое число специализированных контактов в базальном слое может быть показателем повышенной подвижности клеток, составляющих колонию (Tursken et al., 1991), и

способствовать миграции за пределы колонии отдельных клеток (Dover, Potten, 1988).

Сходное строение имеет и концевая часть колонии, однако здесь пласт содержит не более двух слоев клеток. При этом оба этих слоя чаще всего состоят из сильно уплощенных клеток, с признаками деградации.

Проведенный ультраструктурный анализ позволяет заключить, что миграция колоний кератиноцитов человека обеспечивается формированием ламеллиподий у большого числа клеток ведущего края колонии, что является морфологическим проявлением процесса миграции. В то же самое время между соседними клетками сохраняются контакты, обеспечивающие движение пласта как единого целого.

1.3. Изучение связи процессов миграции и пролиферации в колониях ЭКЦ J.3.I. Характер миграции колоний п условиях подавления клеточной пролиферации

Мы изучили характер миграции колоний после ингибирования в них клеточной пролиферации. Для этого мы блокировали пролиферацию с помощью митомицина С, путем добавления в питательную среду избытка холодного тимидина и инкубированием ЭКЦ в среде без Ca +2 и сыворотки.

Митомицин С вызывает образование поперечных сшивок в молекуле ДНК, что приводит к прекращению пролиферации клеток (Long et al., 1984). После обработки митомицином С скорость движения колоний снижалась, и через 24 ч движение полностью прекращалось. Поляризованные колонии при этом становились округлыми. Это подтверждается уменьшением экстензии при морфометрическом анализе (рис.1).

Добавление тимидина приводило к замедлению движения колоний к концу вторых суток, а на третьи сутки движение прекращалось и колонии приобретали округлую форму. Снятие тимидинового блока способствовалс возобновлению движения, при этом направление движения часто отличалоы от первоначального.

Смена питательной среды со стандартным содержанеим Ca +2 на среду бе: Са+2 и сыворотки приводила к остановке миграции колоний, разъединении кератиноцитов и потере колониями поляризации в течение суток.

Полученные результаты указывают на связь между пролиферацие! клеток и миграцией колоний. Мы предположили, что направленност] движения колоний может быть обусловлена неравномерностьн распределения делящихся клеток. Для выяснения характера пролиферацш составляющих колонии клеток было проведено радиоавтотрафическо' исследование распределения пролифирирующих клеток в мигрирующи: колониях ЭКЦ.

и

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 О

□ контроль И после обработки митомищшом С

□ под коллагеновым гелем

Рис.1. Морфометрические параметры колоний ЭКЦ. Элонгация выражает степень вытянутости колоний и равняется нулю у радиально симметричных фигур. Дисперсия выражает степень изрезанности контура и равняется нулю у любого эллипса. Экстензия - сумма дисперсии и элонгации. Экстензия возрастает с увеличением степени поляризованности колоний.

1.3.2 Распределение пролиферирующих клеток на тотальных гистологических препаратах колоний ЭКЩ

Мы исследовали характер распределения клеток, включивших меченый тимидин, на тотальных гистологических препаратах колоний ЭКЦ. Для этого подсчитывал» индекс меченых клеток в различных частях колонии: на ведущем крае (первые 5 рядов клеток), в центре колонии, в концевом отделе колонии.

Было исследованы 22 мигрирущие колонии, выращенные в присутствии фидерных клеток, и 10 колоний - без фидерных клеток. В присутствии фидерных клеток индекс меченых клеток составлял в среднем 30,4% на ведущем крае и 31,3% - на ведомом. Для колоний, растущих без фидерных клеток, эти величины составляли соответственно 21,0 и 23,7%.

Таким образом, анализ распределения меченых кератиноцитов не выявил статистически значимых различий между ведущим и ведомым краями колоний. Следует отметить, что анализ автографов был затруднен в связи с

экстензии

дисперсия

элонгация

дифференциацией кератиноцитов и включением клетками метки сразу i нескольких слота колонии.

1.3.3. Изучение распределения меченых клеток на полутонких срезах колоний ЭКЦ

Поскольку мигрирующие колонии многослойны, и различные сло1 образованы клетками различной стадии дифференцировки, представлялс интерес изучение распределения меченых клеток не только в различны: частях колоний, но и но слоям. Для этого было проведенс авторадиографическое исследование полутонких срезов небольши: мигрирующих колоний с выраженной поляризацией.

Анализ радиоавтографов показал, что все меченые клетки бьш расположены в ведущем крас колоний, причем эти клетки имел! ламеллиподии. Меченые клетки учитывались в 7 первых рядах клето] ведущего края. В разных колониях метку содержали от 7 до 17 % клеток . В т> же время в ведомом крае меченые клетки не были обнаружены. Эт] результаты показывают, что синтез ДНК отмечается в той части колоши кератиноцитов, где клетки проявляют признаки миграции.

Отличие этих результатов от данных исследования тотальных лрепарато колоний ЭКЦ, вероятно, можно объяснить тем, что на тотальных препарата были изучены достаточно крупные колонии, у которых в ведомом крае такж встречались участки пролиферирующих клеток. По нашим аблюдениям пр увеличении размеров колонии теряют выраженную поляризацию и высоку] подвижность. Поэтому в достаточно больших колониях уже може изменяться распределение ДНК-синтезирующих клеток.

