Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в норме и в условиях измененной гравитационной нагрузки

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в норме и в условиях измененной гравитационной нагрузки"

9 15-3/276

На правах рукописи /

РАДУГИНА Елена Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ МОРФОГЕНЕЗА РЕГЕНЕРИРУЮЩЕГО ХВОСТА ТРИТОНА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕННОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ

03.03.05 - Биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2015

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

ГРИГОРЯН Элеонора Норайровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ЗАРАЙСКИЙ Андрей Георгиевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, руководитель лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза

доктор биологических наук ДОЛМАТОВ Игорь Юрьевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, заведующий лабораторией сравнительной цитологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита диссертации состоится « 09 » декабря 2015 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.02 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 1 19334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, At Кузнецова A.B.

кандидат медицинских наук ^¿ff* avkuzn@idbras.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Исследования в области регенерации, начавшиеся еще в XVIII веке, вновь приобрели актуальность с появлением современных методов исследования. Хвостатые амфибии относятся к классическим модельным объектам в данной области в силу высочайших рсгенерационных способностей, а также простоты в разведении, содержании и манипуляциях. В последнее время они активно использовались и как объекты гравитационной биологии. Данное исследование предпринято в связи с обнаружением интересного явления - зависимости формообразования при регенерации хвоста тритона от уровня гравитационной нагрузки. Это явление - редкий пример морфогенетического эффекта внешних физических факторов во взрослом организме. Механизмы преобразования сигналов таких факторов в биологические изменения, которые определяют морфогенетический контроль, в настоящее время изучены недостаточно. Предложенная модель позволяет обнаружить не только внутриклеточные механизмы восприятия и реагирования на внешние факторы, но и механизмы, осуществляющиеся на уровне межклеточных и межтканевых взаимодействий.

Степень разработанности темы исследования. Междисциплинарный характер темы исследования и трудности, связанные с проведением экспериментов в области гравитационной биологии, обусловили малую ее разработанность. Наиболее последовательные и информативные работы, касающиеся регенерации различных тканей и органов у хвостатых амфибий в условиях космического полета, симулированных невесомости и перегрузок, были выполнены в лаборатории проблем регенерации ИБР РАН в сотрудничестве с несколькими российскими и зарубежными коллективами. Одним из последних достижений в этой серии работ стало обнаружение морфогенетического эффекта, изучению которого посвящена данная работа.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение измененного морфогенеза регенерирующего хвоста под действием внешних факторов: уточнение природы воздействия, выявление клеточных процессов, за счет которых хвост приобретает иное, ассиметричное строение, а также поиск сигнальных путей и регуляторных молекул, опосредующих данные изменения. В рамках данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Воспроизвести обнаруженный эффект в лабораторных условиях, провести анализ устойчивости и достоверности его проявления, обратимости, зависимости от темпа регенерации; описать динамику развития эффекта.

2) Уточнить предполагаемую гравитационную природу действующего фактора.

3) Провести полное морфологическое описание получаемых регенератов на разных стадиях, а также изучить клеточные процессы, протекающие в них: пролиферацию и апоптоз.

4) Проверить роль одного из главных морфогенетических регуляторов регенерации хвоста - БЬЬ - в развитии наблюдаемого эффекта.

5) Тестировать другое системное воздействие - тепловой шок - на способность к индукции подобных морфогенетических изменений при регенерации хвоста у тритонов.

6) Провести фармакологическое ингибирование белков теплового шока в ходе регенерации хвоста тритона в нормальных условиях и в условиях, вызывающих изменение формы регенерата.

7) Исследовать динамику экспрессии генов Нхр7(), Нхр90 в ходе регенерации и локализацию в тканях соответствующих белков, как в нормальных условиях, так и в условиях содержания, вызывающих морфогенетический эффект.

Научная новизна работы. В работе предлагается совершенно новая модель для исследований на стыке биологии развития и гравитационной биологии. Влияние внешних воздействий на регенерацию тканей хвоста было описано впервые, кроме того, получены первые данные по выявлению молекулярных посредников развития эффекта. Впервые были проведены оценка пролиферации и апоптоза в тканях регенерата, ингибирование сигнального пути БЬЬ, регенерация в присутствии теплового шока, оценка экспрессии генов Нзр70, Нвр90, иммунохимическое исследование белков Н8Р70, Н8Р90, ингибирование белков теплового шока. Результаты этих экспериментов являются новыми и для исследований регенерации в стандартных лабораторных условиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенная в работе модель позволяет изучать эффекты гравитационной нагрузки без применения дорогостоящего труднодоступного оборудования, выявляя клеточные, межклеточные, межтканевые аспекты воздействия внешних факторов, а также учитывая системные физиологические изменения в организме. Результаты, полученные в данной работе, являются необходимой базой для дальнейшего использования преимуществ описанной модели в решении этих и других вопросов. Проведенные исследования имеют и практическую ценность, поскольку в настоящее время на разных животных моделях показано, что механические силы способны вызывать нарушения в развитии и регенерации скелетно-мышечной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем организма, в то время как глубокое понимание соответствующих механизмов необходимо для предотвращения или компенсации морфогенетических аномалий.

