Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и экспрессии гомеобоксных генов семейства Six в процессе регенерации конечности амфибий

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и экспрессии гомеобоксных генов семейства Six в процессе регенерации конечности амфибий"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ. Н. К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи

РГ6 ОД ш 591 ■596/599

О в ФВ

ЗН0ЙК0 Ия Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ ГОМЕОБОКСНЫХ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА SIX В ПРОЦЕССЕ.' РЕГЕНЕРАЦИИ КОНЕЧНОСТИ АМФИБИЙ

03.00.30 биология развития 03.00.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института биологии развития им. Н. К. Кольцова ( Директор Института - академик Н. Г. Хрущов)

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Р. Д. Зиновьева Доктор биологических наук В.И.Миташов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук А.. Г. Бабаева /^Доктор биологических наук Л.И.Корочкин

Ведущее учреждение: Биологический факультет

Защита диссертации состоится И,0г. 1998 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.85.01

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова. 26

Автореферат разослан ^декабря 1997 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова

при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул Вавилова. 26

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одной из наиболее актульных проблем современной биологии является изучение молекулярных механизмов, направляющих развитие отдельных органов и организма в целом (Stocum. 1995; Tsonls. 1996). В данной работе предпринята попытка выявить и охарактеризовать гены, участвующие в регулировании процесса регенерации конечности амфибий. Проблема регенерации волнует биологов и медиков уже давно, и на морфологическом уровне она достаточно хорошо описана. Однако, молекуляр-но-генетические механизмы этого процесса остаются неясными. Очевидно, что начало процесса регенерации после утраты органа или повреждения его части является следствием активации экспрессии генов, которые в нормальных условиях "молчат". Выявление и изучение этих генов помогло бы. во-первых, ответить на вопрос, почему только некоторые животные обладают способностью к регенерации, и. во-вторых, возможно, получить средство для стимуляции регенерации у животных (и человека). которые в норме не обладают способностью к регенерации. Понимание молекуляр-но-генетических механизмов '.регенерации помимо фундаментально-научного значения может также иметь и практическое значение для решения таких медицинских проблем, как заживление ран и восстановление пораженных тканей.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.Целью настоящей работы было выявить и охарактеризовать гены, специфически экспрессирующиеся в ходе регенерадии конечности амфибий. В качестве претендентов на роль таких генов были выбраны гомеобоксные гены семейства Six, гак как известно, что гены этого семейства играют важную роль в развитии мыши. Моделью для исследования служили представители бесхвостых (травяная лягушка Rana temporaria) и хвостатых (испанский тритон Pleuroáeles wait I и аксолотль (Ambystoma mexica-urni) амфибий. Поскольку указанные животные обладают различной способностью к регенерации конечности, выбранная модель дает зозможность оценить роль, которую играют анализируемые гомео-5оксные гены в процессе регенерации, а также установить, су-цествует ли связь между их экспрессией и регенерационной способностью изучаемых животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. В данной работе впервые идентифицированы гомеобоксные

- г -

гены семейства Six, экспрессирующиеся у амфибий.

2. Впервые проведены исследования уровня экспрессии генов семейства Six в ходе регенерации конечности хвостатых и бесхвостых амфибий.

3. Впервые показано наличие корреляции между экспрессией Six генов и регенерационной способностью у амфибий.

4. Нами впервые получен и охарактеризован фрагмент гена Síxl лягушки Rana temporaria, а также фрагменты генов семейства Six, экспрессирующиеся в ходе регенерации конечности у тритона Pleurodeles ml ti и аксолотля Ambystoma mexícanum.

Практическая значимость работы определяется прежде всего непосредственной близостью проблемы, освещаемой в диссертации, к практическим задачам медицины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены на Европейской конференции международной ассоциации исследователей регенерации 29 сентября - .3 октября 1997 г в Кельне (Германия) и на конференции "Современные проблемы биологии развития", посвященной 30-летию Института биологии развития им. Н.К. Кольцова. 29-31 октября 1997 г в Москве.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты .диссертационной работы изложены в 3-х публикациях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением материала и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Изложена на 'f^ страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками. Список литературы содержит источника, в том числе А.1 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Идентифицированы гомеобокс-содержащие гены семейства Six. гомологи гена дрозофилы sine оси lis, у травяной лягушки (Rana temporaria). испанского тритона (Pleurodeles rnltl) и аксолотля Mmbystoma mexícanum). Обнаружена дифференциальная экспрессия Six генов в ходе регенерации конечности у изученных амфибий.

Выявлена корреляция экспрессии этих генов с наличием регенера-ционной способности у изученных животных. Определена первичная структура наиболее консервативных участков идентифицированных генов. С помощью компьютерного анализа выявлены различия в первичной структуре генов семейства Six, экспрессирующихся в регенератах конечностей тритона, лягушки и аксолотля, с одной стороны. и общие структурные особенности этих генов у всех изучен-• ных амфибий в сравнении с соответствующими генами млекопитающих. с другой стороны. Структурный анализ полученных клонов показал. что впервые удалось выделить и охарактеризовать фрагмент гена Sixl лягушки Rana temporaria и участки генов семейства Six. экспрессирующихся в регенерирующих конечностях хвостатых амфибий. В процессе работы сконструирована кДИК библиотека зародышей тритона на 20-30 стадиях развития, клонированная в фаг-миде UNI-ZAP XR. Подобрана .система для поиска полноразмерных копий охарактеризованных клонов в виде Marathon-кДНК амплифици-рованной библиотеки регенерирующих тканей конечности испанского тритона.

ВВЕДЕНИЕ.

Генетический контроль восстановительных процессов (регенерации) является предметом интенсивного изучения. Развитие этого направления исследований открывает возможности не только для понимания молекулярных механизмов такого сложного процесса как регенерация органов и тканей, но и для практического использования полученных данных для решения био-медицинских задач. Современные молекулярно-биологические методы исследования позволяют искать подходы для решения проблемы восстановления утраченной способности к регенерации путем выявления и изучения генов, специфически экспрессирующихся в ходе регенерации. Поскольку прогрессивная фаза регенерации имеет много общего с процессом развития, логично предположить, что в этих двух процессах могут участвовать сходные регуляторные гены.

