Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Феномен провизорности при репаративной регенерации кожи

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Феномен провизорности при репаративной регенерации кожи"

На правах рукописи

Иванова Наталья Владимировна

ФЕНОМЕН ПРОВИЗОРНОСТИ ПРИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.03.01 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

22 ДПР2015

0055674Ь»

Тюмень - 2015

005567455

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Соловьев Георгий Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Пантелеев Сергей Михайлович

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАН, Банин Виктор Васильевич ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Геренг Елена Андреевна ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «12» мая 2015 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан« » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д. м. н. ' Л. В. Вихарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Согласно исследованиям ученых Тюменской школы морфологов одним из морфогенетических и адаптивных механизмов эволюции гисто- и органогенезов является феномен провизорности (Янин В. Л., Дунаев П. В., Соловьев Г. С. и др., 2000; Янин В. Л., 2001; Соловьев Г. С., 2002; Соловьев Г. С. и др., 2011). Фундаментальное изучение этапов гистогенеза опорных тканей и витального цикла первичной почки (Смышляева Р. К., 2004, 2011; Носова Н. П.,2010; Агафонова Н. А. и др., 2011), на основании которого было сформулировано определение провизорности, в дальнейшем было распространено на расшифровку закономерностей эмбриональных и постнатальных морфогенезов применительно к гипофизу, стомодеуму, яичнику (Богданов А. В., 2005; Струихина О. В., 2006; Шилин К. О., 2010). Объективное существование провизорных форм морфологического субстрата до недавнего времени рассматривалось с позиций эпигенеза и этапности в индивидуальном развитии организма (Кнорре А. Г., 1971; Павлова В. Н. и др. 1988; Чумасов Е. И., 2009; Баженов Д. В. и др., 2011; Sainio К., 2003; А1у К. Н., 2007). До настоящего времени не подвергнуто изучению формирование провизорных структур на ранних этапах репаративной регенерации тканей и органов, трансформация провизорного субстрата в дефинитивный, выявление объективных показателей процесса замещения провизорных структур дефинитивными. Нет достаточных сведений, подтверждающих существование провизорности как детерминированного принципа механизмов гисто- и органогенезов не только в пренатальном, но и в постнатальном периоде онтогенеза.

Первые исследования детерминированности феномена провизорности в процессах репаративной регенерации у взрослого организма были проведены на примере гистогенеза скелетных тканей в условиях культивирования «in vivo» по методу Ф. М. Лазаренко, заживления дефектов и переломов трубчатых костей в эксперименте и клинике на фоне суперинвазионного описторхоза, а также при изучении становления анастомозов в различных отделах пищеварительного канала (Бахлыков Ю. Н„ 1973, 2006; Соловьев Г. С. и др., 2004; Вакулина О. Э„ 2008; Баранов С. В., 2009; Молокова О. А., 2012).

Одним из вариантов выявления феномена провизорности при репаративной регенерации может быть наблюдение за морфологической картиной заживления кожных ран. Изучение регенерации кожи и её дериватов продолжает оставаться в центре внимания исследователей, несмотря на обширную информацию по этой проблеме в научной литературе (Миллер Л. Г., 2004; Данилов Р. К., 2008, 2010; Zi Y. et al., 2006; Ong С. Т. et al., 2007; Денисов А. А., 2011; Синельщиков Е. А., 2011; Горелова М. В., 2011; Никитюк Д. Б., Глухов А. А., Алексеева Н. Т., 2012; Нузова О. Б., Стадников А. А., Нузов Б. Г., 2012; Воротеляк Е. А., 2012).

Вместе с тем сведений о значимости феномена провизорности в обеспечении репаративной регенерации кожи в доступной научной литературе нами не обнаружено.

Все упомянутое убеждает нас в целесообразности дальнейшего привлечения внимания к феномену провизорности и наблюдению событий, происходящих в провизорных структурах при репаративной регенерации.

Цель работы: обосновать значимость феномена провизорности при репаративной регенерации кожи и её дериватов.

Задачи исследования:

1. Изучить в эксперименте провизорную стадию морфогенеза кожи при репаративной регенерации после химического ожога.

2. Изучить в эксперименте провизорную стадию репарации кожи после локального воздействия температурного фактора на раневую поверхность кожного покрова (термического ожога).

3. Выявить морфологические, морфометрические и иммуногистохимические критерии провизорных гисто- и органогенезов при репаративной регенерации кожи и на фоне лечения гелем «Эйковит».

4. Провести анализ трансформации провизорных структур в дефинитивные при репаративной регенерации кожи.

Научная новизна

Впервые показано, что дефинитивная кожа половозрелого животного сохраняет детерминированную способность провизорных эмбриональных зачатков к формированию временных провизорных структур тканево- и органотипи-ческого уровня организации, выполняющих важные функции регенерирующего органа и моделирующие формирование структурных компонентов дефинитивной кожи. Сравнительный анализ репаративной регенерации кожи после термического и химического ожога выявил закономерность развития универсальных формообразовательных процессов, независимо от характера повреждающего фактора: образование зачатков эпидермального и мезенхимного генезов, миграционные потоки клеток мезенхимных и эпидермальных дифферонов, образование провизорных структур и их трансформация в дефинитивную форму субстратов. Одним из объективных показателей трансформации провизорного эпидермального пласта при репаративной регенерации кожи в дефинитивную структуру является обнаружение в его составе клеток - дифферонов мезенхимного ге-неза СБ 1а (клетки Лангерганса) и СОЗ (Т-лимфоциты). Облигатным условием формирования дефинитивного эпидермального регенерата при термических

и химических ожогах кожи является наличие провизорной стадии гистогенеза соединительной ткани сосочкового слоя дермы.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые рассматривается процесс репаративной регенерации кожи с позиций реализации принципа провизорности. Показано, что «выпадение» провизорной стадии морфогенеза эпидермиса завершается состоянием субституции регенерирующего органа.

