Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние элементов внеклеточного атрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении кожных ран

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние элементов внеклеточного атрикса на функциональную активность эпидермальных кератиноцитов в культуре и при заживлении кожных ран"

РГЗ од 1 1 НОЯ 1996

На правах рукописи УДК 577.2.03 : 577.2.04 : 576.312.6 : 576.3

ГОРЕЛИК Юлия Владиславовна

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО АТРИКСА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПИДЕРМАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ В КУЛЬТУРЕ И ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ КОЖНЫХ РАН

03.00.25 — клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург.

I кучный руководитель:

доктор биологических наук, профессор,

Пинаев Георгий Петрович. Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Михельсон Виктор Михайлович, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат медицинских наук

Галибин Олег Всеволодович,

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Бнолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург.

о а щита состоится « /С» 1 1996 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН но адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., дом 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РА11. ^

Автореферат разослан « уО. » Р1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Л. Н. Писарева

- э -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной клеточной биологии является проблема взаимодействия клеток о внеклеточным матриксом. Внеклеточный матрикс -г ето обобщающее название для высокомолекулярных биополимеров, которые находятся в межклеточном пространстве. Внеклеточный матрикс выполняет две основные функции! опорную и регуляторную. Он принимает участие в осуществлении межклеточных взаимодействий и в регуляции пролиферации и диф$еренцировки клеток In vivo и in vitro. Внеклеточный матрикс играет важную роль в самых разнообразных процессах: эмбриогенезе, регенерации, канцерогенезе и многих других.

Ярким примером того, как внеклеточный матрикс влияет на поведение клеток, является его взаимодействие о впидермальными клетками или кератиноцитами. Влияние элементов внеклеточного матрикса на кератиноциты интенсивно изучается в последние десятилетия. Хотя показано, что от внеклеточного матрикса могут зависеть как степень дифференцировки и пролиферации, так и миграционная способность кератиноцитов (Bissel et al., 1993; WoocLLey et al., 1988)» недостаточно полно исследована роль конкретных элементов матрикса в этих клеточных процессах. Кератиноциты принимают участие в таком важном процессе как регенерация кожной ткани, поэтому експерементальное исследование влияния внеклеточного матрикса на поведение кератиноцитов необходимо для • понимания . сущности данного процесса, следовательно для решения связанных с ним практических задач, такйх как заживление различных ран. Изучение механизмов действия отдельных элементов внеклеточного Матрикса на функционирование кератиноцитов необходимо для решения задач медицины, особенно при применении технологии клеточной инженерии для восстановления структурной и функциональной целостности кожного покрова. Несмотря на то, что в настоящее время продемонстрировано успешное применение выращенных в культуре клеточных пластов кератиноцитов для лечения обширных окогов (Rheinwald, Green, 1977), этот метод требует дальнейшей оптимизации. Существует ряд ограничений в использовании культивируемых кератиноцитов для этой цели. Во-первых, как правило, пласт кератиноцитов но успевает вырасти в культуре к тому сроку, когда нужно его

пересаживать. Во-вторых, клеточный пласт не всегда . приживается на ране из-за того, что клетки слабо прикрепляются к раневой поверхности. Процесс их приживления поэтому идет слишком медленно, и в результате происходит отторжение трансплантата. В-третьих, после пересадки пласта очень долго идет процесс регенерации кожи, в частности восстановление ее базальной мембраны. При заживлении трансплантируемые клетки должны обладать достаточным потенциалом для прикрепления к ране, размножения и миграции по- ее поверхности и кроме того быть способными к дифференцировке и формированию полноценной ткани. В создании оптимальных условий, тспособствующих проявлению втих свойств, принимают участие факторы, которые влияют на микроокружение клеток при их трансплантации на раны. Важнейшим из них является внеклеточный матрккс.

Хотя ранее было исследовано участие различных элементов матрикса на разных этапах раневого . заживления (Gailit, Clark, 1994), не удалось обнаружить, как именно эти элементы взаимодействуют с трансплантируемыми клетками и как влияют на их поведение. Более того, до настоящего времени не было предпринято даже' попыток одновременного внесения в рану культивируемых клеток и элементов внеклеточного матрикса. Исключением является использование отдельных белкой в составе разнообразных "кожных эквивалентов" (Bell et al., 1981). К сожалению. На основе многолетних эмпирических попыток использовать разнообразные кожные эквиваленты, не сформировалось общего представления о том, какие именно элементы внеклеточного матрикса оказывают влияние на процесс восстановления поврежденной кожи.

В связи с этим в данной работе было предпринято систематическое исследование'"' влияния ряда элементов внеклеточного матрикса На поведение кератиноцитов как при регенерации кожи in vivo, так и при культивировании кератиноцитов in vitro. Подобные сравнительные исследования

допустимо проводить только на лабораторных животных. Поэтому

/

эксперименты выполняли на крысах, и, соответственно, использовали культуру кератиноцитов крысы. / Культивируемые кератиноциты крысы являются удобной моделью для изучения влияния элементов внеклеточного матрикса на поседение клеток, так как все перечисленные выше ключевые клеточные функции, а именно: пролиферация, дифференцировка и миграционная активность клеток

- 5 'моделируются in vitro.

Цель и задачи работы. Целью дшшой работы являлось изучение

влияния элементов внеклеточного метрикса на свойства

кератиноцитов, существенные для заживления ран.

Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие

задачи:

I. Изучить влияние различных елэментов внеклеточного матрикса, а именно: коллагена I типа; - матрикса, синтезированного фибробластами; матригеля и его фракций на поведение кератиноцитов новорожденных крыс в культуре. Для отого было необходимо: I. Изучить динамику культуры кератиноцитов новорожденных крыс. 2 Исследовать взаимодействие фидерных клеток и кератиноцитов в совместной культуре in vitro. 3. Исследовать в культуре влияние элементов внеклеточного матрикса на прикрепление и распластывание, лсевдоподиальную активность и пролиферацию. 4. Изучить влияние ■ различных влемонтов внеклеточного матрикса, а именно, коллагена I типа, матригеля и его фракций, а также фибробластов на заживление ран разлитых типов.

