Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние интерлейкина-1 бета на регенерацию эпидермиса при заживлении кожных ран на фоне иммуносупрессии

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние интерлейкина-1 бета на регенерацию эпидермиса при заживлении кожных ран на фоне иммуносупрессии"

Розломий Валентин Леонидович

Влияние интерлейкина-1бета на регенерацию эпидермиса при заживлении кожных ран на фоне иммуносупрессии

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 ДЕК 2011

Санкт-Петербург 2011

Диссертация выполнена на кафедре общей физиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в лабораториях иммунофармакологии и электронной микроскопии Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства России, г. Санкт-Петербург.

Научные руководители:

доктор биологических наук, доцент Рыбальченко Оксана Владимировна, доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Гилерович Елена Георгиевна

доктор медицинских наук, профессор Гавришева Наталья Алексеевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Огта Северо-западного отделения РАМН

Защита состоится «_20_» декабря 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д.

12).

Автореферат разослан « /» 2011

У

г.

доктор медицинских наук

Ученый секретарь диссертационного сове;

П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблемы морфологии и патофизиологии заживления хронических кожных ран интенсивно изучаются в современных исследованиях по хирургии, иммунологии и дерматовенерологии. При регенерации кожной раны запускается каскад различных иммунологических факторов, одним их которых является интерлейкин-ip (ИЛ-1р) - многофункциональный цитокин. ИЛ-ip обладает широким спектром эффектов на различные клетки, включая клетки эпителия кожи. При регенерации эпителия кожи ИЛ-ip обеспечивает миграцию лейкоцитов в область раны и активирует нейтрофилы в зоне воспаления. Кроме того, ИЛ-lp может стимулировать рост соединительной ткани, вызывая пролиферацию фибробластов, а также способствовать эпителизации, регулируя пролиферацию кератиноцитов (Thornton et al., 1990; Chedid et al., 1994, Maas-Szabowski et al., 2000). ИЛ-ip инициирует продукцию других провоспалительных цитокинов. Своё влияние на кератиноциты ИЛ-ip способен осуществлять как посредством связывания с комплементарным рецептором I типа на поверхности кератиноцита, так и опосредованным путем за счет стимуляции продукции фактора роста кератиноцитов фибробластами после активации рецептора ИЛ-1 I типа на поверхности фибробласта (Werner, 1994; Grewe, 1996; Maas-Szabowski et al., 2000).

Хотя способность ИЛ-ip положительно влиять на заживление ран была хорошо изучена in vitro, всего несколько работ опубликовано об эффекте аппликации ИЛ-ip у экспериментальных животных. ИЛ-ip применялся у мышей с кожными ранами, получавших дозы радиоактивного облучения в качестве замедляющего фактора (Vegesna et al., 1995). В этих условиях ИЛ-ip действовал как фиброгенный фактор. Также местное применение ИЛ-ip способно ускорять реэпителизацию полнокожных ран у мышей на фоне введения гидрокортизона, что было показано при морфологических исследованиях (Variouchina et al., 2003). Кроме того показано, что при повреждении кожи экспрессия мРНК и уровень эндогенного белка ИЛ-ip в раневой жидкости повышаются, достигая пика на ранних стадиях заживления (Sato, Ohshima, 2000). Местная аппликация человеческого рекомбинантного ИЛ-1а, обладающего идентичным действием с ИЛ-1р, значительно ускоряла заживление кожных ран у свиней (Sauder et al., 1990). Зажившие под влиянием ИЛ-1а раны представляли собой полную и структурно-нормальную эпидермальную регенерацию.

Ранение кожи, как правило, сопровождается нарушением эпидермального барьера, в состав которого входят роговой слой эпидермиса с белково-липидным комплексом, а также плотные контакты между клетками зернистого слоя. Основными структурными и регуляторными белками плотных контактов являются клаудины. «Нокаутные» мыши по

клаудину-1 или гиперэкспрессируклцие клаудин-6 умирают вскоре после рождения вследствие нарушения эпидермального барьера и массивной потери жидкости через эпидермис, что подчеркивает важность структур плотных контактов для поддержания барьерной функции кожи (Furuse et al., 2002; Turksen, Troy, 2002). В ходе эксперимента при исследовании заживления раны человека показано, что белки плотных контактов клаудин-1, окклюдин и ZO-1 появляются уже в первых клетках нарастающего эпителиального пласта на самых ранних этапах заживления раны задолго до реконструкции рогового слоя (Brandner et al., 2002). Для сравнения, десмоколлин-1 -маркер дифференциации десмосом, или маркер рогового слоя филаггрин в регенерирующем эпидермисе на ранних этапах не определялись (Moll et al., 1998). ИЛ-lp способен влиять на экспрессию белков плотных контактов в различных тканях (Al-Sadi, Ma, 2007; Abe et al., 2003), однако его влияние на экспрессию белков плотных контактов в коже in vivo не изучено. Также показано, что короткая экспозиция высоких концентраций ИЛ-ip способна оказывать влияние на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ (Watson et al., 2007). Тем не менее, влияние длительной экспозиции малых доз ИЛ-ip на экспрессию белков плотных контактов in vitro также ещё не изучено.

