Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста

Горин, Андрей Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста"

На правах рукописи

ГОРИН АНДРЕЙ ОЛЕГОВИЧ

РОЛЬ БИОСИНТЕЗА СТЕРОЛОВ В ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К БЛОКАТОРАМ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

03.01.04 - Биохимия

6 ИЕН Ш

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2013

005061015

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Абрамова Зинаида Ивановна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мустафин Ильшат Ганиевич (ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» заведующий кафедрой биохимии.

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ» заведующий лабораторией биохимии.

Ведущая организация Государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Башкирский государственный

медицинский университет».

Защита диссертации состоится 20 июня 2013 г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория №211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

420008, Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ к. 104, отдел аттестации научных кадров, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru

Ученый секретарь < ^ J

Диссертационного совета, доктор ШЗ^ X

биологических наук, профессор Т; Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), стимулирующий деление клеток после активации факторами роста. Многие опухолевые клетки приобретают амплификацию или активирующие мутации этого рецептора, что дает им преимущество в делении и росте (Yarden Y. // European journal of cancer. 2001. №37(4). P.3). Это привело к созданию многочисленных блокаторов этого рецептора, которые показали хорошие результаты при исследованиях in vitro (Jimeno А. // Critical reviews in oncology/hematology. 2005. №53. P.179). К таким блокаторам относятся антитела против внеклеточного домена рецептора и низкомолекулярные ингибиторы тирозиновых киназ. Однако в клинической практике блокада рецептора ЭФР оказалась значительно ниже предполагаемой вследствие развития опухолями первичной или приобретенной резистентности к используемым препаратам (Норрег-Borge Е.А. // Expert opinion on therapeutic targets. 2009. №13. P.339). При большинстве опухолей эффективность такой терапии не превышает 10% (Metro G. // Reviews on recent clinical trials. 2006. №1. P.l)

Таким образом, поиск способов усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР является крайне актуальной проблемой современной онкологии, над котороый работают многочисленные лаборатории в России и за рубежом. Большинство опубликованных по данной теме работ направлены на изменение структуры самого лекарственного средства для усиления его эффективности и уменьшения вероятности развития резистентности клетками опухолей (Elloumi J.//Recent patents on biotechnology .2012.№6.P.45).

В данной работе был использован новый подход к увеличению эффективности блокаторов рецептора ЭФР, основанный на принципе синтетической летальности. Во многих случаях причиной развития приобретенной резистентности является запуск альтернативных сигнальных путей (Jarme P.A. // Nature reviews Drug discovery. 2009. №8. P.709), поэтому в качестве основы для работы было взято устранение этого обхода. Сигнальная система клеток представляет собой огромную сеть пересекающихся путей, которые до сих пор остаются не до конца изученными. Так как спрогнозировать путь обхода клеткой опухоли блокады рецептора на современном этапе развития науки не представляется возможным, то в качестве средства поиска альтернативных путей использовались опубликованные скрининговые исследования, указывающие точечно на гены, блокада которых может усилить эффект ингибирования рецептора ЭФР (Astsaturov I. // Science signaling. 2010. №3. Р.130).

Для сужения огромных баз данных были выбраны гены, относящиеся только к пути метаболизма стеролов. Блокада биосинтеза стеролов сама по себе была описана в качестве средства профилактики опухолей (Israel М. // Mol Cancer. 2011. №10. Р.70). Кроме этого снижение уровня холестерола в мембранах клеток влияет на функционирование рецепторов факторов роста (Sigismund S. // Developmental cell. 2008. №15. Р.209). Тем не менее, клинического применения лекарства, влияющие на биосинтез стеролов, не нашли. Более того дистальный участок пути стерольного синтеза в контексте онкологических заболеваний исследован не был. Нахождение генов из данного пути, блокада которых усиливает чувствительность опухолей к ингибиторам рецептора ЭФР, поможет существенно снизить смертность от опухолей, поддерживаемых функционированием рецептора ЭФР.

Цель настоящей работы заключалась в описании механизма влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР;

2. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы;

3. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов;

4. Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

Научная новизна. В данной работе было впервые исследовано взаимодействие пути биосинтеза стеролов с сигнальным путем рецептора ЭФР. Показано, что эффект на жизнеспособность опухолевых клеток оказывает не сам факт блокады пути, а точечное ингибирование активности определенных генов, кодирующих этап С4-деметилирования предшественника холестерола. При этом было впервые описано, что эти гены контролируют такой общий клеточный процесс, как везикулярный транспорт, что не относится к их непосредственной функции. Это изменение движения везикул и является основной причиной развития опухолями сенситизации к лечению блокаторами рецептора ЭФР.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты представляют интерес для разработки новых лекарственных препаратов, которые будут усиливать эффект лечения пациентов антагонистами рецептора ЭФР, а также будут препятствовать развитию приобретенной резистентности опухолевыми клетками к данной терапии.

Кроме этого описанные взаимодействия являются крайне интересными для понимания процессов внутриклеточного везикулярного транспорта, так как описан абсолютно новый механизм модификации данного процесса посредством блокирования генов из пути биосинтеза стеролов. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения в качестве лекарственного препарата, так и с точки зрения таких теоретических дисциплин, как молекулярная биология и биохимия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование двух ферментов С4-деметилирующего комплекса из пути биосинтеза стеролов сенситизирует опухолевые клетки к блокаде рецептора ЭФР.

2. Блокада С4-деметилирования приводит к изменению внутриклеточного движения везикул, что в результате ускоряет лизосомальную деградацию рецептора ЭФР.

3. Рост ксенографтных опухолей с выключенным ферментом из пути С4-деметилирования подавляется практически полностью лечением блокаторами рецептора ЭФР.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на ежегодных конференциях «Актуальные проблемы биохимии и нанотехнологии» (Казань, 2012 и 2013), на III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012; приз за лучший устный доклад), на 50-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (Филадельфия, США, 2010), на 13-й конференции онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2011; второе место в постерной сессии), на конференции «Метаболизм и опухоль» Американской ассоциации исследования опухоли (Балтимор,

США, 2011), на конференции «Молекулярные мишени и терапия опухоли» Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Франциско, США, 2011), на I конференции университета Тэмпл (Филадельфия, США, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 2 публикации в журналах базы SCOPUS.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 141 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В экспериментах in vitro использовались клеточные линии эпидермоидной карциномы А431, сквамозных карцином SCC61, SCC68 и FaDu, немелкоклеточного рака легкого РС9. Для выключения ферментов стерольного синтеза использовалась трансфекция при помощи миРНК. Для блокады рецептора ЭФР применялись ингибитор эрлотиниб (Santa Cruz, США) и антитело цетуксимаб (FCCC, США), для стимуляции - ЭФР (Sigma-Aldrich, США). Для исследований in vivo использовались самцы мышей весом 25г линии C-B17.SCID (Jackson Laboratory, США).