Выявлено, что репаративная регенерация кожи осуществляется двумя вариантами - кожный тип и дермальный тип. При дермальном типе регенерация завершается субституцией пораженного органа: формируется струп композитного строения и подстилающая плотная (рубцовая) соединительная ткань. Кожный тип репарации завершается реституцией пораженного участка с формированием послойной структуры кожи как органа и формированием дериватов - сальных желез и волос.

Результаты исследования позволяют рекомендовать целесообразность использования препарата гель «Эйковит» в качестве одного из эффективных средств при лечении термических ожогов кожи и дерматитов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дефинитивная кожа половозрелого животного характеризуется детерминированной способностью формирования провизорных структур.

2. Репаративная регенерация кожи осуществляется в соответствии с принципом провизорности и сопровождается морфогенезом тканево- и органотипических производных.

3. Реституция кожи коррелирует с конвергенцией компонентов различных диф-феронов на стадиях регенераторного процесса.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на: научном совещании «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии», посвященном 80-летию со дня рождения профессора А. А. Клишова (г. Санкт-Петербург,2010); X конгрессе международной ассоциации морфологов (г. Ярославль, 2010); IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине (г. Тула, 2010); III эмбриологическом симпозиуме ВНОАГЭ: «Югра-Эмбрио» (г. Ханты-Мансийск, 2011); научном совещании «Актуальные вопросы преподавания морфологических дисциплин с использованием современных технологий. Фундаментальные и прикладные проблемы гисто-

логии» (г. Санкт-Петербург, 2012); Х1конгрессе МАМ (г. Самара, 2012); I Международной конференции «Морфоклиничеекие аспекты безопасности жизнедеятельности» (г. Воронеж, 2013); VII терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (г. Тюмень, 2013); 48-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (г. Тюмень, 2014); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной фундаментальной и клинической медицины», (г. Ханты-Мансийск, 27-28 ноября 2014г. ).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, 9 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кафедры патологической анатомии и кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Минздрава России», и кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Ханты-Мансийской государственной медицинской академии ХМАО-Югры.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 143 страницах текста, иллюстрирована 20 графиками, 7 гистограммами и 29 рисунками. Состоит из «Введения», глав: «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы». Список литературы содержит 277 источников (184 отечественных и 93 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Проведено изучение заживления кожи после моделирования экспериментального контактного дерматита (химический ожог) и термического ожога. Контактный дерматит вызывали локальным действием на организм химического субстрата 2,4 - динитрохлорбензила: производили втирание в кожу спины половозрелых нелинейных мышей - самцов массой тела 20-30г спиртово-ацетонового раствора 2-4 ДНХБ 1 раз в сутки в течении 5 дней. Препарат гель «Эйковит» наносили на раневую поверхность сразу после термического ожога и через 5 суток после втирания раствора 2,4 - ДНХБ. Эксперименты проведены в зимне-весенний период года. Все манипуляции производили в одно и тоже время суток с 11 до 13 часов. Эксперимент проведен в соответствии с международными рекомендациями по использованию животных в биологических и медицинских исследованиях (1986). Условия содержания и кормления животных соответствовалисанитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник, утвержденных приказами МЗ СССР №1045 от 06. 04. 73г., №1179 от 10. 10. 83г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с учетом требований к работе с экспериментальными животными. В эксперименте использовано 108 животных (табл. 1). Забой животных производили под эфирным наркозом путем декапитации. Для гистологического исследования выделяли кожу спины и забирали кусочки в очаге поражения и интактных участках. Материал фиксировали в жидкости Карнуа и Ю-% нейтральном формалине, заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали обзорными методиками (гематоксилин Майера и эозин), гистохимически выявляли вещества углеводной природы с использованием ШИК-реакции по Мак-Манусу (Пирс Э., 1962). Гель «Эйковит» наносили равномерным слоем на весь участок сенпликации с помощью стеклянной лопаточки. В основе геля использовали «Эйковит» лечебно-косметический (ТУ 9158-00134458166-95) производства Салехардского рыбоконсервного завода (Кутузова И. В., Волков А. И., Миллер Л. Г., 1999). Термический ожог моделировали с использованием аппарата «Терцик» И5-232С, Россия. Аппарат имеет выносной металлический модуль площадью 1 см2. Температура модуля 80°С, экспозиция 3 минуты. Отмеченный режим обеспечивает формирование локуса ожога кожи 2 степени (Берлин Л. Б., 1966).

Морфометрические исследования (измерение площади и периметра ядра и цитоплазмы, фактора формы ядра и цитоплазмы и ядерно-цитоплазматического отношения) производили с помощью микроскопа МЕКОС-Ц1(комплекс аппаратно-программный автоматизированного определения фотоморфометрических параметров для диагностики заболеваний: МЕКОС-Ц1, ТУ 9443-001-27543786-97). Морфометрические данные получали при анализе материала от трех животных в каждом

сроке исследования. У каждого животного измеряли по 220 клеток в эпидермисе и дерме. Количество клеток на единицу площади тестовой поверхности дермы подсчитано с помощью морфометрической сетки 16x16 (Автандилов Г. Г., 1990) при объективе х90 и окуляре х7 (по 30 тестовым поверхностям).

Иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах. Срезы, покрытые полилизином, помещали на адгезивные стекла (Menzel-Glasser, Германия). Иммуногистохимический анализ проводили с использованием непрямого иммунопероксидазного метода в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. При постановке иммуногистохимической реакции для выявления антигена Ki-67 - маркер ядер пролиферирующих клеток в эпителиальных структурах - эпидермис, волосяной фолликул, сальная железа - и тканях мезенхимного генеза кожного регенерата, CD3+ - маркера Т-лимфоцитов и CDla+ - маркера клеток Лан-герганса - использовали антитела и реактивы фирмы NeoMarkersFremont, США.

При приготовлении срезов для иммуногистохимического исследования выполняли ряд требований, необходимых для успешного проведения реакции: срезы были ровные, толщиной 4 мкм, расправлялись в теплой дистиллированной воде (+25°С) и не подвергались перегреванию, так как температура выше 56°С может разрушить антиген, что приведет к ложному результату реакции. Срезы после постановки гистохимической реакции докрашивали гематоксилином Майера, подвергали дегидратации, заключали в канадский бальзам.

Результаты иммуногистохимических реакций оценивали методом полуколичественного анализа: слабая очаговая реакция оценивалась (+) и обозначалась как слабая экспрессия; реакция средней интенсивности оценивалась (++) и обозначалась как средняя экспрессия; интенсивная реакция оценивалась (+++) и обозначалась как высокая экспрессия. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого антигена. При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (Iki - 67) по формуле:

I = (n+/N) х 100%, где п+ - количество меченых ядер, N - общее число ядер в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, формирующихся сальных железах, волосяных фолликулах и сосочковом слое дермы в поле зрения микроскопа. Исследования проводили при Об. 100, Ок. 10 в 20-30 полях зрения среза (Ланичева А. X., Семченко В. В., Мурзабаев X. X., 2013).

Статистическая обработка результатов морфометрии проведена на персональном компьютере с использованием программы «Microsoft Excel» из пакета Microsoft Office ХР с определением критерия достоверности по Стьюденту (для всех показателей р<0,05)

Таблица 1.

Распределение экспериментальных животных по группам исследования (белые беспородные мыши-самцы, абсолютные значения)

3 суг. 5сут. 7сут. Юсут. 15сут. 20 сут. ЗОсуг.

I группа (норма) 3 - - - - - -

II группа (экспериментальный дерматит) 3 3 3 3 3 3 3

III группа (лечение экспериментального дерматита гелем «Эйковит») 3 3 3 3 3 3 3

IV группа (термический ожог) 3 3 3 3 3 3 3

V группа (лечение термического ожога гелем «Эйковит») 3 3 3 3 3 3 3

VI группа (плацебо) 3 3 3 3 3 3 3

Итого: 108 животных

Результаты исследования и их обсуждение.

В литературе представлена обширная информация о морфофункциональ-ной характеристике кожи в эволюции, онтогенезе, экспериментальных условиях и патологических состояниях. Уровень восстановительных процессов кожи и ее дериватов при действии различных факторов среды представляет собой результирующую сочетания биологических потенций морфологического субстрата, его способности к реализации эпигенетических проявлений и состояния дистантных и локальных механизмов регуляции «кинетики» клеточных, тканевых и органных структур. Одной из важных сторон расшифровки восстановительных процессов является сочетание производных всех дифферонов в оптимальном хроно-векторе в соответствии с известными этапами репарации. Восстановление эпидермиса, его дериватов и производных мезенхимного генеза в конечном итоге выражается в преобладании дермального, либо кожного типов регенерации или обеспечивает реституцию пораженного субстрата (Ефимов Е. А., Букина Т. В., 1990; Ноздрин В. И., Барашкова С. А., Семченко В. В., 2005; Ноздрин В. И. и др., 2006; Соловьев Г. С. и др., 2008).

Анализ материала настоящего исследования проведен с позиции учения об органотипической детерминированности тканей (Дунаев П. В., 1998), принципа провизорности и реализации морфогенетических корреляций в регенерирующем участке кожи (Соловьев Г. С. и др., 2005). Воспалительные разрастания эпителиев в виде выстилающего и погружного типов были обнаружены в очаге пораженной кожи и характеризовались этапностью тканево- и органотипической дифференци-ровки. Инфильтративных разрастаний в материале не выявлено.

Первые - третьи сутки эксперимента характеризовались разрастаниями выстилающих пластов, инициация которых относится к участкам краевых дефектов поверхности кожи и сохранившихся фрагментов - «островков» в пограничных участках интактной и пораженной кожи. Воспалительная реакция дермальной основы трансформируется в продуктивную стадию, что сопровождается, наряду с альтеративными процессами, регенераторными проявлениями. В участках с глубокими поражениями эпидермиса наблюдались феномены воспалительного генеза (вакуолизация, спонгиоз, акантоз). К концу первых суток эксперимента проявляется ответная реакция кожи на действие химического агента в виде защитных реакций эпидермиса, гиперемии сосудистого бассейна сосочкового слоя и отсутствия сосудистой реакции в глубоких слоях дермы.

В эпидермисе происходит отторжение слоев кератиноцитов, намечается граница отторжения между зернистым и ороговевающими слоями. Вместе с апопто-тическими слоями эпителия слущиваются компоненты волосяных воронок, увлекая за собой секрет сальных желез и структуры внутреннего корневого эпителиального влагалища. В отдельных участках отторгаются стержни волос. Базальная мембрана эпидермиса утолщена и четко выявляется в виде ШИК -позитивной каймы. Секреторные отделы сальных желез уменьшаются в объеме, снижается активность себоцитов и количество клеток, вступивших в фазу голокринии. В волосяных фолликулах отмечается атрофия клеток наружного и внутреннего эпителиального влагалища и, как следствие, уменьшается диаметр луковицы и корня волоса с оболочками. Эпителий матрицы волоса сохраняет жизнеспособность, однако уровень физиологической регенерации корня волоса ослабевает, что завершается отторжением волоса. Вокруг волосяных фолликулов определяются очаги местного отека и изоляции сумки волоса от прилежащей ткани сосочкового слоя дермы. При эпиляции в сохранившихся луковицах наблюдается явление ускоренной кератинизации.