Научная, яомзяа н практическая значимость работа. Впервые при исследовании поведения . кератиноцитов новорожденных крыс в качестве подложки был использован препарат матригеля, получешшй из EHS-сарксма мыши. Установлено, что скорость роста кератиноцитов пропорциональна концентрации матригеля.

Впервые выявлено, что именно внеклеточный матрикс, наработанный фидерными клетками, положительно влияет на прикрепление, распластывание и пролиферацию культивируемых кератиноцитов новорожденных крыс.

Модифицирована методика стриппинга, которая широко используется на человеческих кератиноцитах (Васильев и др., 1993). Стриппннг кератиноцитов крыс можно использовать для тестирования пролиферативной активности различных биологических препаратов. В отличие от человеческих кератиноцитов сроки тестирования сокращаются.

Впервые установлено, что при использовании в качестве добавки в расщепленную рану матригель ускоряет ее впителизацию.

Впервые матригель был использован при трансплантации суспензии аллогенных кератиноцитов на полнослойную рану. Установлено, что матригель способствует приживлению суспензии

йдлогешшх кератгаюцитов на полнослойиой рано. Повышенна концентрации матригеля ускоряет приживление.

Данные, полученные в работе, имеют большое практическое значение для лечения различных типов поражения коки. Полученные результаты позволят планировать применение элементов внеклеточного матргасса в качестве лечебных средств для улучшения заживления ран. Использование елэментов внеклеточного матрикса в качество добавок при трансплантации кератгаюцитов будет способствовать прнкивлешпо клеток на раневом лоясе. Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались на симпозиуме " Epithelial ooll biology" (Оксфорд, 1994), 4 конгрессе Европейского общества клеточной биологии (Прага, 1994), 8 конференции Международного общества ди'Мсронцировки (Хиросима, 1994), Конференции "Биология клетки в культуре" (С-Петербург, 1995), 4 Конгрессе Международного общества по ранениям (Тель-Авив, 1996).

Публикации. По теме диссертации имеется 14 публикаций, в .том числе 3 статьи. ' . ///л

Структура и обЬем диссертации. Диссертация изложена на ' ' страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов Я выводов. Список литературы содержит источников.

Материалы н методы. I. Получение первичных культур кератшюцитов новоровдешшх крыс.

Эпидермалыше кератиноциты выделяли из коки новоровденных крысят в возрасте 2-4 суток по методу Рейнвальда (Reinwald, 1980). Кожу нарезали на Мелкиефрагменты размером 5-10 мм, которые помещали в 0,5% раствор диспазы (Boehringer Hanheim СпзВН) и инкубировали при 37°С в течение I часа. Затем кусочки переносили в солевой фосфатно-буферный раствор PBS по Дульбекко и впидермис отделяли пинцетом от дермы по линии базальной мембраны. Выделенный эпидермис инкубировали в О,125% растворе трипсина в течение 10-15 мин при перемешивании со ' скоростью 50 об/мин. После окончания трипсинизации фермент / инактивировали добавлеш!ем Ь% эмбриональной сыворотки. Получетую в результате пипетирования суспензию клеток фильтровали через нейлоновый газ. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и

культивировали в ростовой среде ФАД, включающей в себя смесь сред DIÍEM и F12 в соотношении 3:1, о добавлением 10* эмбриональной сыворотки теленка, 5 мкг/мл бычьего инсулина (Sigma), 0,5 мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), Ю нг/мл епидермального фактора роста (Институт цитологии РАН).

В качестве фидерных клеток использовали вмбриональны« фибробласты кожи человека, которые выделяли из абортивного материала. Кусочки коки переносили, в 0,25% раствор трипсина на 16 Часов в холодильник при температуре +4°С, затем ети же кусочки кожи в свежем 0,25% растворе трипсина помещали на магнитную мешалку при +37°С на 30 минут. После этого полученную смесь пипетировали 10 раз и пропускали через нейлоновый газ. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин и культивировали п ростовой среде DMEM о 10% сыворотки крупного рогатого скота.

2. Получение элементов внеклеточного ыатракса.

В работе были использовали следующие элементы внеклеточного матрикса: коллаген I типа; внеклеточный матрикс, наработанный фидерный клетками, и матригель - препарат, содержащий элементы эпителиальной базальной мембраны. Коллаген I типа из хвостов крыс получали по методу Бутковского (Butkowsky et al., 1982).

Внеклеточный матрикс, наработанный фидерными клетками, получали следующим образом: монослой фибробластов, образовавшийся после 15 суток культивирования, удаляли обработкой в течение 40 мин при 3?°С 0,5 мМ раствором ЭГТА Полное очищение поверхности от клеток контролировали но светооПтйЧескоМ уровне.

Препарат матригель получали из EHS-саркомн мыши по стандартной методике (Kleinmann et al., 1986). Кроме матригеля полного состава получали его фракции путем осаждения 20% раствором сульфата аммония (Taub et al., 1990). Осадок белкоп представлял собой фракцию I, а супернатант - фракцию 2. Электрофорез белков матригеля проводили в Ъ% полиакриамидном геле (Laemli, 1970). Содержание уроновмх кислот в препарата* матригеля определяли при помощи цветной реакции с карбазолом по методу Биттера и Мшр (Bitter, Muir, 1962). Содержание коллагена в пробах матригеля и его фракций определяли по ' реакции ня окситтролип (Bergman, Loxley, 1963).

3. Исследование кератиноцитов в культуре.

Клетки с плотностью ЯхЮ^ кл . высевали но помпщечн^<? п

культуральную чашку Петри диаметром 40 мм чистые покровные стекла, или на стекла, обработанные элементами внеклеточного матрикса: 0,1% раствором коллагена I типа из крысиных хвостовj матригелем в концентрации 200 мкг/мл; фракциями матригеля I и 2 в концентрации 200 мкг/мл;, внеклеточным матрюссом, синтезированным фибробластами.

Анализ псевдоподиальной активности проводили по модифицированному наьш методу Albreoht.-Buehler (Albreoht-Buehler, 1977). Вместо коллоидного золота использовали латексныэ шарики диаметром 0.8 мкм (Sigma). Покровные стекла обрабатывали исследуемыми елементами внеклеточного матрикса, затем на стекла наносили густую суспензию латексных шариков, предварительно гомогенизированную ультразвуком в течение 10 сек. После аккуратной промывки избытком воды стекла помещали в чааки, и на них высевали кератиноциты в полной среде FAD с 10$ сыворотки. В ряде опытов через 4 часа после посева среду с сывороткой заменяли на среду без сыворотки. Спустя 17 часов культивирования стекла с клетками промывали, фиксировали раствором формалина и фотографировали в темном поле.