Молекулярные механизмы, управляющие важнейшими биологическими функциями. - высококонсервативны, так как находятся под эволюционным давлением. Наиболее ярко это демонстрируют гомео-боксные гены, участвующие в регуляции важнейших процессов в хо-

де развития организма. Эти гены содержат в своем составе гомео бокс - высококонсервативный участок, кодирующий гомеодомен. от ветственный за связывание регуляторного белка с ДНК. Практически все гомеобоксные гены являются транскрипционными факторами i на данный момент есть все основания предполагать, что именнс они играют ключевую роль в определении "клеточной судьбы".

Данное исследование было предпринято для установления возможного участия гомеобоксных генов семейства Stx в ходе регенерации конечности амфибий. В качестве модели были выбраны представители бесхвостых (лягушка) и хвостатых (тритон и аксолотль) амфибий. Поскольку указанные животные обладают различной способностью к регенерации конечности, выбранная модель дает возможность оценить роль, которую играют вышеназванные гомеобоксные гены в реализации регенерационной потенции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Биологический материал. Работа выполнялась на следующих видах животных: лягушки травяные (Rana temporaria), тритоны испанские (Pleurodeles mltl) и аксолотль (Ambystoma mexícanum). Все операции на животных проводились под наркозом MS 222. У взрослых тритонов и аксолотлей удаляли задние конечности на уровне 1/2 бедра и 1/2 голени. У личинок лягушки удаляли задние конечности на Па и III стадиях развития по Полежаеву (Полежаев, 1968). Образо- вавшиеся регенераты конечности удаляли на стадиях ранней, средней и поздней почки, на стадии конуса. До момента использования образцы тканей хранили при -70'С.

Выделение РНК и синтез 1-ой цепи кДНК. Из полученных образцов ткани выделяли РНК гуанидинтиоцианатным методом с помощью набора TRI-REAGENT (Molecular Research Center, Inc.. США). 1-ую цепь кДНК синтезировали по стандартному протоколу с помощью обратной транскриптазы M-MLV-RT (BRL, США).

Выделение геномной ДНК из семенников тритона и лягушки проводили по стандартному протоколу с помощью протеиназного метода.

Анализ экспрессии генов семейства Six проводили с использованием метода RT-PCR. С помощью компьютерного анализа (пакет программ DNASTAR) известных структур генов семейства Six млекопитающих были сконструированы вырожденные праймеры. В качестве матрицы использовали образцы 1-ой цепи кДНК. синтез которых описан выше.

Выделете и клонирование амплифицированных фрагментов. Фрагменты, полученные в результате амплификации фракционировали в 1.535 агарозном геле. Из геля кДНК элюировали с помощью набора GeneClean II (Bio 101 Inc.. США). Полученные фрагменты кДНК клонировали в вектор pCR 2 с помощью набора "Original ТА Cloning Kit" Version F (InVltroGen. США).

Определение первичной структуры кДНК проводили секвенирова-нием по методу Сэнгера с 'использованием универсальных М13 прай-меров.

Компьютерный анализ. Первичную структуру полученных кДНК фрагментов анализировали с помощью пакета програм "DMASTAR".

Конструирование кДНК библиотеки зародышей тритона на 20-30 стадиях развития проводили с помощью набора ZAP-cDNA SYNTHESIS KIT (Stratagene, США).

Создание амплифицированной кДНК библиотеки тканей регенерирующей конечности тритона проводили в системе "Marathon" (Clontech. США). мРНК выделяли с помощью набора "DYNABEADS mRNA purification kit" (DYNAL. США). Скрининг библиотеки проводили с помощью метода 3' и 5'RACE.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ экспрессии гомеобоксных генов семейства Six в интактных и регенерирующих структурах амфибий.

Для поиска гомологов генов семейства Six. экспрессирующих-ся в развивающихся и регенерирующих тканях амфибий мы использо-

вали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). На основе известных структур генов Sixl. Six2 и Six3 мыши были сконструированы вырожденные праймеры, фланкирующие консервативный участок, общий для генов семейства и содержащий два домена: так называемый, Six-бокс и гомеобокс. что соответствовало положениям между 139 и 492 нуклеотидами для Sixl. 247 и 600 для Six2. 602 и 955 для Six3 (Oliver et al., 1995).

В качестве матрицы использовали РНК. выделенную из регенератов конечностей животных, обладающих различной способностью к ее регенерации, а также из развивающихся и дифференцированных конечностей. Известно, что в отличие от тритонов, которые сохраняют способность к регенерации полноценной конечности на протяжении всей жизни, конечность у травяных лягушек может регенерировать только в том случае, если она была удалена на достаточно ранней стадии развития (до 116 стадии по Полежаеву, см. Рис. 1). Лягушки на продвинутых стадиях развития, начиная с III. а также взрослые особи полностью утрачивают способность к регенерации конечности.

Таким образом, при проведении данных исследований мы пытались ответить на следующие вопросы: во-первых, экспрессируются ли гены семейства Six в ходе регенерации конечности у амфибий, и. во-вторых, существует ли корреляция между экспрессией Six генов и регенерационной способностью животных.

Результаты ПЦР эксперимента, представленные на Рис. 2, показали. что экспрессия генов семейства Six наблюдалась в регенератах конечности тритона и лягушки. В диференцированных тканях взрослого тритона экспрессия генов семейства Six не обнаружена. Следует особо отметить, что экспрессия этого гена наблюдалась в развивающейся конечности лягушки на стадии, когда она способна к регенерации конечности, и не детектировалась на следующей стадии развития лягушки, когда она теряет способность к регенерации конечности (Рис. 2. 1-ая и 3-я дорожки, соответственно). Полосы, присутствующие в дорожках, соответствующих образцам геномной ДНК лягушки и тритона, подтверждают наличие гомологов Six-генов в геномах лягушки и тритона, а также свидетельствуют о том. что этот район гена не интронирован (Рис. 2).

Полученные нами данные свидетельствуют о том. что экспрес-

Рис. 1. Последовательные стадии метаморфоза головастиков травяной лягушки (Полежаев, 1968).