Апробация работы. Результаты были неоднократно доложены в форме устных (13) и стендовых (5) докладов на ряде российских и международных конференций: 1) Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва; 2010, 2011, 2012, 2013; доклад трижды занимал призовые места); 2) Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва; 2011, 2014, 2015; в 2014 году доклад был удостоен первого места в подсекции «Биология развития»); 3) Всероссийская конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» (Москва; 2011, 2012, 2015); 4) Всероссийская научная конференция

«Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» с международным участием (Москва; 2014); 5) Международная космическая научная ассамблея COSPAR (Бремен, 2010; Майсор, 2012; Москва, 2014); 6) Международная конференция 5th ЕМВО Conference Series on The Molecular & Cellular Basis of Regeneration & Tissue Repair (Сан Фели де Гуиксол, 2014); 7) Международная конференция 24 th Annual meeting of the European Tissue Repair Society (Эдинбург, 2014); 8) Международная научная школа ЕМВО Practical Course on Multi-level Modelling of Morphogenesis (Норидж, 2015).

Личное участие автора. Личный вклад автора состоял в анализе обширной литературы, планировании и выполнении экспериментов, проведении статистической обработки и интерпретации полученных результатов, подготовке данных для публикаций и представлении результатов исследований на российских и международных конференциях соответствующей тематики. Основные результаты работы получены лично автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 148 страницах, содержит 37 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 218 цитируемых источника.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 11, публикаций в периодических изданиях, индексируемых в базе данных WOS - 3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были взрослые тритоны Pleurodeles waltl (Michahelles, 1830).

Содержание животных и операции. Тритонов содержали в аквариумах при комнатной температуре. Для ампутации дистальной трети хвоста и фиксации регенератов тритонов наркотизировали в растворе MS-222 (1:1000). Для изучения морфогенетического действия гравитационной нагрузки часть животных («субстратную группу») с первого дня после операции (п/оп) содержали в отдельных контейнерах на влажной подложке. Для экспериментов по тепловому шоку нагревание воды проводили постепенно в течение 90 мин, рабочую температуру 32°С поддерживали 60 мин, после чего пассивно остужали воду до исходной температуры.

Морфометрическое изучение регенератов хвоста проводили на фотографиях, сделанных с помощью бинокуляра, оснащенного камерой; изображения последовательных стадий регенерации совмещали и измеряли в программе Adobe® Photoshop® CS5, используя особенности пигментации в качестве реперных точек. Форму хвоста описывали в терминах смещения кончика регенерата по вертикали с помощью коэффициента угла загиба хвоста

К, рассчитываемого по формуле: К = Ltana/H, где L - длина регенерата, tana -тангенс угла загиба хвоста, Н - основание регенерата (рис. 1).

Рис. 1. Морфометрические показатели, измеряемые для описания формы хвоста.

Эксперименты по исследованию обратимости морфогенетического эффекта. Аквариальный контроль (5 особей) и субстратную группу (15 особей) содержали раздельно до появления статистически значимых различий значений К, после чего часть животных из субстратной группы переносили в аквариумы, продолжая наблюдения и фотографирование в течение 10 дней.

Морфологическое изучение регенератов хвоста. Формировали аквариальный контроль и субстратную группу (по 9 животных). Через 14, 28 и 49 дней п/оп хвоста регенераты фиксировали в растворе Буэна, получали серийные сагиттальные парафиновые срезы (5 мкм), окрашивали их гематоксилином Эрлиха и заключали под покровные стекла для анализа под световым микроскопом. Стадии регенерации определяли по Iten, Bryant (1976а).

Изучение пролиферативной активности клеток в регенератах хвоста. Формировали аквариальный контроль и субстратную группу (по 9 особей). Материал фиксировали в 4% растворе формальдегида на 0,01 М PBS (pH 7,4) через 24 часа, 7 дней и 14 дней п/оп. За 3 часа до фиксации внутрибрюшинно вводили водный раствор 5-бромо-2'-дезоксиуридина (Zymed Laboratories) из расчета 20 мкл/1 г веса. Включение БрдУ детектировали на серийных сагиттальных парафиновых срезах с помощью набора Zymed® BrdU Staining Kit под световым микроскопом. Для каждого регенерата на 10 срезах вычисляли соотношение количества меченых клеток на вентральной и дорсальной сторонах (V/D) эпидермиса и подлежащих тканей, что позволило оценить уровень «асимметрии» пролиферативной активности клеток без сравнения абсолютных величин. Также подсчитывали долю апикально расположенных меченых клеток от всех меченых клеток эпидермиса. Для оценки индекса мечения срезы тех же образов окрашивали Hoechst 33342 (1 мкл/мл) и подсчитывали количество ядер в изучаемых областях.

