Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная, морфометрическая и иммуногистохимическая характеристика кожного регенерата и иммунокомпетентных органов на фоне локального воздействия температурного фактора (экспериментальное исследован

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурная, морфометрическая и иммуногистохимическая характеристика кожного регенерата и иммунокомпетентных органов на фоне локального воздействия температурного фактора (экспериментальное исследован"

На правах рукописи

Маркелова Полина Павловна

СТРУКТУРНАЯ, МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЖНОГО РЕГЕНЕРАТА И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ НА ФОНЕ ЛОКАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРНОГО ФАКТОРА (экспериментальное исследование)

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург 2014

К

005549926

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Соловьев Георгий Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Правоторов Георгий Васильевич, профессор кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России;

доктор медицинских наук, профессор Четвертных Виктор Алексеевич, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России. Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России. ^

Защита состоится 2014г. в _ час на

заседании Диссертационного Совета Д 208.066.04 при ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия», 460000, г.Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

2014г.

Н.Н. Шевлюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Несмотря на большое количество исследований, до настоящего времени не существует четкого представления о ряде процессов, протекающих в ходе репаративной регенерации (Ланичева А.Х. Семченко В.В., Степанов С.С., 2010; Винник Ю.С. с соавт., 2011). Механизмы репарации неразрывно связаны с воспалением и формируют с ним единую реакцию на повреждение (Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2001; Данилов Р.К., 2001, 2008; Молокова О. А., 2012). Репаративная регенерация является стереотипным процессом, однако имеет свои особенности в различных органах и тканях, в том числе и при заживлении кожных ран. Детальное исследование регенерации имеет не только фундаментальную, но и клиническую направленность, так как является основой для разработки оптимальных режимов и методов лечения (Ноздрин В.И., 2006; Ноздрин В.И. и др., 2008).

Актуальность изучения вопросов регенерации ран кожного покрова обусловлена высокими уровнями травм, особенно среди населения детского возраста (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003). Наряду с традиционными методами пластической, эстетической и реконструктивно-восстановительной хирургии, в последние годы активно внедряются консервативные методики контроля за активностью заживления дефектов органов на разных стадиях репаративного процесса. В конечном итоге весь арсенал способов ускорения трансформации биологического субстрата из состояния «болезнь» в состояние «здоровье» направлен на достижение реституции пораженного участка (Morelli J.G., 1998; Адаскевич В.П., 2000; Фенчин K.M., 2009).

В исследованиях ряда авторов (Черешнев В.А. и др, 2002; Бабаева А.Г., 2009; Храмцова Ю.С. и др., 2012) установлено участие иммунной системы в регуляции процессов физиологической и репаративной регенерации тканей и органов. В этой связи представляет интерес поиск способов влияния на процессы регенерации посредством воздействия на естественные механизмы иммунной системы.

Одним из распространенных способов воздействия на иммунную систему является воздействие температурного фактора (Суховей Ю.Г., 2006).

з

Цель исследования - выявить особенности структурных, морфометрических и иммуногистохимических показателей заживления кожной раны, тимуса и селезенки при локальном воздействии различных режимов температурного фактора в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Выявить динамику морфометрических параметров эпидермиса, сальной железы, волоса и соединительнотканной основы регенерирующей кожи на фоне температурной экспозиции.

2. Изучить состояние пролиферативной активности клеток генеративных слоев эпидермиса (кератиноцитов) и дериватов кожи (себоцитов, клеток корневых эпителиальных влагалищ волоса), содержание клеток Лангерганса на стадиях заживления дефекта кожи на фоне температурной экспозиции.

3. Изучить состояние компонентов дермы на стадиях заживления кожной раны на фоне температурной экспозиции.

4. Исследовать динамику морфометрических и иммуногистохимических параметров тимуса и селезенки лабораторных животных на фоне формирования кожного регенерата и действия температурного фактора.

Научная новизна работы. Впервые показано, что температурный фактор неоднозначно действует на процессы репарации кожной раны: ускорение ранних стадий регенераторного процесса выявлено у мышей в условиях «холодового» режима. Низкие температуры стимулируют образование грануляционной ткани и способствуют ускорению процесса контракции краев раны. На последующих и заключительных стадиях эксперимента действие «холодового» фактора вызывает замедление органотипической дифференцировки эпителиальных и

соединительнотканных компонентов регенерата. Одной из особенностей соединительнотканного компонента кожного регенерата при действии низких температур является увеличение количества тучных клеток с явлениями дегрануляции в сосочковом слое дермы. При холодовом воздействии не прослеживается стадийность изменений в тимусе, сохраняется структурно-функциональная стабильность в дольках.

В режиме действия «теплового» фактора отмечено ускорение органотипической дифференцировки эпидермиса, дериватов кожи и формирование кожного регенерата на уровне реституции, выявлена стадийность структурно-функциональных изменений в тимусе: начальному периоду были характерны деструктивно-компенсаторные прогрессивные процессы, восстановительному периоду - возвращению к исходному состоянию.

Воздействие низких и повышенных температур вызывает уменьшение размеров селезеночных телец и увеличение числа фагоцитирующих макрофагов в красной пульпе селезенки.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана экспериментальная модель для изучения влияния дозированных температурных воздействий на ход регенераторных процессов в кожных ранах.

Определены физиологические параметры (длительность, цикличность) температурных режимов, способствующих ускорению закрытия дефекта и органотипической регенерации кожного покрова. Повышенные температуры (+42°С, длительностью воздействия 30 секунд в течение 5 дней) обеспечивают ускорение клеточных, тканевотипических и органотигшческих преобразований регенерата, создают условия для реституции кожи как органа. При низких температурах (+8°С, длительностью воздействия 5 секунд в течение 5 дней) регенераторный процесс протекает замедленно и к конечным стадиям эксперимента не обеспечивает реституции пораженного участка кожи.

Проведенные исследования позволили расширить представления о механизмах взаимодействия репаративного процесса и иммунной системой. Установлено, что кратковременное температурное воздействие оказывает влияние на иммунную систему на разных ее уровнях организации: от иммунокомпетентных клеток в кожном регенерате до иммуноархитектоники периферического органа (селезенки) и центрального органа (тимуса) иммунной системы организма. Активность процессов регенерации коррелирует с состоянием органов иммунного ответа организма.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Кратковременные режимы температурного воздействия оказывают влияние на течение репаративного процесса, полноту регенерации кожных ран и состояние клеточных дифферонов иммунокомпетентных органов.