И 1 2 34 5678

Вне. 2. Электрофоретическое фракционирование в 1,5% агароэнои геле продуктов ПЦР реакции, о синтетически«« олигокук-леотидными прайкерани, фланкирующими наиболее консервативный участок генов семейства Six, размером около 350 п.н. В качестве матрицы использовали материал, выделенной: из развивающейся конечности травяной лягушки на стадии развития, когда возможна регенерация .(до На стадии по Полежаеву, 1 дорожка) и когда регенерация невозможна (III стадия по Полежаеву, 3 дорожка); из регенерата конечности травяной лягушки (2 дорожка) и испанского тритона (4 дорожка); из дифференцированной конечности тритона (5 дорожка); из конечности взрослого тритона без кожи (6 дорожка); образцы геномной ДНК лягушки (7 дорожка) и тритона (8 дорожка). М - маркер молекулярных весов, содержащий фрагменты размером 1000, 700, 525, 500, 400, 300, 200, 100 И 50 П.Н.

сия генов семейства Six наблюдается в ходе регенерации и на ранних стадиях развития, но не детектируется на поздних этапах развития лягушки и в дифференцированных тканях конечности взрослых амфибий. Таким образом, обнаруженная нами корреляция экспрессии генов семейства Six и регенерационной способности у лягушек, позволила сделать вывод о том. что экспрессия этих генов характерна для периода интенсивных- формообразовательных процессов в развивающейся и регенерирующей конечности.

Анализ первичной структуры генов семейства Six.

экспрессирущихся в регенерирующих конечностях амфибий.

Для идентификации полученных фрагментов и анализа их' первичной структуры они были клонированы в вектор pCR2 (InVltro-Gen, США) и секвенированы.. На. Рис. 3 представлены последовательности клонов, несущих фрагменты генов, экспрессирующйхся в регенерирующей (SlxReg3) и развивающейся (SixRT8) конекности лягушки, регенерате конечности тритона (SlxPwi)., а также пер. вичная структура фрагмента, полученного наш аналогичным: образом из регенерирующей конечности другого представителя хвостатых амфибий, аксолотля Mbystoma mexicanm (AmFLR).

Анализ представленных последовательностей показал.; что исследованные участки генов, экспрессирующихся в развивающейся и регенерирующей конечности лягушки, практически идентичны, за исключением 4-х silence-мутаций по 84. 124-, 291 и 294 положениям, не приводящим к заменам на аминокислотном уровне. Скорее всего, эти замены объясняются внутривидовым полиморфизмом, однако нельзя исключить возможность существования альтернативных форм гена, участвующих в различных, процессах - развитии и регенерации.

Хотя анализируемый участок - наиболее консервативная часть гена, между первичными последовательностями клонов из регенерата конечности лягушки и регенерата конечности тритона (см. Рис. 3) было выявлено достаточно большое количество различий - 44 замены на нуклеотидном уровне, которые привели к замене 6 аминокислот. Сравнение структур кДНК клонов из регенерата конечности другого представителя хвостатых амфибий, аксолотля, и травяной лягушки выявило 48 различий на нуклеотидном и 7 на

1 ТТССАСАССООСААСТТССОЛОНОСТСТАСЛЮАТССТООАОАОССАССАОТТСТССССССДСААССАСС 81ХНЕСЗ

1 ..................................................................................................81ХЯТ8

1 ............ее......С..................О . в С О .... С С.....С. .С....................51ХРК1

1 ....................С.....................О С С .... С С.....Т. .С....................АМР1В.

71 ССААССТОСАССААСТСТСССТСААСССТСАСТАССТССАСССССАСААОСТОСССССААСАССССТТСС 81ХЙЕСЗ

71 ............в.......................................Л..............................51ХВТ8

71 ............. . . С . . . . : А..............А.....Т.........: . . . . С С . С . . Т..........81ХРМ1

71 .............О. .С...........в...........................С.ТСОСОС..ОС...

141 СССАСТССОСААСТАСССОСТСАССАОСАААТТСССССТОСССАССАССАТСТСССАССОАСАССАОАСС ЭКЯЕОЗ

141 ..........................................................................................51ХЯТ8

141 ... с....................А.....в.....в......С................т........Т вХХРМ!

141 ...ОТ.................С. С.....в.....О.....ОС. С..............С........б АМРи\

211 АССТАСТОСТТСААСеАСАААТССАООООССТССТСАОАСАОТСОТАТОСССАСААССССТАСССТТСТС вШКвЗ

211 ............................................................................................................................................51ХВТ8

211 ..........................С..Т../.ССС.С........С. .А..............О. .С. 81ХРК1

211 ....................О . . . С . С . . А.....СС.С........С . . б..............О. .С. АМЯ.Я

н*

281 СССССОАСААОАСАСАОСТССССеАООССАСТООАСТСАССАСТАСТйАСОТСАаСААСТСОТТТААОАА вШЕОЗ °

281 ..........А . ................................................................................................................81ХЯТ8 . I

281 . Б.....А . .' ^ С :• О . . . Т.............б . . О........С . . С.........................................81ХРК1

281 -б.........С . О....................С........С . . е . ...........................................АМР1Я

351 С С О О 81ХЯЕСЗ

351 ... . . 51ХВТ8

351 ... . * 51ХРМ1

351 .... АМЯ1Я

Рно. 3. Первичная структура кДНК клонов, выделенных из регенерирующей (ЭАхКедз) и развивающейся конечности травяной лягушки (Б1хКТ8), а также регенерирующей конечности испанского тритона (51хРи1) и аксолотля (АтГ1Л1). Структура Б1хКедЗ приведена полностью, в остальных клонах обозначены только замены нуклеотидов.

аминокислотном уровнях. Сравнение первичных последовательностей клонов хвостатых амфибий - тритона и аксолотля - между собой, обнаруживает 36 замен на нуклеотидном и 9 на аминокислотном уровне.