Изучение апоптоза в регенератах хвоста. Формировали аквариальный контроль и группу на субстрате (по 9 особей). Материал фиксировали через 24 часа, 7 дней и 14 дней п/оп в растворе 4% формальдегида на PBS и обрабатывали для получения серийных сагиттальных парафиновых срезов, которые окрашивали реактивами набора DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Срезы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Ингибировиние сигнального пути Shh. Использовали 6 групп животных: 1) отрицательный контроль (в аквариуме и на субстрате, по 2 особи); 2) контроль специфичности (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи), получавший раствор томатидина (Calbiochem); 3) опытные группы (в аквариуме и на субстрате, по 5 особей), получавшие раствор циклопамина (Calbiochem). Агенты, растворенные в 96% этаноле, вводили в среду до концентрации 0,6 мкМ (дважды в неделю по 180 мин с 21 до 49 дней п/оп), либо внутрибрюшинно по 12 нмоль на животное (каждые 48 ч с 31 до 49 дней п/оп).

Ингибировиние белков теплового шока проводили веществом Heat Shock Protein Inhibitor I (Santa Cruz Biotechnology), также известным как KNK437. По итогам сравнения эффективности наружного, внутрибрюшинного, внутримышечного внесения ингибитора для работы было выбрано наружное нанесение агента, растворенного в оливковом масле, в дозе 5 мкг на животное. Формировали 6 групп животных: 1) отрицательный контроль (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи); 2) контроль специфичности (в аквариуме и на субстрате, по 3 особи), получавший оливковое масло без ингибитора; 3) опытные группы (в аквариуме и на субстрате, по 8 особей), получавшие раствор ингибитора. Воздействие ингибитора осуществлялось с 21 до 47 дней п/оп 12 раз.

Изучение экспрессии генов HsplO и Hsp90 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на тканях интактного хвоста до и после теплового шока (по 4 образца) и регенератах хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по 3 образца через 2, 28 и 49 дней п/оп). Фенол-хлороформным методом выделяли тотальную РНК, чистоту и концентрацию которой измеряли спектрофотометрически. От примесей геномной ДНК образцы освобождали ДНКазой I. Обратную транскрипцию проводили с набором «Синтез первой цепи кДНК (рэндом)» (Силекс). Качественную оценку экспрессии генов HsplO и Hsp90 проводили методом ОТ-ПЦР с помощью набора «Амплификация ДНК с ColoredTaq полимеразой» (Силекс) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler 5532 (Eppendorf); в качестве внутреннего контроля были выбраны гены Efl-a, Gapdh и a-Actin. Праймеры для ПЦР (см. табл. 1) были сконструированы с использованием международной базе данных GenBank и сервиса BLAST. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием в ТАЕ буфере и оценивали интенсивность свечения полос на УФ-трансиллюминаторе. Секвенирование продуктов ПЦР, полученных с использованием специфических праймеров к нуклеотидной последовательности Hsp70 и Hsp90, показало их соответствие исходным последовательностям в базе данных GenBank (Авдонин и др., 2013). Количественную оценку экспрессии генов HsplO и Hsp90 проводили методом ПЦР в реальном времени с помощью 2,5 х реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол) на амплификаторе Step One Plus™ (Applied Biosystems); в качестве внутреннего контроля был выбран ген Efl-a. Специфичность реакции увеличили добавлением линейных разрушаемых проб (табл. 1). Исходные данные по приросту флуоресценции репортера, нормализованной по флуоресценции ROX, обрабатывали по алгоритму DART-

PCR (Peirson et al., 2003). Для каждого образца относительное количество РНК изучаемого гена, нормированное по количеству РНК Efl-a, выражали через среднее значение в интактном контроле.

Таблица 1. Характеристики и источники специфических праймеров и проб.

Ген Последовательности олигонуклеотидов Длина продукта Та

Прямой праймер (0,4 мкМ) Обратный праймер (0,4 мкМ) Проба (0.2 мкМ)

Ef1-a 5'- GGCACAGGGATTT CATCAAGAAC-3' 5'- GGAAATACCAGCTTC AAACTCACC-3' 5"-FAM - CGCCAGCAACAATC AGCACCGCAC- BHQ1-3' 104 н.о. 63°С

Gapdh 5'- GGCTAAGGTCATC CACGACAAC-3' 5'- CGGTAGAGGCTGGAA TGATATTCTG-3' нет 155 н.о. 56°С

а-Actin 5'- CACCACGGCTCAC CTTCAG-3' 5- AAGAGAATGGTTATG GTGCTGTTG-3' нет 81 н.о. 63°С

Hsp70 5'- GGCAGTTCGGAGG CTGAG-3' 5'- AAGCGTGCTCTGGTG ATGG-3' 5'-FAM - CTGCCTGTGAGCGA GCCAAGAGAACC- BHQ1-3' 132 н.о. 63°С

Hsp90 5'- GGTTGAGAAGGTG ACTGTTTCCA-3' 5'- TGCCTTCATAATCCTT TCCATGT-3' 5'-FAM- CGCCTTGTCTCTTC GCCCTGCT-BHQ1-3' 103 н.о. 63°С

