Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенетические процессы в культуре кератиноцитов человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шинин, Василий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Культивирование кератиноцитов человека.

1.1.1. Формирование культуры кератиноцитов.

1.1.2. Межклеточная адгезия.

1.2. Адгезия к субстрату.

1.3. Пролиферация кератиноцитов.

1.4. Использование трехмерных гелей в культивировании эпителиальных клеток.

1.5. Взаимодействия кератиноцитов и фибробластов.

1.6. Эпителиальная инвазия.

1.6.1 Межклеточные взаимодействия в инвазии.

1.6.2. Взаимодействия с субстратом в процессе инвазии.

1.6.3. Регуляция инвазии.

1.7. Эпителиальный морфогенез.

1.7.1. Модель эпителиального тубулогенеза (branching morphogenesis, tubulogenesis).

1.7.2. Регуляция эпителиального морфогенеза.

1.7.3. Механизмы морфогенеза эпителиальных трубок.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение первичных кератиноцитов человека и эпителия роговицы кролика.

2.2. Культивирование первичных кератиноцитов человека на пластике, сорбированным коллагеном.

2.3. Культивирование постнатальных и эмбриональных фибробластов человека.

2.4. Получение сред, кондиционированных фибробластами.

2.5. Выделение коллагена из хвостов крыс.

2.5. Приготовление коллагенового геля.

2.6. Получение колоний фибробластов.

2.7. Кокультуры кератиноцитов и фибробластов.

2.8. Культивирование кератиноцитов в коллагеновом геле (модель эпителиального тубулогенеза).

2.9. Ингибирование пролиферации кератиноцитов в коллагеновом геле митомицином С и тимидином.

2.10. Культивирование кератиноцитов в низкой посадочной концентрации под коллагеновым гелем.

2.11. Гистологическое исследование.

2.12. Радиоавтографическое исследование пролиферации кератиноцитов.

2.13. Трёхмерная компьютерная реконструкция фокусов инвазии эпидермальных кератиноцитов в коллагеновый гель.

2.14. Морфометрический анализ роста кератиноцитов на коллагеновом геле.

2.15. Статистическая обработка результатов.

2.16. Материалы и реактивы, использованные в работе.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Сравнительный анализ влияния постнатальных и эмбриональных фибробластов на инвазию кератиноцитами коллагенового геля.

3.2. Реконструкция эпителиального кластера инвазии кератиноцитами коллагенового геля.

3.3. Изучение характера роста первичных кератиноцитов человека на модели эпителиального тубулогенеза в коллагеновом геле.

3.3.1. Сравнительный анализ влияния кондиционированных фибробластами сред на тубулогенез первичных кератиноцитов человека в коллагеновом геле.

3.3.2. Влияние блокаторов и стимуляторов пролиферации на тубулогенез.

3.3.3. Интенсивность пролиферации кератиноцитов на начальных этапах формирования эпителиальных сфероидов.

3.3.4. Пролиферация кератиноцитов в эпителиальных сфероидах и цистах.

3.3.5. Пролиферация кератиноцитов в эпителиальных трубках и их предшественниках.

3.4. Формирование эпителиальных трубок и эпителиальных колоний при культивировании кератиноцитов под коллагеновым гелем.

3.5. Индукция тубулогенеза кератиноцитов роговицы кролика в коллагеновом геле средой, кондиционированной эмбриональными фибробластами человека.

3.6. Роль ВКМ в эпителиальном морфогненезе кератиноцитов человека.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфогенетические процессы в культуре кератиноцитов человека"

Эпителиальный морфогенез является сложным многоступенчатым процессом, в результате которого формируются активно функционирующие ткани, клетки которых интегрированы в единую и сложно организованную систему компартментов (Magerl М, 2001; Pollack et al, 1998; Watt, 2001). Механизмы, лежащие в основе морфогенетических преобразований, вызывают изменение генной экспрессии, затрагивают межклеточные взаимодействия и взаимодействие клеток с ВКМ.

Покровный эпителий кожи человека представлен многослойным пластом клеток и выполняет барьерную функцию. Эпителий придатков кожи, проникает в подлежащие слои дермы и формирует трубчатые и альвиолоподобные структуры, выполняющие специфические функции. Согласно общепринятым данным, формирование придатков происходит в результате инвагинации эпителия кожи в подлежащую мезенхиму (Wessells. 1965, Sato, 1999). Недавние исследования показали, что эта модель не точна, так как не учитывает пролиферацию кератиноцитов (Magerl et al, 2001). Одним из затруднений в исследовании клеточных механизмов морфогенеза придатков кожи является отсутствие репрезентативных моделей для его изучения.

Существует несколько экспериментальных моделей изучения эпителиального морфогенеза. Некоторые аспекты морфогенеза целесообразно изучать в культуре клеток, в относительно простом микроокружении по сравнению с ситуацией in vivo. Значительная часть культуральных моделей основана на использовании коллагенового геля, который представляет собой физиологичный для эпителиальных клеток субстрат (Asselineau et al, 1987). Существенный успех в изучении регуляции роста и эпителиального морфогенеза связан с созданием живого эквивалента кожи in vitro (Bell, 1981). Оказалось, что важную роль в регуляции морфогенеза покровного эпителия и в поддержании структурно-функциональной целостности эпителия кожи играют фибробласты подлежащей соединительной ткани. Регуляция роста кератиноцитов в этой модели носит реципрокный характер.

Взаимный обмен сигналами между эпителием и мезенхимой является узловым элементом в органогенезе кожи и её придатков. Факторы роста, продуцируемые фибробластами, играют ключевую роль в гомеостазе эпидермиса (Smola et al, 1993). Использование модели органотипического эквивалента кожи привело к открытию двойного паракринного механизма регуляции эпителиально-мезенхимных взаимодействий с участием интерлейкина-1, фактора роста кератиноцитов и их рецепторов (Maas-Szabowski et al., 2000).

Репрезентативными моделями эпителиального морфогенеза в культуре являются модель тубулогенеза эпителиальных клеток в коллагеновом геле и модель эпителиальной инвазии (Montesano et al, 1991а). Согласно многочисленным источникам, тубулогенез in vitro отражает центральные этапы эпителиального морфогенеза in vivo и служит адекватной моделью для его изучения (Brinkmann et al, 1995; Berdichevsky et al., 1994). Ряд авторов рассматривают модель эпителиального тубулогенеза в качестве наиболее приближённой к ситуации in vivo модели регенерации эпителия (Sakurai, Nigam, 1998).

Наше исследование в основном посвящено изучению морфогенетического потенциала кератиноцитов человека, а также роли пролиферации и миграции клеток в эпителиальном морфогенезе.