Несмотря на то. что. все полученные нами клоны амфибий различаются между собой, для них характерны некоторые структурные черты, выделяющие их в единую группу при сравнении с известными генами млекопитающих. На Рис. 4 приведено сравнение первичных последовательностей полученных клонов амфибий и соответствующего фрагмента наиболее близкого к ним из опубликованных генов млекопитающих - Sixl мыши. Следует отметить, что многие замены идентичны для всех изученных амфибий (см.. например, положения 7, 36. 66. 75. 138. 141 и др). Этот факт может не только иллюстрировать очевидную эволюционную дистанцию между амфибиями и млекопитающими, но и отражать возможные функциональные различия генов семейства Siх. экспрессирующихся у.названных таксонов.

На Рис. 5 представлен сравнительный анализ производных аминокислотных последовательностей полученных клонов, а также соответствующих участков известных генов семейства Six мыши и гена sine oculis дрозофилы.

Следует подчеркнуть, что кДНК клон SlxReg3 травяной лягуш-си по структуре, практически идентичен гену Sixl мыши - на ами-íokислотном уровне пристствует всег<з одна замена по 3-ему поло-гению. Таким образом, ген дифференциально экспрессирующийся в ipouecce регенерации конечности лягушки, скорее всего, является 'еном Sixl лягушки Rana temporaria.

Аминокислотная последовательность кДНК клонов из регенери-(ующих конечностей тритона и аксолотля гораздо сильнее отличатся от структур известных генов семейства Six. Наибольшую сте-:ень гомологии из всех опубликованных последовательностей клоны ритона и аксолотля демонстрируют с геном SíxJ мыши: 82,855 и 5,6% гомологии на нуклеотидном и 94.155 и 93.235 гомологии на минокислотном уровнях, соответственно (см. Рис. 6). Однако, азличий в структуре разных генов мыши Sixl и Six2 даже меньше 8535 гомологии на нуклеотдном и 95.835 гомологии на аминокис-отном уровнях. Несмотря на то, что гены семейства Stx амфибий бразуют единую структурную группу (Рис. 4) в сравнении с гена-

АИРЦВ

А.....С С . >...................С....С.ОСО....СС........в.....е.... Б1ХРН1

51ХЯЕ6Э

вххятв

ТТССАССССОбСААСТ.ТССОСОАОСТСТАСААОАТАСТООАОАОССАССАОТТСТСОССТСАСААТСАСС иадош

1 АИРЦВ

1 ЭХХРМЛ.

1 г1хяЕ(зз

1 31ХЯТ8

1 ССАААСТбСАвСАОСТОТбвСТаАААОСОСАСТАСаТаОАваССОАОАААСТТСОСООССОАССССТбСС М0и$51Х1

41 АМРШ

41 б...........в . . С......А . А А . 0 . . б......С. ...С........С........Т........Т 51ХР*1

41 51ХЙЕСЗ

41 81ХПТ8

41 ТСССбТбОбСАААТАТ:СбббТОСОССбАААЛТТСССОТТОССаСббАССАТбТбООАСОбСОАООАбАСС ►1011331X1

211

211 в1ХРУ(1

211 вШЕОЗ

211 ...........С.........А .. С А .... В......А. А:.......Т. .С..............Т. .Т. 51ХЯТ8

211 А'бстАСТбстттААав'лоААвтстсваоасатастосааалатаатлсвсаслсААССсстАсссстсАс НОУвв 1X1

281 АНРШ ■ •

281 81ХРИ1

281 СО.......б А . А.................Т.гА........Т . . Т ....................... вШЕОЗ

281 вГХВТв '

281 СОАбббАбААЛСбббАбСТббССбАвбССАССбОССТСАССЛССЛСССЛООТСАОСААСТОбТТТААбАА

351 АНРЬЯ

351 81ХРН1

351 81ХПЕСЗ

351 э гхдтв

351 СС6--6 ~ НОдевт

Рис. 4. Сравнение первичной структуры кДНК клонов амфибий и соответствующего фрагмента гена 1 мыши. Структура последнего (тоивев1х1) приведена полностью, в остальных клонах обозначены только замены нуклеотидов. Обозначе-

ния аналогичны Рис. 3.

Т ЩСЙШ D н №&>.*& N К т т К Е S № G Ш F' .H ' -ntiGi О Y К ЗИВЭД R L Н Щ Н A Q A ¡f£

•^йШЯЗШВВД^ А щ

1 л г,4»1л1«,4лг.'Фг'лЛг*V*>•»'«xiAг-й¿J-Чw it ГОд'Л vi t : .,»/.'

M0USSIX3

DROSSO

M0USSIX2

M0USSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

M0USSIX3

DROSSO

H0USSIX2

M0USSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

M0USSIX3

DROSSO

M0USSIX2

M0USSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

M0USSIX3

DROSSO

M0USSIX2

M0USSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

M0USSIX3

DROSSO

M0USSIX2

M0USSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

>нс. 5. Сравнение производных аминокислотных последовательностей наиболее консервативного участка генов семейства Six. SixPwl - ген, экспрессирующийся в регенерирующей конечности испанского тритона; SixReg3 - ген, экспрессирующийся в регенерирующей конечности травяной лягушки; AmFLR - ген, экспрессирующийся в регенерирующей конечности аксолотля; mousSixl, mousSix2 и mousSix3 - гены мыши Sixl, Six2 и Six3, соответственно; drosso - ген дрозофилы sine oculis. Совпадающие участки генов заштрихованы.

ми млекопитающих, один из них, а именно, ген лягушки очень близок по структуре гену Sixl млекопитающих - гомология на аминокислотном уровне составляет 99.2% (см. Рис. 6). Эти обстоятельства позволяют предположить, что клоны, полученные нами из регенератов конечности тритона и аксолотля несут информацию о генах семейства Síx. еще неописанных в литературе. В таком случае. в процессе регенерации конечности животного с ограниченной способностью к таковой (лягушки Rana temporaria) и в процессе регенерации у животных с совершенной регенерацией (тритона и аксолотля) экспрессируются различные гены семейства Síx.

Чтобы проверить это предположение необходимо располагать дополнительной информацией структуре соответствующих генов амфибий. С этой целью нами была подобрана система для поиска полноразмерных копий охарактеризованных клонов амфибий.

Создание базовых систем для структурных исследований генов, принимающих участие в регулировании процесса регенерации.