2. Дозированное холодовое воздействие на область раны ускоряет эпителизацию, способствует закрытию дефекта, пролонгирует процессы морфогенеза дериватов кожи, вызывает увеличение числа макрофагов и уменьшение числа плазмоцитов в селезенке, не оказывает регистрируемого влияния на состояние тимуса.

3. Повышенные температуры стимулируют органотипическую дифференцировку эпителиального и соединительнотканного компонентов регенерата, способствуют реституции пораженного участка, нарастанию содержания макрофагов и плазмоцитов в селезенке, динамичным преобразованиям коркового и мозгового вещества долек тимуса на стадиях репарации.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования докладывались и обсуждались на: II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека» (Тюмень, 2012); 47-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2013); VII терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2013); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптагенеза и репаративных гистогенезов», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ для публикации материалов кандидатских и докторских диссертаций.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Работа изложена на 135 страницах печатного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 30 рисунками. Библиографический указатель включает 148 отечественных и 95 работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Исследование было проведено на 100 лабораторных мышах самцах массой 20-23г (табл. 1). Животные содержались в стандартных условиях вивария. Все эксперименты соответствуют этическим нормам, изложенным в Женевской конвенции (1971), «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). Эвтаназия животных проводилась методом дислокации шейных позвонков под наркозом.

Воздействие температурного фактора проводили с помощью опытного образца аппарата «Терцик» (марка Я8-232С, Россия) с выносным модулем площадью 1см2. Использовали 3 режима температурного воздействия: (1) +8°С с длительностью сохранения температуры в течение 5 секунд (группа «Холод», п=35), (2) +42°С и длительностью сохранения температуры в течение 30 секунд (группа «Тепло», п=35), (3) температура выносного модуля +33°С (что соответствует температуре тела животного) и длительность воздействия 30 секунд (группа «Контроль», п=30). Температурное воздействие проводили локально на область раневой поверхности. Все манипуляции с животными проводили в одно и то же время суток (10.00) один раз в день в течение 5 дней подряд (Калёнова Л.Ф., Суховей Ю.Г., Фишер Т.А., 2006).

Исследование регенерации кожной раны на фоне локального воздействия температурного

фактора

Группа «Контроль» Группа «Холод» Группа «Тепло»

(30 жив.) (35 жив.) (35 жив.)

2 сутки 8 9 9

7 сутки 8 9 9

14 сутки 7 9 9

21 сутки 7 8 8

Материалом для исследования служили раневая поверхность кожи и внутренние органы, принимающие участие в процессах иммуногенеза (тимус, селезенка) на 2, 7, 14 и 21 сутки после моделирования раны и экспозиции локального температурного фактора.

Использовалась модель плоскостной асептической раны Турищева С.Н. (1996). В стерильных условиях под легким эфирным наркозом у мышей вырезали лоскут кожи в нижней трети спины справа от позвоночника по трафарету из пластикового стекла с овальным отверстием размером 3x4 мм. Трафарет прикладывался к телу. В отверстие за шерсть пинцетом вытягивалась кожа на высоту 1 мм и отрезалась хирургическими ножницами. При таком способе не затрагивался мышечный слой. В результате у мыши получалась открытая овальная рана площадью 60-70 мм2. Для сравнительного изучения динамики заживления ран проводили визуальное наблюдение и измерение площади ран в течение 3 недель ежедневно, оценивая состояние краев раны, ее отделимое, формирование кожного регенерата.

Для анализа заживления проводили измерение площади раневой поверхности по тесту, предложенном Поповой Л.Н. (1942). К ране прикладывали обработанную 70% спиртом прозрачную пленку, обводили края раны тонким маркером. Измеряли штангенциркулем больший и меньший диаметр овала раны. Площадь овала рассчитывали по формуле: 8=71*г1*г2, где Г] и г2 - радиусы овала, 8 - площадь раны. Во всех 5 группах изучали скорость контракции раны но формуле: У=(8п-8/8п)*100%, где V - скорость контракции раны, 8п - площадь раны при предыдущем измерении, Б - площадь раны при данном измерении.

8

Для гистологического анализа органы фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина, обрабатывали по стандартной методике и заливали в парафиновые блоки (Семченко, В.В., 2006). Гистологические серийные срезы в тангенциальной и фронтальной проекциях приготавливали на ротационном микротоме Microm НМ 335S. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали для обзорных целей гематоксилин-эозином по Эрлиху, для определения тучных клеток - азурП-эозином по Нохт-Максимову (Селиванов, Е.В., 2003). Для морфометрических исследований использовали модульную систему обработки и анализа изображений AxioVision Reí. 4.6. Подсчет клеток производили с помощью окулярной сетки Автандилова, с последующим перерасчетом на единицу площади S=1 мм2 (Автандилов Г.Г., 1990).

Выделяли 4 типа тучных клеток: 1) «1» тип - низкое содержание гранул в цитоплазме, располагающихся околомембранно; 2) «2» тип -среднее содержание гранул, располагающичся диффузно; 3) «3» тип -крупные клетки, с плотным и диффузным расположением гранул в цитоплазме; 4) «0» тип - дегранулированные клетки с признаками нарушения целостности цитоплазматической мембраны.

Степень дегрануляции оценивали как отношение числа «0» типа клеток к общему числу анализируемых клеток, выраженное в процентах. Включение гранул цитоплазмы тучных клеток оценивали с помощью среднего гистохимического коэффициента, который рассчитывается по формуле J.Astaldi и L.Verga: (3*а + 2*6 + 1*в + 0*г)/100.

Буквы (а-г) обозначают количество клеток с определенной интенсивностью реакции. Цифры (3-0) характеризуют степень интенсивности окрашивания, т.е. +++ (3+), ++ (2+), + (1+) и 0. Цифра 100 в знаменателе соответствует общему числу подсчитанных клеток этой группы.

ИГХ-исследование осуществляли на серийных парафиновых срезах толщиной 4 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином (Menzel-Glasser, Германия). Иммуноморфологический анализ проводили непрямым иммунопероксидазным методом реактивами по рекомендациям фирмы-изготовителя. Определяли экспрессию рецепторов Ki-67+ - маркер

9

ядер активно пролиферирующих клеток в кожном регенерате, CD3+ - маркер зрелых Т-лимфоцитов в кожном регенерате и тимусе, CDla+ - маркер клеток Лангерганса в кожном регенерате, CD20+ - маркер плазмоцитов в селезенке, CD68+ - маркер макрофагов. Все антитела и реактивы фирмы NeoMarkers Fremont, США. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Результаты ИГХ-реакции оценивали методом полуколичественного анализа: а) число иммунореактивных клеток: «-» -менее 5%, «+» - 5-25%, «++» - 50-75%, «+++» - 75-100%; б) интенсивность окраски: «+» - слабая экспрессия, «++» - сильная экспрессия. При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (Iki) по формуле: 1= (nVN)*100%, где п+ - число меченых ядер, N - общее число ядер в поле зрения микроскопа. Подсчеты производили в 20-23 полях зрения среза (Mitselou A. et al., 2003).