Анализ прикрепления и роста кератиноцитов проводили по методике Джиллеса (Gillee et al., 1986). После окраски клеток 0,1% раствором криствлл-виолета и солюбилизации краски оптическую плотность раствора измеряли на приборе Sumal (Karl Zeltîs Jena) при длине волны 590 нм.

Стрилпинг Лультур кератиноцитов проводили по методу Ексена и Болунда (Jensen, Bolund, 1988).

4. Анализ влияния элементов внеклеточного матрикса на заживление глубоких рвн при пересадке на них аллогекшх кератиноцитов.

Все експерименты по анализу заживления кожных ран проводились совместно с к.м.н. Б.А. Парамоновым (Кафедра термических поражений Военно- Медицинской Академии, Санкт-Петербург). Анестезию осуществляли посредством внутримышечного введения смеси каллипсола и дроперидола. Животное фиксировали к станку, после чего сбривали шерсть на спине. Обработку операционного поля производили 5% спирт-иодным раствором и спиртом, после чего закрывали стерильными марлевыми салфетками. Циркулярно иссекали кожу и фасцию, покрывающую мышцу, в области нижней трети спины. К дну раны пришивали пластиковое кольцо диаметром 1,5 см. Второе кольцо пришивали к

краям раны для предотвращения контракции кожи.

В контрольной серии опытов на подготовленную рану производили трансплантацию первичной суспензии кератиноцитов, полученной как описано в п.1, с плотностью 4x10 клеток в 0,3 мл буфера PBS на рану. В опытных вариантах смешивали клетки в 0,1 ил PBS с коллагеном I типа (0,3 мл 0.IÍÍ раствора), матригелем (0^2 мл раствора в концентрации 200 мкг/мл), фракциями матригеля I й 2 (0,2 мл раствора в концентрации 200 мкг/мл) и с суспензией аллогенных фибробластов (I05 клеток на рану) и полученные смеси клеток с элементами внеклеточного матрикса наносили на раны, которые покрывали тремя слоями парафинизированного раневого покрытия "Paranet" и накладывали стерильный марлевый шарик, фиксированный посредством завязывания над ним концов лигатур. Для профилактики загрязнения раны поверх марлевого шарика пришивали 6-8 слойную марлевую салфетку. Внутримышечно вводили 50'ООО единиц бициллина-5. Забор биоптатов производили на 4,7 и 14-е сутки после трансплантации. Для изучения методами световой а электронной микроскопи биоптаты фиксировали в 0,25$ растворе глютарового альдегида (BDH). 5. Анализ загяэлешш расщепленных ран.

Эксперименты с расщепленными кожными ранами проводили на крысах с анестезией. После депиляции с помощью дерматома ДШ-30 срезали расщепленные кожные лоскуты толщиной 0,2 мм. Глубина

срезания кожи в различных участках раны была неодинаковой, более

р

поверхностной по краям. Площадь рай составляла 2-Зсм . Испытуемые препараты наносили только на раны, в которых глубина срезания в центральной части была равномерной. На раневые поверхности в опытных Вариантах наносили суспензию аллогенных фибробластов в культуральной среде (2 мл среда, содержащей в различных группах наблюдения от 0,72 до 4,2 млн. клеток), кондиционированную среду без клеток, коллаген I типа (0,1Яраствор) и матригель (200 мкг/мл), и покрывали их повязками.

Результаты.

I. исследование динамики культуры кератиноцитов новорожденных крыс.

Для определения влияния элементов внеклеточного матрикса на поведение клеток было необходимо выяснить, как и в кякио временные интервалы происходит пролиферация и • диф!«р<пщ«рсвка

кератиноцитов крыс в культуре. Поскольку при ферментативной обработке эпидермиса в суспензию переходят не только базальные клетки, но и кератиноциты, находящиеся на разных этапах дифференцировки, только часть выделенных клеток давала начало последующей культуре. С помощью методов электронной микроскопии было обнаружено, что одиночные клетки имеют характеристики повревдешшх клеток, тогда как в агрегатах клетки имели нормальную морфологию.

При помещении клеток в среду с нормальным содержанием кальция (1,8 мМ) они прикрепляются' и распластываются в виде агрегатов. По мере культивирования происходит образование супрабазалышх слоев дифференцирующихся клеток. Прикрепление агрегатов происходит сравнительно медленно и зависит от плотности суспензии. При плотности 100 тысяч клеток на чашку около 30% агрегатов прикрепляется за первые 24 часа, а за следующие 21 часа прикрепляется до 50¡5 от исходного количества агрегатов в суспензии кератиноцитов. В процессе культивирования происходит образование пласта дифференцированных клеток. На поперечном срезе пласта видны по крайней мере три слоя клеток: базальный, промежуточный и верхний. Слои клеток не примыкают плотно друг к другу, между ними остается просвет. Клетки контактируют между собой микроворсинками, как внутри слоя, так и между слоями.

В бессывороточной среде с пониженным содержанием кальция (0,1 мМ) межклеточные контакты кератиноцитов нарушаются, и колонии распадаются на отдельные клетки. По мере культивирования количество клеток увеличивается, и образуется монослой кератиноцитов, подобный тому, который характерен для большинства постоянных клеточных линий.

Для сравнения характеристик пролиферации клеток на фоне слабой дифференцировки и в условиях сильно выраженной дифференцировки культивирование клеток проводили также в среде с сывороткой и высоким содержанием кальция. Для обеспечения стандартных условий эксперимента многослойную культуру подвергали стришшнгу, в результате чего происходило отделение дифференцированных клеток, и на субстрате оставался только слой базалъных клеток. После последующего перевода клеток на полную среду происходила вторичная стратификация культуры и внешний ее вид был такой же, как до стриппинга.

2. Характеристика элементов внеклеточного иатрикса, использованных в работе.

Данные электрофореза в полиакриламидном геле показали (Рие.