Заживление кожных ран у лабораторных животных целесообразно изучать на фоне иммуносупрессии, вызываемой инъекциями гидрокортизона, поскольку данная модель позволяет снизить скорость раневого процесса и оценить влияние ИЛ-1 (3 на различные аспекты регенерации кожных покровов (Варюшина и соавт., 2004).

Цель исследования: изучение влияния интерлейкина-ip на динамику заживления кожных ран, а также на формирование эпидермального барьера у мышей на фоне иммуносупрессии. Задачи исследования:

1. Оценить динамику уменьшения раневой поверхности под влиянием интерлейкина-lp с помощью морфометрического анализа

2. Исследовать влияние интерлейкина-ip на ультраструктуру клеток при заживлении кожной раны

3. Исследовать локализацию белков плотных контактов при регенерации эпидермиса под влиянием интерлейкина-ip

4. Оценить влияние интерлейкина-ip на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ

Научная новизна. Впервые проведено комплексное электронно-микроскопическое, иммуноцитохимическое и молекулярно-биологическое исследование влияния ИЛ-ip на заживление кожных ран. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что местное

применение И Л-1 р способствует формированию межклеточных контактов (десмосом) между регенерирующими кератиноцитами. Впервые установлено, что нанесение ИЛ-lp на поверхность кожной раны сопровождается активизацией местных факторов защиты, что приводит к элиминации микроорганизмов из раны. Впервые показано, что ИЛ-ip ускоряет дифференцировку кератиноцитов. Получены новые данные о том, что ИЛ-ip усиливает экспрессию клаудина-1 в культуре кератиноцитов и меняет характер экспрессии белков плотных контактов в регенерирующих кератиноцитах при заживлении кожной раны. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены данные, которые позволяют расширить представления об эффектах, оказываемых ИЛ-ip на ткани при регенерации кожных покровов. Результаты, полученные в ходе исследования влияния ИЛ-ip на регенерацию кожных покровов у мышей на фоне иммуносупрессии, позволяют предположить возможные механизмы действия ИЛ-ip, применяемого при лечении кожных ран. Результаты диссертации использованы в курсах лекций по физиологии и иммунологии на медицинском и биолого-почвенном факультетах Санкт-Петербургского государственного университета. Положения, выносимые на защиту:

1. Интерлейкин-ip способствует восстановлению эпидермального барьера за счет образования межклеточных контактов при заживлении кожных ран

2. Интерлейкин-lp обусловливает формирование клеточных слоев, ускоряя дифференцировку кератиноцитов

3. Интерлейкин-lp ускоряет элиминацию микроорганизмов из раны, препятствуя развитию раневой инфекции

Апробация работы. Результаты исследования были доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом Форуме - 2008 (Санкт-Петербург, 2008); на VII Всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2009); IX Всероссийской молодежной научной конференции «Физиология человека и животных (от эксперимента к клинической практике)» (Сыктывкар, 2010); XIII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2010); XXIII Европейской конференции EITG (Солерно, 2010). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и 5 работ в сборниках трудов научно-практических конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка

литературы, включающего 291 источник, из которых 19 работ отечественных авторов и 272 - зарубежных. Диссертация иллюстрирована тремя таблицами и 33 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения регенерации кожи использовалась модель осложненного течения раневого процесса у мышей на фоне иммуносупрессии, вызванной введением гидрокортизона (Варюшина и соавт., 2004). Глюкокортикоиды обладают противовоспалительными и антипролиферативными свойствами, и способны замедлять нормальные процессы заживления у экспериментальных животных (Светикова K.M., Шемеровская Т.Г., 1975; Gupta et al., 1990). Выбор модели основывался на том, что кожные раны у мышей при отсутствии отягощающих раневой процесс факторов заживают быстро, поэтому сложно оценить стимулирующий эффект аппликаций ИЛ-lß. Показано, что гидрокортизон в дозе 25 мг/кг массы тела способен значительно снижать скорость реэпителизации кожных ран. Введение гидрокортизона приводит к уменьшению количества клеточных элементов в грануляционной ткани, а также к замедлению ее формирования и созревания (Варюшина и соавт., 2004). В данной концентрации гидрокортизон обладает выраженным системным действием. Его применение вызывает значительное снижение веса селезенки и количества спленоцитов у исследуемых мышей. Введение гидрокортизона приводит к уменьшению относительного и абсолютного количества лимфоцитов в крови (Варюшина и соавт., 2004).

В эксперименте использовали 45 белых беспородных мышей-самцов весом 22-25 г (Питомник РАМН «Рапполово», Россия). Животных содержали в индивидуальных клетках со свободным доступом к пище и воде. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с требованиями международных норм по работе с экспериментальными животными. Для нанесения полнокожных ран у мышей под анестезией каллипсолом (80 мг/кг веса, в/м) оттягивали кожу на нижней части спины и через кожную складку вырезали участок кожи округлой формы с помощью биопсийного ножа («Stiefel», Германия). Таким образом, после этой манипуляции на спине у мышей образовывались две раны диаметром 4 мм. Данная процедура позволяла получить полнокожную рану глубиной до поверхностной фасции мышц. День нанесения раны считали началом эксперимента и обозначали как «0 сутки». После проведения операции животных разделили на три группы, по 15 мышей в каждой. В качестве контрольной группы использовали оперированных животных, не получавших инъекций гидрокортизона. Второй группе мышей (группа «плацебо») вводили внутримышечно гидрокортизон («Гедеон Рихтер», Венгрия) в дозе 25 мг/кг массы тела ежедневно в течение 7 суток эксперимента, первый раз за сутки до