1.4. Изучение характера миграции колоний ЭКЦ под коллагеновым гелем

Моделирование процесса регенерации и миграции эпидермиса в культу] возможно при использовании трехмерного коллагенового геля. Так как условиях in vivo миграция эпидермиса часто проходит под слоем омертвевпи клеток и межклеточного матрикса, представляло интерес изучить характ( миграции эпидермальных кератиноцитов под коллагеновым гелем. Для это! мы покрывали активно движущиеся колонии с хорошо выражение поляризацией слоем геля и инкубировали их в течение 3-5 сут. Зате культуры были зафиксированы, и проведен морфометрический анагп параметров колоний, исследована морфология.

По данным морфометрнческого анализа колонии ЭКЦ под гелем теряй выраженную поляризацию, становились более округлыми и характеризовали меньшей экстензией по сравнению с контрольными культурами (рис.

Это указывает на замедление движения колоний ЭКЦ под гелем единым кластером. Можно предположить, что верхние слои

высокодифференцированных кератиноцитов вследствии адгезии к гелю вызывают остановку колонии, поскольку связаны с остальными клетками с помощью десмосом.

В то же время краевые клетки колонии начинают образовывать многочисленные клеточные "языки", некоторые клетки выползают из колонии, формируя широкие ламеллиподии. Практически все клетки на краю колонии имеют шиповатые выросты. Таким образом, подвижность отдельных клеток под гелем сохраняется.

2. МИГРАЦИЯ КОЛОНИЙ КЛЕТОК ЭПИДЕРМОИДНОЙ КАРЦИНОМЫ А-431.

В качестве модельной системы для изучения закономерностей миграции эпидермалышх клеток в культуре мы использовали линию клеток эпидермоидной карциномы человека А-431. В отличие от первичных ЭКЦ, клетки А-431 не проявляют признаков морфологической дифференцировки и не образуют многослойных эпидермалъных пластов, состоящих из клеток различной пролиферативной активности. При достаточно редком посеве удается получить отдельные колонии этих клеток, которые приобретают определенную ориентацию на плоскости культурального флакона и начинают мигрировать.

2.1. Формирование колоний

На второй день после посева прикрепившиеся клетки А-431 начинали активно пролиферировать, образуя кластеры из 2-5 клеток. Через 7-8 сут. колонии насчитывали от нескольких десятков до нескольких сотен клеток и были поляризованы . Митотический индекс в колониях составлял в среднем 3.0%. Клетки, находящиеся в митозе, располагались равномерно по всей площади поляризованных колоний.

2.2. Связь пролиферации и миграции

2.2.1. Ингибирование пролиферации и миграции колоний А-431

Мы предположили, что выбор колонией направления движения может быть обусловлен различной пролиферативной активностью клеток в разных частях этой колонии.

Для того, чтобы выяснить, существует ли некоторая закономерность в распределении пролиферирующих клеток при инициации миграции и

определяет ли это направление движения колонии, необходимо было сначала полностью подавить пролиферацию и миграцию колоний А-431. С этой целью колонии А-431 инкубировали в среде без сыворотки, а также при комнатной температуре.

После инкубации в бессывороточной среде в течение 4 сут. пролиферация клеток подавлялась не полностью, митотический индекс составил в среднем 1.2%. Среди клеток, расположенных по краю колонии, не было, за исключением единичных случаев, клеток с ламеллиподиями. Таким образом, в среде без сыворотки подавляется активная миграция колоний, но пролиферация клеток сохраняется. Это, очевидно можно объяснить наличием аутокринной регуляции пролиферации клеток эпидермоидпой карциномы.

Добиться практически полного подавления пролиферации и миграции удалось только лишь после инкубации культур при комнатной температуре (20°С) в течение 2 сут.

2.2.2. Характер распределения меченых клеток в колониях А-431 после инициации пролиферации и миграции

После инкубации колоний при комнатной температуре в течение 48 ч. пролиферацию и миграцию инициировали перенесением культур I нормальные условия (37°С) на 30, 60 и 120 мин. Характер пролиферативно! активности клеток оценивали по включению меченого тимидина в эти сроки.

Во все сроки наблюдения какой-либо значительной неравномерности ] распределении меченых клеток в колониях обнаружено не было Одновременно с этим краевые клетки в колониях формировал! ламеллиподии по всему периметру. Выбор направления миграции колонне! в дальнейшем проходил на фоне высокой (95%) пролиферативно! активности клеток во всех частях кластера. Таким образом, получении результаты не позволяют связать выбор колонией направления миграции разной иролиферативной активностью клеток в этой колонии.

2.2.3. Влияние пролиферативного статуса клетки на ее положение мигрирующей колонии

Поскольку подавление пролиферации приводило к полному прекращени] движения колоний кератиноцитов, мы предположили, что интенсивн пролиферирующие клетки мигрируют активнее и в процессе движет1 колонии происходит их распределение в соответствии с пролиферативне активностью.

Мы изучили местоположение в мигрирующей колонии клеток, нмеювд разную способность к пролиферации. Для этого выращивались колони

юдержащие два типа клеток А-431: нормально пролиферирующие и потерявшие способность к пролиферации в результате обработки митомицином С. Последние были предварительно помечены радиоактивной меткой. Анализ распределения метки показал, что в 32% колоний меченые клетки располагались в концевой части, а в 68% колоний - в центре. Ведущий край колонии никогда не содержал меченых клеток. Полученные результаты показывают, что пролифератипный статус клетки влияет на ее подвижность. Для интенсивной миграции, вероятно, необходима активация клетки, которая невозможна без пролиферации.