Иммуногистохимичеекое определение экспрессии белков HSP70 и HSP90 в тканях регенерирующего хвоста проводили на тканях интактного хвоста до и после теплового шока (по 3 образца) и регенератах хвоста на разных стадиях в аквариальном контроле и группе на субстрате (по 3 образца через 2, 28 и 49 дней п/оп). Было проведено сравнение различных процедур фиксации и проводки и разработан оптимальный протокол. Материал фиксировали в растворе PAGA (56% этанола, 20% полиэтиленгликоля, 4% глицерина, 2,5% ледяной уксусной кислоты на PBS; +4 С, 16 часов), отмывали и проводили по растворам сахарозы, замораживали в среде Tissue-Tek® О.С.Т. Compound (Sakura Finetek Europe) и получали сагиттальные криосрезы (10 мкм). Реакцию пермеабилизации проводили с раствором 0,25% Triton Х-100 и 0,1% Tween 20 на PBS (30 мин), неспецифическое связывание антител блокировали раствором 3% BSA и 0,1 % Tween 20 на PBS (30 мин). Инкубацию с первичными антителами (табл. 2) проводили в растворе 3% BSA и 0,1 % Tween 20 на PBS (90 мин, 37°С), с вторичными антителами - в PBS (90 мин, tiioMn)- После каждой процедуры срезы отмывали в PBS. Окрашенные срезы, заключенные под покровные стекла в смеси глицерина и PBS, анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Статистическая обработка данных. Обработку всех численных данных проводили в редакторе Microsoft Office Excel 2007 и программе STATISTICA 8.0; выбор статистического критерия осуществляли отдельно для каждого эксперимента, принимая во внимание количество групп сравнения, количество значений в группах сравнения, их распределение и дисперсию.

Таблица 2. Использованные в работе антитела, их источник и рабочие разведения.

Название Фирма Вид- Тип Антиген Раб. Конц., мкг/мл

Anti-HSP70 antibody (N27F3-4) Abeam, Англия мышь моноклональные IgG рекомбинантный белок человека НЗР70 5

Anti-HSP90 antibody (S88) Abeam, Англия мышь моноклональные IgG, очищенный белок НЭРЭО ЛсЛ/уа атЫзехиаИэ 5

Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse lgG1 (y1) Antibody Molecular Probes, США коза IgG, Рс-фрагмент тяжелых цепей |дв мыши 2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Морфометрические исследования регенератов хвоста

1.1 Воспроизведение эффекта измененного морфогенеза при содержании на субстрате. Загиб формирующихся регенератов хвоста в группе, содержавшейся в лаборатории на субстрате, был обнаружен в экспериментах Фотон М2 и МЗ (О^огуап е? а/., 2008). Для воспроизведения этого эффекта регенерация хвоста тритона в аквариуме и на субстрате (по 10 особей) прослеживалась в течение 49 дней п/оп. Начиная с 21-го дня, осевые структуры в регенератах из группы на субстрате формировались под углом к переднезадней оси хвоста. Угол загиба хвоста в группе на субстрате на всех стадиях был меньше, чем в аквариуме, в то время как длина регенерата отличалась лишь первые 14 дней. Коэффициент загиба хвоста К уменьшался в обеих группах между 7 и 28 днями п/оп, что соответствует стадии бластемы и начала дифференцировки. После 28 дней п/оп значение К в аквариальном контроле стабилизировалось, а в группе на субстрате продолжило уменьшаться и стало достоверно меньше аквариального к концу эксперимента (рис. 2). Таким образом, полученные результаты доказали устойчивое проявление эффекта изменения формы регенерата в зависимости от условий содержания (предположительно, гравитационной нагрузки).

р - 0,086

р = 0,022

Динамика изменения коэффициента К

7 11 21 28 35 12 19

дни после ампутации Аквариальный кому роль-в-Группа на субстрате

Рис. 2. Изменение медианных значений коэффициента К в двух группах в ходе регенерации. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графике приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

1.2 Изучение темпов регенерации. Достижение последовательных стадий регенерации в аквариальном контроле в пяти проведенных экспериментах шло медленнее, чем описано в литературе. Во второй половине зимы, весной и летом темпы регенерации были сходны (0,126-0,133

стадия/день), в то время как поздней осенью темпы регенерации были ниже (0,081 и 0,100 стадия/день), что, видимо, отражает тормозящее влияние пониженных температур. При сравнении темпов регенерации в четырех экспериментах, включавших как аквариальный контроль, так и субстратную группу, достоверных различий между группами выявлено не было. Можно заключить, что сам факт содержания животных на субстрате не влияет на скорость регенерации.