В отдельных волосяных фолликулах активизируется эпителий наружного эпителиального влагалища, формируются многослойные пласты с четкой вертикальной анизоморфностью. Последнее свидетельствует о системной ответной реакции производных эктодермы на раздражение и вовлечении в данный процесс генеративных структур кожи. К третьим суткам на поверхности эпидермиса находятся отслоившиеся ороговевшие слои, пропитанные фибрином и инфильтрированные лейкоцитами. Эпидермис характеризуется прерывистостью, а в пограничных с действием поражающего фактора участках состоит только из двух слоев клеток. Состав надэпидермального детрита, занимающего значительные площади, характеризуются наличием кусочков волос, компонентов внутреннего эпителиального влагалища, эпидермальных чешуек, фибрина.

Фрагменты детрита в отдельных участках прикрывают зоны эпидермиса, формируя изолирующую от внешней среды оболочку - «струп». К 5 суткам эпидермис утолщается за счет герминативного слоя, уменьшается плотность оволосе-нения, в эпидермисе формируются кистоподобные структуры. Ороговение не выражено. Волосяные фолликулы фрагментируются, что сопровождается образованием полостей, заполненных десквамировавшимися эпидермоцитами на стадии ороговевания и воспалительным экссудатом. В отдельных зонах эпидермиса отмечаются тяжи погружного роста, соответствующие по строению втулкам закладок волос в эмбриогенезе. 7-10 сутки характеризуются очагами изъязвления, размеры которых бывают различными. Эпидермис по краям раны находится в состоянии некробиоза, межклеточные промежутки расширены, базалиоциты уплощаются. Ба-зальная пластинка эпителия утолщена или прерывистая. Раневое содержимое представлено грануляционной тканью с клетками фибробластического ряда, лейкоцитами, обилием аморфного вещества и малым содержанием фибриллярных структур. Перифокальное воспаление сопровождается гиперемией сосудов, диапедезом форменных элементов крови, отсутствием сальных желез и волосяных фолликулов. В отдаленных от дефекта участках замедляются процессы кератинизации, дифференцированные клетки достигают состояния кератиноцитов зернистого слоя, приостанавливая дальнейшее созревание. В зоне изъязвлений незначительного размера грануляционная ткань не только восполняет полость дефекта, но и распространяются за пределы дефекта на сохранившийся эпидермис (феномен «плюс -ткань») (рис. 1).

К 15 суткам эпидермис истончен. Ороговевшие слои представлены только в отдельных участках по протяжению пласта, роговые чешуйки не формируют защитного слоя, сохраняют множественные «точечные» дефекты эпидермиса с проявлениями замедленной регенерации по краю дефекта, за счет наползающего 1-2-х-слойного эпителиального клина. В волосяных фолликулах активизируется состояние клеток наружного и внутреннего эпителиальных влагалищ и матрицы. Вокруг

Рис. 1. Химический ожог кожи. Стадия опыта 7 суток. Кожный тип репаративной регенерации. Формирование тяжа погружного роста. Начальные этапы органогенеза волосяного фолликула. Фиксация: 10% нейтральный формалин. Шик-реакция по Мак-Манусу. 7x40.

волосяного мешка находятся остатки погибающих участков бывшего наружного корневого влагалища. Отдельные луковицы регенерируют в достаточно полном объеме, что обеспечивает ростовые процессы корней волос. Хаотичность регенераторных процессов приводит к неоднозначной морфологической картине в очагах поражения. Дискомплексация кожи как органа сопровождается нарушением гистохимической структуры, что демонстрируется резко позитивной ШИК- реакцией цитоплазмы отдельных эпителиоцитов, базальной пластинки и основного вещества соединительной ткани.

К 20 суткам эпидермис в области заживающих дефектов характеризуется наличием камбиальных и дифференцированных слоев. Восстанавливается керати-низация и формирование эпидермальных чешуек. В коже восстановленных дефектов волосы и сальные железы отсутствуют - свидетельство пролонгирования реституции и преобладание дермального типа регенерации. Продуктивная фаза воспаления при дерматитах без лечения активизируется только к 20 суткам эксперимента, что свидетельствует о длительности воспалительного процесса и недостаточного уровня регенераторных свойств кожи как органа и ее компонентов в отдельности. К 30 суткам эпидермис истончен, в нем сохраняются дефекты, в коже содержатся немногочисленные волосы и сальные железы. Регенераторные процессы не активны. Эпидермис морфологически неравнозначен по протяжению пласта, роговые слои формируются неравномерно, определяются в виде изолированных участков. Инфильтрация сосочкового слоя дермы характеризуется меньшей интенсивностью, преобладают клетки механоцитарного дифферона.