3. ВЛИЯНИЕ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ НА МИГРАЦИЮ И ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭПИДЕРМОЦИТОВ IN VITRO

3.1. Миграция клеток эпидермоидной карциномы человека А-431 в рану

Для оценки действия различных агентов на миграцию эпидермоцитов использовали модельную систему "раны" in vitro.

Анализ миграции клеток А-431 в рану показал, что при выращивании культур в среде с 10% ЭТС максимальная скорость миграции наблюдается в первые 24 ч после нанесения раны, а через 72 ч рана первоначальной ширины 2,5 мм полностью закрывается.

Поскольку эмбриональная телячья сыворотка содержит большое количество митогенов, гормонов и компонентов внеклеточного матрикса, в большинстве случаев клетки инкубировали в среде без ЭТС.

Как упоминалось выше, пролиферация клеток А-431 в бессывороточной среде продолжается, а миграция колоний практически отсутствует. Предполагалось, что после нанесения раны миграция в контрольных культурах не будет выражена. Однако как видно на рис.2, в бессывороточной среде происходит сокращение раны. Различное поведение клеток А-431 в составе отдельных колоний и пласта в бессывороточной среде может объясняться наличием аутокринной стимуляции миграции. Известно, что многие опухолевые линии выделяют факторы, аутокринно стимулирующие пролиферацию и миграцию клеток (Todaro et al., 1980; Liotta ct al., 1986; Fibbi et al., 1990; Anzano et al., 1983). В плотной культуре факторы, выделяемые клетками, могут содержаться в более высокой концентрации, обеспечивая миграцию в среде без сыворотки и митогенов. Такую миграцию мы назвали базальной. Следует отметить, что через 72 ч после нанесения раны в бессывороточной среде остается незакрытой более половины ширины раны.

3.2. Действие эпидермального фактора роста (ЕОБ) и инсулина на миграции клеток А-431 в рану

ЕОР значительно стимулировал миграцию клеток А-431. В ирисутствш ЭТС стимулирующий эффект был заметен б основном в первые 24 ч и бы, слабо выражен. Следует отметить, что в данных экспериментах ЕСБ и оказывал существенного влияния на включение меченого тимидина в клетю А-431 в течение всего времени эксперимента. Эти данные позволяют говорит о частичной диссоциации процессов миграции и пролиферации в этих клетка) При добавлении Ев Я в отсутствие сыворотки стимулирующий эффект бы значительно сильнее и проявлялся в более поздние сроки (рис.2). Как следуе из таблицы 1, максимальная скорость миграции наблюдалась между 1 и 2 су после нанесения раны. Спустя 72 ч произошло полное закрытие раны, то время как в контрольных культурах рана закрылась менее, чем на 50%.

мм

-коигроль

-иск

часы

Рис.2. Влияние ЕОР на миграцию клеток А-431 в рану в бесывороточн среде.

Таблица 1

Средняя скорость миграции пласта за каждые сутки инкубации в бессывороточной среде (мкм/ч)

1 сутки 2 сутки 3 сутки

контроль 5,3 ± 1,3 8,6 ± 0,6 5,3 ± 0,6

EGF 8,1 ± 3,9 28,5 ± 0,8 13,3 ± 1,2

Совместное использование EGF и инсулина адаптивно стимулировало миграцию клеток А-431.

3.3. Миграция клеток А-431в рану после подавления пролиферации

Действие EGF на клетку осуществляется путем взаимодействия с рецептором к EGF, которое запускает каскад последовательных внутриклеточных реакций (Chen et al., 1994). EGF не только стимулирует пролиферацию эпидермальных клеток, но и вызывает ряд других эффектов, в том числе стимулирует миграцию. Для разделения этих двух процессов, инициируемых одним и тем же фактором, представлялось интересным изучить действие EGF на миграцию клеток, в которых подавлена пролиферация.

Для подавления пролиферации клетки обрабатывали митомищпюм С. Через 72 ч включение меченого тимидина в таких культурах падало до 3,5% от контроля. В это время на монослой наносили рану и изучали действие EGF на миграцию. Как показано на рис.3, после обработки митомицином С клетки А-431 сохраняют контрольный уровень миграции, но теряют способность отвечать на добавление EGF. Таким образом, ингибирование пролиферации делает невозможным прохождение мотогенного сигнала EGF.

3.4. Влияние фактора роста кератиноцитов (KGF) на пролиферацию и миграцию клеток А-431

Фактор роста кератиноцитов значительно стимулирует пролиферацию первичных эпидермальных кератиноцитов и повышает их подвижность (Tsuboi et al., 1993). Было исследовано действие KGF на миграцию клеток А-431 в рану.. В концентрации 25 нг/мл скорость миграции повышалась в 1,8 раза. При использовании более высоких концентраций KGF стимулирующий эффект был выражен слабее. Добавление в культуры клеток А-431 KGF в

различных концентрациях не влияло на рост клеток. В данном случа наблюдается разделение процессов миграции и пролиферации.