Трансфекция клеток при помощи миРНК. Для проведения трансфекции использовались клетки в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 1% сыворотки теленка и L-глютамин. Для

одной лунки 6-луночного планшета 1,8 мкл миРНК (20 мкМ) смешивались с 6 мкл трансфекционного реагента HiPerfect в 96 мкл безсывороточной среды DMEM. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре раствор с образовавшимися комплексами миРНК-HiPerfect добавлялся в 1 мл 1%-ной среды DMEM с клетками до конечной концентрации миРНК 10 нМ. Через 72 часа после трансфекции происходил полный нокдаун гена и клетки были готовы для проведения экспериментов. В экспериментах с использованием блокаторов через 48 часов начала после трансфекции к клеткам добавлялись лекарственные вещества. Также через двое суток среда клеток сменялась на бессывороточную DMEM для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток.

Анализ экспрессии белка методом иммуноблотинга. Клетки сажались в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка и L-глютамин. Через 24 часа инкубации клетки стимулировались 100 нг/мл ЭФР в бессывороточной среде. По окончании стимуляции клетки помещались на лед для остановки всех внутриклеточных процессов, отмывались два раза в натрий-фосфатном буфере и лизировались в 50 мкл буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз на лунку 6-луночного планшета. Клетки соскабливались клеточным скребком и полученные лизаты помещались в пробирки. Далее лизаты центрифугировались на скорости 13,000 g в течение 30 минут для осаждения нерастворенных частиц. В полученных супернатантах измерялся уровень белка по методу Лоури, после чего концентрации белка уравнивались путем добавления лизирующего буфера в более концентрированные образцы до концентрации наиболее разбавленного. После этого лизаты кипятились в

растворе 2%-ного додецилсульфата натрия в течение пяти минут для полной денатурации белков. Полученные образцы разгонялись методом электрофореза при 120В на градиентном (4-12%) полиакриламидном геле. Белки с геля переносились на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану с помощью электроблоттинга при напряжении 30 В в течение 410 часов. Мембрана блокировалась в течение часа в блокирующем буфере Odyssey, после чего инкубировалась с первичными антителами в конечной концентрации 100 нг/мл в течение 12-24 часов при +4°С. Затем мембрана отмывалась три раза по пять минут в трис-боратном буфере, содержащим 0.05% Твин-20, и в течение часа при комнатной температуре инкубировалась с вторичными антителами, меченными флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 1 мкг/мл. После трех отмывок мембрана сканировалась на сканнере Licor Odyssey Scanner.

Анализ выживаемости клеток. Для анализа выживаемости клетки сажались в 96-луночные планшеты в концентрации 3 тысячи клеток на лунку. миРНК трансфекция проводилась описанным выше способом. Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавлялось 10 мкл среды, содержащей 10-кратное количество лекарственных веществ. После этого клетки инкубировались в течение трех дней. Через 96 часов после трансфекции к клеткам добавлось 10 мкл на лунку реагента CellTiter Blue. Живые клетки метаболизируют входящий в состав реагента ресазурин, восстанавливая его до флуоресцентного ресоруфина. Через два часа после добавления реагента флуоресценция клеток считывалась при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке.

Анализ апоптоза. Анализ клеточной гибели проводился по методу мечения апоптотических клеток красителем аннексином V. Через 48 часов после трансфекции к клеткам SCC61 в 6-луночном планшете добавлялся

эрлотиниб в рабочей концентрации. Через 72 часа клетки трипсинизировались, ресуспендировались и окрашивались аннексином V, меченным зеленой меткой, и 7-амино-актиномицмном, меченным красной меткой. Результаты считывались при помощи проточного цитометра.

Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора ЭФР. Через 72 часа после трансфекции клетки лизировались в буфере RIPA. Очищенные центрифугированием и нормализованные на уровень белка лизаты растворялись в 0.5 мл натрий-фосфатного буфера и инкубировались с 10 мкл антител к рецептору ЭФР в течение 12 часов при +4°С при постоянном вращении. Затем к лизатам добавлялось 20 мкл протеин-О-конъюгированных агарозных бус и инкубировалиьс в течение 2 часов при +4°С при постоянном вращении. Бусы осаждались центрифугированием при 3,000 g и отмывались в натрий-фосфатном буфере три раза, после чего кипятились в растворе додецилсульфата натрия в течение пяти минут для отщепления белков от бус и их денатурации. Суспензия бус центрифугировалась при 10,000 g и полученный супернатант подвергался анализу иммуноблоттингом по описанному выше протоколу. После переноса белков мембрана окрашивалась антителами к убиквитину и рецептору ЭФР в качестве контроля преципитации.

Иммунофлуоресценция н анализ колокализации сигналов. Клетки выращивались и трансфецировались в 6-луночных планшетах на стеклянных покровных стеклах. Через 48 часов после трансфекции среда клеток сменялась на бессывороточную для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток. Через 72 часа после трансфекции клетки помещались на лед и инкубировались с меченным зеленой меткой ЭФР в концентрации 200 нг/мл в течение 10 минут, после чего отмывались от несвязавшегося

лиганда в холодном натрий-фосфатном буфере, помещались в полную ростовую среду и инкубировались при +37°С для стимуляции рецептора. По окончании стимуляции клетки немедленно помещались на лед для остановки транспорта рецептора и отмывались холодным натрий-фосфатным буфером. Клетки фиксировались в натрий-фосфатном буфере, содержащим 4% формальдегида, в течение 10 минут при комнатной температуре. Все последующие процедуры выполнялись при комнатной температура. Перфорация клеточных мембран проводилась раствором 0.05%-ного тритона Х-100 в натрий-фосфатном буфере в течение 5 минут, после чего клетки блокировались в растворе 3%-ного бычьего сывороточного альбумина в натрий-фосфатном буфере в течение 30 минут. Затем клетки окрашивались по 1 часу первичными и вторичными антителами с тремя пятиминутными отмывками натрий-фосфатным буфером после каждой инкубации. Концентрация первичных антител составляла 1-2 мг/мл, вторичных антител - 2 мкг/мл. Покровные стекла приклеивались на предметные при помощи глицерола, содержащего краситель ДНК DAPI. Фотографии с полученных слайдов снимались на спектральном конфокальном микроскопе Nikon С-1 объективом с 60-кратным увеличением. Полученные снимки анализировались в программном обеспечении MetaMorph (Universal Imaging/Molecular Devices). Анализ колоколизации красного и зеленого сигналов проводился при помощи встроенного в программу приложения.

Проточная цитометрия. Клетки трипсинизировались и после подсчета разводились до конечной концентрации 10б клеток/мл в холодном натрий-фосфатным буфере, содержащим 10% сыворотки и 1% азида натрия. Все процедуры проводилиь на льду для замедления внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР. В пробирки помещалось по 100 мкл суспензии клеток и добавлялись первичные антитела до конечной

концентрации 1 мкл/мл, после чего клетки инкубировались в течение часа. Клетки отмывались от неприсоединенных антител 3 раза в натрий-фосфатным буфере с центрифугированиями со скоростью 900 g для осаждения клеток. Затем клетки инкубировались со вторичными антителами в конечной концентрации 2 мкг/мл в течение часа, после чего отмывались 3 раза в натрий-фосфатным буфере. Готовые образцы хранились при +4°С без доступа света до считывания результатов при помощи проточного цитометра.