Процессы регенерации, на фоне использования геля «Эйковит» (III, V серии) повторяют основные этапы преобразования компонентов кожи в других сериях опытов, однако характеризуются более активными проявлениями, реализацией биологических потенций на более ранних стадиях эксперимента и обеспечивают реституцию пораженной кожи к конечным стадиям опыта. Кожный тип регенерации, характерный для животных опытных групп сопровождается выраженными проявлениями органотипической дифференцировки кожного эпителия и его участия в органогенезе дериватов кожи. В частности, сальные железы активно формируются на протяжении эксперимента, начиная с 7 суток. При этом органогенез сальных желез осуществляется в виде 2 хронофаз, первая из которых обеспечивает формирование свободно открывающихся желез на поверхность эпидермиса. Подобное состояние регенераторного процесса обеспечивает санирование раневой поверхности секретом, обладающим бактерицидным действием, «кожное сало» одновременно предотвращает появление трещин и делает кожу эластичной. Феномен первой волны органогенеза сальных желез интересен с теоретических позиций и подтверждает эволюционно сформированные закономерности органотипической дифференцировки. Кожный эпителий низших животных формирует железистые

производные, а эпидермис наземных амниотов способен к построению защитных компонентов в виде пера и волоса. Вторая волна активизации органогенеза сальных желез связана с процессами формирования зачатков волос и регистрируется к 20 суткам эксперимента.

Формирование эпителиальных тяжей погружного роста на фоне лечения гелем «Эйковит» генерализуется к 10 суткам опыта обеспечивает регенерацию органа в полном объеме, т. е. по кожному типу. Характер восстановительных процессов в эпидермисе дериватах кожи и дерме свидетельствует о важном значении объема реализации биологических потенций субстрата и зависимости типа регенерации от локальных условий. Наблюдения за регенераторными процессами после химических ожогов кожи показали, что состояние восстановления эпидермиса и его производных является не только результирующей органотипической детерминированности, но и установлением межтканевого взаимодействия структур экто-дермальной и мезенхимной природы. В частности, динамика соотношения площади клеток и межклеточного вещества, клеточная плотность формирующейся соединительной ткани кожной раны показали закономерность проявлений продуктивного характера в различные фазы воспаления, совершенно неравнозначные при заживлении и с применением геля «Эйковит». Акрофазы уровня клеточной плотности на 3 и 7-10 сутки опыта свидетельствуют о проявлении единой цепи событий в ходе смены клеточных генераций и вариантность их топики в грануляционной и соединительной ткани. Преобладающее количество клеток на 3 сутки относится к категории полинуклеаров крови, а на 10 сутки - к системе фибробластического (ме-ханоцитарного) дифферона. Фибробластическая стадия сопровождается нарастанием объема межклеточной основы грануляционной ткани, фибриллогенез в которой может генерализоваться и привести к формированию рубцовой ткани. На таком фоне (серия без лечения гелем «Эйковит») эпидермальные компоненты не в состоянии реализовать в полном объеме эпигенетические проявления, а регенераторный процесс осуществляется по дермальному типу.

Рис. 2. Трансформация струпа в области регенерирующей зоны пораженной кожи. Стадия опыта 30 суток. Состояние субституции. Струп (1), дерма (2), гиподерма (3). Фиксация: 10% нейтральный формалин. Шик-реакция по Мак-Ма-нусу. 7x10.

Закономерности этапов тканевой и органотипической дифференцировки кожного эпителия и регенерирующей дермы подтверждают существование феномена органотипической детерминированности и свидетельствуют о дивергенциях, как одном из фундаментальных механизмов органотипической дифференцировки. «Выпадение» провизорной стадии при дермальном варианте репарации кожи приводит к закрытию дефекта несовершенным по своей тканевой структуре струпом композитного состава. Дефинитивная тканево-типическая структура кожного эпителия отсутствует. Не образуются т акже эпидермальные дериваты — волосы и сальные железы (рис. 2). В составе композита выявляются многочисленные гиалиновые тельца и гиалиновые мембраны. Соединительно-тканные слои дермы при дермальном варианте кожной раны не реализуют органотипические потенции и формируют единый слой образованный плотной неоформленной соединительной тканью.

Проявления активности репарации эпидермиса и его дериватов при кожном варианте регенерации коррелируют с топикой белка Кл-67 в клетках формирующихся структур в опытах на фоне использования геля «Эйковит» и в сериях без применения названного препарата (рис. 3)

В опытах с обработкой пораженного участка кожи гелем «Эйковит» распределение К ¡-67 отражает динамику репаративной регенерации эпидермиса, перемещение Кл-67-позитивных клеток в соответствии с закономерным формированием в пласте эпидермальных пролиферативных единиц (табл. 2).

Рис. 3. Термический ожог кожи. Стадия опыта 10 суток. Обработка гелем «Эйковит». Распределение белка Кл-67 в клетках эпидермиса (в овалах). Фиксация: 10% нейтральный формалин. Гематоксилин Майера и эозин. 7x40.

Ч. ' : -Л

Таблица 2

Содержание Ю-67 позитивных клеток в эпидермисе кожного регенерата, %

Сутки Плацебо Химический ожог Термический ожог

опыта п=15, (М±ш) Без «Эйко- С «Эйковитом» Без «Эйко- С «Эйкови-

вита» п=15, (М±т) вита» том»

п=15, (М±ш) п=15, (М±т) п=15, (М±т)

3 41,64±0,75 32,76±0,68 31,26±0,54* 23,48±0,36 25,61±0,46*

7 24,32±0,38 18,37±0,62 12,46±0,43*" 16,23±0,32 11,22±0,34*'

15 28,43±0,61 31,46±0,34 32,37±0,36* 26,11 ±0,28 37,42±0,48*"

20 32,24±0,44 36,23±0,71 46,22±0,48** 37,12±0,58 48,31±0,56*'

30 37,56±0,28 38,32±0,46 54,18±0,67*" 36,23±0,55 51,43±0,44*'

Контроль 36,45*0 38

*- коэффициент достоверности по сравнению с контролем р < 0,001; коэффициент достоверности по сравнению с серией опыта «Без Эйковита», р < 0,001.