1.3 Проверки обратимости изменения формы регенерата при содержании на субстрате дополнительно подтвердила описанную выше динамику изменения К в аквариуме и на субстрате. Через 32 дня п/оп различия между группами были признаны статистически достоверными, и 8 тритонов из группы на субстрате были перемещены в отдельный аквариум. В течение дальнейших 10 дней значение К в группе на субстрате продолжило снижаться, в то время как в группе, перенесенной в аквариум, несколько увеличилось. В результате этого данная группа стала отличаться от группы на субстрате и перестала достоверно отличаться от аквариального контроля. Можно заключить, что эффект изменения формы регенерата при содержании на субстрате, проявившись и достигнув уровня статистической достоверности, может быть обращен сменой условий.

2 Проявление эффекта загиба хвоста при регенерации с перегрузкой 2g

Гипотеза о ведущей роли гравитационной нагрузки в изменении морфогенеза на субстрате была проверена в Эймском центре HACA на трех группах животных: аквариальном контроле (5 особей), субстратной группе (12 особей) и в группе, подвергавшейся центрифугированию с перегрузкой 2g (12 особей). На рисунке 3 видно, что в субстратной группе, как и в группе центрифугирования, к 21 дню п/оп формируются загнутые регенераты, неотличимые друг от друга, но значимо отличающиеся от регенератов в аквариальном контроле. Результаты подтвердили наше предположение о

Рис. 3. Медианные значения коэффициента К в трех группах в финале эксперимента. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графике приведены уровни значимости отличий между группами по критерию Данна.

3 Изучение тканевых и клеточных аспектов измененного морфогенеза 3.1 Морфологическое изучение регенератов хвоста. Через 14 дней п/оп регенераты достигли стадии II; эпидермис регенератов в группе на субстрате

гравитационной природе действующего фактора.

Значения коэффициента К в финале эксперимента

р O.Q.3Q

□ Аквариум Ш Группа на субстрате Ш Группа центрифугирования

утолщался в дорсоапикальной зоне, чего не было отмечено в контроле. Через 28 дней п/оп регенераты находились в стадии III; в регенератах субстратной группы, по сравнению с аквариальным контролем, наметилась точка перегиба хрящевого тяжа и эпендимной трубки, прохрящевая конденсация образовалась под углом к переднезадней оси регенерата, дорсальнее точки перегиба хрящевого тяжа. В апикальной части бластемы наблюдалась «направленная» конденсация бластемных клеток. Через 49 дней п/оп (рис. 4) регенераты достигли стадии IV; в субстратной группе по сравнению с контролем стал очевиден изгиб осевых структур в вентральном направлении и соответствующее этому изменение окружающих тканей. Таким образом, на стадии III имели место отчетливые морфогенетические изменения формирующихся регенератов из группы на субстрате, обуславливающие изменение их морфометрических параметров и усиливающиеся на последующих стадиях. Утолщения эпидермиса и плотные «треки» в бластеме позволяют предположить участие дифференциальной пролиферации и

Рис. 4. Морфологическое строение регенератов хвоста в аквариальном контроле (А) и группе на субстрате (Б) на 49-й день п/оп. Увеличение 24*. ПХК - прохрящевая конденсация, T3 - точка загиба, XT - хрящевой тяж, ЭТ - эпендимная трубка.

3.2 Изучение пролиферативной активности клеток регенерата. В

интактном контроле и культях через 24 часа п/оп наблюдали единичные БрдУ+ клетки в эпидермисе и соединительной ткани. Через 7 и 14 дней п/оп на срезах обнаруживались многочисленные меченые клетки в эпидермисе, бластеме, соединительной ткани дистальной части культи, в том числе в оболочках осевых структур, а также отдельные клетки в толще мышечных волокон. Приблизительная оценка индекса мечения дала значения 2,2% через 7 дней п/оп и 1,6% через 14 дней п/оп. Локализация и распределение БрдУ1 клеток на срезах согласовывались с положением митотических фигур. В эпидермисе культи встречались одиночные меченые клетки, в то время как в раневом эпидермисе плотность мечения была высокой. В группе на субстрате процент меченых БрдУ+ клеток в апикальной зоне эпидермиса на обоих сроках был выше, чем в аквариальном контроле (рис. 5). Соотношение V/D в эпидермисе и бластеме варьировало в широких пределах как через 7, так и через 14 дней п/оп, и в среднем находилось на уровне 1,0-1,5, не различаясь достоверно в аквариальном контроле и группе на субстрате. Таким образом, было показано, что пролиферативная активность клеток апикального эпидермиса увеличивается на субстрате, что на гистологическом уровне отражается в его утолщении.

миграции клеток в развитии загиба хвоста.