1, а), что препарат матригеля, полученный нами, состоит из в мажорных белковых полоо. Наиболее высокомолекулярная полоса, расположенная в концентрирующем геле, судя по литературным данным, соответствует протеогликанам. Ниио, на уровне 440 кД и 22б кД, расположены две полосы, предположительно большой и малой цепей ламинина. Полосы, расположенные на уровне 158 кД и 80 кД, совпадают по молекулярным массам с энтактипом и нидогеном. Матригель содержит, помимо элементов базальпой мембраны, еще и низкомолекулярные факторы. Для того, чтобы отделить результаты действия высокомолекулярных элементов от дополнительного эффекта низкомолекулярных факторов на рост и дифференцировку клеток в культуре, матригель фракционировали, удалив из него низкомолекулярные составляющие. На електрофореграмме дорожка, соответствующая фракции I, т.е. осадку после осаждения матригеля 20% раствором сульфата аммония, содержит практически весь набор полос, характерный для матригеля. В то же время дорожка Фракции

2, супернатанта после высаживания матригеля, лишена полос 158 кД и 80 кД, соответствующих предположительно ентактину и нидогеяу.

„ Ввиду того, что выявить коллаген IV типа на электрофореграммах оказалось невозможным, его содержание в препаратах разных фракций Матригеля определяли' по сравнительному .анализу количества оксипролкна. Важной составляющей протеогликанов, которые содержатся в матригеле, является полисахаридные цепи (гликозамшгогликаны). Выявить их на електорофореграммах было также невозможно. Поэтому содержание гликозбаминогликанов определяли по количеству уронорых кислот как их маркера. На основании данных, прчпеденшт в таблице I, можно сделать вывод о том, что Фракция I отличается от полного матригеля более высоким содержанием коллагена ГУ типа и низким содержанием тголпсахарчгагой составляющей нротоогликятн». Фракция 8 содержит наибольшее количество урснопнт, кислот . п нз5*м"17ыпо<г -- коллагена Т7 тина.

ТаблЛ. Биохимический анализ матригеля и его фракций.

наименование препарата коллаген IV уроновыэ кислоты (мкг /мг белка)

матригель 25-1,5 8,3*0,8

фракция I 57-6,0 2,4-0,2

фракция г 14-1,1 90,5-9,0

вШЭЭ Д'ВУЙ?

266* 255*

133« 122«

205* 115«

85

47 •

* /л.. 0

Рис.1. Схематическое изображение данных влекторофоретического анализа элементов внеклеточного матрикса, использованных в работе. ■■'

а) лолный матригель - дорожка 2; фракция I - дорожка I; фракция 2 - дорожка 3. Гель - Ь% ПААГ.

б) матрикс, синтезированный фибробластами. Гель - В% ПААГ.

На влектрофореграмме препарата элементов внеклеточного матрикса фибробластов можно различить шесть мажорных полос (Рис. I, б). Используя маркеры молекулярного веса, мы установили, что полосы предположительно соответствуют белкам с молекулярными массами: 210, I2Ó, 93, 78, 63 и 47 кД. Вероятно, верхняя полоса может соответствовать либо фибронектину, либо ламинину. По литературным данным известно, что фибронектина они синтезируют больше, чем ламинина, и вероятнее всего эта полоса принадлежит именно фибронектину. Сравнивая влектрофореграммы матригеля и матрикса фибробластов, можно сделать вывод, что оба матрикса различаются по белковому составу, и могут оказывать различное действие на поведение кератиноцитов.

3,Исследование влияния элементов внеклеточного ыатрикса на Поведете кератиноцитов in vitro.

• Степень прикрепления клеток к ' различным субстратам оценивали по количеству клеток, оставшихся на субстрате после Перевода культуры Из среды о высоким содержанием кальция в пизкокальциевую среду. Число прикрепившихся клеток, которое подсчитывал! после окрашивания их кристаллическим фиолетовым, зависит от состава элементов внеклеточного матрикса на субстрате< при условии, что они нанесены й равной концентрации. К фйбробластНому матриксу прикрепляется клеток в 2 раза больше, Чем к Пластику в контрольном Варианте. Коллаген также усиливает .адгезии кератйноцитой почти в 2 раза по сравнению с контролем, в то время, как фракция 2 Матригеля ослабляет ее примерно в 1,4 раза. Полный нехонцентрировайный матригель й фракция I Матригеля не влияют на адгезию кератиноцитов. На Матригеле с самой высокой концентрацией число прикрепившихся клеток в 1,33 раза больше, чем на Матригеле с концентрацией 200 мкг/мл и в 1,26 раз больше, чем на матригеле с концентрацией 4 мг/мл. Таким образом, к самым адгезивным относятся матрице, синтезированный фибробластами, и коллаген.

При наблюдений за процессом распластывания кератиноцитов можно было виДеть, что круглые прикрепившиеся, клетки вначале образуют нитевидные выросты мембраны - филоподии. Далее, если процесс распластывания прогрессировал, происходило образование широкой плоской ■ ламеллы по краю клетки. Соответственно происходило и преобразование актинового цитоокелета. Изучая

процесс распластывания кератиноцитов на субстратах, покрытых влементами внеклеточного матрикса, мы оценивали - степень распластывания по характеру образующихся выростов. Филоподиальный тип, по нашему мнению, характеризовал низкую степень распластывания, а формирование ламеллоподий свидетельствовало о более плотном контакте клетки с подложкой.

При культивировании в среде с низким содержанием кальция было обнаружено, что на субстрате, содержащем коллаген I типа, вти эпителиальные клетки не образовывали компактных колоний, характерных для них при распластывании на стекле. Клетки, растущие на коллагене I типа, имели большие радиальные филоподии, интенсивно окрашиваемые родамин-фаллоидином, а у клеток на стекле наблюдались кортикальные пучки актина и небольшие филоподии. При культивировании в высококальциевой среде практически все клетки на коллагене I типа тош содержат филоподии. Это говорит о том, что характер распластывания кератиноцитов на коллагене сохраняется независимо от содержания кальция в среде.