Несмотря на очевидность поставленной цели - получение полноразмерных копий изученных клонов - ее достижение является нетривиальной задачей, поскольку рассматриваемые гены являются регуляторными, то есть очень низко представленными. Кроме того, анализируемый материал - регенерирующие ткани - доступен в очень ограниченных количествах, которых явно недостаточно для создания кДНК библиотеки классическим способом.

В ходе исследований мы обнаружили (данные приводятся в диссертации), что Six гены экспрессируются и в ходе развития тритона. Это обстоятельнство позволило нам использовать для создания кДНК банка доступный материал - зародыши тритона на 20-30 стадиях развития. Таким образом, нами был собран материал на соответствующих стадиях развития тритона, из которого была выделена мРНК и сконструирован кДНК банк в фагмидном векторе UNI-ZAP XR (Stratagene. USA). Однако, скрининг этого-банка с помощью ПЦР-продукта. полученного на той же матрице (РНК. выделенная на 20-30 стадиях развития тритона), не выявил ни одного положительного сигнала. Для анализа полученного результата, мы приблизительно оценили содержание интересующиего нас гена в ис-

Гомология (5<)

«

я я

X о и

а о я я fct

I 1 I 2 3 4 5 6 7

1 щщ 61.3 75.1 73.4 67.8 6S.4 72.0 1

2 32.5 ■1 70.1 76.0 68.6 65.5 69.5 2

3 22.3 27.1 шш 65.0 81.6 81.6 84.5 3

4 23.7 22.3 14.4 ■■ 84.2 82.8 85.6 4

5 27.1 27.4 15.5 14.7 ■■ 88.2 84.7 5

б 28.5 29.9 16.1 18.1 12.7 ЕВ 88.7 в

7 22.4 26.3 11.6 12.5 12.5 8.5 ■■ 7

1 2 3 4 5 Л 7

MOUSSIX3

DROSSO

MOUSSIX2

MOUSSIX1

SIXREG3

SIXPW1

AMFLR

6.

Гомология (X)

1 2 3 * 5 6 7

1 ■в 68.1 71.4 71.4 71.2 67.8 66.9 1

2 31.9 ■1 86.6 87.4 86.4 83.9 822 2

3 28.6 13.4 ЩЩ 95.8 94.9 89.8 89.0 3

4 28.6 1Z6 4.2 ■1 99.2 94.1 93.2 4

5 28.8 13.6 5.1 0.8 ■1 94.9 94.1 5

в 32.2 16.1 10.2 5.9 5.1 ЯШ 92.4 в

7 33.1 17.8 11.0 6.8 5.9 7.6. ■■ 7

1 2 3 4 5 6 7

MOUSSIX3

DROSSO

MOUSSIX2

MOUSSIX1

SIXREG3 •

SIXPW1

AMFLR

Ряс. 6. а. Результаты сравнения нухлеотидной последовательности наиболее консервативного участка генов семейства Six, выраженные в процентах. Обозначения аналогичны Рис. 5. б. Результаты сравнения производной аминокислотной последовательности наиболее консервативного участка генов семейства Six, выраженные в процентах. Обозначения аналогичны Рис. 5.

ходном материале мРНК (см. подробно в тексте диссертации). Оказалось, что несмотря на достаточно высокий титр полученного кДНК банка (10x6 бляшек/l мкг кДНК). интересующий нас ген из-за низкой представленности мог не попасть в банк.

Это позволило нам сделать следующие выводы: во-первых, создание банка для поиска низкопредставленных регуляторных генов следует проводить из обогащенного по ним материала (то есть в нашем случае - из регенерирующих тканей); во-вторых, поскольку обогащенный материал ограниченно доступен, целесообразно конструировать амплифицированный кДНК банк.

В связи с этим нами была использована одна из последних разработок фирмы Clontech - набор для создания амплифицирован-ных кДНК банков Marathon. Особенность этой системы заключается в том. что она позволяет получить из небольшого количества исходного материала набор кДНК молекул с унифицированными 3' и 5'концами. Если известен даже небольшой участок из середины гена, на основе которого можно сконструировать праймеры в обоих направлениях, то один раунд амплификации позволяет получить полноразмерную копию интересующего гена. Еще одним преимуществом этого метода является то обстоятельстово, что созданный один раз, этот банк позволяет искать полноразмерные копии любых генов, которые могут экспрессироваться в анализируемой ткани. Этот метод имеет и свои недостатки. • В частности, как в случае всех методов на основе ПЦР. скрининг такой библиотеки, в отличие от скрининга библиотеки, полученной классическим образом, дает большое количество артефактов. Однако, использование дополнительных контролей и параллельных экспериментов позволяет достичь желаемого результата.

Из регенерирующих конечностей тритона была выделена мРНК, которую использовали для создания амплифицированного Marathon-кДНК банка. Использование специфических к генам семейства Six и универсальных для системы Marathon праймеров были проведены З'и 5'RACE (Rapid Amplification or cDNA Ends) эксперименты. которые позволили получить ряд фрагментов. Анализ полученных фрагментов с помощью ПЦР со специфическими праймерами позволил выделить из них 4 фрагмента, содержащих участок, идентифицированный нами как фрагмент гена семейства Six. экспресси-рующийся в ходе регенерации конечности тритона. Аналогичным об-

разом мы планируем получить полноразмерные копии Six генов лягушки и аксолотля, которые необходимы для синтеза высокоспецифичных зондов при проведении экспериментов по in situ гибридизации для локализации экспрессии анализируемых генов в регенерирующих конечностях амфибий.

Помимо решения поставленной задачи - получения более полной информации о структуре генов семейства Six амфибий - полученные библиотеки послужат базовыми системами для структурной характеристики любых других низкопредставленных (регуляторных) генов, экспрессирующихся в регенерирующих конечностях амфибий.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые идентифицированы гены семейства Six, гомологи гена дрозофилы sine oculis. . у представителей хвостатых и бесхвостых амфибий.

2. Изучена экспрессия генов семейства Six в ходе регенерации конечности травяной лягушки, испанского тритона и аксолотля. Выявлена корреляция экспрессии этих генов с наличием реге-нерационной способности у изученных животных.