3.3 Изучение локализации апоптоза в регенерирующих тканях. Метод TUNEL позволил обнаружить одиночные меченые клетки в эпидермисе хвоста из интактного контроля. Через 24 часа п/оп меченые клетки находились в эпидермисе, подлежащих тканях (как единичные, так и группы клеток), дистальной части хряща, спинном мозге и его оболочке. Через 7 дней п/оп меченые клетки обнаруживались в основном в соединительной ткани культи и, в меньшей степени, в эпидермисе и бластеме. В бластеме под эпидермисом меченые клетки были расположены редко, но равномерно, а в более глубоких слоях, в зонах дедифференцировки тканей, формировали кластеры с плотным мечением. Через 14 дней п/оп меченых клеток было меньше, их группы встречались только в области дедифференцировки. Локализация меченых TUNEL клеток на срезах регенератов совпадала с локализацией пикнотических ядер на гистологических срезах. Количественную оценку интенсивности мечения с использованием данного метода получить не удалось, однако впервые было показано участие апоптоза не только в процессе дегенерации

Рис. 5. Среднее количество БрдУ-меченых клеток в апикальной зоне регенератов из аквариального контроля и группы на субстрате в процентах от общего числа меченых клеток эпидермиса на 7-14 дни п/оп. Планки погрешности построены по величине стандартного отклонения. На графике приведены уровни значимости отличий между двумя группами по критерию Манна-Уитни.

4 Исследование роли сигнального пути 5ЛЛ в изменении морфогенеза

Как в случае добавления агента в среду, так и в случае внутрибрюшинного введения мы не выявили ингибирующего действия циклопамина на ход регенерации, описанного в других работах. Кроме того, ни в одном случае не было показано устойчивых и достоверных изменений формы регенерата при введении циклопамина ни в аквариуме, ни на субстрате. Эти результаты могут являться следствием слишком позднего применения ингибитора в нашем эксперименте, либо недостаточно высокой или постоянной его концентрации. С другой стороны, отсутствие эффекта может быть истолковано в пользу независимости его проявления от центральных морфогенетических механизмов регенерирующего хвоста, включающих сигнальный путь БЬИ. Это вполне согласуется с полученными ранее данными об обратимости морфогенетического эффекта при изменении условий.

ткани культи, но и в ходе формирования бластемы.

Доля апикальных клеток от всех меченых

% меченых

клеток эпидермиса

р = 0,200 И

р » 0,200

7 дней п/оп 14,

О Аквариальный контроль

р - 0,009

3 Группа на субстрате

5 Морфогенетический эффект теплового шока при регенерации

В эксперименте участвовали 3 группы животных: аквариальный контроль, субстратная группа и группа, регенерировавшая в аквариуме при еженедельном действии теплового шока. По окончании эксперимента в последней присутствовали как загнутые книзу регенераты, так и регенераты нормальной формы и даже несколько загнутые кверху. Для описания разнонаправленных изменений формы использовали величину ДК, которую рассчитывали как модуль разности между значением К для конкретного образца и средним значением К для аквариального контроля на данном сроке. На рисунке 6 видно, что в субстратной группе ДК возрастает с ходом регенерации, и через 49 дней п/оп достоверно отличается от ДК в аквариальном контроле. В группе, подвергнутой тепловому шоку, величина ДК также нарастает с ходом регенерации, но менее значительно, чем в субстратной. Таким образом, было показано, что воздействие теплового шока в ходе регенерации может приводить к изменению формы регенерата хвоста. Тот факт, что совершенно разные внешние воздействия оказывают сходный морфогенетический эффект указывает на универсальность клеточных и

Рис. 6. Медианные значения величины отклонения формы хвоста ДК в трех группах. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графиках приведены уровни значимости отличий между группами по критерию Данна.

молекулярных механизмов, данный эффект опосредующих.

дк

0 25

Отклонение коэффициента К от нормы

р=0,006

I

28 35

дни после ампутации

3 Аквариум

ШТегшовой шок

6 Ингибирование белков теплового шока

При введении ингибитора белков теплового шока у животных, содержавшихся в аквариуме, было отмечено увеличение разброса значений ДК в опытной группе по сравнению с отрицательным контролем, однако средние значения ДК в двух группах не отличались. Таким образом, нарушений формы регенерата при введении К№С437 в обычных внешних условиях не наблюдалось. Для животных, содержавшихся на субстрате, значения ДК в опытной группе оказались достоверно меньше, чем в отрицательном контроле (рис. 7). В то время как регенераты, не подверженные экспериментальным воздействиям, демонстрировали на субстрате развитие загиба и, соответственно, рост ДК с ходом регенерации, регенераты, обработанные ингибитором, оставались симметричными, а величина у них ДК не менялась на

протяжении эксперимента. Таким образом, можно констатировать, что введение ингибитора КЫК437 препятствует развитию изменений формы хвоста при содержании животных на субстрате, где формируются регенераты загнутой

Рис. 7. Медианные значения величины отклонения формы хвоста ДК в группе на субстрате в присутствии ингибитора и без него. Планки погрешностей построены по значениям первой и третьей квартилей. На графике приведен уровень значимости отличий между группами по критерию Манна-Уитни.