мм

контроль —и— митомнции С —*-EGF + мнтомнцнп С

часы

Рис.3. Динамика миграции клеток А-431 в рану после обработк митомицином С.

3.5. Изучение действия сурамина на KGF-стимулированную миграцию клето А-431

Сурамин ингибирует связывание KGF с рецептором и удаляет у; связавшийся с рецептором фактор роста (Fleming et al., 1989). Мы изучги влияние обработки сурамином на характер миграции опидермальных клето Для этого за 4 ч до нанесения раны в среду вносили сурамин (0,4 мМ) оставляли его на все время проведения эксперимента. Раны наносили к обычно и в часть культур добавляли KGF. Результаты, представленные : рис.4, позволяют заключить, что сурамин практически полностью подавля базальный уровень миграции клеток А-431. Он также снимает стимулирующ] эффект KGF на миграцию. Добавление KGF в культуры, обработанн] сурамином, приводило лишь к очень незначительному повышен! подвижности клеток через 48 ч после нанесения раны. Однако общ расстояние, пройденное клетками за время эксперимента, в этом слу; оставалось в 3 раза меньше, чем в контрольных культурах. Блокирован рецепторов сурамином приводит к значительному ингибированию миграц клеток А-431, в то время как клетки сохраняют пролиферативную активносп

ММ

О 24 48 72

—♦—контроль —в— КСР —К(Л" +сурамии —х—сурамин

часы

эис.4. Мшрапия клеток А-431 после обработки сурамином

}. ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА НА МИГРАЦИЮ ЭПИДЕРМОЦИТОВ

компоненты ннеклеточного матрикса являются существенными регуляторами лиграцин клеток. Контакт клеток с матриксом обеспечивает их движение. С (ругой стороны, прочный контакт клетки с подложкой препятствует ее Зыстрому продвижению вперед. Установление оптимального равновесия лежду процессами адгезии и открепления способствует максимальной жорости миграции. С целью выяснения роли различных матриксных белков ! процессе клеточной миграции мы исследовали влияние отдельных сомпонентов матрикса.

1.1. Влияние коллагена 1 типа и фибронектина на миграцию клеток А-431 в )ану

Предварительное сорбирование культуральных чашек коллагеном 1 типа триводило к усилению миграции клеток А-431 на 60% в первые сутки и на ¡9% во вторые сутки. Фибронектин в использованной концентрации (20 жг/мл) незначительно изменял скорость миграции.

1.2. Миграция клеток А-431 под трехмерным коллагеновым гелем. Влияние на миграцию эмбриональных фибробластов человека, заключенных в гель

Мы изучили динамику миграции клеток А-431 в рану под трехмерны* коллагеновым гелем. Сразу же после нанесения раны культуры покрывши гелем. В части чашек в коллагеновый гель вносили эмбриональны фибробласты человека. Первая серия экспериментов проводилась в среде бе сыворотки. В этих условиях динамика миграции клеток А-431 по, коллагеновым гелем без фибробластов практически не изменялась in сравнению с контролем (табл. 2). Однако в том случае, когда в гель бьии включены фибробласты, через 24 ч клетки А-431 начали откреплятьс: сплошным пластом, образуя впоследствии крупные сфероиды. Еще через 24 1 было обнаружено, что большинство этих сфероидов прикрепилось i флотирующему коллагеновому гелю. На поперечных гистологических среза геля было видно, что клетки А-431 в составе сфероидов прикрепились к гель и практически полностью в него погрузились. Однако, остается неясным могут ли они сохранять жизнеспособность в этой системе и мигрироват ("инвазировать") внутрь коллагенового геля. Следует подчеркнуть, чт подобный эффект наблюдался только в том случае, когда в гель был включены эмбриональные фибробласты. Можно предположить, чт продуцируемые фибробластами факторы обусловливают подобное поведени эпидермальных клеток в отсутствие сыворотки. Известно, например, чт фибробласты выделяют рассеивающий фактор, значительно повышающи подвижность эпителиальных клеток (Stoker et al., 1987). Кроме этого, иокрыти монослоя эпителиальных клеток коллагеновым гелем часто вызывае изменение поляризации эпителия и формирование сферических струкгу (Chambard et al., 1981; Hall et al., 1982).

В том случае, когда в среде содержалось 10% ЭТС, коллагеновый гел: нанесенный на рану стимулировал миграцию в 2 раза в первые 24 ч (табл.2), результате через 48 ч все раны под коллагеновым гелем полность: закрылись, в то время как в контрольных культурах восстановлен! целостности пласта произошло, как обычно, через 72 ч. Надо отметить, чз в этом эксперименте присутствие в коллагеновом геле фибробластов не влия/ на поведение клеток А-431.

Таким образом, стимулирующий эффект коллагенового геля i миграцию эпидермальных клеток проявляется только в среде с сыворотко Присутствующие в сыворотке факторы роста и другие физиологичен активные вещества обеспечивают стимуляцию миграции клеток коллагеновы гелем. В литературе имеются указания на то, что факторы роста мог модулировать реакцию клеток на компоненты межклеточного матрию (Solic N. & Davies, 1997). В то же время, действие факторов, выделяемь фибробластами, нивелируется и в этом случае эмбриональные фибробласг человека, заключенные в гель, не влияют на динамику миграции.