Статистический анализ. Для статистического анализа полученных данных использовался двусторонний t-критерий Стьюдента. Статистически достоверным принималось различие при значении р<0.05. Проверка полученных выборок на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова; критерием нормальности выборки было значение р>0.10.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Увеличение чувствительности опухолевых клеточных линий к

блокаде рецептора ЭФР Для определения генов, сенситизирующих опухолевые клетки к

блокаде рецептора ЭФР, был проскринирован весь дистальный участок

пути биосинтеза стеролов. Как показано на рис. 1, выключение синтеза

только ферментов SC4MOL и NSDHL значительно увеличивает гибель

клеток А431 при лечении их ингибитором рецептора ЭФР эрлотинибом.

Аналогичные результаты были получены и на других опухолевых клеточных линиях: SCC61, SCC68, FaDu, РС9. Клетки нормального эпителия молочной железы оказались нечувствительными к блокаде, что говорит о специфическом эффекте на клетки, рост которых в значительной мере опосредуется функционированием рецептора ЭФР.

□ Контроль В Эрлотиниб, 2 мкМ

120

ё 100

с 80

З 60

І 40]

миРНК З а

Рис. 1. Клетки опухолевой линии А 4 31 увеличивают чувствительность к ингибитору рецептора ЭФР эрлотинибу только при выключении ферментов БС4МОЬ и N80111, но не других ферментов га пути биосинтеза стеролов. - контрольная миРНК, * -р<0.05.

Анализ клеточной гибели показал, что клетки гибнут механизмом апоптоза (рис. 2).

Контроль Эрлотиниб, 1мМ

-------.

миРНК: вС4 ЕгЬВЗ С1_2 ЭС4 ЕгЬВЗ

Каспаза 3

19 кДа > 17кДа ->

РАЯР р85

[З-акгин

миРНК:

С12

О и

і °

то

16%

Ш:

Аннексии V-

_5С4МОк.

11%

37%

Рис. 2. Удаление метиоксидазы БС4МОЬ с одновременной блокадой рецептора ЭФР эрлотинибом вызывает апоптотическую гибель клеток опухолевой линии А431. Маркеры апоптоза: расщепление каспазы 3 и индукция белка РАЯР, измеренные методом иммуноблотинга (А) и увеличение количества аннексии V-положительных клеток, измеренное методом проточной г\итофлуориметрии(Б).

Выключение других ферментов не оказало влияния на чувствительность к лекарству. Ферменты 8С4МОЬ и ^ОНЬ катализируют одну комплексную реакцию отщепления метальной группы

от 4 атома углерода предшественника холестерола. Это позволяет предположить, что решающим фактором сенситизации клеток к блокаде рецептора ЭФР является не само выключение генов, а остановка синтеза стеролов на определенном этапе - С4-деметилировании стеролов.

Специфичность эффекта к антагонистам рецептора ЭФР

На клеточной культуре А431 было установлено, что выключение БС4МОЬ и ШОНЬ увеличивает чувствительность клеток только к лекарственным веществам, блокирующим функционирование рецептора ЭФР (рис. 3).

120

миРНК: □ в12

и всдмоц

и^ццм

¿г

-о-

& <5

Рис. 3. Удаление ферментов 8С4МОЬ и №ОНЬ в клетках опухолевой линии А431 приводит к увеличению их чувствительности только по отношению к антагонистам рецептора ЭФР: эрлотинибу, дасатинибу и цетуксимабу, но не блокаторам других рецепторов или сигнальных путей. * -р<0.05 по сравнению с контрольными клетками.

Остановка стерольного пути на этапе С4-деметилирования увеличило чувствительность клеток к следующим веществам: низкомолекулярному ингибитору рецептора ЭФР эрлотинибу, неспецифическому ингибитору рецептора дасатинибу и антителу против рецептора цетуксимабу. При этом ответ на лечение блокаторами других рецепторов и сигнальных путей остался неизмененным. Это указывает на специфичность эффекта

как в отношении места блокады стерольного пути, так и в отношении мишени, к которой возникает сенситизация.

Изменение стерольного профиля клеток при блокаде стерольного

пути на различных участках На рис. 4 представлены данные по изменению стерольного состава клеток А431, измеренному методом хромато-масс-спектрометрии, после блокады пути биосинтеза стеролов на разных его этапах: три фермента, участвующих в С4-деметилировании (БС4МОЬ, Н8017В7, С140гП) и СУР51А1 - фермент, катализирующий реакцию на два шага выше С4-деметилирования.

Так как путь биосинтеза стеролов является полностью необратимым, то при выключении указанных ферментов в клетках накапливались специфические для данного этапа пути метаболиты и снижалось содержание нижестоящих метаболитов, в том числе и самого холестерола. В частности, удаление БС4МОЬ приводило к существенному накоплению метилированных стеролов, в норме отсутствующих в клетках. Полученные данные позволили предположить, что изменение стерольного состава является ключевым фактором, влияющим на изменение чувствительности опухолевых клеток к антагонистам рецептора ЭФР.

Добавление нижестоящих метаболитов

Так как при выключении БС4МОЬ и ШЭНЬ падал общий уровень холестерола, то для начала было решено проверить, уменьшатся ли наблюдаемые эффекты при добавлении нижестоящих метаболитов: ланостерола и холестерола. На рис. 5 показано влияние добавления указанных стеролов на жизнеспособность клеток А431 и их сенситизацию к ингибитору рецептора ЭФР эрлотинибу

а е в1

с: Ъ В о

¡к | <Н

* О і 11161

1 "

сг

2 &

5 а

2 с 20

» <3> О Ю О. Т_

ь | ю

МиРНК

І.ІІ. Пии ІІІІІ

Рис. 4. Стеролъный профиль клеток после удаления указанных ферментов при помощи миРНК интерференции, измеренный методом хромато-масс-спектрометрии. Удаление фермента приводит к накоплению соответствующего метаболита и снижению уровней нижестоящих стеролов. СЬ2 -контрольная миРНК.

Исследование механизма сенситизации Описанные выше данные позволяют связать развитие сенситизации с изменением состава стеролов в мембранах клеток. Для определения ключевого фактора в развитии сенситизации был проведен ряд экспериментов по модификации стерольного состава клеток.

Холестерол,мкг/мл О

120 Q Контроль М Эрпотиниб, 2мМ

Ланостерол,мкг/мл

миРНК GL2

Рис. 5. Добавление холестерола и

ланостерола не влияет на жизнеспособность и чувствительность к эрлотинибу клеточной линии А431 при удалении метшоксидазы 8С4М01. Ы2 контрольная миРНК, * -р<0.05 по сравнению с соответствующей колонкой в контрольных клетках

Добавление ланостерола и холестерола не оказало значительно влияния на жизнеспособность и сенситизацию клеток. Таким образом, снижение уровня нижестоящих стеролов не является причиной появления описываемых эффектов.