Интегральная оценка морфологических преобразований регенерата и морфо-метрических показателей клеточного состава эпидермиса и формирующейся дермы послужила базовым критерием оценки состояния регенераторного процесса, его закономерной стадийности и выявления провизорных и дефинитивных структур в составе кожного регенерата (рис. 3, 4). Нарастание уровня интегрального показателя в серии опытов с использованием геля «Эйковит» свидетельствует о благоприятном течении гисто- и органогенезов, косвенно указывает на реальную возможность реституции пораженной кожи и реализацию феномена провизорности в постнатальном онтогенезе. В тех случаях, когда интегративные отношения имели низкие значения или проявляли тенденцию к снижению, состояние регенераторного процесса свидетельствовало о субституции или могло привести к заживлению дефекта путем формирования нехарактерных для нормального органогенеза кожи структур в виде струпа многотканевого состава, отсутствию сосочкового слоя дермы и отсутствию кластерного расположения липоцитов в гиподерме.

Хроновектор миграции в состав регенерата клеток механоцитарного, гемопо-этических, а также эпидермальных дифферонов может служить одним из объективных критериев формирования провизорных и дефинитивных органотипических структур. Хроновектор эстафеты от провизорной к дефинитивной структуре реализуется только в том случае, когда оформляется провизорный морфологический субстрат. Наши морфометрические исследования клеточной плотности на единице площади дермы на стадии 3 суток эксперимента выявили значительное возрастание от исходного уровня от 40 до 100 в опытах с формированием ожогов на фоне применения геля «Эйковит».

-1 группа

- II группа

- Ill группа

- IV группа -V группа -VI группа

Зсут

5 сут

7 сут

10 сут 15 сут 20 сут 30 сут

Рис. 3. Морфометрические показатели клеток базального слоя, Бц (цветом выделены группы животных, получавших лечение препаратом «Эйковит»: красный - при экспериментальном дерматите, синий - при термическом ожоге).

Рис. 4. Морфометрические показатели клеток шиповатого слоя, 8ц (цветом выделены группы животных, получавших лечение препаратом «Эйковит»: красный - при экспериментальном дерматите, синий - при термическом ожоге).

К 30 суткам эксперимента использование геля «Эйковит» обеспечивает уровень клеточной плотности регенерирующей дермы до показателей в коже интакт-ного животного. Влияние геля «Эйковит» на состояние морфометрических показателей и картины морфологических преобразований регенерата свидетельствует о роли локальных регуляторных факторов в хроновекторе провизорного этапа регенерации, формирования тканевотипических структур и их трансформации в дефинитивные субстраты. Результаты эксперимента подтверждают реализацию феномена провизорности при заживлении дефектов кожи в постнатальном периоде онтогенеза. Иммуногистохимические исследования позволили проследить динамику содержания пролиферирующих клеток в структурных компонентах кожного регенерата на этапах эксперимента: в эпидермисе, дериватах кожи - сальной железе и волосе, и формирующейся дерме.

Выявление на стадии 7 суток репарации СВ1а-позитивных клеток в эпи-дермальном пласте (рис. 5) свидетельствует о взаимосвязи миграционных свойств эпидермальных макрофагов и пролиферативной активности клеток пласта. Прослеживается также участие СГ) 1а-клеток в формировании эпидермальных пролифера-тивных единиц, так как повышение содержания С01а-клеток коррелирует со снижением пролиферативной активности кератиноцитов (табл. 3).

Рис. 5. Содержание СП 1 о+ позитивных клеток в составе регенерирующего эпителия кожной раны (стадия 7 суток). Лечение гелем «Эйковит». Экспрессия рецепторов С01а+ клеток Лангерганса (в овалах) в составе кожного регенерата после химического ожога. Визуализация при помощи пероксидазы (коричневое окрашивание), докраска гематоксилином Майера. 10x100.

Таблица 3

Содержание С01а-позитивных клеток в эпидермальном пласте кожного регенерат а, %

Сутки опыта Плацебо п=12,(М±ш) Химический ожог Термический ожог

Без «Эйковита» п=12, (М±ш) С «Эйковитом» п=12, (М±ш) Без «Эйковита» 11=12, (М±т) С «Эйковитом» п=12, (М±т)

3 0 0 0 0 0

7 8,36±0,24 9,12±0,41 6,14±0,22** 9,46±0,36 5,24±0,42**

20 8,42±0,73 14,32±0,51 9,23±0,34*' 16,36±0,52 11,73±0,64*'

30 6,24±0,32 12,41±0,37 11,42±0,26* 12,21 ±0,34 11,44±0,52*

Контроль 4,45±0,72

*- коэффициент достоверности по сравнению с контролем р < 0,001; коэффициент достоверности по сравнению с серией опыта «Без Эйковита», р < 0,001.

Содержание СБЗ-позитивных клеток позволило провести один из возможных вариантов сравнительного анализа репаративного процесса дермы и эпидермиса. Выявление СОЗ клеток в сосочковом слое регенерата в довольно значительном содержании, начиная с 7 суток эксперимента, указывает на облигатный вариант участия этих клеток в репарации дермы. Следует отметить, что позитивное влияние на регенераторный процесс и дифференцировку сосочкового слоя оказывают препараты «Эйковит» (табл. 4,5).