Таблица 2.

Миграция клеток А--431 в рану под коллагеновым гелем

1 сут 2 суг 3 сут Итого Примечание

Среда с ЭТС- контроль 0.32 * 0.13 0.09 0.54

гслъ 0.34 0.17 0.17 0.68

гель с фиб-робласта-ми Через 24 ч открепились, а еще через 24 ч конглом< раты клеток были обнаружены прикрепившимися к флотирующему гелю

Среда без ЭТС контроль 0.44 0.26 0.38 1.08 рана закрылась через 72 ч

гель 0.9 0.2 рана закрылась через 48 ч

гель с фиб-робластами 0.86 0.23 рана закрылась через 48 ч

-расстояние, пройденное клетками с обеих сторон раны, мм; приведены олько средние значения

!ЫВОДЫ

. Эпидермальные клетки человека в культуре способны формировать шогоклеточные кластеры, мигрирующие по поверхности культурального осуда как единое целое. Изменение направления движения происходит в езультате согласованного поведения клеток, составляющих кластер. Угносительное расположение клеток в колонии практически не изменяется.

. Морфологическим проявлением миграции можно считать образование амеллиподий на ведущем крае колонии и поляризацию кластера, которую озможно оценивать путем определения его дисперсии и элонгации.

3. Анализ ультраструктуры колоний первичных кератинодитов показал, что наименее дифференцированные клетки располагаются в центре колонии и не формируют ламеллиподий. Ведущий край состоит из более дифференцированных клеток, активно формирующих ламеллиподии. Сильно дифференцированные и деградирующие кератиноциты могут пассивно переноситься колонией.

4. Направление движения эпидермальных колоний не определяется неравномерностью пролиферации клеток в разных частях колонии. Однако л целом, подвижность клеточного кластера зависит от пролиферативной активности всех клеток колонии. Пролиферативный потенциал клетки влияем на ее способность к миграции в составе многоклеточного кластера.

5. Обнаружена возможность диссоциации процессов пролиферации 1 миграции в эпидермальных клетках. Миграция клеток А-431 стимулируется внесением эпидермального фактора роста, фактора роста кератиноцитов 1 инсулина. В то же время, эти факторы роста не влияют на синтез ДНК.

6. Клетки эпидермоидной карциномы А-431 обладают базальным уровне» миграции в среде без сыворотки и митогенов. Способность к мигращп сохраняется в клетках А-431 после подавления пролиферации пуга обработки их митомицииом С, однако ЕОР-стимулированная миграция пр] этом полностью подавляется. Сурам ин полностью подавляет миграцию клетках А-431.

7. Культивирование колоний первичных кератиноцитов под коллагеновы: гелем приводит к значительному замедлению их миграции, чт подтверждается морфометрическим анализом. При этом краевые клетк колонии проявляют высокую подвижность и могут выходить из состаЕ колонии.

8. Культивирование клеток А-431 в бессывороточной среде под коллагеновы гелем с включенными в него эмбриональными фибробластами приводит изменению поляризации клеток А-431 и прикреплению их к гелю.

Зписок статей, опубликованных по теме диссертации.

1. Воротеляк Е.А., Волошин А.В., Васильев А.В., Терских В.В. Миграция и тролиферация колоний эпидермальных кератиноцитов.// Цитология, 1992, т. И, с. 582. Васильев А.В., Волошин А.В., Воротеляк Е.А., Терских В.В. Миграция солоний эпидермальных кератиноцитов человека в культуре. // Докл. Акад. 1аук, 1993, т. 329, N. 2, с. 232-235.

3. Terskikh V.V., Vasiliev A.V., Vorotelyak Е.А., Volosliin A.V. Migration of ceratinocyte colonies in vitro. // Cell proliferation, 1993, V. 26, 5, p. 496.

4. Vorotelyak E.A., Satdykova G.P., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Migration of mman keratinocyte colonies. // Wound repair and regeneration, 1995, V. 3(1), j. 114.

5. Воротеляк E.A., Сатдыкова E.A., Васильев A.B., Терских В.В. Электронно-микроскопическое исследование мигрирующих колоний <ератинодитов. // Известия РАН, 1996, N. 4, с. 485-489.

6. Самарова А.В., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Пролиферация слеток в мигрирующих колониях клеток эпидермоидной карциномы А-431 з культуре. // Онтогенез, 1997, т. 28, N. 4, с. 288-292.

7. Воротеляк Е.А., Сатдыкова Г.П., Самарова А.В., Васильев А.В., Данилова Г.И., Терских В.В. Распределение ДНК-синтезирующих клеток в мигрирующие колониях эпидермальных кератиноцитов человека. // Докл. Акад. наук, 1997, т. 354, N. 6, с. 829-831.

8. Воротеляк Е.А., Самарова А. В., Васильев А.В., Терских В.В. Действие шидермального фактора роста на миграцию клеток А-431. // Известия РАН, L997, N. 6, с. 734-740.

9. Vorotelyak Е.А, Samarova A.V., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Migration

)f human epidermoid carcinoma cells A-431 in vitro. [| International European U.I.R. Conference at Cologne, Germany, 29 Sep.-3 Oct. 1997, Abstracts, p. 45.