Добавление метилированных стеролов Далее была проверено, воспроизведутся ли эффекты удаления SC4MOL и NSDHL при добавлении к клеткам метилированных по 4 атому углерода стеролов. Для этого были взяты непосредственный субстрат реакции С4-деметилирования T-MAS и FF-MAS, отличающий ненасыщенной связью при 14 атоме. Результат добавления T-MAS к различным опухолевым линиям показан на рис. 6.

% живых клеток м Л ОТ т о э о о о о о І і 3 о і 1 д. О I .............................................................Н ■ о Контро Эрлоти N. е> л н 1б 8 о I о 0 1 I І

T-MAS, 4мкг/мп SCC25 f + SCC61 - + А431 4 SCC68 FaDt + PCS

Рис. 6. Эффект добавления Т-МАБ на жизнеспособность и чувствительность опухолевых клеточных линий к блокаде рецептора ЭФР эрлотинибом (1 мМ). Над колонками указан индекс сенситизации для данной клеточной линии. Значительное увеличение чувствительности наблюдалось только на клеточной линии БСС25, но не на других линиях.

Для двух из шести клеточных линий (8СС25 и БССбІ) Т-МАБ показал значительную сенситизацию к эрлотинибу. Тем не менее, для большинства линий метаболит не оказал существенного влияния.

РР-МАБ оказался токсичным для клеток (рис. 7). В результате высокой токсичности оказалось невозможным оценить сенситизирующий эффект при добавлении РР-МАБ. Тем не менее, сам факт токсичности метаболита оказался крайне интересным, так как до настоящего времени РР-МАБ был описан только в качестве индуктора процессов мейоза.

0 А431 |

м SCC61 |

FaDu

—0— Detroit j

—*— РС9 [

—й— SCC25 j

0 12 3

FF-MAS, мкг/мл

Рис. 7. Эффект добавления FF-MAS на

жизнеспособность опухолевых клеточных

линий. Для всех линий, кроме А431, FF-MAS оказался токсичным.

Эффекты Т-МАБ и БР-МАБ оказались сильнее выражены в клеточных линиях с наименьшей экспрессией рецептора ЭФР. Клетки А431, несущие амплификацию гена рецептора, оказались практически нечувствительны к добавлению метаболитов. Это указывает на опосредованность эффекта функционированием рецептора ЭФР. Тем не менее, в целом непосредственное добавление метаболитов не воспроизводит полностью эффекта блокады стерольного пути, что может быть объяснено различной концентрацией стеролов внутри клетки и различием в их локализации при экзогенном добавлении и внутреннем накоплении при блокаде синтеза.

Карта взаимодействий ортолога гена 8С4МОЬ в дрожжах 8асскатотусс$ сетех'тае

В связи с малым количеством информации о функции и взаимодействиях гена ЕС4МОЬ в человеке и в связи с тем, что путь биосинтеза стеролов является высоко консервативным среди всех эукариот, для понятия механизма влияния на рецептор ЭФР был проведен анализ взаимодействий эволюционно консервативного гомолога (ортолога) гена БС4МОЬ в дрожжах - ЕЯС25. Результат этого анализа представлен на рис. 8.

Помимо основной функции в процессах синтеза и метаболизма Е1Ю25 активно вовлечен в процессы внутриклеточного везикулярного транспорта. Это дает основания предположить схожие функции гена БС4МОЬ в клетках человека. Таким образом, нарушение функции гена может приводить к изменению движения везикул, содержащих рецептор ЭФР, и этим может опосредоваться эффект удаления метилоксидазы на функционирование рецептора.

Рис. 8. Карта генетических и физических взаимодействий гена ЕЯС25 (ортолога 8С4МОЬ) в дрожжах БассИаготусез сегеу'мае согласно базе данных ВюСпс1. Взаимодействующие гены поделены по выполняемым функции. Цифрами указано количество генов в группе. 28% всех взаимодействий гена приходится на везикулярный транспорт._

синтез и метаболизм 69

везикулярный транспорт 52

митохондрии 19

транспортеры 17

неизвестные функции

другие функции 21

Влияние удаления $С4МОЬ на внутриклеточный транспорт рецептора ЭФР

Общее распределение эндосом с рецептором ЭФР В нормальных условиях после активации рецептор ЭФР фосфорилируется и подвергается интернализации, попадая сначала в ранние эндосомы. Затем одна часть рецептора переходит в рециклирующие эндосомы и возвращается на поверхность клетки, а другая часть попадает в поздние эндосомы для последующей деградации в лизосомах.

01.2 8С4МОЬ

расстояние от ядра, рлкм

Рис. 9. Везикулы, содержащие фосфоршированный рецептор ЭФР (рЕйЕИ.), находятся ближе к ядру в клетках с удаленной метилоксидазой БС4МОЬ после стимуляции лигандом в течение 15 минут. Сверху-оригинальные фотографии контрольных клеток (йЬ2) и клеток с отсутствием БС4МОЬ с окрашенными ядром (синий) и эндосомами с фосфорилированным ре11етпором ЭФР (красный); снизу - среднее распределение везикул, измеренное на 100 клетках._

Иммунофлуоресцентная окраска эндосом, содержащих рецептор ЭФР, показала различие в распределении рецептора после его активации лигандом в клетках с выключенным БС4М0Ь по сравнению с контрольными клетками (рис. 9). Везикулы с рецептором ЭФР находятся значительно ближе к ядру в клетках с выключенным ферментом. Эти данные подтверждают гипотезу о влиянии гена БС4МОЬ на движение и локализацию эндосом.

Для подробной характеристики изменения везикулярного транспорта была проведена серия экспериментов по измерению вхождения рецептора

в ранние, рециклирующие и поздние эндосомы. Для этого производилась иммунофлуоресцентная окраска рецептора ЭФР и исследуемых эндосом, после чего измерялся процент колокализации этих двух сигналов.

Вхождение рецептора ЭФР в ранние эндосомы

Для визуализации ранних эндосом использовался специфический маркер ЕЕА1. После активации рецептора ЭФР лигандом измерялось его вхождение в ранние эндосомы в клетках с выключением различных ферментов (рис. 10).

(8 £ 50

V о 40

=г,

Г) 30

т-

2¡ 20

ffl 10

ш 0

миРНК:

-о— GL2 -«— CYP51A1 -é— SC4MOL -О— SC4MOL+CYP51A1 NSDHL

180

время стимуляции (минуты)

Рис. 10. Вход рецептора ЭФР в ранние эндосомы не изменяется при удалении ферментов пути биосинтеза стеролов

посредством миРНК трансфекции. йЬ2 -контрольная миРНК.

Как видно из графика, блокада пути биосинтеза стеролов на различных этапах не влияет на вход рецептора ЭФР в ранние эндосомы.