Статистическая обработка данных морфометрии проведена на персональном компьютере с использованием программы «SPSS 11.5 for Windows». Определяли средние величины, ошибку среднего, достоверность по t-критерию Стьюдента (Гмурман В.Е., 2000; Платонов А.Е., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Собственные исследования показали различия в течении раневого процесса при локальном действии низких и повышенных температур. Они выражались в разной скорости контракции раны и полноценности регенерации. Процессы репаративной регенерации в области дефекта кожи протекали в соответствии с известными закономерностями и сопровождались эпителизацией и последующей дифференцировкой эпидермального эпителия, формированием дериватов кожи (волос, сальная железа) и становлением слоев дермы мезенхимного генеза.

При экспозиции низкими температурами на область кожной раны в ранней фазе (2-е сутки) течения репаративного процесса в эпидермисе наблюдалось уменьшение количества пролиферирующих клеток по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2).

Пролиферативная активность клеток в эпидермисе кожного регенерата после воздействия ___ЛТФ, % (М±ш)__

Стадии «Контроль» «Холод» «Тепло»

(п=30) (п=35) (п=35)

2 сутки 46,98±0,25 10,03±0,14** 19,37±0,46*

7 сутки 8,13±0,01 25,11±0,26 15,13±0,26*

14 сутки 11Д6±0,01 28,9±0,20* 25,87±0,37*

21 сутки 29,31±0,25 28,13±0,2 53,16±0,31*я

Примечание: здесь и далее достоверность различий по сравнению с контролем - * -Р<0,05; ** - Р<0,01; достоверность различий по сравнению с группой «Холод» - # - Р<0,05.

На 7-е сутки эксперимента отмечается сниженная пролиферативная активность клеток эпидермиса (табл. 2). Транзиторные клетки уже начинают дифференцироваться и переходят в супрабазальные слои. В процесс восстановления эпидермиса включаются единичные камбиальные клетки волосяного фолликула околораневой области (табл. 3).

Рис. 1. Кл-67 позитивные клетки (в овалах) в эпидермисе кожного регенерата. Визуализация при помощи пероксидазы (коричневое окрашивание). Докраска гематоксилином. Об. 100 х Ок. 10.

На 14-е сугки увеличивалось число пролиферирующих клеток эпидермиса (табл. 2). Клетки сохраняли столбчатую организацию, снижалась пролиферативная активность клеток волосяных фолликулов. Стволовые клетки эпидермиса могут мигрировать из наружного корневого волосяного влагалища и пополнять пул базальных кератиноцитов эпидермиса.

На 21-е сутки в эпидермисе наблюдалось снижение пролиферативной активности (табл. 2). Эпидермис сохранял столбчатую организацию. Отсутствовали клетки с высокой пролиферативной активностью в сальных железах (табл. 3).

Пролиферативная активность клеток в дериватах кожного регенерата после воздействия ___ЛТФ, % (М±ш)__

Стадии «Контроль» «Холод» «Тепло»

(п=30) (п=35) (п=35)

Волосяные фолликулы

2 сутки 30,37±0,55 0* 28.20±0,10т

7 сутки 27,65±0,12 12,05±0,15* 28,44*0,30*

14 сутки 24,14±0,47 7,13±0,001* 22,07±0,24**

21 сутки 42,11±0,74 9,24±0,02* 53,14*1,68**

Сальные железы

2 сутки 0 0 0

7 сутки 0 0 18,150±0,001

14 сутки 0 0 55,08±0,03*™

21 сутки 20,53±0,52 28,97±0,12 69,33*1,11**"

При тепловой экспозиции на область кожной раны в эпидермисе животных на 2-е сутки наблюдалась сниженная пролиферативная активность кератиноцитов (табл. 2). Камбиальные клетки прочно были прикреплены к базальной мембране и распределялись в тесном содружестве с волосяными фолликулами.

На 7-е сутки митотическая активность клеток возрастала (табл. 2). Эпидермис продолжал сохранять неровные очертания и был ассоциирован с волосяными фолликулами Интенсивность пролиферации эпителиоцитов наружных корневых влагалищ превосходила таковую у базальных клеток поверхностного эпителия (табл. 3).

14-е сутки сопровождались усилением пролиферативной активности клеток эпидермиса (табл. 2). Камбиальные клетки были локализованы околобазально. Хорошо сформирован поверхностный слой эпидермиса -роговой.

На 21-е сутки митотически активные клетки обнаруживались в базальном слое и в удаленных от базальной мембраны слоях эпидермального пласта.

На протяжении всего эксперимента устанавливалась положительная тенденция роста количества пролиферирующих клеток в эпидермальных наружных корневых влагалищах (табл. 3), которые участвуют в формировании структур пилосебацейного комплекса.

Результаты эксперимента (21 сутки) показали, что в кожном регенерате контрольной группы животных клетки Лангерганса чаще располагались в базальном и нижних рядах шиповатого слоя. Отростки клеток Лангерганса направлялись в дерму и заканчивались контактами на дермальных клетках Лангерганса, расположенных в сосочковом слое. Клетки Лангерганса эпидермиса формировали сеть с дендритными клетками дермы.

Рис. 2. Экспрессия рецепторов С01а+ клеток Лангерганса (в овалах) в эпидермисе кожного регенерата. Визуализация при помощи пероксидазы (коричневое окрашивание). Докраска гематоксилином. Об. 100 х Ок. 10.

При холодовой экспозиции в кожном регенерате клетки Лангерганса локализовались не только в базальном слое эпидермиса, но и в верхних слоях эпидермального пласта вплоть до рогового слоя. Их количество достоверно увеличивалось и составляло 28,14±0,79% против контрольных 4,12±0,13% (р>0,01) (табл. 4). В формирующейся дерме клетки Лангерганса располагались преимущественно в сосочковом слое. Ассоциированность клеток Лангерганса с волосяными фолликулами не отмечалась.

При тепловой экспозиции в кожном регенерате клетки Лангерганса локализовались в базальном и шиповатом слоях эпидермиса, формировали межклеточные контакты между собой и с кератиноцитами. В эпидермисе их уровень достоверно увеличивался относительно контрольных значений (7,11 ±0,27% против 4,12±0,13%, р>0,5) (табл. 4).