3. Определена первичная структура наиболее консервативных участков идентифицированных генов. Выявлены межвидовые различия в первичной структуре генов семейства Six, экспрессирующихся в регенератах конечностей тритона, лягушки и аксолотля, с одной стороны, и общие структурные особенности генов изученных амфибий в сравнении с соответствующими генами млекопитающих, с другой стороны.

4. Впервые выделен и охарактеризован фрагмент гена Slxl лягушки Rana temporaria.

5. Создана базовая система для дальнейшей структурной характеристики идентифицированных генов, а также для изучения других регуляторных генов, экспрессирующихся в регенерирующих тканях конечностей амфибий: в процессе работы сконструированы кДНК банк зародышей тритона на 20-30 стадиях развития, клонированный в фагмидном векторе UNI-ZAP XR, и амплифицированный Marathon кДНК банк регенерирующих конечностей испанского тритона.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Знойно И.О.. Знойно С. Л.. Зиновьева Р.Д.. Миташов В.И. Дифференциальная экспрессия генов семейства Six в ходе регенерации и развития конечности амфибий. // Изв. РАН. Сер. биол. 1997. N 6.

2. Миташов В.И.. Лукьянов С.А.. Казанская О.В.. Маркитан-товаЮ. В.. Долгилевич С. М., Снеговая (Знойко) И.О.. Знойко С. Л.. Микаелян А. С. Молекулярно-биологические подходы в исследованиях экспрессии генов в процессе регенерации. // Изв. РАН. Сер. биол. 1995. N 3. С. 280.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ТЕЗИСОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Znoiko I.Yu. Znoiko S.L., Zlnovieva R.D.. and V.I. Mltashov. six family genes participate in the regeneration processes, occurring In amphibian limb. International European A.I.I.R. Conference at Cologne. Germany. 29 Sep.-3 Oct. 1997, Abstracts, p. 50.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Знойко, Ия Юрьевна, Москва

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

на правахч рукописи

\

УДК 591.596/599

ЗНОЙКО Кя Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ ГОМЕОБОКСНЫХ ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА SIX В ПРОЦЕССЕ РЕГЕНЕРАЦИИ КОНЕЧНОСТИ АМФИБИЙ

03.00.30 биология развития 03.00.03 молекулярная биология

Научные руководители: к.б.н. Зиновьева Р.Д. д.б.н. Миташов В.И.

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1997

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ .................................................. 4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурно-функциональная характеристика гомеобоксных генов, участвующих в ходе развития и регенерации.................................... 9

1.1. Гомеобоксные гены и их классификация............................10

1.2. Гомеодомен - ДНК узнающий модуль. ..................................14

1.2.1. Геометрия комплекса комеодомен-ДНК............................14

1.2.2. Специфичность связывания гомеодомена с ДНК......15

1.3. Функционирование гомеобоксных генов..............................20

1.4. Роль гомеобоксных генов в развитии организма......21

1.5. Участие гомеобоксных генов в процессе регенера-

♦

ции конечности..........................................27

1.5.1. Регенерация конечности у амфибий................................27

1.5.2. Гомеобоксные гены и регенерация конечности у амфибий..................................................................32

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................39

II.1. Подготовка экспериментального материала..................39

II. 2. Операции на животных........................................................39

11.3. Выделение РНК и синтез 1-ой цепи кДНК......................40

11.4. Выделение геномной ДНК лягушки и тритона........40

11.5. Анализ экспрессии генов семейства Six с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).........41

11.6. Выделение и клонирование амплифицированных фрагментов...........................................42

11.7. Определение первичной структуры кДНК и компьютерный анализ....................................................................43

11.8. Конструирование кДНК библиотеки личинок тритона и ее скрининг............................. . 43

11.9. Создание амплифицированной кДНК библиотеки тканей регенерирующей конечности тритона и ее скрининг......................................... 44

III. РЕЗУЛЬТАТЫ........................................... 45

III.1. Идентификация и исследование экспрессии го-меобоксных генов семейства Six в интактных и регенерирующих структурах амфибий с помощью полимеразной цепной реакции................ 45

II1.1.1. Конструирование вырожденных праймеров для

♦

гомеобоксных генов семейства Six............ 45

111.1. 2. Оптимизация полимеразной цепной реакции

для исследования экспрессии генов семейства Six..................................... 48

111.1.3. Изучение экспрессии гомеобоксных генов семейства Six в регенерирующих, развивающихся и дифференцированных тканях испанского тритона и травяной лягушки............. 50

111.1.4. Изучение экспрессии гомеобоксных генов семейства Six в регенерирующих тканях конечности и хвоста испанского тритона и аксолотля................................... 56

111.2. Структурный анализ генов семейства Six, экспрессирующихся в регенерирующих конечностях амфибий................................ 59

II1.2.1. Клонирование ПЦР-продуктов, содержащих

наиболее консервативных участок генов семейства Six, экспрессирующихся в регенератах конечностей амфибий................... 59

II1.2.2. Определение первичной структуры клонированных фрагментов.......................... 61

II1.3. Создание базовых систем для структурных исследований генов, принимающих участие в регулировании процесса регенерации. ........... 62

111.3.1. Конструирование кДНК банка личинок испанского тритона на 20-30 стадиях развития . ........................................ 62

111.3.2. Создание амплифицированной кДНК библиоте-

»

ки регенерирующей конечности тритона........ 67

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................ 7 6

IV.1. Идентификация и экспрессия гомеобоксных генов семейства Six в интактных и регенерирующих

структурах амфибий.............................. 76

IV.2. Анализ первичной структуры генов семейства Six, экспрессирующихся в регенерирующих конечностях амфибий............................... 80

IV.3. Создание базовых систем для структурных исследований генов, принимающих участие в регулировании процесса регенерации.................. 88

V. ВЫВОДЫ................................................. 9 3

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................... 94

I. ВВЕДЕНИЕ

Все живые организмы в разной степени обладают способностью восстанавливать утраченные или поврежденные части тела и тканей (Stocum, 1995). За более чем двухсотлетнюю историю изучения феномена регенерации исследовано большое количество видов животных, сделан ряд обобщений (Morgan, 1901; Воронцова, Лиознер, 1957; Полежаев, 1968; Schmidt, 1968; Goss, 1969; Hinchliffe and Johnson, 1980; Wallace, 1981). В настоящее время центральной проблемой регенерации является проблема изучения механизмов восстановительных процессов и их генетического контроля.