Таблица 4

Содержание СОЗ-позитивных клеток в эпидермисе регенерата, %

Сутки Плацебо Химический ожог Термический ожог

опыта п=12, Без С Без С «Эйкови-

(М±т) «Эйковита» «Эйковитом» «Эйковита» том»

п=12, (М±ш) п=12, (М±ш) п=12, (М±т) п=12,(М±т)

3 0 0 0 0 0

7 0 0 3,62±0,12*' 0 4,08±0,22**

20 14,24±0,62 15,31±0,54 17,36±0,73*" 15,06±0,48 18,63±0,72*"

30 31,05±0,42 18,41±0,32 17,41±0,22* 19,22±0,!8 19,32±0,61*

__Контроль 9,46±0,32_

*- коэффициент достоверности по сравнению с контролем р < 0,001;

коэффициент достоверности по сравнению с серией опыта «Без Эйковита», р < 0,001.

Таблица 5

Содержание СОЗ-позитивных клеток в сосочковом слое регенерата, %

Сутки Плацебо Химический ожог Термический ожог

опыта п=12, Без С Без «Эйко- С «Эйковитом»

(М±ш) «Эйковита» «Эйковитом» вита» п=12, (М±т)

п=12, (М±ш) п=12, (М±ш) п=12, (М±т)

3 0 0 0 0 0

7 21,37±0,72 24,53±0,61 41,22±0,73*" 28,46±0,32 42,31±0,23*"

20 26,7±0,85 30,03±0,12 42,31±0,52*" 38,41±0,32 44,23±0,64*'

30 39,62±0,61 32,08±0,42 43,41±0,32*' 39,26±0,24 46,33±0,71**

Контроль 36,7±0,43

*- коэффициент достоверности по сравнению с контролем р < 0,001;

*- коэффициент достоверности по сравнению с серией опыта «Без Эйковита», р < 0,001.

Рис. 6 Содержание СШ позитивных клеток в составе формирующегося эпидермиса и подлежащей дермы (стадия 7 суток). Лечение гелем «Эйковит». Экспрессия рецепторов СОЗ+ Т-лимфоци-тов (в овалах) в составе эпидермиса и формирующейся дермы в зоне заживления кожной раны после химического ожога.

Динамика С 1)3 позитивных клеток в эпидермальном регенерате подтверждает значимость феномена конвергенции при трансформации провизорного субстрата в дефинитивный (рис. 6). СЮЗ клетки, являясь обыденным компонентом зрелого эпидермиса, начинают выявляться в пласте только начиная со стадии 7 суток опыта, причем только в том случаи, если пораженный участок обрабатывался пре-

паратами ненасыщенных жирных кислот. Не исключено, что препараты «Эйко-вита» способствуют миграционной активности Т-лимфоцитов. Выявление СБЗ клеток в формирующейся дерме указывает на закономерный транспорт Т-лимфоцитов из ткани внутренней среды в эпидермальный регенерат. Поэтому на стадии 7 суток эксперимента СБЗ позитивные клетки выявлялись в материале всех серий опытов. При этом наибольшее их содержание находилось в сериях с использованием «Эйковита».

Наиболее четко определяется участие СБЗ-клеток в становлении соединительно-тканной основы регенерата. На этапах репарации, начиная со стадии 7 суток, содержание СОЗ-позитивных клеток поддерживается на высоком уровне.

Таким образом, иммуногистохимические исследования намного расширили комплекс информации о закономерностях посттравматической регенерации кожи и позволила подтвердить активное участие клеток производных эктодермального дифферона и клеток дифферонов мезенхимного генеза в процессах гисто- и органогенеза при репаративной регенерации кожи и её дериватов.

ВЫВОДЫ

1. Репаративная регенерация кожи после химических и термических ожогов осуществляется в соответствии с принципом провизорности и сопровождается поэтапным формированием тканевотипических (провизорных) и органотипических (дефинитивных) структур.

2. Провизорные морфогенезы являются морфологическими предикторами реституции и детерминируют формирование дефинитивного субстрата. Объективными критериями трансформации провизорной стадии формирования кожного регенерата в дефинитивную являются наличие в составе эпидермального пласта клеток дифферонов мезенхимного генеза и формирование зачатков дериватов кожи.

3. К критическим стадиям репаративной регенерации кожи относятся 7-10, 20 и 30 суток опыта, когда осуществляются наиболее важные процессы формообразования зачатков, миграционных потоков клеток дифферонов мезенхимного и эпидермального генезов.

4. Регенерация кожи при химических и термических ожогах в условиях применения геля «Эйковит» сопровождается реституцией пораженного участка к концу сроков наблюдений.

5. Объективным критерием реституции кожи после химических и термических ожогов является интегративная взаимосвязь морфологических проявлений гисто-и органогенезов с динамикой морфомеггрических показателей структурных компонентов регенерата.

6. Соотношение клеток, производных различных дифферонов, на стадиях репа-ративной регенерации кожи свидетельствует о возможности конвергентного или дивергентного вариантов морфогенеза. При конвергентном варианте обеспечивается кожный механизм регенерации и реституция пораженного участка. При нарушении хроновектора конвергенции производных различных дифферонов репарация кожи осуществляется по дермальному варианту (субституции). Эпидермис и сосочковый слой дермы в таких случаях не формируются (образуется рубец).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соловьев Г. С. Проявление кожного и дермального типов регенерации после химических ожогов на фоне применения геля «эйковит» / Г. С. Соловьев, Н. В. Иванова, Л. Г. Миллер, Н. М. Сторожок // Медицинская наука и образование Урала, 2008. - № 6. - С. 60-64.

2. Соловьев Г. С. Реализация принципа провизорности в механизмах органогенеза/Г. С. Соловьев, В. Л. Янин, С. М. Пантелеев, А. В. Богданов, Н. А. Агафонова, С. В. Баранов, Н. В. Иванова, О. Ф. Истомина, Р. А. Идрисов, А. В. Кон-тарев, Н. П. Носова, О. В. Струихина // Морфология, 2009. - №4. - С. 128-129.