10. Птицын JT.P., Альтман И.Б., Гуров M.B., Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Герских В.В. Продукция рекомбинангаого фактора роста кератиноцитов

человека (hKGF) в клетках Escherichia coli. // Биоорганическая химия (в печати).

11. Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Терских В.В., Локализация непролиферирующих клеток в мигрирующих колониях кератиноцитов.// Докл. Акад. Наук (в печати).

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воротеляк, Екатерина Андреевна, Москва



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им.Н.К.Кольцова

на правах рукописи УДК 576,5

Воротеляк Екатерина Андреевна

МИГРАЦИЯ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В

КУЛЬТУРЕ

03.00.11. эмбриология, гистология и цитология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. В.В.Терских

Москва, 1998

(и^у 'О Л.. ч/

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭКЦ - эпидермальные кератиноциты ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка EGF - эпидермальный фактор роста FGF - фактор роста фибробластов HGF - фактор роста фибробластов IGF - инсулиноподобный фактор роста KGF - фактор роста кератиноцитов PDGF - фактор роста из тромбоцитов SP - субстанция Р

TGFot - трансформирующий фактор роста ос TGFß - трансформирующий фактор роста ß TNF - фактор некроза опухолей

СОДЕРЖАНИЕ

стр

Введение..............................................................................................................5

1 .Обзор литературы..........................................................................................7

1.1. Морфологические аспекты миграции......................................................7

1.2. Скорость движения....................................................................................11

1.3. Роль элементов цитоскелета в клеточной миграции............................11

1.4. Влияние межклеточного матрикса на миграцию эпителиальных клеток...................................................................................................14

1.5. Регуляция пролиферации элидермальных клеток в культуре.............19

1.6. Соотношение процессов пролиферации и миграции в эпителиальных клетках..................................................................................................23

1.7. Действие факторов роста на миграцию эпителиальных клеток..........25

1.8. Синтез макромолекул и миграция клеток...............................................29

1.9. Межклеточные взаимодействия в регуляции миграции.......................29

1.10. Комплексные взаимодействия в регуляции миграции эпителиальных клеток..................................................................................................31

1.11. Характеристика линии эпидермоидной карциномы человека

А-431...........................................................................................................34

.....л

2. Материалы и методы.....................................................................................39

3. Результаты и обсуждение..............................................................................46

3.1. Миграция колоний первичных ЭКЦ человека в культуре...................46

3.1.1. Морфология колоний и характер миграции........................................46

3.1.2. Ультраструктура мигрирующих колоний кератиноцитов................50

3.1.3. Изучение связи процессов миграции и пролиферации в колониях ЭКЦ............................................................................................................58

3.1.3.1. Характер миграции колоий в условиях подавления клеточной пролиферации.....................................................................................................58

3.1.3.2. Распределение пролиферирующих клеток на тотальных гистоло-

гичеких препаратах...............................................................................59

3.1.3.3. Изучение распределения меченых клеток на полутонких срезах

колоний ЭКЦ.........................................................................................60

3.1.4. Изучение характера миграции колоний ЭКЦ под коллагеновым гелем...........................................................................................................62

3.1.5. Морфометрические характеристики колоний ЭКЦ (компьютерный анализ).......................................................................................................65

3.2. Миграция колоний клеток эпидермоидной карциномы А-431............65

3.2.1. Формирование колоний..........................................................................66

3.2.2. Связь пролиферации и миграции..........................................................68

3.2.2.1. Ингибирование пролиферации и миграции колоний А-431..........68

3.2.2.2. Характер распределения меченых клеток в колониях А-431 после инициации пролиферации и миграции..............................................69

3.2.2.3. Влияние пролиферативного статуса клетки на ее положение в мигрирующей колонии.........................................................................71

3.3. Влияние факторов роста на миграцию и пролиферацию эпидермо-цитов in vitra...............................................................................................74

3.3.1. Миграция клеток эпидермоидной карциномы человека А-431 в

рану...........................................................................................................74

3.3.2. Действие EGF и инсулина на миграцию клеток А-431 в рану..........77

3.3.3. Базальный уровень миграции клеток А-431........................................81

3.3.4. Влияние KG F на миграцию клеток А-431 в рану...............................83

3.3.5. Изучение дейтвия сурамина на KGF-стимулированную миграцию клеток А-431.............................................................................................84

3.3.6. Действие KG F на пролиферацию клеток А-431..................................85

3.4. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на миграцию эпидермоцитов.............................................................................................87

3.4.1. Влияние коллагена I типа и фибронектина на миграцию клеток

А-431 в рану..............................................................................................87

3.4.2. Миграция клеток А-431 под трехмерным коллагеновым гелем. Влияние на миграцию эмбриональных фибробластов человека, заключенных в гель 88

4. Заключение......................................................................................................92

5. Выводы............................................................................................................94

6. Список литературы........................................................................................96

ВВЕДЕНИЕ

Интактный эпителий необходим для выживания любого многоклеточного организма. Эпителий - это самый первый барьер, защищающий организм от воздействий внешней среды и поддерживающий внутренний гомеостаз. Постоянное обновление путем активной регенерации - один из основных механизмов поддержания целостности эпителия. Клеточная адгезия, миграция и пролиферация -важнейшие составляющие этого процесса.