Развитие этого направления исследований открывает возможности не только для понимания молекулярных механизмов такого сложного процесса как регенерация тканей, но и для практического применения полученных данных для решения медико-биологических задач.

Объем и характер регенерации органа определяется способностью сохранившихся клеток к повторному воспроизведению соответствующих этапов развития. Для полноценного протекания процесса регенерации конечности у позвоночных животных необходимо скоординированное изменение биосинтетической активности клеток, расположенных в определенных частях органа. Согласно современным представлениям, такие изменения могут происходить в результате изменения набора регуляторных генов, входящих в состав транскрипционных комплексов клетки. Предполагается, что различные сочетания регуляторных белков в транскрипционном комплексе формируют индивидуальный синтетический профиль клетки.

Прогресс в молекулярной биологии в целом и создание новых

современных методов исследования в настоящее время позволяют искать подходы для решения проблемы восстановления утраченной способности к регенерации путем выявления и изучения генов, специфически экспрессирующихся в ходе регенерации (Savard et al., 1988; Simon and Tabin, 1993; Gardiner and Bryant, 1996). Поскольку прогрессивная фаза регенерации имеет много общего с процессом развития, логично предположить, что в этих двух процессах могут участвовать сходные регуляторные гены.

Большинство регуляторных генов, известных к данному моменту, являются гомеобоксными (т.е. содержат гомеобокс - высококонсервативный участок гена, кодирующий гомеодомен, ответственный за связывание регуляторного белка с ДНК). Молекулярные механизмы, управляющие важнейшими биологическими функциями, - высококонсервативны. Наиболее ярко это демонстрируют гомеобоксные гены, участвующие в регуляции важнейших процессов в ходе развития организма. Практически все гомеобоксные гены являются транскрипционными факторами, и на данный момент есть все основания предполагать, что именно они играют ключевую роль в определении "судьбы" клеток (McGinnis and Krumlauf, 1992; Kenyon, 1994; Scott, 1994). Большая часть гомеобоксных генов была первоначально охарактеризована у плодовой мушки Drosophila, а затем структурные гомологи были найдены у других видов животных (Gehring, 1985, 1987).

Так, в 1994 г. был охарактеризован ген дрозофилы sine оси-lis (so) (Cheyette et al. 1994, Serikaku and O'Tousa, 1994), экспрессия которого оказалась необходимой для формирования зрительной системы мухи. Позже, в 1995 и 1996 гг. у мыши было описано целое семейство генов-гомологов so, состоящее, по крайней

- б -

мере, из 5 членов, которые были названы Six генами. Six-гены помимо гомеобокса содержат высококонсервативную область, фланкирующую его с 5'конца, названную Six-боксом, что позволило отнести все вышеописанные гены к одному семейству. Гены этого семейства характеризуются очень широким спектром экспрессии. Sixl и Six2 обнаружены в ходе развития мыши в мезенхиме головы и тела, в мышцах конечностей и сухожилиях (Oliver et al., 1995а). Экспрессию Six3 наблюдали в передней части нейральной пластинки и позже в развивающемся глазу мыши (Oliver, 1995b). Six4 экс-прессируется в развивающихся скелетных мышцах, клетках ганглиев, сетчатке (Kawakami et al., 1996). lSix50 - также в сетчатке (Kawakami et al., 1996).

Исходя из характера экспрессии генов семейства Six в тканях развивающейся конечности мыши (Oliver, 1995а), можно предположить, что соответствующие белки обеспечивают тканеспецифи-ческую регуляцию генов в период дифференцировки мышечной ткани. Процесс активного миогенеза происходит на определенном этапе развития и регенерации; значительно в меньшем объеме он продолжается у растущего животного на продвинутых стадиях развития и в зрелом регенерате.

Согласно современным представлениям, большинство процессов, происходящих в ходе развития организма, связывают с активностью, так называемого, каскада регуляторных генов, который запускается по типу цепной реакции и вызывает цепь событий, приводящих к развитию того или иного органа. Характер экспрессии генов Sixl и Six2 в развивающейся конечности мыши в период активного морфогенеза, позволил нам рассматривать их как кандидатов на роль генов из регуляторного каскада.

Наше предположение о вовлеченности Six генов в регулятор-ный каскад согласуется и с данными об эктопической экспрессии другого представителя того же семейства - гена Six3, очень сходного с Sixl и Six2 по структуре, однако сильно сличающегося от них по характеру экспрессии. Как было указано выше, экспрессия этого гена обнаружена в развивающемся глазу мыши, также как и в случае "родоначальника" семейства - гена sine oculis дрозофилы) . Было показано, что эктопическая экспрессия гена Six3, введенного в составе специальной генно-инженерной конструкции в эмбрионы рыбки медака (Oryzias latipes), способна вызвать у них образование дополнительного хрусталика (Oliver et al., 1996).

В связи со всем вышесказанным, вызывает интерес недавно опубликованная гипотеза д-ра Бонини (Zimmerman et al., 1997). На основании анализа экспрессии, представленности у различных животных и критичности функционирования для существования организма (летальность мутаций по соответствующим генам), Бонини выделяет 3 основных группы генов, а именно: Рахб/eyeless, Six/sine oculis и еуа. Эти гены являются "тремя китами", которые формируют суперконсервативный каркас всех регуляторных генетических каскадов, существующих в организме и лежащих в основе развития отдельных органов и организма в целом (Zimmerman et al., 1997).