нанесения ран. Один раз в день в течение всего эксперимента кожные раны у мышей обрабатывали чистой ланолин-вазелиновой мазью (плацебо). Третьей группе мышей (опытная группа) гидрокортизон вводили по такой же схеме, а раны обрабатывали с помощью стандартного шпателя мазью на ланолин-вазелиновой основе, содержащей ИЛ-lß (ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России) в дозе 50 нг/мл мази. В данной концентрации ИЛ-lß продуцируется моноцитами при развитии воспалительной реакции in vitro (Cereijido et al., 1981; Thornton et al., 1990; Maas-Szabowski et al., 2000). В этой дозе HJl-lß оказывает исключительно местное влияние и не обладает системным эффектом, о чем свидетельствует отсутствие изменений количества лимфоцитов и нейтрофилов крови, веса селезенки, а также функциональной активности снленоцитов и нейтрофилов периферической крови лабораторных животных (Variouchina et al., 2003). Взятие материала в виде участка здоровой кожи с областью раны в центре проводили на третьи, 8-е и 14-е сутки с помощью биопсийных ножей («Stiefel», Германия) диаметром 8 мм. Дни взятия материала были выбраны с учетом динамики заживления кожных ран на фоне иммуносупрессии (Variouchina et al., 2003).

НаСаТ кератиноциты культивировались в RPMI среде, содержащей 10% бычью сыворотку (Biochrom, Германия), 600 мМ L-глутамина, 500 ME пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина (Seromed/Biochrom, Германия) в 20x10 мм культуральных блюдцах (Falcon, Becton Dickinson, Германия) при 37°С, 5% С02 и 100% влажности. К клеткам опытной группы добавляли рекомбинантный человеческий ИЛ-lß в концентрации 10 нг/мл среды. Через 7 суток после достижения ими конфлюэнтности, клетки механически соскабливали с поверхности культурального блюдца для проведения исследования мембранных белков методом Вестерн-блот. В качестве позитивного контроля при Вестерн-блоте использовалась культура клеток эпителия толстой кишки НТ-29/В6, экспрессирующая окклюдин и клаудины-1, -2, -3 и -5 (Amasheh et al., 2005).

Морфометрнческое исследование. Морфометрию области раны проводили непосредственно после операции, а также на третьи и седьмые сутки эксперимента. Определение площади раневой поверхности производили с помощью цифровой фотокамеры. Обработку изображений и измерение площади ран проводили на компьютере с помощью программы ImageJ 1.35r (NIH, США).

Электронно-микроскопическое исследование. При электронно-микроскопическом исследовании объектами исследования служили сегменты раны, взятые с границы очага поражения, которые фиксировали по Hayat раствором глутаральдегида и затем заливали в смолу Spurr (Spurr, 1969; Hayat, 1974). Для выявления наиболее оптимальных для электронно-микроскопического исследования зон регенерации кожи предварительно

получали полутонкие срезы и окрашивали метиленовым синим и основным фуксином для ориентирования материала в световом микроскопе. Затем на на ультратоме LKB-8800 (LKB, Швеция) готовили ультратонкие срезы. Контрастирование срезов проводили по методу Reynolds уранилацетатом и цитратом свинца (Reinholds, 1963). Готовые препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100C (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Полученные результаты оценивались полуколичественным методом.

Иммунофлюоресцеитное окрашивание белков плотных контактов. Для проведения иммунофлюоресцентной конфокальной микроскопии после взятия материала образцы ткани фиксировали в формалине, а затем заключали в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 4 мкм и монтировали на предметные стекла. На срезы наносили (60 мин; 37 °С) раствор первых моноклональных мышиных антител к окклюдину, клаудину-1 и ZO-1 в разведении 1:200 для окклюдина и 1:100 для клаудина-1 и ZO-1 (исходная концентрация 20 мкг/мл, Zymed Laboratories, США). После этого срезы отмывали блокирующим раствором и для визуализации первых антител инкубировали (60 мин, 37 °С) в растворе вторых моноклональных антител (исходная концентрация 2 мкг/мл, MoBiTec, Германия) в разведении 1:500, конъюгированных с Alexa Fluor™ 488. После проведения реакции срезы тщательно отмывали блокирующим раствором и проводили окраску ядер DAPI в разведении 1:1000. Препараты изучали с помощью конфокального лазерного микроскопа Zeiss LSM510 (Karl Zeiss, Германия) в институте клинической физиологии Свободного университета Берлина, используя 40-кратное увеличение и возбуждающую длину волны 488 нм. Эмиссия Alexa Fluor™488 происходила в зеленой области спектра. Данные по конфокальной микроскопии обрабатывали программным обеспечением LSM Image Browser (Германия).

Вестерн-блот. Для проведения Вестерн-блота определяли количество всех мембранных белков, содержащихся в суспензии кератиноцитов НаСаТ с помощью спектрофотометра (Tecan Spectra, Австрия). На основе полученных данных рассчитывался объем раствора мембранных белков и в течение 90 мин проводили электрофорез в полиакриламидном геле с напряжением 100 В.