У кератиноцитов, растущих в среде с высокой концентрацией кальция на субстрате с фидерными клетками, через 17-18 часов после посева происходит образование ламеллоподий, фибриллярный актин распределяется по краю ламеллоподии. При отсутствии фидерных клеток у кератиноцитов образуются филоподии, видны актиновые пучки, которые составляют основу филоподии, а краевого распределения актина не наблюдается. Дополнительные эксперименты показали, что именно внеклеточный метрике, наработанный фидерными клетками, а не кондиционированная ими среда был необходим кератиноцитам для более полного распластывания. В дальнейших экспериментах по исследованию роли фидерных клеток в регуляции клеточных процессов кератиноцитов был использован матрикс, наработанный этими клетками.

Окраска родамин-фаллоидином показала, что на полном мятригеле также, как и на фибробластном матриксе, актин у краевых клеток колоний кератиноцитов распределяется по краю ламеллоподии. В отличие от полного мэтригелл фракция 2 , использованная в качестве подложки, не вызывает образование ламеллоподий у краевых клеток колдний. У 50Ж краевых кератиноцитов образуются филоподии, остальное клетки на . данном этгшо че образуют ни ламеллоподий, ни филоподий.

Подводя итог результатам по прикреплению и распластыванию клеток, мы пришли к заключению, что наибольшей адгезивностыо обладают коллаген I типа, матригель в концентрации 8 мг/мл и матрикс, синтезированный фибробластами. При втом, однако, клетки, хорошо прикрепившиеся к коллагеновому субстрату, тем не менее довольно плохо распластываются. Напротив, распластывание идет быстро и наиболее эффективно на субстратах, покрытых ыатригелем и матриксом, синтезированным фибробластами.

Представляло интерес сопоставить данные по распластыванию с миграционной способностью кератиноцитов, культивируемых на разных субстратах. Оценку псевдоподпальной активности кератиноцитов проводили с использованием латексных шариков. Клетки, активно формирующие выросты мембраны, способны поглощать шарики, очищая определенную площадь поверхности вокруг себя. Подсчитав площадь, очищаемую от шариков, можно оценить псевдоподиальную активность клеток. Независимо от количества кальция в среде площадь поверхности, очищенной клетками на коллагене I типа, в два раза больше, чем на других субстратах, а именно: на стекле, матриксе, наработанном фибробластами, матригеле (Рис. 2). Клетки на фракции 2 матригеля очищают в 2-3 раза меньше поверхности по сравнению с клетками на стекле. Таким образом, на субстратах, где образуется более плотный контакт с подложкой, миграция кератиноцитов минимальна. Напротив, при слабом характере взаимодействия филоподиального типа, как, например, на коллагене.I типа, клетки демонстрируют повышенную способность к миграции. В том случае, когда субстрат вообще не способствует ни! прикреплению, ни распластыванию клеток, миграционной активности практически не обнаруживается.

Влияние елементов внеклеточного матрикса на пролиферацию клеток оценивали по включению Н-тимидина, которое измеряли через сутки после перевода клеток на низкокальциевую среду. Как видно на рис. 3, в данных условиях только фракция 2 матригеля

з

резко снижает включение Н-тимидина в клетки по сравнению с контролем. Включение метки на полном матригеле в низкой концентрации остается на уровне контроля, а на фракции I

Рис. 2. Площадь. очищенная от шариков кератиноцитами, распластанными на различных субстратах при различны* Концентрациях кальция в среде, колл! - колЛагей. I типа} К -субстрат без покрытия Матриксом; Ы.ф. - метрике от фибробластов; Иатр - матригель} фр2 - фракция 2 матригеля.

включение 3Н-тимидина немного 'превышает контрольное. В присутствий На субстрате коллагена I типа и Матрикса от фибробластов наблюдается сильная стимуляция включения

з

•Н-тимидина. Включение радиоактивной Метки в кератиноциты пропорционально концентрации Матригеля в диапазоне 0,2-8 мг/л. Можно сделать, вывод, что Коллаген I типа, матрикс, синтезированный фибробластами, и Матригель в концентрации 8 иг/ил сильно стимулируют включение кератиноцитами радиоактивной метки. В то же время фракция 2 матрйгеля сильно ингибирует этот процесс.

При сравнении етйх результатов с данными, полученными на модели стриппинга, когда одновременно с пролиферацией происходит дифференцировка клеток» оказалось,что, в клетки, растущие на фракции 2 матрйгеля, на протяжение всего срока исследования (1-3 суток) включалось меньше тимидина, чем в контроле. Различие было Наибольшим.через двое суток Носле перевода клеток на среду с кальцием. В клетках, растущих на других матриксах, »тот показатель оставался все время на уровне контроля. Понижение

кол! м.ф. матр фр! фр2 к

250 200 150 100 50 0

Ш Кпр

вкл. тимидина

Рис. 3. Включение меченого тимидина {% от контроля) и коэффициент прироста Клеток (Кпр) Кератиноцитов на различных субстратах в низкокальциевой среде: Кол1 - коллаген I типа: ы.ф. - метрике, наработанный фибробластами; Ыатр - матригель} фр1 -фракция I матригеля; фр2 - фракция 2 натрителя; К - субстрат без покрытия матриксом.

включения метки в кератиноциты, растущие на субстрате с фракцией 2 матригеля, возможно объясняется тем, что клетки с наиболее высоким пролиферативным потенциалом . являются наименее адгезивными и удаляются из культуры в результате стриппинга. В пользу этого свидетельствует тот факт, что прикрепление клеток к данному субстрату понижено. . С Другой стороны, можно предположить, что какие-то факторы, присутствующие в этой фракции матригеля, подавляют пролиферацию кератиноцитов• Результаты, полученные На двух Моделях, совпадают в значительной степени. Различия могут зависеть от того, что в стриппинговой модели одновременно с пролиферацией в высококальциевой среде может идти и дифференцировка.

з

Так как включение н-тимйдина клетками отражает только наличие синтеза ДНК и не дает Полную информацию о процессе пролиферации, мы оценивали прирост клеток на разных субстратах как производное от деления числа клеток, выросших за двое суток на данном субстрате, на число клеток в начальной точке. За начальную точку приняли срок через 17 часов после перевода

б 4 3 2 1 О

Кпр

%

О

0.2

4

8

мг/мл

1Я

Кпр

ви

вкл. тимидина

Рис. 4. Зависимость включения меченого тимидина (юл/мин) и коэффициента прироста клеток (Кпр) от концентрации матригеля (мг/мл).