Вхождение рецептора ЭФР в рециклирующие эндосомы

В качестве маркера рециклирующих эндосом использовался белок Rabil. Как видно из рис. 11, клетки с удаленным SC4MOL или NSDHL имеют значительно меньшую часть рецептора ЭФР в рециклирующих эндосомах. Это свидетельствует о том, что при выключении этих ферментов количество рецептора, возвращающего на поверхность клетки сразу после интернализации, уменьшается.

миРНК: GL2

CYP51A1

¥urm А,'-.• ' .''(

; У ' '"Ji ШІ • ."» ™Jf ,.: ■ * ■ ib'' ' - [ v • * ■ ■ * - '

cSF 39 «.-и Rab11

(J Q без стимуляции

2 I стимуляция 30 мин

миРНК: GL2 CYP51A1 SC4MQL

Рис. ¡1. Количество рецептора ЭФР в рециклирующих эндосомах снижается после удаления ферментов SC4MOL и NSDHL посредством миРНК трансфекции. Сверху - иммунофлуоресцентные картинки со стимуляцией клеток А431 меченым зеленым красителем ЭФР (EGF) в течение 30 минут и окраской рециклирующих эндосом (Rabí 1) красным; стрелками указаны места наложения сигналов. Снизу - процент колокализации зеленого и красного сигналов в образцах. GL2 -контрольная миРНК, *-р<0.05 по сравнению с соответствующей колонкой в контрольных клетках.

Вхождение рецептора ЭФР в поздние эндосомы

Маркером поздних эндосом служил Г1аЬ7. Анализ колокализации рецептора с поздними эндосомами показал обратную ситуацию. В случае ингибирования БС4МОЬ и ШОНЬ в поздних эндосомах после стимуляции лигандом в течение 30 минут содержалось большее количество рецептора, чем в контрольных клетках (рис. 12).

Все описанные данные показывают, что блокада С4-деметилирующих ферментов изменяет движение рецептора ЭФР из пути рециклирования в сторону поздних эндосом. Поздние эндосомы переходят с лизосомы, в которых происходят процессы деградации белков, что в нашем случае свидетельствует об увеличении деградации рецептора

кар йаЬ7

X 1 75 О 0 1 Я 50 £ л * 25 О и, О ш о) вр миРНК: * & —0—С1_2 —А— 5С4МОІ-—#—^ОНІ. 1Г ¿ЙГ^ ^Чі —в— СУР51А * 0 30 60 >емя стимуляции (минуты)

Рис. 12. Количество рецептора ЭФР в поздних эндосомах увеличивается после удаления ферментов 8С4МОЬ и ТУЖ/Я. посредством миРНК трансфекции. Сверху — иммунофлуоресцентные картинки со стимуляцией клеток А431 меченым зеленым красителем ЭФР (ЕСР) в течение указанного времени и окраской поздних эндосом (ЯаЬ7) красным; стрелками указаны места колокализации. Снизу - процент колокализации зеленого и красного сигналов в образцах. С12 - контрольная миРНК, *-р<0.05 по сравнению с соответствующим значением в контрольных клетках.

Деградация рецептора ЭФР

Для анализа деградации рецептора ЭФР использовалась клеточная линия БССб 1. После активации рецептора лигандом в течение указанного времени клетки лизировались и подвергались иммуноблоттингу (рис. 13).

Рис. 13. Ускорение деградации рецептора ЭФР и его корецепторов в клетках с удаленным 8С4МОЬ после стимуляции лигандом в течение указанного времени, измеренная методом иммуноблотинга. Оригинальный тииуноблот с указанными интенсивностями соответствующих сигналов (А) и количественный обсчет иммуноблота, нормализованный на уровень рецептора в контрольных клетках. йЬ2 - контрольная миРНК, *-р<0.05 по сравнению с соответствуюгцим значением в контрольных клетках._

д ЕСР, часы: ЕЄРЯ

ЕгЬВ2

ЕгЬВЗ

Е-хадгенрин

а-тубулин

В контрольных клетках при стумуляции лигандом в течение 4 часов наблюдается деградация примерно 50% рецептора по сравнению с исходным уровнем. В клетках с удаленным БС4МОЬ за такое же время стимуляции деградировало 80% рецептора. Кроме самого рецептора ЭФР ускоренной деградации подвергались его корецепторы ЕЛВ2 и ЕЯВЗ, образующие гетеродимеры с ЕОРЯ на поверхности клеток. Уровень другого мембранного белка Е-кадгерина, не взаимодействующего с рецептором ЭФР, при ингибировании БС4МОЕ не менялся.

Изменение сигнальной активности рецептора ЭФР Главными стимуляторами онкогенного процесса являются белки АКТ и МАР-киназа ЕЯК, поэтому для описания сигнальной активности рецептора были выбраны эти две киназы и их нижестоящие эффекторы (рис. 14).

ЕСР. часы:

ЕОРІ* рУ1173

ЕСРИ

АКТ рЭ473 АКТ рТЗОв

АКТ

ЕЯК рТ202/У204

ЕЯК

56К рТ389 4Е-ВР1 РТ37І46 а-тубулин

0 12 4 0 БС4МОІ- 12 4

«мц ЮТ* ттт т- ♦ ■

'ЩШ' Црі ■ :|:#8;

ттт тт - МММш

»«в«»-

.......... — —■ ~

ї і ЦЦ \

Рис. 14. Лиганд-индуцированная сигнальная активность рецептора ЭФР в клетках БССбІ снижается при удалении 8С4МОЬ посредством миРНК интерференции. Оригинальный иммуноблот (А) и количественный обсчет интенсивностей сигналов иммуноблота, нормализованных на уровень а-тубулина (Б). - контрольная миРНК, * -р<0.05 по сравнению с соответствующим значением в контрольных клетках.

миРНК: О СІ.2 ■ ЭСДМО!.

рТ202/У204-ЕРК

0 2 4

рТ37/4Є-4ЕВР1

рв473-АКТ

время с ЭФР 100 нг/мл, часы

Клетки с удаленной метилоксидазой БС4МОЬ имели значительно сниженный уровень фосфорилирования как самого рецептора ЭФР, так и его сигнальных эффекторов ЕЯК и АКТ (по остатку серина 473), а также двух киназ из пути тТСЖ: Б6К и 4Е-ВР1. Это свидетельствует об общем

подавлении митогенной активности и снижении биосентетических

процессов.

Влияние на рост ксенографтных опухолей у мышей Для использования клеток в экспериментах in vivo для начала была получена линия клеток А431 со стабильным нокаутом гена SC4MOL. Для этого была проведена вирусная трансфекция двумя плазмидами, содержащими малую шпилечную РНК (мшРНК) против различных участков мРНК гена SC4MOL. Обе клеточные линии с мшРНК, как и линии после трансфекции миРНК (рис. 1), имели повышенную чувствительность к антагонистам рецептора ЭФР (рис. 15).