Затем под воздействием электрического тока с постоянным напряжением 100 В в течение 60 мин осуществляли электроперенос белков с геля на гидрофобную мембрану. Для идентификации осажденных белков плотных контактов гидрофобную мембрану блокировали в буфере в течение 2 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами (Zymed Laboratories, США) к окклюдину (1:2000), клаудину-2 (1:1000), клаудинам-1, -7, -8, -10, -И, -12, -14, -15, -18, -23

(1:10000), клаудинам-З, -4, -5 (1:5000). Затем мембраны промывали и инкубировали со вторыми антителами (MoBiTec, Германия). После того как мембраны на 5 мин помещали в растворе Lumi-LightPLUS (Roche Diagnostics, Germany) для визуализации белков, проводили хемилюминисцентное определение белков плотных контактов. Детекцию и идентификацию белков проводили в анализаторе изображений LAS-1000 (Fujifilm, Japan). Для сравнения интенсивности сигналов окклгодина и клаудина-1 использовался метод депситометрии. Сравнительный анализ проводился с помощью программного обеспечения AI DA Raytest, 2.5 (Straubenhardt, Германия).

Статистический анализ. Полученные в ходе морфометрического исследования результаты выражали в процентах от исходной площади раны и проводили статистическую обработку с помощью компьютерной статистической программы NCSS 6.0.21 Jr, различия считали достоверными при р<0,05, использовался U-критерий Манна -Уитни. Для статистической обработки результатов денситометрии также использовался U-критерий Манна - Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ИЛ-lß на заживление кожной раны. Морфометрия площади кожной раны позволяла оценить скорость заживления. Измерение площади раневого дефекта при морфометрическом анализе показало, что иммуносупрессия, индуцированная инъекциями гидрокортизона, не приводила к статистически значимому снижению скорости уменьшения раневого дефекта на третьи сутки эксперимента (рис. 1). Существенные различия в скорости регенерации кожных покровов в исследуемых группах наблюдались на седьмые сутки эксперимента. В то время как у животных контрольной группы площадь раневого дефекта составляла 28±4% (п=7) от исходной площади раны, у мышей группы «плацебо» наблюдалось замедление скорости регенерации и определялось статистически значимое увеличение площади раневого дефекта, составившей 45±7% (п=5), что подтверждало развитие иммуносупрессии, вызванной инъекциями гидрокортизона. Однако у мышей опытной группы мазевые аппликации с ИЛ-lß приводили к ускорению заживления раны, и на седьмые сутки площадь раневого дефекта составляла 27±3% (п=7) и практически соответствовала таковой у животных контрольной группы

О Контроль 0 Плацебо а Опыт

нанйсемия раны

Рис. 1. Изменение площади раневой поверхности у животных под влиянием ИЛ-1р. * - р<0,05 относительно контроля и опыта на 7-е сутки.

Электронно-микроскопическое исследование влияния ИЛ-10 на ультраструктуру кератиноцитов при заживлении кожной раны на фоне иммуносупрессии. Анализ полутонких срезов пограничного участка ткани в области нанесения раны показал, что на восьмые сутки контрольная группа характеризовалась отсутствием раневого дефекта, в то время как в опытной группе и группе «плацебо» ещё сохранялись деструктивные изменения в коже (табл. 1). На 14-е сутки в контрольной группе определить область ранения не представлялось возможным вследствие полностью зажившего эпидермиса и появления волосяных фолликулов. Ткани в области раневого дефекта в опытной группе на 14-е сутки характеризовались наличием вновь образованного утолщенного эпидермиса, в то время как в группе «плацебо» на поверхности кожи у мышей ещё можно было отметить морфологические признаки раневого дефекта. Данные различия указывали на снижение скорости регенерации под влиянием применения гидрокортизона, что также подтверждалось результатами морфометрического анализа.

Таблица 1

Наличие раневого дефекта на коже мыши

Сутки от начала Контрольная Группа Опытная

эксперимента группа «плацебо» группа

3 + + +

8 - + +

14 - + -

Сравнительный анализ ультратонких срезов ткани из пограничной зоны раневого дефекта группы «плацебо» и опытной группы на третьи сутки эксперимента не выявил существенных отличий в препаратах животных исследуемых групп. Кератиноциты характеризовались неправильной формой, крупным ядром с выраженным преобладанием гетерохроматина, ядрышком и интер- и перихроматиновыми гранулами, светлой зоной цитоплазмы, насыщенной большим количеством свободных рибосом, что свидетельствовало о высоком уровне биосинтетической активности клеток нарастающего эпителиального пласта. Контакты между клетками определялись в виде единичных десмосом. На ультратонких срезах препаратов группы «плацебо» и опытной группы во внеклеточной среде отмечали обильный рост микроорганизмов - грамположительных и грамотрицательных бактерий. Одиночные бактериальные клетки и скопления в виде колоний располагались в большей степени в области струпа и на поверхности нарастающего эпителиального пласта. Наблюдаемые фрагменты поверхностной пленки, образующейся вокруг бактериальных микроколоний, свидетельствовали о специализации и дифференцировке клеток и высоком уровне организации микробных сообществ. Присутствие лишь единичных клеток микроорганизмов в контрольной группе наряду с минимальными изменениями в ультратонкой организации врастающих в структуру струпа кератиноцитов, по всей видимости, свидетельствует о том, что иммуносупрессивное воздействие гидрокортизона уже внесло существенный вклад в ослабление местных факторов защиты, но, тем не менее, это ещё не отразилось на белоксинтезирующей функции кератиноцитов.