Направленная миграция эпителиальных клеток чрезвычайно важна в таких событиях как эмбриональное развитие, заживление ран, метастазирование опухолей. Большую группу морфогенетических процессов в эмбриогенезе представляют перемещения эпителиальных слоев, например, при гаструляции амфибий и в эмбриогенезе рыб (1). Направленная миграция отдельных клеток и клеточных пластов необходима для нормального развития (2,3).

В эпителиальных тканях взрослых организмов также отмечаются постоянные перемещения клеток, в частности происходит постоянная миграция эпидермальных кератиноцитов из базального слоя, где происходит размножение клеток, в супрабазальные слои (4). Наиболее типичным примером миграции эпителиальных клеток у эмбрионов и взрослых организмов является заживление ран (5).

Несмотря на большое число исследований миграции, феномен направленного клеточного движения далек от понимания. Явление клеточной миграции включает в себя самые различные аспекты жизнедеятельности клетки: специфическое поведение цитоскелета, возникновение внутриклеточных сил натяжения и ретракции мембраны, циклический ток плазматической мембраны от ведущего края клетки и

встраивание новых фрагментов в передний край, адгезия к субстрату и многое другое (6).

Миграция - это очень сложный прцесс, включающий временное и пространственное взаимодействие различных факторов: сигнальные молекулы (факторы роста, цитокины и компоненты матрикса), внутриклеточные мессенджеры (протеин киназы, фосфолипазы, низкомолекулярные вТРазы), факторы, регулирующие адгезию к другим клеткам (например. Е-кадхерин) и к внеклеточному матриску (интегрины, рецепторы к гиалуроновой кислоте), факторы, определяющие открепление клеток от субстрата (активатор плазминогена урокиназного типа, металлопротеиназы) и молекулы, регулирующие функции цитоскелета (например, Rae) и образование специальных клеточных структур миграции, называемых ламеллиподиями (7).

Миграция эпидермальных клеток может происходить в составе многоклеточных кластеров (групп), эпидермальных пластов или на уровне отдельной клетки. Однако многие характеристики процесса миграции являются общими для всех указанных видов движения.

Регенерация поврежденного эпителия происходит не только за счет миграции эпителиальных клеток, но и их интенсивной пролиферации. Ранение является сигналом и для пролиферации и для миграции клеток. Миграцию можно рассматривать как более быструю реакцию на повреждение. В том случае, когда она оказывается недостаточной, наступает пролиферативный ответ. Однако очень часто, например в ответ на действие факторов роста, происходит одновременное инициирование миграции и усиление пролиферативной активности клеток (8.9. 10).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфологические аспекты миграции

Миграция практически всегда связана с изменением формы клеток и образованием специальных структур: ламеллиподий, раффлов, цитоплазматических выростов различной формы.

Ламеллиподии имеют форму плоских отростков, обычно полукруглой формы, направленных в сторону движения клеток. Они могут ундулировать, но сохраняют свою форму в процессе движения клеток. Ламеллиподии представляют собой морфологическое выражение процесса миграции. В некоторых случаях наблюдается формирование цитоплазматических выростов разных типов: плоских полукруглых и тонких со звездчатым образованием на конце (11).

Образование ламеллиподий и миграция происходит в ответ на появление свободного края. Свободный край образуется при нанесении на эпидермис раны или при эксплантации эпителиальных кеток на субстрат in vitra Образование ламеллиподий отмечено при регенерации эпидермиса у человека (12), культивировании эпителиальных клеток кожи и амниона куриного эмбриона (13). при заживлении эпителиальной раны у новорожденных мышей (14). у мигрирующих клеток эпидермиса, роговицы и пищевода куриных эмбрионов (15). при закрытии ран в эпидермисе головастиков Xenopus (16), в кластерах эпителиоидных опухолевых клеток рыб (17). в процессе эпиболии эпидермиса зеленой лягушки вокруг вырезанного кусочка кожи (18), в эпидермальных клетках кожи тритона (11).

Образование ламеллиподий связано с возникновением натяжения плазматической мембраны клетки. Формирование прочных связей между плазматической мембраной и цитоскелетом клетки приводит к однонаправленному току материала мембраны в направлении миграции и

может регулировать образование и ретракцию ламеллиподий и филлсподий (19). В то же время, возникновение избыточного механического натяжения само по себе может запускать внутриклеточные реакции. Так, например, механическое растяжение эпителиального пласта вызывает повышение включения меченого тимидина почти в два раза (20). В таких клетках обнаруживается большое количество филаментов и десмосом. Натяжение мигрирующего эпидермального пласта приводит к перераспределению микрофиламентов (21). Таким образом, регуляция клеточной подвижности, пролиферации и других внутриклеточных событий находится в тесной взаимосвязи и запуск одних и тех же регуляторных каскадов приводит к различным последствиям.

Ламеллиподии создают движущую силу, обеспечивающую миграцию клеток или клеточных кластеров. Чем больше длина ламеллиподий (то есть площадь их контакта с субстратом), тем больше скорость перемещения клеточных кластеров по субстрату (17). При этом направление движения кластера совпадает с направлением вектора, который выражает усредненное направление ламеллиподий (17). В клетках головастика Xenopus скорость движения пласта in s/й/значительно больше, чем in vitro (16). При этом ламеллиподии клеток, мигрирующих in vitro сильнее распластаны и, по-видимому, находятся в состоянии большего натяжения. С другой стороны ламеллиподии субмаргинальных клеток ориентированы достаточно хаотично, в отличие от субмаргинальных клеток in situ что также может влиять на скорость миграции пласта как целого.