3. Иванова Н. В. Тканевотипическая и органотипическая стадия регенерации кожи и ее дериватов при химических ожогах / Н. В. Иванова // Материалы конференции «IX Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых по медицине», г. Тула, 2010. - С. 52-53.

4. Соловьев Г. С. Закономерности развития органов смешанного генеза у человека /Г. С. Соловьев, Н. А. Агафонова, А. В. Богданов, В. И. Гарчук, Н. В. Иванова, О. Ф. Истомина, В. В. Кушба, А. В. Маргарян, Р. К. Смышляева, К. О. Шилин // Морфология, 2010. - №4. - С. 177.

5. Янин В. Л. Сравнительная характеристика мезонефроногенеза у млекопитающих и птиц / В. Л. Янин, В. И. Гарчук, Н. В. Иванова, О. Ф. Истомина, С. А. Молокова, О. М. Бондаренко, А. В. Соловьева, К. О. Шилин, Р. К. Смышляева // Морфология, 2010. - №4. - С 228.

6. Агафонова Н. А. Критические стадии в развитии провизорного органа / Н. А. Агафонова, В. Л. Янин, Г. С. Соловьев, А. В. Богданов, О. М. Бондаренко, Н. В. Иванова, О. Ф. Истомина, В. В. Кушба, А. В. Маргарян, С. А. Молокова, Е. С. Орлова, Шилин К. О. // Медицинская наука и образование Урала, 2011. -№1,-С. 51-54.

7. Соловьев Г. С. Феномен провизорности в гисто-, органо- и системогенезах / Г. С. Соловьев, В. Л. Янин, А. В. Богданов, С. М. Пантелеев, Д. В. Баженов, В. Г. Бычков, А. В. Богданов, Л. В. Вихарева, К. О. Шилин, О. Ф. Истомина, Е. В. Иванова, Н. В. Иванова, В. В. Кушба, А. В. Маргарян, С. А. Молокова, О. Г. Соловьева, Е. С. Орлова, Е. Д. Хадиева// Морфология, 2011. - №5. - С. 8-12.

8. Каленова Л. Ф. Влияние локального воздействия температурного фактора на репарацию кожной раны в эксперименте / JI. Ф. Каленова, М. А. Новикова, П. П. Маркелова, И. М. Беседин, Н. В. Иванова, Е. В. Иванова // Медицинская наука и образование Урала, 2011. - №2. - С. 72-75.

9. Иванова Н. В. Провизорные гистогенезы при репаративной регенерации кожи / Н. В. Иванова, Е. В. Иванова, JI. Ф. Каленова, М. А. Новикова // Морфология, 2011.-№5.-С. 88-89.

10. Иванова Н. В. Заживление кожной раны на фоне локального воздействия геля «Эйковит», температурного фактора и никелида титана / Н. В. Иванова, Е. В. Иванова, Е. В. Золотухина, О. Ф. Истомина, П. П. Маркелова, Г. С. Соловьев // Морфология, 2012. - №3. - С. 64

11. Соловьев Г. С. Феномен провизорности в эмбриогенезах и при репартивной регенерации в постнатальном онтогенезе/ Г. С. Соловьев, К. О. Шилин, Н. В. Иванова// Материалы международной конференции «Морфологические аспекты безопасности жизнедеятельности», г. Воронеж, 22-23 ноября 2013г. - С. 87-88.

12. Соловьев Г. С. Формирование провизорных структур в онтогенезе, культурах «in vivo» и при репаративной регенерации / Г. С. Соловьев, Е. Е. Ельцова, Р. А. Идрисов, Е. В. Иванова, Н. В. Иванова, М. Ю. Лукина, П. П. Маркелова, О. В. Медведева, В. А. Шидин // Материалы VI] терапевтического форума «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов», г. Тюмень, 24 октября - 1 ноября 2013 г. - С. 79-80.

13. Иванова Н. В. Динамика пролиферативной активности клеток эпидермиса на стадиях заживления кожной раны/ Н. В. Иванова, П. П. Маркелова, Е. В. Иванова // Материалы 48-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации», г. Тюмень, 2425 апреля 2014 г.-С. 189.

14. Соловьев Г. С., Янин В. Л., Пантелеев С. М. и др. Феномен провизорности как научная проблема в исследованиях ученых тюменской и ханты-мансийской морфологической школы / Г. С. Соловьев, С. М. Пантелеев, Ю. В. Алексеева, Л. В. Вихарева, И. А. Голубева, Е. Е. Ельцова, С. А. Гольцман, Е. В. Иванова, Н. В. Иванова, Р. А. Идрисов, О. Ф, Истомина, А. В. Маргарян, О. М. Бонда-ренко, Д. А. Мухамедьяров, О. Г. Соловьева, Н. А. Сазонова, В. А. Шидин, Д. В. Янина, Т. Н. Соколова, Я. А. Карпова, Л. Н. Деревянко, В. В. Кужба // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной фундаментальной и клинической медицины», г. Ханты-Мансийск, 2728 ноября 2014г. - С. 177-182.

Иванова Наталья Владимировна

ФЕНОМЕН ПРОВИЗОРНОСТИ ПРИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖИ

03. 03. 04 - клеточная биология, цитология, гистология 14. 03. 01 - анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 02 апреля 2015 г. Формат 60x84/16. Печ. Л. 1,0. Печать цифровая. Тираж 100. Зак. № 2390 Типография ООО «Печатник», лицензия ПД № 17-0027 Тюмень, ул. Республики, 148 корп. 'Л. Тел. (3452) 20-51-13, тел/факс (34520) 32-13-86