На восьмые сутки с начала эксперимента ткань в области раны в контрольной группе характеризовалась наличием веретенообразных клеток в супрабазальных слоях, с цитоплазмой более высокой электронной плотности по сравнению с цитоплазмой клеток на третьи сутки эксперимента, а также со значительно меньшим количеством свободных рибосом. Ультратонкая организация клеток свидетельствовала о более низкой белоксинтезирующей функции по сравнению с кератиноцитами на третьи сутки эксперимента. Между клетками определялись десмосомы. Микробные сообщества, состоящие из нескольких бактериальных клеток, обнаружить в контрольной группе не удалось. В верхних слоях вновь образованного эпидермиса поверхностные клетки не содержали кератогиалиновые гранулы.

Кератиноциты в зоне регенерации группы «плацебо» характеризовалась выраженным снижением количества свободных рибосом и фагоцитарных включений. В кариоплазме кератиноцитов наблюдалось уменьшение насыщенности гетерохроматина, интер- и перихроматиновые гранулы не определялись, ядрышки присутствовали лишь в

единичных клетках, что указывает на снижение синтетической функции (рис. 2). Контакты между клетками определялись в виде единичных десмосом. В то же время в эпидермальных клетках зоны регенерации у мышей опытной группы на восьмые сутки хорошо визуализировались рибосомы, кариоплазма ядер клеток была насыщена гетерохроматином, определялись ядрышки с хорошо различимым гранулярным компонентом, а также пери- и интерхроматиновые гранулы, что указывает на активацию белоксинтезирующей функции под влиянием ИЛ-1р (рис. 3). В препаратах группы «плацебо» обнаружено значительное разнообразие различных микроорганизмов: грамположительных и грамотрицательных бактерий с фрагментами поверхностной пленки, что является свидетельством достаточно сложно организованного микробного сообщества. Обращало на себя внимание наличие мицелиальных форм микромицетов, что указывало на выраженность и глубину развития иммуносупрессии (рис. 4).

В ткани области раны опытной группы микроколонии микроорганизмов не были обнаружены, при этом на поверхности струпа определялись макрофаги с выраженной фагоцитарной активностью, что говорило об активации местных факторов защиты под действием ИЛ-1р (рис. 5).

На 14-е сутки с начала эксперимента клетки шиповатого слоя эпидермиса у контрольной группы мышей, сформировавшегося на месте раневого дефекта, характеризовались достаточно высоким уровнем метаболической активности: имели округлую форму с крупными овальными ядрами, в которых отмечалось резкое увеличение материала эухроматина, присутствие ядрышек и интер- и перихроматиновых гранул; в относительно узких полосках электроннопрозрачной цитоплазмы определялись многочисленные свободные рибосомы. Между клетками выявлены хорошо выраженные десмосомы. Клетки зернистого слоя характеризовались наличием в перинуклеарной зоне множественных крупных включений неправильной формы с очень высокой электронной плотностью, располагавшиеся в виде цепочки - гранулы кератогиалина, что указывает на высокую степень дифференцировки клеток.

На 14-е сутки эксперимента клетки зоны регенерации группы «плацебо» по-прежнему характеризовались сниженной белоксинтезирующей функцией. Наблюдалось значительное снижение количества рибосом, при этом шероховатая эндоплазматическая сеть была слабо выражена. Между клетками выявлялись единичные десмосомы.

Клетки супрабазального слоя вновь образованного эпидермиса у мышей опытной группы на 14-е сутки с начала эксперимента характеризовались ярко выраженным рибосомальным аппаратом, а также множественными контактами между цитоплазматическими выростами соседних клеток и десмосомами. Вновь образованный

,цв

я

Рис. 2. Ультратонкий срез участка кожи мыши в области края раны на восьмые сутки эксперимента. Группа «плацебо». Увеличение х4000.

Обозначения: Я - ядро кератиноцита, ЦВ - цитоплазматические выросты. Масштабная линейка - 1 мкм.

Рис. 3. Ультратонкий срез участка кожи мыши в области края раны на восьмые сутки эксперимента. Опытная группа. Увеличение х4000.

Обозначения: Я - ядро кератиноцита, Д - десмосома. Масштабная линейка - 1 мкм.

Рис. 4. Ультратонкий срез краевого участка кожной раны мыши на восьмые сутки эксперимента. Группа «плацебо». Увеличение х5000.

Обозначения: МФ - мицелиальная форма микромицетов. Масштабная линейка - 1 мкм.

Рис. 5. Ультратонкий срез краевого участка кожной раны мыши на восьмые сутки

эксперимента. Опытная группа. Увеличение х2000.

Обозначения: М - макрофаги, С - струп. Масштабная линейка - 1 мкм.

зернистый слой в тканях раневой зоны опытной группы животных отличался наличием уплощенных клеток с электронно-прозрачной цитоплазмой, содержащей свободные рибосомы, и гранулами кератогиалина, что указывало на дифференцировку клеток.

При исследовании ткани группы «плацебо» на 14-е сутки достаточно часто выявлялись физиологически активные формы бактерий, при этом мицелиальные формы микромицетов, свидетельствующие о глубоком поражении тканей, отсутствовали. В то же время в образцах тканей животных опытной группы физиологически активные формы бактерий не выявлялись.