* й о О

£ Я о о

к <Л

•ЯЦг

Рис. 15. Клетки А431 с мшРНК против 8С4М01 имеют повышенную чувствительность с антагонистам рецептора ЭФР. Подтверждение удаления белка методом иммуноблотинга (А) и выживаемость клеток после лечения эрлотинибом (Б) и цетуксимабом (В). *-р<0.05 по сравнению с соответствующим значением в контрольных клетках._

После подкожной инъекции данных клеток мышам ЭСГО в течение недели наблюдалось образование опухолей. Мыши были разделены на группы с лечением антителом против рецептора ЭФР цетуксимабом и без лечения. Цетуксимаб вводился внутрибрюшинно два раза в неделю в течение трех недель. Измерения опухолей проводились два раза в неделю. Результаты измерений приведены на рис. 16.

О контроль ■ SC4MOL-1 SC4MOL-2

О S

SC4MOL

100

цетуксимаб, 5 мкг/мл

А431 кон

эрлотиниб, мкМ

Рис. 16. Рост ксенографтных опухолей с нокаутом БС4МОЬ значительно подавлен как без лечения, так и при лечении цетуксимабом. Стрелками указаны дни инъекций. * — р<0.05 по сравнению с соответствующим значением в контрольных опухолях_

Без лечения контрольные опухоли в течение двух недель достигали больших размеров (более 200 см3). Опухоли с нокаутом гена БС4МОЬ без лечения росли примерно в два раза медленней, но, тем не менее, постоянно увеличивались в объеме. Лечение антителом против рецептора ЭФР цетуксимабом значительно замедляло рост контрольных опухолей, но после окончания лечения их рост увеличивался. При лечении БС4МОЬ-дефицитных опухолей цетуксимабом опухоли развивались значительно медленней как во время, так и после лечения и после достижения определенного минимального объема переставали расти.

ВЫВОДЫ

1. Удаление ферментов БС4МОЬ и ИБОНЬ, катализирующих реакцию С4-деметилирования на дистальном участке пути биосинтеза стеролов, значительно сенситизирует опухолевые лини А431, 8СС61, БСС68 и РС9 к воздействию антагонистов рецептора ЭФР эрлотинибу и цетуксимабу. Это данные подтвердились как при проведении

миРНК трансфекции клеток, так и при использовании мшРНК против соответствующих генов.

2. Биоинформативный анализ генетических и физических взаимодействий ортолога гена БС4МОЬ в БассЬагошусез сегеу1з1ае показал, что 28% всех взаимодействий приходится на гены, регулирующие внутриклеточный везикулярный транспорт.

3. Удаление ферментов БС4МОЬ и ^ЭЛЬ в клеточной линии БСС61 приводит к изменению внутриклеточного транспорта рецептора ЭФР, направляя его преимущественно в сторону деградации. Это уменьшает общий активный пул рецептора, приводя к снижению активности основных онкогенных сигнальных путей.

4. Ксенографтные опухоли с удаленным ферментом 8С4МОЬ растут значительно медленней без лечения по сравнению с контрольными клетками и полностью останавливают рост при лечении цетуксимабом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск новых мишеней для лекарственного воздействия является сложной задачей. В данной работе был применен подход с использованием явления синтетической летальности для нахождения способа увеличения эффективности блокаторов рецептора ЭФР. Это привело к описанию гена БС4МОЬ, кодирующего метилоксидазу из пути биосинтеза стеролов, в качестве мишени, блокада которой приводит к существенному увеличению чувствительности опухолевых клеток к ингибитору рецептора ЭФР эрлотинибу.

Было показано, что удаление 8С4МОЬ изменяет внутриклеточное движение рецептора ЭФР, направляя его в сторону деградации. Это приводит к снижению активного пула рецептора и, как результат, к

подавлению его сигнальной активности, что для опухолевых клеток оказывается катастрофическим. Такие клетки сначала замедляют рост, а затем начинают погибать механизмом апоптоза, который является самым благоприятным способом гибели нежелательных клеток в организме. Полученные данные позволяют предположить успешное применение ингибирования метилоксидазы SC4MOL на людях.

Таким образом, описанный в данной диссертационной работе способ увеличения эффективности блокаторов рецептора ЭФР может в последующем использоваться в клинической практике для терапии опухолей, ассоциированных с активностью рецептора ЭФР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горин, А. О. Блокада биосинтеза холестерола на этапе С4-деметилирования сенситизирует опухолевые клетки к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста / А. О. Горин, 3. И. Абрамова // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. Науки. - 2012. -Т. 154-кн.2.-С. 33-41.

2. Gorin, A. Regulation of cholesterol biosynthesis and cancer signaling / A. Gorin, L. Gabitova, I. Astsaturov // Current Opinion in Pharmacology -2012.-Vol. 12(6).-P. 710-716.

3. Sukhanova, A. L. Targeting C4-demethylating genes in the cholesterol pathway sensitizes cancer cells to EGF receptor inhibitors via increased EGF receptor degradation / A. L. Sukhanova, A. Gorin, I. G. Serebriiskii, L. Gabitova, H. Zheng, D. Restifo, B. Egleston, et al. // Cancer Discovery - 2013. - Vol. 3 (1). - P. 96-111.

4. Горин, А. О. Блокада внутриклеточного синтеза холестерола на этапе С4-деметилирования ингибирует опухолевый рост in vivo / А. О. Горин, JI. Р. Габитова, 3. И. Абрамова // Здоровье человека в XXI

веке: сб. научных статей. С.С. - Казань: Изд-во Казанского Медицинского Университета - 2012. - С. 452-456.

5. Горин, А. О. Блокада С4-деметилирования пути биосинтеза холестерола сенситизирует опухолевые клетки блокаторам рецептора эпидермального фактора роста / А. О. Горин, 3. И. Абрамова // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: сб.трудов II Межд. Интернет-конференции. T.I. - Казань: изд-во Казанский университет. - 2012. - С. 87-89.

6. Gorin, A. The C4-demethylating genes in the cholesterol pathway regulate epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor response by targeting EGFR to degradation / A. Gorin, A. L. Sukhanova, H. Zheng, T. Bagnyukova, I. G. Serebriiskii, D. Cunningham, L. E. Cratz, L. M. Weiner, R. I. Kelley, G. E. Herman, E. A. Golemis, I. A. Astsaturov // Materials of 50th annual meeting of American Society for Cell Biology. Philadelphia, PA. - 2010. - p.49.

7. Gorin, A. Targeting cholesterol pathway genes sensitizes cancer cells to EGFR inhibitors / A. Gorin, A. L. Sukhanova, H. Zheng, T. Bagnyukova, I. G. Serebriiskii, D. Cunningham, L. E. Cratz, L. M. Weiner, R. I. Kelley, G. E. Herman, E. A. Golemis, I. A. Astsaturov // Fox Chase Cancer Center 13th Annual Postdoctoral and Graduate Student Research Conference. Philadelphia, PA. - 2011. - P. 50.