культур на среду с низким содержанием кальция. Самый высокий коэффициент прироста оказался у клеток, росши на коллагене I типа, несмотря на то, что в начальной точке на данном субстрате было в 2 раза больше кератиноцитов, чем в контроле. На матриксе, наработанном фибробластами, коэффициент прироста клеток повышался незначительно. ' Прирост клеток на матригеле пропорционален его концентрации в диапазоне 0,2 - 8 мг/мл. Коэффициент прироста у клеток, которые росли на фракции 2 матригеля, существенно ниже контроля. Интересно, что фракция I, практически не влияющая на прикрепление клеток, имеет ростовой коэффициент, который превышает контрольный почти в 1,2 раза, что говорит о стимулирующем влиянии этой фракции на рост кератиноцитов, однако эта стимуляция меньше, чем у коллагена.

Из получении* результатов можно сделать вывод, что наиболее положительное влияние на рост кератиноцитов оказывают коллаген I типа, матрикс, синтезированный фиброблпстами, матригель в высокой концентрации и ого фракция I. Фракция 2 матригеля ингибиру°т этот процесс. Хотя коллвгрн и матрикс, нпроботэшшй

фибробластами, стимулируют рост кератиноцитов в низкокальциевой среде, ета стимуляция ниже, чем стимуляция ими включения радиоактивной метки. Вероятно, в ©том случае определенная часть клеток вошла в в фазу, но еще не успела поделиться. Поэтому у клеток на данных субстратах ростовой коэффициент увеличен не так сильно, как включение метки.

4. Анализ влияния элементов внеклеточного ыатрикса на заживление раы.

Результаты исследований, полученных на культуре клеток, приводят к предположению, что элементы внеклеточного матрикса могут оказывать существенное стимулирующее действие на процесс заживления кожных ран. Для того, чтобы проверить это и определить прогностическую ценность полученных данных, было изучено действие тех же элементов внеклеточного матрикса при внесении их в неглубокие расщепленные и глубокие полнослойные раны.

Полнослойная рана является аналогом глубокой раны большой площади, которая образутся при тяжелых ожогах и травмах. При втом собственные краевые клетки неповрежденной кожи не способны принять участие в восстановлении кожного покрова. Поэтому в случаях глубоких ран необходимо использовать трансплантацию клеток для восстановления кожного покрова. Чтобы приблизить условия в моделированной полнослойной ране к условиям глубокой раны большой площади, влияние собственных клеток раны на процесс раневого заживления было исключено ограничением краев раны пластиковыми кольцами. Модель полнослойной раны, разработанная нами, является промежуточной ступенью при переходе от культуры клеток к расщепленной ране. Если в культуре кератиноцитов оценивалось влияние элементов внеклеточного матрикса в виде подложки для культивирования, то В полнослойной ране оценивался совместный эффект внесенных элементов внеклеточного Матрикса и трансплантируемых кератиноцитов.

В отличие от человеческих крысиные кератиноциты образуют очень непрочный пласт клеток, который разрушается при снятии его с подложки после обработки диспазой. Поэтому в наших экспериментах для трансплантации на полнослойную рану использовали не пласт кератиноцитов, а их суспензию. Успех заживления полнослойных ран определяется прежде всего тем, насколько хорошо прикрепляются к мышечному ложу, распластываются

на нем и размножаются трансплантируемые кераетшоциты. На основании данных, полученных в экспериментах In vitro, можно было ожидать, что наибольший эффект окажут матригель в высокой концентрации, фракция матригеля I и матрихо, наработанный фибробластами. Наоборот, фракция матригеля 2 будет замедлять приживление трансплантируемых кератиноцитов ко дну раны. Что касается коллагена I типа и неконцентрированного матригеля, то прогноз затруднен. Это связано о тем, что хотя коллаген I типа положительно влияет на прикрепление клеток in vitro и на их рост, распластываются кератиноциты на коллагеиовом субстрате не так быстро, как на других исследованных подложках. Матригель в низкой концентрации, наоборот, положительно влияет на распластывание клеток, но не оказывает эффекта на прикрепление и рост.

Табл. 3. Влияние элементов внеклеточного матрикса на приживление аллогенных кератиноцитов на полнослойные раны.

условия опыта число животных число животных у которых зафиксировано приживление на 14-е сутки

без матрикса (контроль) 18 3

матригель полный 24 22

матригель фракция I 10 8

матригель фракция 2 II I

фибробласты 8 8

коллаген I типа 9 0

Элементы внеклеточного матриКса и суспензию фибробластов вместо используемого в экспериментах in vitro наработанного ими йатрикса добавляли на рану вместе с суспензией кератиноцитов. В случае приживления суспензии на ране образуется тонкий слой эпидермиса,- тогда как при отсутствии приживления раневое ложе остается непокрытым. Результаты проведенных экспериментов (Табл.3) показали, что полный матригель, фибробласты и Фракция I

мат-ригеля действительно способствуют приживлению, тогда как при отсутствии элементов внеклеточного матрикса приживление крайне низкое. При внесении в рану фракции 2 матригеля приживление клеток было обнаружено лишь в одном случае из II. В случае использования коллагена I типа приживление не происходило.

Позитивное действие матригеля на приживление аллогенных кератиноцитов зависит от количества внесенного в рану матригеля. Увеличение концентрации добавленного матригеля ускоряет процесс приживления клеток. Повышение концентрации матригеля от 200 ыкг/мл до 8 мг/мл приводило к двукратному сокращению срока приживления клеток (от 7 до 4 суток).

На гистологических препаратах биопсийного материала, взятого йз контрольных ран, было обнаружено два различных слоя: нижний является мышечным ложем, верхний - грануляционной тканью. Грануляционная ткань сформирована фибробластами и инфильтрована Макрофагами. Кератиноциты в ране отсутствуют. На препаратах биопсий из ран, в которых произошло приживление кератиноцитов. Над мышечной тканью наблюдается масса клеток, по своему виду напоминающих кератиноциты. У них округлая форма, большое ядро и светлая цитоплазма. Однако, характерной гистологической структуры многослойного эпителия не наблюдается, встречаются только образования, напоминающие сфероиды или трубки. При исследовании биоптатов посредством просвечивающей электронной микроскопии установлено, что в состав неоепидермиса входят клетки, схожие по своей структуре с кератиноцитами в суспензии. Эти клетки имеют сильно развитый ендоплазматический ретикулум, вакуоли и тонофиламенты.

Как и предполагалось, данные, полученные in vivo, коррелировали с результатами опытов на культурах кератиноцитов. Так, фракция 2 матригеля, которая ингибирует прикрепление, распластывание и рост кератиноцитов in vitro, не способствует приживлению кератиноцитов. Напротив, фракция I матригеля, положительно действующая на эти процессы в культуре, положительно влияет и на приживление суспензии клеток ко дну раны. Повышение концентрации матригеля, которое способствует прикреплению и росту клеток в культуре, также ускоряет процесс . приживления кератиноцитов на полнослойной ране. Такая же корреляция наблюдалась и при использовании фидерных клеток. Однако, коллаген I типа не способствовал приживлению.

Следующая серия экспериментов была поставлена на расщепленных ранах. Расщепленная рана является аналогом неглубокой раны небольшой площади. В такой ране остаются неповрежденными сосочки эпидермиса. Из них и о краев раны могут мигрировать собственные клетки раны, которые будут участвовать в заживлении. Элементы внеклеточного матрикса могут только ускорять или замедлять данный процесс. Вероятно, что помимо вышеописанных клеточных процессов, для такого типа раны будет иметь значение подвижность клеток, которая в культуре оценивалась по псевдоподиальной активности. Поэтому ожидалось, что кроме концентрированного матригеля, и фибробластов, коллаген I типа также должен ускорять заживление расщепленной раны.

На неглубокие расщепленные раны кератиноциты не пересаживали, а в качестве добавок для улучшения заживления наносили коллаген I типа, матригель, суспензию фибробластов,

Табл. 4. Влияние элементов внеклеточного матрикса на сроки епителизации расщепленных ран.

Условия опыта число животных сроки епителизации

(сут)

V .

I .контроль 46 ; МО

2.Культуральная среда

БМЕМ 10 7-9

,3.Кондиционированная. • фибробластами ростовая

среда БМЕМ 33 7-9

4.Суспензия фибробластов 40 : 3-4

5.Коллаген I типа 13 5-7

6. Матригель : : 24 З^

культуральную среду ДМЕМ и кондиционированную фибробластами среду ДМЕМ. Установили, что трансплантация взвеси фибробластов, и аппликация матригеля существенно ускоряют впителизацию ран. При гистблогическом исследовании биоптатов показано, что эпидермис на ранах, где пересаживали суспензию фибробластов, имел большее количество слоев клеток и выглядел более зрелым по сравнению о ранами, где не было никаких добавок. Скорость эгттелизации ран

не зависела от количества пересаженных на раневые поверхности фибробластов. В наших экспериментах количество пересаженных фибробластов колебалось от .0,72 до 4,3 млн клеток на рану, и какой-либо разницы в заживлении не было отмечено. Ускорения впителизацин ран при аппликации кондиционированной в процессе культивирования фибробластов среды не происходило (Табл. 4).

В опытах с расщепленными ранами показано, что матригель ускоряет епителизацшэ раны. В группе животных, которым но вносили в рану матригель, заживление шло 7-10 суток, тогда как п группе животных, которым производили аппликаций матригеля в раны, эпителизация наступала на 3-4 сутки (Табл. 4).

Ускоренное по сравнению с контролем восстановление эпидермиса происходило также и в результате применения коллагена I пта, однако с меньшей скоростью, чем в случае с полным матркгелем и фибробластами (табл. 4). Коллаген I типа, который стимулирует псовдоподиальную активность кератиноцитов и ростовые Процессы In vitro. Tárate ускоряет епителизацию расщепленных ран. Матригель в использованной нами концентрации стимулирует размножение кератиноцитов в культуре и ускоряет восстановление коззгаго покрова в неглубоких ранах. Фибробласты, матрикс от которых усиливает пролиферацию кератиноцитов в культуре, также значительно ускоряют заживление расщепленных ран.

Таким образом, видна строгая корреляция результатов, полученных in vitro и in vivo, что позволяет данные, полученные в культуре, использовать для прогнозирования действия различных элементов внеклеточного матрикса в процессе заживления расщепленных ран.

Подводя итог, можно сделать следующее заключение. Культура кератиноцитов может использоваться для прогнозирования поведения клеток в ране в процессе регенерации кожи. Из всех исследованных в настоящей работе элементов внеклеточного матрикса наиболее перспективным является матригель, который продемонстрировал наибольшее стимулирующее действие на рост клеток в культуре и на заживление ран. Вместе с тем, в случае неглубоких поражений кожи, в частности ожогов легких степеней, когда заживление идет за счет краевой миграции, в Качестве добавок для ускорения епителизации можно использовать и другие элементы, которые способствуют миграции и пролиферации клеток, например, коллаген I типа. Однако, в случае глубоких поражений

кожи, даже при добавлении внеклеточного ыатрикса одновременно о трансплантацией ' в рану суспензии кератиноцитов полной дифференцировки клеток и образования полноценного пласта не происходит. Процесс дифференцировки клеток занимает длительное время после завершения епителизации раны. Скорее всего после начального этапа прикрепления клеток и их пролиферации необходимо дополнительно вносить в рану другие элементы внеклеточного матрикса, способствующие дифференцировке кератиноцитов. Сейчао трудно сказать, какие именно элементы окажутся перспективными с этой точки зрения и в какой последовательности их нужно вносить. Возможно, что это будут вещества, синтезируемые фибробластами, поскольку в присутствии фидерных клеток кератиноциты крыс успешно дифференцируются и образуют многослойную культуру. Однако, получение большого количества матрикса, синтезированного фибробластами, представляется трудной задачей. Кроме того, элементы матригеля и матрикса фибробластов можно включать в состав кожного эквивалента или в качестве покрытия аллодермы. Не исключено, и предварительное культивирование фибробластов на маТригеле о целью наработки ими достаточного количества матрикса. Такой матригель вместе с матриксом после-удаления фибробластов монет быть перенесен на раневую поверхность. Руководствуясь уже установленным эффектом воздействия сложных композиций элементов ¡внеклеточного матрикса, мы предполагаем в дальнейшем перейти к более детальным исследованиям влияния отдельных элементов на процесс восстановления кожи. Необходимость подобного рода исследований связана также и с тем, что матригель - это препарат опухолевого происхождения и его клиническое использование затруднено. Следовательно, развитие работы, вероятно, пойдет в направлении создания реконструированного матригеля или другого аналога базальной мембраны.