Несмотря на большое количество данных, касающихся морфологии миграции, механика этого процесса остается неясной. Большинство наблюдений касается, скорее, феноменологии процесса. Обобщенное же представление о том, как присходит перемещение клеток по субстрату с учетом динамики всех клеточных компонентов с трудом поддается описанию. Были сделаны попытки компьютерного моделирования

процесса клеточного перемещения (22). Серия работ посвящена также изучению механическим аспектам миграции подвижных кератоцитов рыб. Тянущие силы, возникающие при перемещении этих клеток направлены перпендикулярно боковым сторонам клетки, что было определено по перемещению частиц, заключенных в субстрат (23). Этими же авторами было высказано предположение, что продвижение переднего края и ретракция противоположного у этих клеток происходит перпендикулярно ведущему клеточному краю (24). При этом баланс степени растяжения и ретракции по периметру клетки способствует поддержанию ее формы во время миграции. В другой работе (25) было показано, что во время движения кератоцита происходит "перекатывание" клеточного тела.

Движение группы клеток обусловлено не только подвижностью отдельных клеток, но и взаимодействием их между собой в процессе миграции. Изучение механизмов движения клеточных пластов связано с необходимостью выяснения этого взаимодействия.

Существуют две точки зрения на характер миграции пластов эпидермальных кератиноцитов и других эпителиальных клеток. Согласно одной точке зрения эпителиальный пласт движется как единое целое (26; 11). Другая точка зрения заключается в том, что кератиноциты перемещаются как отдельные клетки, переползая друг через друга (14; 27). Эти результаты были получены при изучении краевой миграции кератиноцитов на базальную пластинку (межклеточный матрикс). образовавшуюся на дне волдыря. Такой тип миграции, возможно, связан с тем, что ведущий край клетки при контакте с базальной пластинкой быстро образует гемидесмосомы. препятствующие дальнейшей миграции (27). Высказывалось также предположение, что направленность миграции эпителиального пласта может регулироваться самим пластом - явление, названное эффектом "свободного края" (28). После образования дефекта эпителиальной ткани краевые клетки могут формировать ламеллиподии,

направленные в сторону дефекта, в течение нескольких секунд. При этом субмаргинальные клетки ингибируют образование ламелл на противоположном краю краевых клеток и поддерживают, таким образом, направленность движения пласта. Согласно этой точке зрения супрабазальные клетки не участвуют в процессе миграции.

Взаимные перемещения в процессе миграции предполагают разницу в подвижности разных клеток в составе пласта или кластера. В ряде случаев в активной миграции пласта эпителия или кластера клеток in vitro принимают участие только маргинальные клетки. формирующие ламеллиподии (17). В то же время имеются сведения о том. что в процессе миграции участвуют и субмаргинальные клетки (16). В мигрирующем эпителии лягушки, независимо от локализации в пласте и даже в интактной коже, прилегающей к ране, каждая эпидермальная клетка, контактирующая с субстратом, образует ламеллиподию, которая подползает под клетку, лежащую впереди. Таким образом, все базальные клетки участвуют в движении пласта путем взаимодействия с субстратом

Нехарактерным элементом движущихся клеток является формирование раффлов (складок клеточной мемраны), которые образуются на ведущем крае и волнообразно перемещаются по ламеллиподии в направлении заднего конца клетки (13).

Образование раффлов часто является одной из самых первых реакций клетки на добавление фактора роста. Так, например, в культуре глиальных клеток человека добавление EGF вызывало немедленное возникновение раффлов, а синтез ДНК начинался через 20 ч (29).

Считается, что раффлы, содержащие новообразованную сеть микрофиламентов необходимы для направленной миграции клеток (30). Ламеллиподии также содержат полимеризованный актин. Однако, остается неясным, является ли образование актиновых микрофиламентов

необходимым для формирования л а мел л или новые филаменты только стабилизируют мембранный вырост, возникший в результате осмотических явлений (31,32).

Направленное движение клеток может быть стимулировано растворимыми факторами и их градиентом. Миграция по градиенту носит название хемотаксиса (33). Для миграции клеток характерно также явление гаптотаксиса - зависимость движения от характеристик субстрата, а также от градиента связанных с матриксом специфических агентов. Кроме этого, микрорельеф подложки оказывает влияние на ориентацию клеток, их форму и направление миграции (34, 35). Это явление носит название контактного или топографического ориентирования (contact guidance).

1.2. Скорость движения

Скорость миграции кластеров эпителиоидных клеток рыбы может составлять до 4 мкм/мин (17).Скорость миграции эпителиального пласта у головастика Xenopus в рану in situ составляет 11.5 мкм/мин, а миграция пласта по стеклу in неравна 1.5 мкм/мин. однако миграция клеток внутрь микрораны, нанесенной на эпителиальный пласт in vitra достигает 6.5 мкм/мин (36). Скорость миграции эпителия пищевода цыпленка in vitro составляет 1.7 мкм/мин (15).

1.3. Роль элементов цитоскелета в клеточной миграции

Миграция клеток в большой степени обеспечивается элементами цитоскелета. Относительная роль компонентов цитоскелета в направленном движении зависит во многом о