7 Изучение экспрессии генов теплового шока и локализации соответствующих белков в тканях

7.1 Изучение экспрессии генов теплового шока Шр70 и Шр90 методом

ПЦР и ПЦР-РВ. Методом ГТЦР было показано присутствие и сходный размер полос продуктов генов Е/1-а, Сарс1И, а-АсИп во всех пробах. Полосы ПЦР-продуктов, соответствующих Н$р70 и НярЯО, имели ожидаемую длину и наблюдались в интактном контроле, а также в большинстве других проб, однако их размер не был постоянным. Таким образом, данные гены регулировались в ходе регенерации; количественные аспекты этой регуляции были исследованы с помощью ПЦР-РВ. Было показано, что экспрессия Н$р70 тритона резко повышалась после теплового шока и, в меньшей степени, через 2 дня п/оп, а тенденция к повышению уровня экспрессии сохранялась на более поздних стадиях (рис. 8). Достоверных отличий уровня экспрессии Нзр70 в двух группах выявить не удалось. Тем не менее, результаты данного раздела исследования впервые выявили экспрессию гена Няр70 при регенерации хвоста у тритона Р. \valtl вне теплового шока. Для аннотированной последовательности гена Няр90 тритона была показана высокая стабильность экспрессии после теплового шока и в ходе регенерации. Это дает основания считать, что данный ген кодирует конститутивную форму белка ШР90.

7.2 Изучение локализации белков теплового шока Н8Р70 и НЯР90. На срезах интактного хвоста, окрашенных антителами против Н8Р70, были помечены многочисленные овальные ядра клеток соединительной ткани в пространстве между эпидермисом, мышцами и кожными железами; отдельные вытянутые ядра между пучками мышечных волокон и редкие мелкие вытянутые ядра в соединительно-тканных оболочках спинного мозга и вокруг позвоночника. После теплового шока специфическое мечение присутствовало в

формы.

лк

0.45

0.40

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10 -

0.05

0.00

Отклонение коэффициента К от нормы; содержание на субстрате

:......^.......I ^ 'Г

28 35 42

дни после ампутации

□ Контроль ИКМК437,5 миг

р=0,033

■

основном в эпидермисе. Мечение культей хвоста в аквариальном контроле через 2 дня п/оп было сходно с интактным по локализации, но более интенсивным; кроме того, в апикальной области под эпидермисом мы наблюдали группы мелких округлых ядер с ярким специфическим мечением. В группе на субстрате общий уровень мечения был значительно ниже, сохраняясь на высоком уровне лишь между мышечных волокон и в апикальной области под эпидермисом. На стадии IV регенерации как в аквариальном контроле, так и в субстратной группе меченые клетки обнаруживались в большом количестве в локализации, характерной для интактного хвоста. Кроме того, для срезов из группы на субстрате было характерно интенсивное мечение клеток в эпидермисе, ранее отмеченное только в тканях после теплового шока. Распределение специфически меченых антителами против Н8Р90 клеток в целом было сходно с таковым для Н8Р70, и для него была выявлена та же главная закономерность — появление эпидермального мечения после теплового шока и в зрелых регенератах из субстратной группы. Эти результаты подкрепляют гипотезу об участии белков теплового шока в проявлении морфогенетического эффекта обоих внешних факторов - и гравитационной нагрузки, и теплового шока.

Рис. 8. Количество кДНК №р70 в пробах, измеренное относительно количества кДНК ЕИ-а с помощью ПЦР в реальном времени. Планки погрешности построены по значениям стандартного отклонения. Приведены уровни значимости отличий каждой группы от интактного контроля по критерию Данна (статистически достоверные отличия отмечены звездочкой).

Заключение.

Целью данной работы было изучение не описанного ранее явления — изменения морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в зависимости от внешних факторов. Были разработаны условия, в которых такое изменение устойчиво воспроизводится, и способы его измерения. Выяснилось, что содержание на субстрате приводит к загибу регенерата хвоста, предположительно, за счет увеличенной гравитационной нагрузки, в пользу чего свидетельствуют и результаты длительного центрифугирования. Было показано, что при смене условий приобретенное изменение формы оказывается обратимым. Это косвенно свидетельствует о том, что эффект внешнего