8. Gorin, A. Targeting C4-demethylating genes in the cholesterol pathway sensitizes cancer cells to EGFR inhibitors via increased EGFR degradation / A. Gorin, A. L. Sukhanova, E. A. Golemis, I. A. Astsaturov, H. Zheng, I. G. Serebriiskii, B. Egleston, D. Cunningham, G. E. Herman, L. E. Cratz, R. I. Kelley, L. M. Weiner // Metabolism and Cancer Conference of American Association for Cancer Research. Baltimore, MD. - 2011. - P. 78.

9. Gorin, A. Targeting cholesterol pathway genes sensitizes cancer cells to EGFR inhibitors / A. Gorin, A. L. Sukhanova, L. Gabitova, H. Zheng, D. Restifo, T. Bagnyukova, I. G. Serebriiskii, D. Cunningham, L. E. Cratz, L. M. Weiner, R. I. Kelley, G. E. Herman, E. A. Golemis, I. A. Astsaturov // Molecular Targets and Cancer Therapeutics International Conference of American Association for Cancer Research. San-Francisco, CA.-2011.

10. Горин, А. О. Блокада С4-деметилирования пути биосинтеза холестерола сенситизирует опухолевые клетки к блокаторам рецептора ЭФР / А. О. Горин, 3. И. Абрамова // III Межд. научно-практ. конференция "Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли". Материалы конференции - Казань: ИД "Меддок" - 2012. - С. 34-36.

11. Горин, А. О. Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста / А. О. Горин, JI. Р. Габитова, 3. И. Абрамова // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: сб.трудов III Межд. Интернет-конференции. T.I. - Казань: изд-во Казанский университет. —2013. — С. 102.

420008, Казань, ул. Кремлевская, д.18, главное здание КФУ к.104, отдел аттестации научных кадров, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru

Подписано в печать:

16.05.2013

Заказ № 8493 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горин, Андрей Олегович, Казань

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На праваэ^рукописи

04201360018 ~

Горин Андрей Олегович

Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам

рецептора эпидермального фактора роста

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.

Казань 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................4

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................9

1.1 Злокачественные опухоли и механизм их образования.....................9

1.2 Рецептор эпидермального фактора роста и его роль в клетках опухолей.................................................................................................................11

1.2.1 Строение рецептора эпидермального фактора роста....................12

1.2.2 Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста........15

1.2.3 Путь эндоцитоза и деградации рецептора эпидермального фактора роста..........................................................................................16

1.2.4 Блокаторы рецептора эпидермального фактора роста.................20

1.3 Исследование взаимодействия сигнальных путей при помощи синтетической летальности............................................................22

1.4 Биосинтез стеролов их роль и в клетках......................................25

1.4.1 Путь биосинтеза стеролов.......................................................26

1.4.2 С4-деметилирующий комплекс................................................30

1.5 Метаболизм стеролов и опухоли................................................30

1.6 Заключение............................................................................32

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................33

2.1 Реактивы и оборудование.........................................................33

2.2 Объекты исследования.............................................................35

2.2.1 Объекты исследования in vitro................................................35

2.2.2 Объекты исследования in vivo.................................................36

2.3 Трансфекция клеток с помощью малой интерферирующей РНК.....36

2.4 Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга...................37

2.5 Анализ выживаемости клеток...................................................38

2.6 Анализ апоптоза......................................................................39

2.7 Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора ЭФР..........................................................................................39

2.8 Иммунофлуоресценция и анализ колоколизации сигналов.............40

2.9 Проточная цитометрия............................................................41

2.10 Статистический анализ...........................................................42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................43

3.1 Увеличение чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста........................................43

3.2 Изменение стерольного профиля клеток при блокаде биосинтеза стеролов на различных участках....................................................50

3.3 Влияние добавления метаболитов на жизнеспособность клеток......53

3.4 Карта взаимодействий ортолога гена 8С4МОЬ в дрожжах ЗассИагошусев сегеуівіае................................................................56

3.5 Влияние блокады биосинтеза стеролов на эндоцитоз и деградацию рецептора эпидермального фактора роста........................................58

3.6 Влияние блокады биосинтеза стеролов на сигнальную активность рецептора ЭФР............................................................................67

3.7 Влияние блокады биосинтеза стеролов на рост ксенографтных

опухолей у мышей........................................................................69

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................71

ВЫВОДЫ...................................................................................77

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................78

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

^ЭНЕ - ЫАО(Р)-81его1с1-ёеЬус1го§епа8е-Нке - декарбоксилаза из С4-

деметилирующего комплекса

РАКР - поли(АДФ-рибоза)-полимераза

8С4МОЬ - 81его1-С4-шеЛу1-охуёа8е-Нке - С4-метилоксидаза из С4-деметилирующего комплекса ГМГ - З-гидрокси-З-метилглутарил ЭФР - эпидермальный фактор роста

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), стимулирующий деление клеток после активации факторами роста. Это привело к созданию многочисленных блокаторов этого рецептора, которые показали хорошие результаты при исследованиях in vitro (Jimeno and Hidalgo, 2005; Laskin and Sandler, 2004). Однако в клинической практике блокада рецептора ЭФР оказалась значительно ниже предполагаемой вследствие развития опухолями первичной или приобретенной резистентности к используемым препаратам (Hopper-Borge et al., 2009).

В данной работе был использован новый подход к увеличению эффективности блокаторов рецептора ЭФР. Во многих случаях причиной развития приобретенной резистентности является запуск альтернативных сигнальных путей, поэтому в качестве основы для работы было взято устранение этого обхода. Сигнальная система клеток представляет собой огромную сеть пересекающихся путей, которые до сих пор остаются не до конца изученными. Так как спрогнозировать путь обхода клеткой опухоли блокады рецептора на современном этапе не представляется возможным, то в качестве средства поиска альтернативных путей использовались

опубликованные скрининговые исследования, указывающие точечно на гены, которые при их блокаде могут усилить эффект ингибирования рецептора ЭФР (Astsaturov et al., 2010).

Для сужения огромных баз данных были выбраны гены, относящиеся только к пути метаболизма стеролов. Блокада биосинтеза холестерола сама по себе была описана в качестве способа замедления роста опухоли (Israel and Schwartz, 2011), и вместе с сенситизирующим эффектом к ингибиторам рецептора ЭФР может оказаться эффективным средством в терапии опухолей.

В соответствии с вышеизложенным в данной работе была поставлена цель - описать механизм влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР.

2. Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы.

3. Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов.