Плотность содержания иммунокомпетентных клеток в эпидермисе кожного регенерата на

21 сутки, % (М±т)

Популяция «Контроль» «Холод» «Тепло»

клеток (п=30) (п=35) (п=35)

CDlcT 4,12±0,13 28,14±0,79** 7,11±0,27**

CD3+ 9,12±0,24 11,13±0,74 18,45±0,40*

Клетки Лангергаиса были многочисленны в эпителии наружных корневых влагалищ волосяных фолликулов (28,44±0,95% против 3,01±0,01%, р>0,5) (табл. 5).

Таблица 5

Плотность содержания иммунокомпетентных клеток в дериватах кожного регенерата на

21 сутки, % (М±т)

Популяция «Контроль» «Холод» «Тепло»

клеток (п=30) (п=35) (п=35)

CDla+ 3,01±0,01 0* 28,44±0,95*""

CD3+ 9,05±0,01 22,Ю±0,24* 18,87±1,55*

Исследования показали, что Т-лимфоциты в кожном регенерате контрольной группы животных инфильтрировали базальный и супрабазальные слои эпидермиса. В дерме Т-клетки были многочисленны в сосочковом слое. При холодовой экспозиции в коже животных выявлялось достоверно высокое содержание Т-лимфоцитов в дерме (44,56±0,58% и 36,70±1,07%, р>0,5) относительно контрольных значений (табл. 6). Основная масса лимфоцитов распределялась в дерме вблизи волосяных фолликулов. В эпидермисе единичные Т-клетки располагались равномерно по всему эпителиальному пласту. Достоверно значимых изменений числа Т-клеток в эпидермисе выявлено не было (табл. 4).

При тепловой экспозиции анализ содержания Т-лимфоцитов в эпидермисе выявил плавное статистически достоверное их возрастание по сравнению с показателями контрольной группы животных (18,45±0,40% против 9,12±0,24%, р>0,05) (табл. 4) . Т-лимфоциты выявлялись в ростковом слое эпидермиса и в сосочковом слое дермы (табл. 6).

Плотность содержания иммунокомпетентных клеток в дерме кожного регенерата на 21

сутки, % (М±ш)

Популяция «Контроль» «Холод» «Тепло»

клеток (п=30) (п=35) (п=35)

CDla+ 16,21 ±0,44 26,12±0,15* 32,11±0,76*

CD3+ 36,70±1,07 44,56±0,58» 36,56±0,68*

К 2-ым суткам опыта у животных контрольной группы подлежащая к раневой поверхности соединительная ткань дермы содержит активно делящиеся фибробласты (активность пролиферации составляла 46,98±0,25%) (табл. 7). В сосочковым слое наблюдается отечность. Коллагеновые и эластические волокна располагаются плотными тонкими тяжами.

К 7-ым суткам в дерме прослеживается пролиферативная способность клеток фибробластического дифферона (активность пролиферации составляла 77,11±0,02%). Коллагеновые волокна объединяются в крупные пучки. Волосяные фолликулы представлены эпителиальными компонентами наружного и внутреннего корневых влагалищ и матрицей волоса.

К 14-ым суткам происходит спад митотического деления клеток соединительной ткани дермы (69,01±0,18%). Сосочковый слой более дифференцирован и содержит значительно больше волокнистых компонентов и уже зрелых клеток фибробластического ряда.

К 21-ым суткам митотическая активность клеток дермы составляла 64,54±0,28% (табл. 7). Соединительная ткань представлена умеренным содержанием аморфного вещества и пучками плотно расположенных волокнистых структур. Активизируются сальные железы, их секреторные отделы значительно увеличиваются в объеме, в них возрастает количество себоцитов на промежуточной стадии дифференцировки и в состоянии голокринии. Происходит нарастание митотической активности клеток эпителия наружного и внутреннего корневых влагалищ. Формируются многослойные участки в наружном корневом влагалище.

При холодовой экспозиции в биоптате кожного регенерата животных ко 2-ым суткам сосочковый слой характеризуется тонкими нежными волоконными структурами, а сетчатый слон содержит грубые пучки

коллагеновых волокон. Пролиферативная активность клеток фибробластического ряда снижена по сравнению с контрольными значениями. В эпителиальных корневых влагалищах и секреторных отделах сальных желез не выявляются Ю-67 позитивные клетки.

На 7-е сутки продолжается четкое разделение сосочкового и сетчатого слоев дермы по характеру расположения волокон и формированию пучков. Пролиферативная активность клеток дермы нарастает относительно контроля и 2-ых суток эксперимента.

На 14-е сутки пролиферативная способность клеток дермы продолжает увеличиваться, а волосяных фолликулов продолжает достоверно снижаться относительно контрольных показателей (табл. 7). Наблюдаются единичные делящиеся клетки секреторных отделов сальных желез. Дерма сохраняет четкую топику слоев. Волосяные фолликулы содержат эпителиальные влагалища и матрикс волоса.

На 21 сутки пролиферативная активность клеток фибробластического ряда снижается относительно предыдущих сроков наблюдения и контрольных значений. Кл-67 положительные клетки наблюдаются как во внутреннем, так и в наружном эпителиальных корневых влагалищах. Число таких клеток достоверно возрастает по сравнению с 14-ми стуками эксперимента, но снижается относительно контроля. Волосяные фолликулы содержат матрикс волоса, эпителиальные влагалища без четких границ. Единичные себоциты также проявляют пролиферативную активность.

ЙЕН_тепловой экспозиции на 2-е сутки эксперимента

соединительнотканный компонент представлен рыхлым расположением волоконных структур в глубоких слоях и их плотным расположением в сосочковом слое. Митотическая активность клеток дермы достоверно снижается относительно контрольных значений (60,11±0,11% против 76,45±0,56%, р>0,01) (табл. 7).

Пролиферативиая активность клеток в соединительнотканной основе кожного регенерата после воздействия ЛТФ, % (М±т)

Стадии «Контроль» «Холод» «Тепло»

(п=30) (п=35) (n=35)

2 сутки 76,45±0,56 58,13±0,13* 60,U±0,11"

7 сутки 77,11±0,02 78,mo,^"" 79,10±0,15**

14 сутки 69,01 ±0,18 79,01±0,14***,"w 80,12±0,11***

21 сутки 64,54±0,28 61,12±0,12se" 83,44±0,50***

На 7-е сутки пролиферативиая активность фибробластов возрастает относительно контрольных показателей (79,10±0,15 кл/мм2 против 77,11±0,02 кл/мм2, р>0,01) (табл. 6). Во всех слоях дермы коллагеновые и эластические волокна распределяются плотно. Секреторные отделы сальных желез приобретают выраженную альвеолярную форму, в них четко прослеживается этапность дифференцировки себоцитов. В отдельных сальных железах процесс характерной дифференцировки клеток секреторных отделов находится в начальном периоде, поэтому представлены только Кл-67 положительными клетками.