Влияние ИЛ-1(1 на локализацию белков плотных контактов при заживлении кожной раны на фоне иммуносупрессии. Методом иммунофлюоресцентного окрашивания с последующим анализом изображений на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе была исследована локализация клаудина-1 и окклюдина в пролиферативной зоне и наползающем эпителиальном пласте при заживлении кожной раны. Клаудин-1 и окклюдин были выбраны как основной структурный компонент и маркер плотных контактов в коже, соответственно. Точное ориентирование в препаратах стало возможным после предварительной гистологической окраски срезов и просмотра их в световом микроскопе.

На третьи сутки эксперимента анализ препаратов после иммунофлюоресцентного окрашивания не выявил существенных различий в локализации сигнала от клаудина-1 и окклюдина в области раны у мышей исследуемых групп. Клаудин-1 и окклюдин были обнаружены в клетках зоны пролиферации и поверхностных слоев нарастающего эпителиального пласта всех исследуемых препаратов.

Анализ образцов после иммунофлюоресцентного окрашивания на восьмые сутки показал, что в препаратах у мышей контрольной группы клаудин-1 и окклюдин определялись в поверхностных слоях сформированного эпидермиса, за исключением вновь образованного рогового (рис. 6 А, Б). Роговой слой в исследуемых препаратах окрашивался неспецифически. При исследовании препаратов области раны у мышей, получавших гидрокортизоновую терапию без аппликаций ИЛ-1Р (группа «плацебо»), специфический сигнал ни для одного белка плотных контактов получен не был (рис. б А", Б'). В тканях опытной группы аппликации ИЛ-1 р приводили к появлению сигнала от клаудина-1 и окклюдина. Клаудин-1 характеризовался локализацией в поверхностных слоях зоны пролиферации и врастающего под струп эпителиального пласта, а окклюдин определялся во всей пролиферативной зоне и поверхностных слоях эпителиального пласта. При гистологическом анализе препаратов методом световой микроскопии область раны животных контрольной группы на 14-е сутки характеризовалась полным заживлением, в

Контрольна Группа Опытная

я группа «плацебо» группа

' г ? А' • ч Г

20 рт

1 Б' К" / *

.(¡¿го^п--'-^"..

Рис. 6. Локализация белков плотных контактов во вновь образованном эпидермисе (А, Б), зоне пролиферации (А', А", Б") и нарастающем эпителиальном пласте (Б') на восьмые сутки эксперимента.

Голубым отмечены ядра клеток, окраска ОАР1.

Стрелками отмечены места локализации белка. Масштабная линейка - 20 мкм.

Группа Опытная

«плацебо» группа

Я А' ' \ - ■-.' : .л«.

ёут* ' . Б : чС ЩУ Е. \ V Ч ' ц * 11 ' . V 'гот-'

Рис. 7. Локализация белков плотных контактов во вновь образованном эпидермисе (А', Б'), зоне пролиферации (А) и нарастающем эпителиальном пласте (Б) на 14-е сутки эксперимента.

Голубым отмечены ядра клеток, окраска ОАР1.

Стрелками отмечены места локализации белка. Масштабная линейка - 20 мкм.

Рис. 8. Экспрессия различных белков плотных контактов в культуре клеток НаСаТ и Н-29/В6

Обозначения: Оккл - окклюдин, Клдн - клаудин. Число обозначает порядковый номер клаудина.

ИЛ-1Р Ктрл ИЛ-1(3 Ктрл

- * да»;

Клдн-1 Оккл

Рис. 9. Экспрессия окклюдина и клаудина-1 в культуре клеток НаСаТ под влиянием ИЛ-1(3

Обозначения: Оккл - окклюдин, Клдн-1 - клаудин-1, ИЛ-1Р - опытная группа, Ктрл -контрольная группа.

связи с чем обнаружить зону ранения для проведения иммунодитохимии не представлялось возможным. На 14-е сутки у мышей группы «плацебо», получавших инъекции гидрокортизона без аппликаций ИЛ-1(3, наблюдался сигнал от клаудина-1 и окклюдина на протяжении всей зоны пролиферации, а также в поверхностных слоях нарастающего эпителиального пласта. В то же время в препаратах кожи животных опытной группы сигнал от клаудина-1 и окклюдина обнаруживался только в поверхностных слоях вновь образованного эпидермиса (рис. 7).

Экспрессия белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ. С помощью Вестерн-блота при исследовании пятнадцати белков плотных контактов (окклюдин, клаудины-1, -2, -3, -4, -5, -7, -8, -10, -И, -12, -14, -15, -18 и -23) в контрольной группе культуральных кератиноцитов НаСаТ были обнаружены только 5 из них: окклюдин и клаудины -1, -3, -12 и -14 (рис. 8). Окклюдин был идентифицирован как белок с молекулярным весом 60 кДа, а клаудины - 23 кДа, что соответствовало литературным данным (Тзикйа И а1., 2001; ИщНа е1 а1., 2006). Для клаудинов-12 и -14 сигнал от клеток культуры НТ-29/В6 не был получен, поскольку данная культура в норме не экспрессирует эти клаудины. Присутствие клаудина-14 в кератиноцитах показано впервые. Повторные опыты по определению экспрессии изучаемых клаудинов были идентичны.

Сопоставление результатов Вестерн-блота для клаудина-1 и окклюдина в опытной и контрольной группах выявило различия плотности сигналов (рис. 9). Сравнение методом денситометрии интенсивности сигналов клаудина-1 и окклюдина при воздействии ИЛ-1Р показало, что добавление ИЛ-1Р к культуре клеток приводит к существенному усилению сигнала для клаудина-1 (рис. 10).

Рис. 10. Изменение интенсивности сигналов окклюдина и клаудина-1 под действием ИЛ-1|3 в культуре клеток НаСаТ. * - Р<0,05 - относительно контроля.

Сигнал был почти в четыре раза интенсивней относительно контроля. Таким образом, ИЛ-1р увеличивает уровень экспрессии клаудина-1. В то же время для окклюдина значимого усиления сигнала обнаружить не удалось. По всей видимости, в данной концентрации ИЛ-1р не оказывает влияние на экспрессию окклюдина.

Использованная в работе модель осложненного течения раневого процесса у мышей на фоне иммуносупрессии, вызванной введением гидрокортизона, позволила исследовать влияние местных аппликаций ИЛ-1Р на заживление кожных ран. Иммуносупрессивная терапия способна значительно замедлить течение раневого процесса и эпителизацию кожной раны. В то же время по данным морфометрического исследования динамики уменьшения раневой поверхности и гистологического анализа полутонких срезов местное применение ИЛ-1р ускоряет заживление кожной раны на фоне иммуносупрессии.

Снижение скорости эпителизации ран под действием гидрокортизона может быть опосредовано способностью гидрокортизона ингибировать продукцию одного из основных регуляторов активности кератиноцитов - фактора роста кератиноцитов (ВгаисЫе й а1., 1995), а также препятствовать синтезу провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-1р, непосредственно индуцирующего синтез фактора роста кератиноцитов фибробластами (НйЬпег е1 а1., 1996).

Применение гидрокортизона приводит к значительному снижению белоксинтезирующей функции и замедлению дифференцировки регенерирующих эпидермальных клеток. По всей видимости, это находит прямое отражение в снижении экспрессии регенерирующими кератиноцитами белков плотных контактов и нарушении формирования эпидермального барьера в процессе заживления кожной раны. Развитие иммуносупрессии приводит к значительному ослаблению местных факторов защиты при регенерации кожи, что выражается в обильном росте микроорганизмов -грамположительных и грамотрицательных бактерий. Кроме того, фрагменты поверхностной пленки указывают на присутствие достаточно сложно организованного микробного сообщества, а появление мицелиальных форм микромицетов свидетельствует о подавлении местных факторов защиты и выраженности развития иммуносупрессии.

Местное применение ИЛ-1Р оказывает заметное влияние на морфологические характеристики кератиноцитов в области раны. ИЛ-1р приводит к восстановлению белоксинтезирующей функции кератиноцитов и их дифференцировке, о чем свидетельствует активация экспрессии белков плотных контактов и появление в цитоплазме кератиноцитов кератогиалиновых гранул. Местные аппликации ИЛ-1Р на фоне иммуносупрессии способствуют интенсивному очищению раны от микроорганизмов и препятствует развитию раневой инфекции. Появление на поверхности раны макрофагов с

выраженной фагоцитарной активностью указывает на восстановление местных факторов защиты на фоне иммуносупрессии.

Использование клеточной культуры кератиноцитов НаСаТ позволило оценить, обладает ли ИЛ-lß прямым влиянием на экспрессию белков плотных контактов клаудина-1 и окклюдина как основного структурного белка и маркера плотных контактов соответственно. При исследовании культуры кератиноцитов НаСаТ методом Вестерн-блот продемонстрирована экспрессия окклюдина, а также клаудинов-1, -3, -12 и -14. Результаты Вестерн-блота подтверждают полученные ранее с помощью Нозерн-блота данные, показавшие присутствие мРНК окклюдина, а также клаудинов-1 и -3 в культуре кератиноцитов НаСаТ (Tebbe et al., 2002). Полученный спектр экспрессии клаудинов отличается от состава белков плотных контактов в коже млекопитающих, которая характеризуется экспрессией окклюдина и клаудинов-1, -4, -7, -8, -11, -12, -17, -18 (Arabzadeh et al., 2008; Brandner et al., 2002). Однако в обоих случаях в структурах плотных контактов отсутствуют порообразующие белки, такие как клаудины-2, -6 и -16, что подтверждает функцию непроницаемого барьера плотных контактов между кератиноцитами в эпидермисе. В различных эпителиальных тканях экспрессия клаудинов-1, -3 приводит к формированию плотного барьера и увеличению трансэпителиального сопротивления в исследуемых клеточных культурах (Anderson, Van Itallie, 2009). Следует отметить присутствие в культуре кератиноцитов НаСаТ клаудина-14, которое было показано впервые. Известно, что присутствие клаудина-14 встречается в наиболее плотных барьерах (Ben Josef et al., 2003).

Почти четырехкратное увеличение интенсивности сигнала от клаудина-1 под влиянием ИЛ-lß указывает на то, что ИЛ-lß оказывает прямое влияние на экспрессию клаудина-1. Увеличение экспрессии клаудина-1 под действием ИЛ-lß в культуре кератиноцитов НаСаТ моделирует появление клаудина-1 на ранних этапах заживления кожной раны, сопровождающееся увеличением уровня ИЛ-lß в раневой жидкости. Полученные результаты подтверждают гипотезу, согласно которой при нарушении кожных покровов между кератиноцитами формируются плотные контакты, и именно они препятствуют чрезмерной потере влаги через раневую поверхность и защищают организм до тех пор, пока не сформируется полноценный роговой слой (Malminen et al., 2003).

ВЫВОДЫ

1. Местное применение препарата интерлейкина-lß на фоне иммуносупрессии, вызванной инъекциями гидрокортизона, на 7-е сутки эксперимента приводит к достоверному уменьшению раневого дефекта по сравнению с кожными ранами у мышей группы «плацебо».

2. На ультраструктурном уровне показано появление кератогиалиновых гранул в цитоплазме кератиноцитов на 14-е сутки эксперимента под действием интерлейкина-lß, что свидетельствует о клеточной дифференцировке, не наблюдаемой в препаратах группы «плацебо» на этом сроке.

3. РНП-содержащие структуры ядра, развитие рибосомального аппарата, появление десмосомальных контактов между эпидермальными клетками, наряду с выявлением белков плотных контактов клаудина-1 и окклюдина свидетельствуют об активации процессов регенерации под влиянием аппликаций интерлейкина-lß на фоне иммуносупрессии на 8-е сутки эксперимента.

4. Аппликация препарата интерлейкина-lß на фоне иммуносупрессии приводит к активизации местных факторов защиты, о чем свидетельствует появление на поверхности ран у мышей опытной группы макрофагов с выраженной фагоцитарной активностью на 8-е сутки эксперимента.

5. Элиминация бактериальных клеток и микромицетов из ран у животных опытной группы, в отличие от ран у мышей группы «плацебо» на 8-е и 14-е сутки эксперимента, дополнительно подтверждает местное иммуностимулирующее действие интерлейкина-lß.

6. Внесение препарата иктерлейкина-lß в кулыуральную среду кератиноцитов приводит к четырехкратному увеличению экспрессии белка плотных контактов клаудина-1 по сравнению с кератиноцитами в контроле.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Розломий ВЛ., Варюшина Е.А., Рыбальченко О.В. Динамика заживления экспериментальной раны у мышей под влиянием препарата интерлейкин-lß // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2009. 5. С. - 79-82.-0,3/0,1 п.л.

2. Розломий ВЛ., Марков А.Г. Влияние интерлейкина-lß на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - № 3. - С. 251-254. - 0,4 / 0,2 п.л.

3. Варюшина Е.А., Розломий ВЛ., Александров Г.В., Рыбальченко О.В., Потокин И.Л., Исаева E.H., Симбирцев A.C. Влияние местного применения интерлейкина-lß на цитологические параметры заживления кожной раны // Цитокины и воспаление. -2010,-№2.-С. 7-12.-0,7/0,1 п.л.

на цитологические параметры заживления кожной раны // Цитокины и воспаление. - 2010. - № 2. - С. 7-12. - 0,7 / 0,1 п.л.

4. Марков А.Г., Розломий ВЛ., Варюшина Е.А., Александров Г.В., Симбирцев А.С. Влияние ИЛ-lp на экспрессию белков плотных контактов при регенерации кожной раны на фоне иммуносупрессии // Российский иммунологический журнал. - 2010. -Т. 4(13). - № 1. - С. 54-59. - 0,5 / 0,1 п.л.

Тезисы докладов:

5. Рыбальченко О.В., Потокин И.Л., Варюшина Е.А., Александров Г.В., Розломий ВЛ. Электронно-микроскопическое исследование влияния интерлейкина 1 р на развитие раневого процесса // Материалы Объединенного иммунологического форума в Российском Иммунологическом Журнале. - Санкт-Петербург, 2008. - Т. 2 (11). -№2-3.-С. 135.-0,2/0,1 п.л.

6. Розломий ВЛ., Марков А.Г. Влияние интерлейкина-1 бета на экспрессию белков плотных контактов при регенерации кожной раны на фоне иммуносупрессии // Материалы докладов IX Всероссийской молодежной научной конференции ИФ Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных (от эксперимента к клинической практике)». - Сыктывкар, - 2010. - С. 145-147. - ОД / 0,1 п.л.

7. Розломий ВЛ. Влияние интерлейкина-1бета на цитологические параметры заживления кожной раны // Материалы XIII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» «Фундаментальная наука и клиническая медицина». - Санкт-Петербург, - 2010. - С. 169-170.-0,2 п.л.

8. Rybalchenko О., Bondarenko V., Rozlomiy V., Orlova О. «Ultrastructural organization of biofilms of opportunistic microorganisms - representatives of gut human microbiota» // 23rd European Intestinal Transport Group (EITG) Meeting 7-10.04. - Salerno, Italy, -2010.-P. 18.-0,4/0,1 пл.

9. Марков А.Г., Розломий ВЛ. Влияние интерлейкина-ip на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ // Тезисы VII Всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем". - Санкт-Петербург, - 2009. - С. 273. - 0,2 /0,1 п.л.

Подписано в печать 17.11.11 Формат 60х84'/]б Цифровая Печ. л. 1.25 Уч.-изд.л, 1.25 Тираж 100 Заказ 17/11 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)