Наше исследование было предпринято для установления возможного участия генов семейства Six в ходе регенерации конечности амфибий. В качестве модели были выбраны представители хвостатых (испанский тритон, Pleurodeles waltl, и аксолотль, Ambystoma mexicanum) и бесхвостых (травяная лягушка, Rana temporaria) амфибий. Выбранные объекты исследования обладают раз-

личной способностью к регенерации конечности. Испанский тритон и аксолотль регенерируют удаленную конечность с любого уровня в течение всей жизни, тогда как травяная лягушка обладает этой способностью только до определенной стадии эмбрионального развития (Полежаев, 1968), после прохождения которой объем регенерации прогрессивно уменьшается до полного исчезновения. Использование в качестве объекта исследований животных с различной способностью к регенерации конечности дает возможность оценить роль, которую играют анализируемые гомеобоксные гены в реализации регенерационной потенции.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГОМЕОБОКСНЫХ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ

Молекулярные механизмы, управляющие важнейшими биологическими функциями высококонсервативны, так как находятся под эволюционным давлением. Это утверждение хорошо иллюстрируют гомео-боксные гены, кодирующие регуляторные белки, которые контролируют основные процессы, происходящие в ходе развития организма.

Впервые гомеобокс был описан около десяти лет назад у плодовой мушки ИгоБорЬИа те1аподавЬег как высококонсервативный участок гена с характерной структурой. Позже гомологиченые последовательности были найдены во множестве генов эукариот, начиная от дрожжей и заканчивая человеком. Биохимические, биофизические и генетические исследования неопровержимо доказали, что гомеобокс кодирует ДНК-связывающий домен, который позволяет белкам, содержащим его, непосредственно осуществлять регуляторные функции. Решающая роль, которую играют гомеобоксные гены в ходе онтогенеза практически у всех организмов, обусловила огромный интерес исследователей к этому суперсемейству генов. В настоящее время у животных различных систематических групп идентифицировано более 300 гомеобоксных генов, и их число постоянно растет.

В данном обзоре мы хотели суммировать литературные данные о структуре и функциях гомеобоксных генов, а также обсудить их роль в процессах развития и регенерации.

I.1. Гомеобоксные гены и их классификация.

Давно известно о существовании, так называемых, гомеозис-ных мутаций у многих видов животных и растений, приводящих к превращению одной части организма в другую. Наиболее полно го-меозисные мутации изучены у плодовой мушки Drosophila melano-gaster. Так, например мутацию Antennapedia - превращение ампутированной антенны в ногу - наблюдал еще в 1901 году Хербст (Tsonis, 1996) . На протяжении многих лет гомеозисные мутации дрозофилы интенсивно исследуются методами классической генетики, а в последнее время и молекулярно-генетическими методами. К настоящему моменту практически все гомеозисные мутации дрозофилы связаны с активносстью определенных гомеозисных генов.

Несмотря на то, что разные гомеозисные гены определяют различные процессы в организме, они имеют определенное структурное сходство. В 1984 году был описан участок высокой гомологии двух гомеозисных генов плодовой мушки D. melanogaster Antennapedia и гена сегментации, bithorax. Указанный фрагмент, размером 180 п.н. был назван гомеобоксом (McGinnis et al. , 1984; Scott and Weiner, 1984). Такая высокая гомология небольших участков совершенно разных по выполняемым ими функциям генов показалась исследователям неслучайной. Действительно, широкомасштабный поиск последовательностей, гомологичных указанному участку, выявил у дрозофилы множество гомеобокс-содержащих генов. Затем структурные гомологи этих генов были найдены и у других животных. При этом часто одному гену данного класса у дрозофилы соответствует несколько гомеобоксных генов, представленных у других организмов. Обнаружение гомологов практически

всех гомеобоксных генов дрозофилы у позвоночных позволило совершенно по-новому взглянуть на молекулярно-генетические аспекты эволюции.

Более пристальное изучение структуры гомеобоксных генов обнаружило наличие во многих из них дополнительных высококонсервативных структур. Эти структурные особенности гомеобокс-со-держащих генов позволяют подразделить их на несколько классов (Scott et al., 1989; Burglin, 1993).

На Рис. 1 представлены некоторые, наиболее многочисленные, классы гомеобокс-содержащих генов. Следует отметить, что длина и структура соединительных звеньев (на рисунке они изображены тонкими линиями) может меняться в пределах класса. Для класса гомеодоменных белков Antennapedia (Antp) характерно присутствие консенсусной последовательности IYPWMK перед гомеодоменом. Этот мотив, вероятно, вовлечен в белок-белковые взаимодействия (Qian et al., 1992). Цистеин/гистидин-богатый домен LIM одноименного класса участвует в образовании металл-связывающего домена, который также осуществляет белок-белковые взаимодействия (German 1992). Для ряда классов помимо гомеодомена характерно присутствие дополнительных ДНК-связывающих доменов. Так, парный домен класса paired (Ворр et al., 1986), как было показано, демонстрирует сиквенс-специфичную ДНК-связывающую активность (Treis-man et al . , 1991). РО[/-специфичный домен (Herr et al . , 1988) связывает ДНК с низкой афинностью и способствует узнаванию специфических ДНК-мишеней (Verrijzer et al., 1992). Для класса ZF (zink finger) характерно наличие множества ДНК-связывающих последовательностей: помимо нескольких гомеодоменов (их может содержаться от 1 до 4-х) в структуре этих белков присутствует на-

Anl»nn«p»die

Hexapeptide

-Q-

tngrailêd

EH1

EH2 EH3

EH5

paired

paired domain

_■ \ ■'-■ -.-s'S. s 4--,s'_ ^.....

POU

POU-specific domain

cut

cut repeat

—шшшшшш-

LIM

LIM motif

ZF

(C2-H2 Zinc - fingers)g . ^

(homeodomain)

JWW^L

1 - 4

NK-2

CP

PBC

PBC domain

Рис. 1. Схематическое изображение гомеобоксных генов различных классов, содержащих дополнительные консервативные домены вне гомеобокса. Слева указаны названия индивидуальных классов. Последовательности, соответствующие гомеобоксу представлены в виде черных прямоугольников. Остальные прямоугольники представляют другие консервативные домены, специфичные для различных классов. Соотношения размеров прямоугольников отражают реальные соотношения между консервативными доменами (Dorn et al., 1994).

бор (от 9 до 17) ДНК-связывающих мотивов "цинкового пальца", при этом различные домены могут перемежаться (Fortini et al., 1992 ) .

Классификация, представленная на Рис. 1, основывается на наличии или отсутствии консервативных структур вне гомеобокса. Примечательно, что если классифицировать гены только в соответствии со структурой гомеобо