На 14-е сутки клеточные популяции дермы характеризуются высокой пролиферативной способностью. Сосочковый слой представлен рыхлой волокнистой тканью с умеренным содержанием аморфного вещества. Продолжается процесс формирования закладок и дальнейшей дифференцировки новых сальных желез и новых волос. Сальные железы сохраняют состояние активной секреции, секрет которых направляется в сформированные новые выводные протоки. Прослеживается увеличение количества слоев эпителноцитов в наружном и внутреннем корневых эпителиальных влагалищах.

К 21-ым суткам эксперимента происходит еще большее возрастание пролиферативных потенций клеток фибробластического ряда, эпителиальных клеток волосяных фолликулов, клеток секреторных отделов сальных желез. Соединительная ткань содержит значительные прослойки аморфного вещества между пучками фибриллярных структур. Происходит

формирование стержня волоса, но без разделения на корковое и мозговое вещество.

Популяция тучных клеток в сосочковом слое дермы у лабораторных мышей контрольной группы характеризуется относительно небольшой величиной, морфологическим и функциональным разнообразием, также неравномерностью их распределения в соединительнотканных волокнах кожи.

Наибольшее количество мастоцитов наблюдалось у мышей группы «Холод». Они характеризуются малыми размерами, округлой формы и размещены близко к базальному слою эпидермиса. Синтетическая активность в тучных клетках высокая. Активность дегрануляции достоверно снижена по сравнению с контролем.

У мышей группы «Тепло» общее количество тучных клеток снижено. Мастоциты малых размеров, разнообразной формы, располагаются в толще коллагеновых и эластических волокон в близи волосяных фолликул. Синтетическая активность в тучных клетках наибольшая, а степень дегрануляции наименьшая.

Во всех группах отсутствуют тучные клетки «1» типа с низким околомембранным содержанием гранул.

При влиянии локального воздействия температурного фактора на раневую кожную область тимус претерпевает структурно-функциональные изменения. Характер наблюдаемых сдвигов зависит от вектора воздействия температурного режима. При холодовой экспозиции изменения в межклеточных пространствах и в лимфоидном компартменте тимуса наблюдаются уже на 2 сутки в виде увеличения периваскулярных пространств, возрастания относительной площади коркового вещества. В коре при этом нарастает общее число клеток лимфоидного ряда, в первую очередь за счет средних лимфоцитов и бластных клеток. На 7 сутки площадь коркового вещества уменьшалась, но плотность лимфоидных клеток в корковых зонах увеличивалась. При этом наблюдалось увеличение малых, средних лимфоцитов и иммунобластов, что свидетельствует об усилении пролиферативных процессов и моблизации адаптационных возможностей

18

организма. К 21 суткам происходило частичное восстановление лимфоцитарного компонента тимуса.

Морфофункциональная перестройка органа при экспозиции повышенной температуры на кожную рану указывает, что на 2, 7 сутки развиваются деструктивные процессы в виде увеличения периваскулярных пространств и их отечности. В эти сроки имеют место изменения лимфоидного компартмента тимуса: уменьшение размеров коркового вещества и количества лимфоидных клеток за счет падения числа зрелых лимфоцитов. Появляется компенсаторная реакция: одновременное нарастание числа средних лимфоцитов и иммунобластов. В последующее периоде на 14 и 21 сутки происходит восстановление структуры стромы тимуса, частичное увеличение относительной площади коркового вещества и количества малых лимфоцитов. Эти факты позволяют говорить о направленности восстановления баланса процессов созревания и миграции клеток Т-лимфоцитарного дифферона в органе.

Температурное воздействие на область кожной раны вызывает снижение относительной площади белой пульпы с уменьшением размеров лимфоидных узелков, так и периартериальных лимфоидных влагалищ, сужение маргинальной зоны вокруг обоих компартментов белой пульпы, уменьшение числа вторичных лимфоидных узелков. Причем холодовое воздействие быстрее восстанавливает иммуноархитектонику селезенки, оказывает влияние на активность факторов неспецифической иммунорезистентности: количественное увеличение фагоцитирующих макрофагов в герминативных центрах лимфоидных узелков уже на 2 сутки, что свидетельствует об участии макрофагов в поддержании гомеостаза организма через секрецию цитокинов. Локальное воздействие низких температур приводит к увеличению числа мегакариоцитов в селезенке, что возможно стало причиной увеличения скорости репарации кожной раны у животных группы «Холод». Воздействие повышенных приводит к количественному увеличению плазмоцитов в селезенке, что свидетельствует об активации у них гуморального иммунитета.

выводы

1. Обнаружены выраженные различия в характере заживления кожной раны при воздействии на нее низких, повышенных и контрастных температур.

2. Температурный фактор («Холод»):

- активирует пролиферативную активность клеток генеративного слоя регенерирующего пласта эпидермиса. Отмечается повышение Кл-67 позитивных кератиноцитов (25,11±0,26%) в отличие от значений группы «Тепло» (15,13±0,02%) и 8,13±0,01% контрольных.

- ускоряется эпителизация, увеличивается содержание тканевых базофилов дегранулирующих форм, но пролонгируется морфогенез дериватов кожи,

- выявляется уменьшение относительной площади селезеночных телец, увеличение фагоцитирующих макрофагов в герминативных центрах селезеночных телец и красной пульпе,

- стадийность изменений в тимусе не прослеживается.

3. Локальное воздействие повышенной температурой («Тепло») на раневой дефект обеспечивает ускорение клеточных, тканевотипических и органотипических преобразований регенерата и создает условия для реституции кожи:

- вызывает повышение содержания Кл-67 позитивных клеток в эпидермисе (53,16±0,31% против 28,13±0,2% группы «Холод» и 29,31±0,25% контроля), эпителиальных влагалищах волоса (53,14±1,68% против 9,24±0,02% группы «Холод» и 42,11 ±0,74% контроля), себоцитов (69,33±1,11% против 28,97±0,12% группы «Холод» и 20,53±0,52% контроля), фибробластов (83,44±0,50% против 61,12±0,12% группы «Холод» и 64,54±0,28% контрольной группы).

- вызывает нарастание числа СБЗ позитивных клеток в эпидермисе (18,45±0,40% относительно 11,13±0,74% группы «Холод» и контрольных 9,12±0,24%).