Количество кДНК Няр70 а пробе относительно количества кДНК ЕР1-а

р=о.оез

р-1.000 НШ Р-0.2И

воздействия на морфогенез регенерирующего хвоста опосредуется не основными морфогенетическими механизмами, а локальными механизмами контроля клеточного поведения. Изменение формы регенерата было описано на уровне морфометрии, морфологии и поведения клеток - пролиферации и апоптоза; в том числе было показано усиление пролиферации и утолщение в апикальном эпидермисе измененных регенератов. Отсутствие эффекта ингибирования важнейшего морфогена БЬЬ на форму хвоста в аквариуме и на субстрате может говорить о том, что действие гравитационной нагрузки на морфогенез опосредуется нижележащими подчиненными механизмами регуляции клеточного поведения, например, пролиферации, апоптоза и миграции, что согласуется с другими нашими данными. Впервые было показано, что загиб регенерирующего хвоста может вызываться не только увеличением гравитационной нагрузки, но и периодическим действием теплового шока. Это говорит о существовании универсального механизма распознавания внешних воздействий различной природы и ответа на них. В качестве кандидатов на роль молекулярных посредников в таких механизме были предложены белки теплового шока. Действительно, их фармакологическое ингибирование препятствует развитию загиба хвоста на субстрате. Впервые была предпринята попытка охарактеризовать экспрессию генов теплового шока и локализацию соответствующих белков в ходе нормальной регенерации хвоста Р. \valtl и оценить ее изменение при действии повышенной гравитационной нагрузки. Было показано, что в регенератах из субстратной группы и в хвостах после теплового шока белки Н8Р70, Н8Р90 присутствует в нехарактерной для нормальных условий эпидермальной локализации. По итогам работы можно предположить, эпидермальные клетки являются «первичными сенсорами» внешних воздействий и проводниками информации о них. Изменения в эпидермальных клетках могут определять более поздние изменения в бластеме при формировании осевых структур регенерата посредством тканевых взаимодействий, имеющих место в регенерации. Существенная роль в рецепции и трансформации сигнала о воздействии в эпидермисе, вероятно, принадлежит белкам теплового шока.

ВЫВОДЫ

1) Впервые разработана модель, воспроизводящая изменения формы регенерирующего органа под действием внешних факторов. Обнаружено, что гравитационная нагрузка способна менять форму регенерата хвоста у тритона Р. \valtl.

2) С помощью методов компьютерной морфометрии и статистического анализа показано, что морфогенетический результат воздействий достоверен, не сопряжен с угнетением или ускорением регенерации и является обратимым при изменении условий содержания животных.

3) Показано, что на тканевом и клеточном уровнях изменения морфогенеза хвоста обусловлены особенностями строения эпидермиса, эпендимной трубки, хрящевого тяжа и бластемы регенератов. Впервые изучены

пролиферация и апоптоз при регенерации хвоста тритона; показано локальное увеличение пролиферативной активности на фоне ограниченной гибели клеток эпидермиса регенератов у животных в условиях lg в сравнении с аквариальным контролем.

4) Впервые проведен функциональный анализ роли сигнального пути Shh в регенерации хвоста тритона с помощью введения ингибитора -циклопамина. Воздействие ингибитора после формирования бластемы не приводило к нарушению регенерации и не влияло на развитие морфогенетического эффекта в условиях lg.

5) Впервые обнаружено, что воздействие теплового шока в ходе регенерации вызывает изменения формы хвоста, сходные с таковыми на субстрате. Введение ингибитора белков теплового шока КМК437 при физиологически оптимальной температуре препятствует изменению формы хвоста в условиях lg, но не влияет на форму регенерата в условиях аквариума.

6) Впервые на модели регенерации хвоста тритона исследована экспрессия генов Hsp70, Hsp90 и локализация их белков. Показано присутствие мРНК и белков в интактных тканях и на всех стадиях регенерации. Обнаружено повышение количества мРНК Hsp70 в начале регенерации; отмечена специфическая эпидермальная локализация белков HSP70, HSP90 исключительно в регенератах из групп воздействия перегрузкой и тепловым шоком.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 11-04-00125-а с использованием оборудования Центра коллективного пользования ИБР РАН.

Список сокращений

ГТЦР - полимеразная цепная реакция БрдУ - 5-бромо-2'-дезоксиуридин п/оп - после операции

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК

1)Радугина Е.А., Григорян Э.Н. Морфогенетические изменения при регенерации хвоста у тритонов в условиях различной гравитационной нагрузки // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. № 5. С. 478—485.

2) Григорян Э.Н., Маркитантова Ю.В., Авдонин П.П., Радугина Е.А. Исследование регенерации у амфибий в эпоху молекулярно-генетических подходов и методов // Генетика. 2013. Т. 49. № 1. С. 55-72.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Григорян Э.Н., к.б.н. Маркитантовой Ю.В., к.б.н. Авдонину П.П., к.б.н. Поплинской В.А., к.б.н. Новиковой Ю.П., д.б.н. Микаэляну А.С., д.б.н. Авдонину П.В., к.б.н. Маршак Т.Л., д.б.н. Васецкому С.Г., Dr. Е. Almeida, Dr. N. Dvorochkin.

15-109

16

Радугина Елена Александровна Регуляция морфогенеза регенерирующего хвоста тритона в норме и в условиях измененной гравитационной нагрузки Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 02.10.2015 Заказ № 325

I 2015809530

2015809530