Вывода.

■I. Сравнительное исследование действия элементов внеклеточного матрикса на поведение кератиноцитов в культуре показало, что;

а) наибольшее прикрепление клеток наблюдается . на коллагене I типа, матриксе, синтезированном фибробластами, и на матригеле в концентращга 8 мг/мл;

б) максимальное распластывание• кератиноцитов отмечается на

матриксэ, синтезированном фибробластами, и матригеле ;

в) псевдоподиальная активность кератиноцитов усилена' на коллагене I типа;

г) повышение прироста клеток наблюдается у кератиноцитов на коллагене I типа и Матриксе, наработанном фибробластами; стимулирующий эффект матригеля на пролиферацию кератиноцитов прямо пропорционален его концентрации в диапазоне 0,2 - 8 мг/мл.

2. При преципитации матригеля из 20% раствора сульфата аммония значительная часть гликозаминогликанов не преципитирует и остается в растворе. Сравнительный анализ фракций после преципитации матригеля 20S раствором сульфата аммония показал, что:

а) фракция осадка мало отличается от полного матригеля по своему воздействию на клетки в культуре и в ранах;

б) фракция супернатанта ингибирует все изученные в данной работе характеристики поведения клеток в культуре, а именно прикрепление, распластывание, псевдоподиальную активность и пролиферацию; кроме того, данная фракция., не способствует приживлению пересаженных керапшоцитов на раневом ложе полнослойных ран.

3. Сравнительное исследование действия элементов внеклеточного матрикса на заживление ран показало, что:

а) коллаген I типа, матригель, а также суспензия фибробластов ускоряют эпителизацию расщепленных ран;

б) матригель и суспензия фибробластов способствуют приживлению суспензии аллогенных кератиноцитов на раневом ложе полнослойных ран, ускорение приживления Прямо пропорционально концентрации добавленного матригеля в диапазоне концентраций 0,2-8 мг/мл.

4. Культура кератиноцитов может иметь прогностическую ценность при выборе элементов внеклеточного матрикса для их использования в качестве добавок при заживлении различных типов ран.

Основное содержание работы изложено в следущих публикациях:

1. Ю.В.Горелик, М.И.Блинова, Г.П.Пинаев.' Влияние подложки на распластывание кератиноцитов новорожденных крыс. // Цитология. 1994. Т.34.N9.С. 62-63.

2. Ю.В.Горелик, М.И.Блинова, Г.П.Пинаев. Влияние субстрата на распластывание, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов новорожденных крыс. // Цитология. 1994. Т.36. N6. С.520.

3. Ю.В.Горелик, М.И.Блинова, Г.П.Пинаев. Влияние влементов' внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крыс 'при культивировании в низкокальциевой среде. // Цитология. 1994. ' Т.36. N12. С. I209-I2I2.

4. Ю.В.Горелик, Л.В.Кухарева, М.И.Блинова. Стриппинг культур кератиноцитов крыс. // Цитология. 1994. Т.36. N12. С. 1205-1208.

5. Н.В.Цупкина, Н.С.Николаенко, Э.И.Конду, Р.Я.Подчерняева, А.В.Полюшкин, А.Г.Васильев, Ю.М.Никитина, Ю.В.Горелик, Г.П.Пинаев. Физико-химические свойства питательных сред, составленных из компонентов отечественного производства. // Цитология. 1994.Т.36. N6.С.541.

6. J.V.Gorelik, H.I.Blinova, G.P.Pinaev. Culture substrate influences rat keratinooyte differentiation and oytoekeletal aotin distribution. /7 Cell Biol.Internatl., 1994, v.18, N5. TU-7

7. J.V.Gorelik, L.V.Kukhareva, M.I.Blinova. Matrigel free of low moleoular weight Iraotion oan decrease keratinooyte growth.// Proo. 8th Int. Conf. of the Int. Soo. Differentiation, 1994, Ю44

8. М.И.Блинова, Б.А.Парамонов, Ю.В.Горелик, И.В.Воронкина, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина. Использование влементов внеклеточного матрикса для заживления ран и восстановление кожного покрова. В сб.: Избранные вопросы хирургии и военно-полеВой хирургии. Изд-во Саратовского университета, 1995, с.30-31.

9. J.V.Gorelik, M.I.Blinova, I.A.Diakonov, L.Y.Kukhareva. G.P.Pinaev. Role of feeder oells in spreading and oytoskeleton organization of newborn rat keratinocytes. Cell Biol. Intern., 1995, v.19, p.59-64

10. J.V.Gorelik, B.V.Paramonov, M.I.Blinova, L.V.Kukhareva. Matrigel increases keratinooyte suspension "take" in split-thickness wound in rats. Proo. 4th Int. Congress. Int. Wound. Association. Tel-Aviv, 1996, p.88.

■ II. М.И.Блинова, Б.А.Парамонов, Ю.В.Горелик, И.В.Воронкина, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина. Влияние элементов внеклеточного матрикса на процесс заживления ран. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1996. (в печати)

12. И.А.Дьяконов, Ю.В.Горелик, М.И.Блинова. Влияние влементов внеклеточного матрикса на псевдоподиальную активность кератиноцитов крыс.// Цитология. 1996. Т.38. N 2. С.198-199.

13. Н.С.Николаенко, Л.А.Садбфьев, Л.В.Кухарева, Ю.М.Никитина, А.Ю.Молодых, Н.В.Цупкина, Ю.В.Горелик, Г.П.Пинаев.

Сравнительное исследование соотава белков внеклеточного матрикса культивируемых <ЗЕибробластов крысы.// Цитология. 1996. Т.38. N 2. С.229-230.

14. М.И.Блинова, В.Парамонов, Ю.В.Горелик, 1).М.Никитина, И.В.Воронкина, Л.В.Кухарева. Влияние элементов внеклеточного матрикса на процесс заживления ран.// Цитология. 1996. Т.38. N2. С.181-182.

Тип. ЬНццЯоЪдЧТ. Г/ОР. ¿^< 9С■