- приводит к поэтапным структурно-функциональным преобразованиям в тимусе: начальный период (2 и 7 сутки) сопровождался уменьшением

20

размеров коркового вещества долек и количества зрелых лимфоцитов, с одновременным нарастанием числа средних лимфоцитов и иммунобластов. В восстановительный период (14 и 21 сутки) отмечалось увеличение относительной площади коркового вещества долек и числа малых лимфоцитов.

4. При всех режимах температурного воздействия происходит нарастание плотности клеток Лангерганса в регенерирующем эпидермисе: в группе «Холод» (28,14±0,79% относительно контрольных 4,12±0,13%), в группе «Тепло» (7,11±0,27% относительно контрольных 4,12±0,13%). Это свидетельствует о системной перестройке эпителиального пласта и обеспечивает условие для формирования эпидермально-пролиферативных единиц - показателей репаративных потенций кожного эпителия.

Список публикаций по теме выполняемой диссертации

*1. Каленова Л.Ф., Новикова М.А., Маркелова П.П. и др. «Влияние локального воздействия температурного фактора на репарацию кожной раны в эксперименте»/ Каленова Л.Ф., Новикова М.А., Маркелова П.П. и др.// «Медицинская наука и образование Урала». - 2011. - Т. 12, №2(66). - С.72-75.

2. Маркелова П.П., Турбасова Н.В. «Морфологическая характеристика репаративной регенерации кожи при локальном воздействии температурного фактора»/Маркелова П.П., Турбасова Н.В.// Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека». — Тюмень, 2012.-С. 100-103.

3. Соловьев Г.С., Соловьева О.Г., Истомина О.Ф., Шилин К.О., Иванова Е.В., Утешева А.Б., Кужба В.В., Маркелова П.П., Молокова O.A., Гарчук И.В., Лукина М.Ю., Маргарян A.B., Хадиева Е.Д., Янина Д.В. Феномен провизорности в системе магистральных путей эволюционирования гисто- и органогенезов // Материалы II Всероссийской научно-практической

конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека». - Тюмень, 2012. - С. 11-14 *4. Иванова Н.В., Иванова Е.В., Золотухина Е.В., Истомина О.Ф., Маркелова П.П., Соловьев Г.С. Заживление кожной раны на фоне локального воздействия геля «Эйковит», температурного фактора и никелида титана/ Иванова Н.В., Иванова Е.В., Золотухина Е.В., Истомина О.Ф., Маркелова П.П., Соловьев Г.С.// «Морфология». - 2012. - Том 141, №3. - С. 98. 5. Маркелова П.П. «Влияние структурных взаимоотношений иммунных клеток на полноту регенерации ран при локальном температурном воздействии»/Маркелова П.П.// Материалы 47-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации». - Тюмень, 2013. - С. 180.

*6. Маркелова П.П. «Состояние реактивных свойств регенерирующих тканей кожи»/ Маркелова П.П.// Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы морфологии, адаптагенеза и репаративных гистогенезов», посвященная памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко. Морфология. - 2013. - Т 144,- № 5. - С. 94.

*7. Соловьев Г.С. «Феномен провизорности при репаративной регенерации кожи»/ Соловьев Г.С., Янин В.Л.,..., Маркелова П.П.// Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы морфологии, адаптагенеза и репаративных гистогенезов», посвященная памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко. Морфология. - 2013. - Т 144. - № 5. - С. 115. 8. Соловьев Г.С., Ельцова Е.Е., Идрисов P.A., Иванова Е.В., Иванова Н.В., Лукина М.Ю., Маркелова П.П., Медведева О.В., Шидин В.А. Формирование провизорных структур в онтогенезе, культурах «in vivo» и при репаративной регенерации // VII терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов». - Тюмень, 2013. - С.79-80.

*9. Маркелова П.П. Динамика структурных и иммуногистохимических показателей компонентов кожного регенерата при локальном действии различных температур (экспериментальное исследование) /Маркелова П.П.,

22

Соловьев Г.С., Зиновьева A.B. // Медицинская наука и образование Урала, 2013-№4-С. 59-61.

МАРКЕЛОВА ПОЛИНА ПАВЛОВНА

СТРУКТУРНАЯ, МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЖНОГО РЕГЕНЕРАТА И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ НА ФОНЕ ЛОКАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРНОГО ФАКТОРА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03.03.04 - КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ, ЦИТОЛОГИЯ, ГИСТОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Подписано в печать Формат 60x84/16. Печ. Л. 1,0. Печать ризограф. Тираж 130. Зак. №

Типография ООО «Печатник», лицензия ПД № 17-0027 Тюмень, ул. Республики, 148 корп. 'Л. Тел. (3452) 20-51-13, тел./факс (3452) 32-13-86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маркелова, Полина Павловна, Оренбург

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи 04201 459247 ^

МАРКЕЛОВА ПОЛИНА ПАВЛОВНА

СТРУКТУРНАЯ, МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЖНОГО РЕГЕНЕРАТА И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ НА ФОНЕ ЛОКАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРНОГО ФАКТОРА (экспериментальное исследование)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Г.С. Соловьев

Тюмень, 2014.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................8

1.1. Современные представления о структурно-функциональной характеристике кожи и ее дериватов.......................................8

1.2. Морфологическая характеристика процессов репаративной регенерации кожи..............................................................34

1.3. Динамика биологических потенций органов иммуногенеза на стадиях репаративной регенерации кожи.................................38

1.4. Влияние температурного фактора на функциональную активность иммунной системы и репаративные процессы..........................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......51

3.1. Динамика репаративного процесса кожных ран.......................51

3.2. Состояние клеток генеративных слоев эпидермиса и дериватов

кожи на стадиях заживления дефекта кожи..........................58

3.3. Состояние компонентов дермы на стадиях заживления кожной раны.............................................................................73

3.4. Динамика иммуноморфологических параметров органов лабораторных животных на фоне формирования кожного регенерата.....................................................................79

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ................................................................94

ВЫВОДЫ..........................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................111

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования.

Несмотря на большое количество исследований, до настоящего времени не существует четкого представления о ряде процессов, протекающих в ходе репаративной регенерации (Ланичева А.Х. Семченко В.В., Степанов С.С., 2010; Винник Ю.С. с соавт., 2011). Механизмы репарации неразрывно связаны с воспалением и формируют с ним единую реакцию на повреждение (Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2001; Данилов Р.К., 2001, 2008; Нартайлакова М.А., Пышкина С.А., Цирятьева С.Б., 2008; Молокова О. А., 2012; Горелова М.В., Алексеев А.Г., Калинина О.В., Ноздрин В.И., 2012). Репаративная регенерация является стереотипным процессом, однако имеет свои особенности в различных органах и тканях, в том числе и при заживлении кожных ран. Детальное исследование регенерации имеет не только фундаментальную, но и клиническую направленность, так как является основой для разработки оптимальных режимов и методов лечения (Ноздрин В.И., 2006; Ноздрин В.И. и др., 2008).

Актуальность изучения вопросов регенерации ран кожного покрова обусловлена высокими уровнями травм, особенно среди населения детского возраста (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003). Наряду с традиционными методами пластической, эстетической и реконструктивно-восстановительной хирургии, в последние годы активно внедряются консервативные методики контроля за активностью заживления дефектов органов на разных стадиях репаративного процесса. В конечном итоге весь арсенал способов ускорения трансформации биологического субстрата из состояния «болезнь» в состояние «здоровье» направлен на достижение реституции пораженного участка (Morelli J.G., 1998; Адаскевич В.П., 2000; Фенчин K.M., 2009).

В исследованиях ряда авторов (Черешнев В.А. и др, 2002; Бабаева А.Г., 2009; Храмцова Ю.С. и др., 2012) установлено участие иммунной системы в регуляции процессов физиологической и репаративной регенерации тканей и органов. В этой связи представляет интерес поиск способов влияния на

процессы регенерации посредством воздействия на естественные механизмы иммунной системы.

Одним из распространенных способов воздействия на иммунную систему является воздействие температурного фактора (Суховей Ю.Г., 2006).

Цель исследования.

Выявить особенности структурных, морфометрических и иммуногистохимических показателей заживления кожной раны, тимуса и селезенки при локальном воздействии различных режимов температурного фактора в эксперименте.

Задачи исследования.

1. Выявить динамику морфометрических параметров эпидермиса, сальной железы, волоса и соединительнотканной основы регенерирующей кожи на фоне температурной экспозиции.

2. Изучить состояние пролиферативной активности клеток генеративных слоев эпидермиса (кератиноцитов) и дериватов кожи (себоцитов, клеток корневых эпителиальных влагалищ волоса), содержание клеток Лангерганса на стадиях заживления дефекта кожи на фоне температурной экспозиции.

3. Изучить состояние компонентов дермы на стадиях заживления кожной раны на фоне температурной экспозиции.

4. Исследовать динамику морфометрических и иммуногистохимических параметров тимуса и селезенки лабораторных животных на фоне формирования кожного регенерата и действия температурного фактора.

Научная новизна.

Впервые показано, что температурный фактор неоднозначно действует на процессы репарации кожной раны: ускорение ранних стадий регенераторного процесса выявлено у мышей в условиях «холодового» режима. Низкие температуры стимулируют образование грануляционной

ткани и способствуют ускорению процесса контракции краев раны. На последующих и заключительных стадиях эксперимента действие «холодового» фактора вызывает замедление органотипической дифференцировки эпителиальных и соединительнотканных компонентов регенерата. Одной из особенностей соединительнотканного компонента кожного регенерата при действии низких температур является увеличение количества тучных клеток с явлениями дегрануляции в сосочковом слое дермы. При холодовом воздействии не проел еживатся стадийность изменений в тимусе, сохраняется структурно-функциональная стабильность в дольках.

В режиме действия «теплового» фактора отмечено ускорение органотипической дифференцировки эпидермиса, дериватов кожи и формирование кожного регенерата на уровне реституции, выявлена стадийность структурно-функциональных изменений в тимусе: начальному периоду были характерны деструктивно-компенсаторные прогрессивные процессы, восстановительному периоду - возвращению к исходному состоянию.

Воздействие низких и повышенных температур вызывает уменьшение размеров селезеночных телец и увеличение числа фагоцитирующих макрофагов в красной пульпе селезенки.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Разработана экспериментальная модель для изучения влияния дозированных температурных воздействий на ход регенераторных процессов в кожных ранах.

Определены физиологические параметры (длительность, цикличность) температурных режимов, способствующих ускорению закрытия дефекта и органотипической регенерации кожного покрова. Повышенные температуры (+42°С, длительностью воздействия 30 секунд в течение 5 дней) обеспечивают ускорение клеточных, тканевотипических и органотипических

преобразований регенерата, создают условия для реституции кожи как органа. При низких температурах (+8°С, длительностью воздействия 5 секунд в течение 5 дней) регенераторный процесс протекает замедленно и к конечным стадиям эксперимента не обеспечивает реституции пораженного участка кожи.

Проведенные исследования позволили расширить представления о механизмах взаимодействия репаративного процесса и иммунной системой. Установлено, что кратковременное температурное воздействие оказывает влияние на иммунную систему на разных ее уровнях организации: от иммунокомпетентных клеток в кожном регенерате до иммуноархитектоники периферического органа (селезенки) и центрального органа (тимуса) иммунной системы организма. Активность процессов регенерации коррелирует с состоянием органов иммунного ответа организма.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Кратковременные режимы температурного воздействия оказывают влияние на течение репаративного процесса, полноту регенерации кожных ран и состояние клеточных дифферонов иммунокомпетентных органов.

2. Дозированное холодовое воздействие на область раны ускоряет эпителизацию, способствует закрытию дефекта, пролонгирует процессы морфогенеза дериватов кожи, вызывает увеличение числа макрофагов и уменьшение числа плазмоцитов в селезенке, не оказывает регистрируемого влияния на состояние тимуса.

3. Повышенные температуры стимулируют органотипическую дифференцировку эпителиального и соединительнотканного компонентов регенерата, способствуют реституции пораженного участка, нарастанию содержания макрофагов и плазмоцитов в селезенке, динамичным преобразованиям коркового и мозгового вещества долек тимуса на стадиях репарации.

Апробация работы.

Основные положения диссертационного исследования докладывались и обсуждались на: II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические механизмы адаптации и экология человека» (Тюмень, 2012); 47-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2013); VII терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» (Тюмень, 2013); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптагенеза и репаративных гистогенезов», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Современные представления о структурно-функциональной характеристике кожи и ее дериватов

Кожа является одним из самых крупных органов системы кожных покровов. В состав системы кожных покровов входят: кожа, волосы, сальные, потовые, церуминозные, молочные и некоторые другие железы, являющиеся производными либо сальных, либо потовых желез, либо образованные их комбинацией (Мяделец О.Д., Адаскавич В.П., 2006). Каждая из перечисленных частей кожного покрова имеет ярко выраженные органные черты строения: состоит из нескольких (более одного) типов тканей, имеет собственные кровеносную и лимфатическую циркуляторные системы, специфические особенности роста и регенерации. Каждый орган системы кожных покровов имеет свои уникальные черты строения и специфические функции. И вместе с тем, как и любой другой системе организма, в системе кожных покровов наблюдается четкое согласование работы всех составляющих ее органов, их взаимодействие как в условиях нормы, так и при патологии и адаптивных перестройках (Соколов В.Е., Женевская Р.П., 1988; Кошевенко Ю.Н., 2006).

Кожа состоит из трех слоев: наружного - эпидермиса (многослойного плоского ороговевающего эпителия), среднего - двухслойной дермы и внутреннего - гиподермы, находящихся в морфофункциональном единстве (Чернух A.M., Фролов Е.П., 1982; Юрина H.A., Радостина А.И., 1996; Шилов В.Н., 2001).

Эпидермис состоит из пяти слоев клеток, отличающихся количеством рядов, формой, и цитологическими характеристиками базального, шиповатого, зернистого, блестящего и рогового слоев (Афанасьев Ю.И., 1996; Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., 1999; Шилов В.Н., 2001).

Область соединения эпидермиса и дермы является границей соприкосновения двух разнородных по эмбриогенезу тканей и зоной с выраженными барьерными функциями, осуществляющей обменные

процессы между эпидермисом, не имеющей кровоснабжения, и подлежащей дермой. Однако роль базальной мембраны не сводится только к функциям структурной опоры и избирательного барьера для различных соединений и клеток. Она играет важную роль в регенерации эпидермиса. При повреждении уцелевшая базальная мембрана направляет и стимулирует продвижение размножающихся клеток, обеспечивая восстановление исходной архитектуры эпидермиса (Пальцев М.А., Иванов A.A., 1995).

Непосредственно на базальной мембране лежат клетки, составляющие базальный слой {stratum basale). Кератиноциты базального слоя - клетки призматической формы функционально находятся в состоянии митотического процесса, что обеспечивает формирование вышележащих слоев эпидермиса. Среди клеток базального слоя располагаются меланоциты, отростчатые клетки Лангерганса и Грейнстейна и осязательные клетки Меркеля. По мере продвижения кератиноцитов наружу, из базального слоя в роговой, кератиноцит в процессе дифференцировки превращается в высоко специализированную клетку и, в конечном счете, в роговую пластинку (Eckert R., 1989).

Над базальным слоем располагается слой шиповатых эпидермоцитов, состоящий из 3-8 рядов клеток - шиповатый слой {stratum spinosum). Кератиноциты, находящиеся ближе к поверхности кожи, приобретают ромбовидную уплощенную форму, а клетки, прилегающие к базальному слою имеют цилиндрическую и кубическую форму. Для строения клеток этого слоя характерно наличие множеств цитоплазматических выростов (шипов или акантов) десмосомальной структуры (Traupe Н., 1997). Эти выросты обеспечивают соединение клеток, образованием между ними сети каналов, по которым циркулирует межклеточная жидкость. Десмосомы и тонофибриллы формируют внутренний каркас клеток. В шиповатом слое, как и в базальном, находятся клетки Лангерганса, осуществляющие вместе с кератиноцитами защитную, иммунную функцию.

Наличие митозов в клетках базального и шиповатого слоев позволяет объединить их в единый ростковый слой эпидермиса (мальпигиев слой).

Регуляция пролиферации клеток эпидермиса находится под контролем различных внутренних и внешних факторов. Гормоны на уровне организма, а цитокины на клеточном уровне осуществляют гуморальную регуляцию не только интенсивности клеточного размножения, но и функциональную активность кератиноцитов и их дифференцировку (Мордовцев В.Н., Цветкова Г.М., 1993).

Над шиповатым слоем находится зернистый слой {stratum granulosum), состоящий из 2-3 рядов сравнительно плоских клеток и названный так потому, что клетки этого слоя содержит кератогиалиновые гранулы. Эти гранулы содержат профилагрин - высокомолекулярный предшественник филагрина, белка, который, по мнению ряда авторов, участвует в агрегации кератиновых тонофибрилл (Leung D.Y., 1999).

За зернистым слоем следует блестящий слой {stratum lucidum), образованный уплощенными безъядерными клетками. Гистологически - это переходная зона между живыми и мертвыми клетками эпидермиса, которая характеризуется интенсивной энзиматической активностью. Внутри этой зоны все клеточные органеллы разрушаются под действием протеаз, кислых гидролаз, ядерных нуклеаз. Одновременно с этим пластинчатые гранулы, содержащие липиды, сливаются с плазматической мембраной, которая приобретает в результате этого слоистое строение (Hughes С.С., Savage С.О., Prober J.S., 1990). При этом выход содержимого пластинчатых гранул в межклеточное пространство обеспечивает гидроизоляционные свойства кожи.

Роговой слой {stratum corneum) - самый мощный слой эпидермиса -состоит из множества черепицеобразных безъядерных пластинок, плотно прилегающих друг к другу за счет взаимопроникающих выростов. Поверхностные участки рогового слоя постоянно отторгаются в результате физиологического шелушения (десквамации). В процессе ороговения

эпидермиса кожи участвует ряд компонентов клеток - тонофибриллы, кератогиалин, кератиносомы, десмосомы.

Таким образом, в пределах одного слоя лежат клетки, имеющие один уровень дифференцировки.

На сегодняшний день эпидермис рассматривается с позиций дифферонного подхода (подхода «вертикалей») для лучшего понимания морфогенетических и патологических процессов (Жучков С.А., 2006; Крстич Р.В., 2010). Эпидермис представляет собой систему клеточных дифферонов, объединенных в эпидермальные пролиферативные единицы (ЭПЕ) (Мяделец О.Д., Адаскавич В.П., 2006).

ЭПЕ могут иметь столбчатую и нестолбчатую структуру в зависимости от функционального состояния эпидермиса. При незначительной функциональной нагрузке на эпидермис он тонкий, а ЭПЕ имеют колончатое строение. При увеличении нагрузки на эпидермис он утолщается, а ЭПЕ теряют колончатую организацию и их клеточный состав существенно возрастает в количественном отношении (Geissmann F, Dieu-Nosjean MC, Dezzutter С et al.,2002).

В ЭПЕ столбчатой организации входят 6-12 роговых чешуек, две зернистые, один-две шиповатые и 8-12 базальных клеток. Роговые чешуйки имеют гексагональные очертания. Именно такая форма наиболее экономна и идеально укладывается в столбики (Potten С.S., Allen T.D., 1975; Jones Ph., Simons B.D., 2008). Как сами роговые чешуйки, т