Научная новизна

В данной работе было впервые исследовано взаимодействие пути биосинтеза стеролов с сигнальным путем рецептора ЭФР. Показано, что эффект на жизнеспособность опухолевых клеток оказывает не сам факт блокады пути, а точечное ингибирование активности определенных генов, кодирующих этап С4-деметилирования предшественника холестерола. При этом было впервые описано, что эти гены контролируют такой общий клеточный процесс, как везикулярный транспорт, что не относится к их

непосредственной функции. Это изменение движения везикул и является основной причиной развития опухолями сенситизации к лечению блокаторами рецептора ЭФР. Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты представляют интерес для разработки новых лекарственных препаратов, которые будут усиливать эффект лечения пациентов антагонистами рецептора ЭФР, а также будут препятствовать развитию приобретенной резистентности опухолевыми клетками к данной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование двух ферментов С4-деметилирующего комплекса из пути биосинтеза стеролов увеличивают чувствительность опухолевых клеток к блокаде рецептора ЭФР.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на ежегодных конференциях «Актуальные проблемы биохимии и нанотехнологии» (Казань, 2012 и 2013),

на III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012; приз за лучший устный доклад), на 50-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (Филадельфия, США, 2010), на 13-й конференции онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2011; второе место в постерной сессии), на конференции «Метаболизм и опухоль» Американской ассоциации исследования опухоли (Балтимор, США, 2011), на конференции «Молекулярные мишени и терапия опухоли» Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Франциско, США, 2011), на I конференции университета Тэмпл (Филадельфия, США, 2012). Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 2 публикации в журналах базы SCOPUS. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 141 наименование.

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Злокачественные опухоли и механизм их образования

Злокачественные опухоли составляют около 15% всех причин смертности и стоят на втором месте по этому показателю после сердечнососудистых заболеваний. В 2010 году в России было зарегистрировано более 500 тысяч новых случаев злокачественных новообразований и 290 тысяч связанных с ними смертей. При этом за последние десять лет число случаев появления опухолей выросло более, чем на 15% [Чиссов и др., 2011]. Таким образом, проблема онкологических заболеваний является крайне актуальной для России в настоящее время.

Опухоль - это патологический процесс, представленный новообразованной тканью, в которой изменения генетического аппарата приводит к нарушению регуляции роста и дифференцировки клеток. Злокачественные опухоли являются наихудшим течением заболевания, которое характеризуется клеточным и тканевым атипизмом, наличием малодифференцированных клеток, быстрым инфильтрирующим ростом, склонностью к метастазированию и рецидивированию, что в совокупности негативно влияет на общее состояние организма. Опухоль является генетическим заболеванием, те есть для ее образования необходимым событием является мутация. При этом нарушается функционирование генетического аппарата, регулирующего деление и дифференцировку клетки. К формированию опухолевой клетки могут привести мутации, активирующие онкогены или подавляющие гены-супрессоры опухолей. Онкогенами называются гены, повышение активности которых приводит к злокачественной трансформации клетки. В обычном, неактивном, состоянии такие гены называются протоонкогенами. В результате генетических изменений, приводящих в активирующей мутации или гиперпродукции этих генов, происходит стимуляция клеточного деления. К онкогенам относятся гены факторов роста и их рецепторов, белков МАР-киназного каскада и ряд

других генов. Гены-супрессоры опухолей, также называемые антионкогенами, являются отрицательными регуляторами клеточного деления. Они сдерживают чрезмерную стимуляцию деления, поэтому их функционирование необходимо для нормальной жизнедеятельности клетки. Потеря их функции ведет к злокачественному перерождению клеток, то есть их малигнизации. Основными генами-супрессорами опухолей являются ТР53 и RB, регулирующие клеточный цикл, и PTEN, ингибирующий митогенные пути рецепторов факторов роста.

Канцерогенез, процесс образования опухоли, начинается с исходной мутации в одной клетке. Причиной этой мутации может быть химическое, физическое или вирусное воздействия. В результате такая клетка получает преимущество в делении перед соседними, что приводит к образованию все большего числа клонов, несущих мутацию. Важным отличием опухолевых клеток от нормальных является геномная нестабильность, развивающаяся в результате дефектов в системах репарации ДНК (Lengauer et al., 1998; Martin et al., 2010). В результате этого увеличивается вероятность появления новых, вторичных, мутаций, которые могут также оказаться онкогенными и придать данной клетке дополнительное преимущество в делении. Таким образом, каждая опухоль приобретает специфический набор мутаций.

Классическим средством для терапии опухолей с 1940-х гг. являются цитотоксические препараты, которые представляют собой ДНК-повреждающие агенты (Чу и др., 2008). Так как в клетках опухолей нарушены процессы репарации, то они становятся более чувствительными к повреждению ДНК, чем нормальные клетки. Тем не менее, этого небольшого воздействия на нормальные клетки достаточно для развития сильных побочных эффектов. Для более специфического эффекта в последние годы все шире применяется таргетная терапия, воздействующая на определенную молекулярную мишень данной опухоли (Имянитов, 2010; Hortobagyi, 2004). Таргетная терапия подбирается индивидуально для каждого случая опухоли, исходя из обнаруженных генетических изменений. При этом существенно

снижается количество побочных эффектов, так как таргетные лекарства не воздействуют на нормальные клетки, не несущие мутаций. К таргетным препаратам относятся блокаторы рецепторов факторов роста, мутантных белков, онкогенных сигнальных молекул и ряд других. Особенно эффективными таргетные препараты оказываются в случае опухолей, несущих только одну мутацию, так как блокада одной мишени останавливает патологическое стимулирование деления.

Но, несмотря на большие достижения за 60 лет исследований, современный уровень лечения онкологических заболеваний остается далеким от идеального. Смертность от опухолей остается на крайне высоком уровне, причем заболеваемость с каждым годом растет. Для большинства опухолей 5-летняя выживаемость пациентов не превышает 30% даже при использовании комбинаций препаратов разных классов (Smyth and Cunningham, 2012). Таким образом, разработка новых видов лекарств и улучшение эффективности существующей терапии онкологических заболеваний является одной из первостепенных задач современной медицины.

1.2 Рецептор эпидермального фактора роста и его роль в клетках

опухолей

Сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) является ключевым механизмом передачи сигналов, регулирующих рост, пролиферацию, дифференцировку, адгезию, миграцию и деление клеток. Этот рецептор экспрессируется на плазматической мембране большинства клеток человека и представляет собой трансмембранный рецепторный гликопротеин с молекулярной массой 170 кДа, обладающий активностью тирозиновой киназы. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста у всех позвоночных включает в себя четыре представителя: собственно рецептор ЭФР (EGFR, HERI, ErbBl), ErbB2 (HER2), ЕгЬВЗ (HER3) и ErbB4 (HER4) (Ferguson et al., 2003; Yarden, 2001).

Так как сигнальная активность рецептора ЭФР регулирует ключевые морфогенетические процессы в клетке (Miettinen et al., 1995; Sibilia and Wagner, 1995; Threadgill et al., 1995), нарушения его функционирования являются главным механизмом развития многих опухолей. Первые шаги к пониманию роли этого рецептора в канцерогенезе были сделаны около двадцати лет назад, когда две группы ученых разработали теорию аутокринной секреции (de Larco and Todaro, 1978; Sporn and Roberts, 1985). Главной идеей этой теории была сниженная зависимость линий опухолевых клеток от добавления эк�

Информация о работе

Горин, Андрей Олегович
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы