Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомеобоксные гены X-nkx-5.1, Dlx5 и Dlx2 в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis и их роль в регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гомеобоксные гены X-nkx-5.1, Dlx5 и Dlx2 в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis и их роль в регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-1"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ АКАДЕМИКОВ М М ШЕМЯКИНА И Ю А ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Байрамов Андрей Вячеславович

Гомеобоксные гены X-nkx-5.1, Dlx5 и Dlx2 в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis и их роль в регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-1.

Специальность - 03.00.03 - молекулярная биологуг

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004

Работа выполнена в группе молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии

им Академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Зарайский А.Г.

Официальные оппоненты:

чл.-корр РАН, доктор биологических наук Лукьянов С.А.

кандидат биологических наук Новоселов В.В.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В А.Энгельгардта РАН

Зашита состоится " t^f**1-* 2005 года в ^ часов на заседании

специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им Академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16-10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им Академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан 11 2004

г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук*

В.А.Несмеянов

g OOfe-4 2760

Актуальность проблемы.

Главная фундаментальная задача функциональной геномики - изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме. Большая часть этой информации используется в эмбриогенезе в процессе дифференцировки основных типов тканей и систем органов развивающегося организма. В связи с этим, изучение молекулярно-генетических механизмов эмбриогенеза является одним из наиболее важных направлений современной геномики.

Одним из важнейших событий эмбриогенеза позвоночных животных является закладка и формирование центральной нервной системы, и, в частности, головного мозга.

Головной мозг позвоночных, в том числе и человека, принципиально отличается от головного мозга всех других организмов наличием переднего мозга, состоящего из двух отделов - промежуточного и конечного мозга.

Несмотря на очевидную важность выяснения механизмов развития передне1 о мозга, молекулярно-генетический аппарат, обеспечивающий ранние этапы дифференцировки этой структуры, изучен в гораздо меньшей степени, чем многие другие процессы эмбриогенеза.

Предшественником мозга в эмбриогенезе является образуемый при гаструляции пласт нейроэпителиальных клеток, называемый нервной пластинкой. В процесс спецификации и последующей дифференцировки нервной гкани включены различные транскрипционные факторы, и, в том числе гомеодоменные белки, кодируемые гомеобоксными генами.

Гомеобоксные гены класса Anf являются одним из ключевых звеньев молекулярного механизма, обеспечивающего развитие переднего моз1а у позвоночных. Возникновение этих генов в ходе эволюции могло быть одним из событий, приведших к появлению у позвоночных данного отдела центральной нервной системы. Было показано, что нарушение пространственного паттерна и временные изменения экспрессии генов класса Anf приводят к серьезным аномалиям развития переднего мозга у позвоночных.

Один из представителей генов класса Anf - ген Xanf-1 (Xenopus Anterior Neural Fold) шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

ГОС. НАЦИОНАЛЬНА! i БИБЛИОТЕКА J

«ysgff j

Было установлено, что механизм локализации экспрессии гена Хап/-1 в области зачатка переднего мозга основан на тотальной активации его экспрессии в нейроэктодерме, в сочетании с ингибированием экспрессии в туловищной и заднеголовной областях. При этом экспрессия гена Хап/-1 в нервной пластинке наблюдается в коротком временном промежутке и ингибируется на стадии нейрулы.

Нарушения своевременного ингибирования экспрессии гена Хап/-1, также как и пространственные изменения его паттерна экспрессии приводят к нарушениям экспрессии нейральных маркеров и аномалиям развития переднего мозга и других нейральных структур шпорцевой лягушки

В связи с этим, исследование регуляции экспрессии гена Хап^1 является перспективным подходом к пониманию механизмов развития мозга позвоночных

Цель работы. Целью данной работы была идентификация и изучение функции транскрипционных факторов, вовлеченных в процесс регуляции экспрессии гена Хап/-1.

Научная новизна. В ходе работы установлена способность гомеодомечных транскрипционных факторов Х-пкх-5.1, 01x5 и Э1х2 связываться с регуляторным элементом промотора гена Хап/-1, расположенным между позициями «—203» и «167» от сайта начала транскрипции. Установлены роли данных транскрипционных факторов в регуляции экспрессии гена Хап/-1.

Гомеодоменный транскрипционный фактор Х-пкх-5.1 идентифицирован и описан впервые.

В работе изучен паттерн экспрессии гена Х-пкх-5 1 на ранних стадиях развития шпорцевой лягушки и исследована его вовлеченность в механизмы развития структур головного мозга и эпителиальных ресничных клеток

Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы.

Структура работы.

Экспериментальная часть работы состояла из нескольких этапов.

- На первом этапе был проведен поиск транскрипционных факторов способных связываться с регуляторным элементом промотора гена Хап/-1 и анализ

экспрессии обнаруженных факторов в развитии шпорцевой лягушки.

н * > * 1 *

' I „»Г?«*^" •

- Па втором этапе была клонирована полноразмерная кДНК и описана экспрессия одного из обнаруженных потенциальных регуляторов экспрессии гена Хап/-1 - гомеодоменного транскрипционного фактора Х-пкх-5.1, не известного ранее у шпорцевой лягушки.

- На третьем этапе был проведен анализ влияния транскрипционного фактора - Х-пкх-5.1 на экспрессию гена Хап/-1 Помимо этого была исследована вовлеченность Х-пкх-5.1 в регуляцию экспрессии ряда других молекулярных маркеров развивающейся нервной системы, а также роль данного гена в дифференцировке эпидермальных ресничных клеток шпорцевой лягушки.

- На четвертом этапе был проведен анализ влияния гомеодоменных транскрипционных факторов 01x5 и 01x2 на экспрессию гена Хап/-1.

Содержание работы.

Поиск и анализ экспрессии транскрипционных факторов, способных связываться с регуляторным элементом промотора гена Хшф].

Для поиска транскрипционных факторов, способных связываться с регуляторным элементом промотора гена Хап/-1, был проведен скрининг кДНК библиотеки шпорцевой лягушки стадии поздней гаструлы (12 стадии) при помощи одногибридной дрожжевой системы. После отбора клонов, содержащих фрашенш кДНК факторов, проявивших способность связываться с исследуемым регуляторным элементом промотора гена Хап/-1, был проведен анализ паттернов экспрессии генов, кодирующих эти транскрипционные факторы на стадии нейрулы.

В результате было выяснено, что подавляющее большинство из обнаруженных факторов экспрсссируются в областях зародыша либо не граничащих непосредственно с областью экспрессии гена Хап£1 (01x2, Н0ХВ9, ХгеШ-1), либо прилегающих к ней спереди ф1х5), сбоку (ЛЛх-/) или сзади (РтгаИать, Уеп/-2). Поэтому, данные транскрипционные факторы не могут непосредственно регулировать экспрессию 1ена Хап/-1 внутри области его нормальной экспрессии в головной нейроэктодерме. В то же время, эти факторы могут играть роль регуляторов Хап/-1 в других областях зародыша. В частности, в группе молекулярных основ эмбриогенеза было показано, что транскрипционные

факторы Pintallavis и Xvent-2 необходимы для установления задней границы области экспрессии гена Xanf-l.

Только один из обнаруженных транскрипционных факторов (гомеодоменный белок класса Nkx) мог бы быть напрямую вовлечен в обеспечение механизма ингибирования экспрессии гена Xanf-l в головной нейроэктодерме на стадии нейрулы, т.к. область его экспрессии перекрывается с областью экспрессии гена Xanf-l.

Ген Х-пкх-5.1 и его роль в раннем развитии шпорцевой лягушки.

Клонирование и исследование характера экспрессии гена Х-пкх-5 1

В связи с тем, что идентифицированный ген пкх не был известен ранее, было проведено клонирование полноразмерной кодирующей части его кДНК.

Полная кодирующая рамка (KP) данного гена была получена при помощи методики быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE от rapide amplification of cDNA ends).

Исходя из полученной нуклеотидной последовательности кДНК, была определена аминокислотная последовательность соответствующего белка и проведен поиск его гомологов с помощью пакета программ BLAST. Данный анализ выявил, что обнаруженный транскрипционный фактор имеет высокую степень гомологии с транскрипционными факторами семейства NkxS, ранее клонированными у представителей других классов позвоночных животных (Рис. I). В частности, аминокислотная последовательность гомеодомена обнаруженного транскрипционного фактора шпорцевой лягушки идентична последовательностям гомеодоменов гомологов Nkx-5.1 Damo rerio, медаки (Oryzias latypes), курицы (Gallus gallus) и мыши (Mus musculus).

На основании этого идентифицированному транскрипционному фактору было присвоено название Х-пкх-5 1 (Xenopus laevis-nkx-5 1).

Исследование динамики экспрессии гена Х-пкх-5.1 методом обратной транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР) показало, что экспрессия гена Х-пкх-5 1 начинается на стадии ранней гаструлы, затем плавно усиливается до стадии поздней нейрулы. после чего поддерживается на относительно постоянном уровне (Рис 2 А) В

качестве маркера общего количества мРНК в пробах использовался уровень экспрессии фактора ЕР- 1а.

X 1»» О lat О lat О г*г в gal и mus

X lav О lat О lat D r«r a gal M mu s

-----s;

KppsapppppIp]

gpaPDASGTASAPPPQPPPQPPAP|

GfLDS-------- ------AA|

AfLEG----------------Gg

GVFBSG-----------------

AGLDG---------------

Kjpjes...............-G¡

A£AAAAAVAAAAAKGALEGAAG<3

4a

60

92 120

lav lat lat rer да 1 nui

JtfiHPLKTBLGAiSSE-----ЗЗЦр 142

Ig8KTEPTAXEDai>gDEHNS!l3s 142

ftPKS---§QÍS®ES----- -AD 127

L¡3^XSDP3AKDDaDB-----"SQ® '34

QG-G^AEQK9R||-----рЩр 14 5

|SSA3gAS3«A! 3AA¿A'

SG¡fPEA¡gGGPGT!

HTKCHVl

.SAAGGGG

-A3GAAAXagahípvs¡

Рис. 1 Сравнение аминокислотной последовательности гомеодоменно! о транскрипционного фактора X-nkx-5.1 шпорцевой лягушки с последовательностями его гомологов у Danto rerto (D.rer), курицы (G.gal.), мыши (M.mus.) и двумя гомологами (Nkx-5 1 1 и Nkx-5 1 2) у медаки (О lat 1, О lat 2) Гомеодомепы обведены черной рамкой Домен, идентифицированный в качестве ингибиторного у мышиного гомолога Nkx-5 1 обозначен пунктирной линией.

Пространственная динамика паттерна экспрессии гена Х-пкх-5.1 была исследована методом гибридизации in situ на целых зародышах шпорцевой лягушки.

Результаты эксперимента представлены на Рис. 2 (Б-М, С-Ч)

Ген Х-пкх-5.1 начинает экспрессироваться на стадии ранней гаструлы в одиночных клетках анимального полушария (Рис. 2 Б) В течение гаструляции интенсивность экспрессии в данных клетках возрастает в брюшной области зародыша (Рис 2 В; и практически отсутствует в его спинной области (Рис. 2 Г) Уровень экспрессии в одиночных эпидермальных клетках достигает своего максимума на стадии ранней нейрулы (ст. 15) (Рис 2 Д, Е, крупным планом). При этом, как показано на поперечном срезе зародыша данной стадии (Рис 2 Ж), клетки, экспрессирующие ген Х-пкх-5 1, лежат во внутреннем слое эпидермиса. В дальнейшем уровень экспрессии гена X-nkx-51 в данных клетках постепенно снижается и полностью исчезает к стадии хвостовой почки.

В тловной области зародыша экспрессия гена Х-пкх-51 отсуплвует на стадии поздней гаструлы (Рис.2 И), но начинает наблюдаться на стадии нейрулы в области соответствующей, переднему нервному валику (Рис. 2 К). Передняя граница будущей (ст. 12 Уг) и формирующейся (ст. 15) нервной пластинки на Рис 2 И и К показана пунктирной линией.

В течение нейруляции экспрессия гена Х-пкх-5.1 в головной области распространяется назад (Рис. 2 3, JI) и, после закрышя нервной трубки, обнаруживается в спинной области зачатка головного мозга, включая глазные пушри (Рис 2 М, С, Т). На стадии ранней хвостовой почки экспрессия Х-пкх 5 1 набтюдается также в ушном ганглии (Рис 2 Т, стрелка) и, на более слабом уровне в районе дифференцирующейся присоски (Рис. 2 Т указатель).

На стадии хвостовой почки (ст. 25-26) экспрессия теш Х-пкх-5.1 усиливается в следующих участках нервной трубки:

- во-первых, два домена экспрессии гена Х-пкх-5 1 обнаруживаются в зачатке головного мозга: один в нижней части будущего переднего мозга (Рис. 2 Ф, черный указатель), а другой - в нижней части среднего мозга (Рис 2 Ф. X, черная стрелка).

- во-вторых, продольные тяжи клеток экспрессирующих ген Х-пкх-51 обнаруживаются по бокам спинного мозга (Рис. 2 У, стрелка).

На более поздних стадиях, в уже сформированном головном мозге, экспрессия гена Х-пкх-5.1 наблюдается в двух доменах нижней части переднего мозга. Один из доменов соответствует lamina terminalis (Рис. 2 Ц, Ч, черный указатель), а другой -вентральному таламусу (Рис. 2 Ц, Ч, красный указатель). Помимо этого, относительно слабый уровень экспрессии гена Х-пкх-5.1 наблюдается в переднем отделе нижней части заднего мозга (Рис. 2 Ц, Ч, красная стрелка), а также в отдельных клетках хвостовой области заднего мозга и в спинном мозге (Рис. 2 Ц, Ч, черные стрелки).

За пределами нервной системы экспрессия гена Х-пкх-51 наблюдается, начиная со стадии хвостовой почки, в передней части слуховых пузырьков (Рис. 2 Ф, X, зеленая стрелка), в ушном ганглии (Рис. 2 Ф, X, желтая стрелка) и в областях, соответствующих средней (Рис. 2 Ф, X, красная стрелка) и антерио-венгральной (Рис. 2 Ф красный указатель) плакодам боковой линии тела.

Хотя исследованный паттерн экспрессии гена Х-пкх-5.1 имеет много общих черт с ранее изученными паттернами экспрессии генов Nkx-5.1 у других видов позвоночных, его важным отличием является то, что экспрессия данного гена в развитии шпорцевой лягушки начинается существенно раньше. Так, экспрессия X-пкх-5.1 впервые обнаруживается в одиночных эпидермальных клетках, начиная со стадии ранней гаструлы. Кроме эюго, на стадии нейрулы экспрессия Х-пкх-5 1 наблюдается в передней части нервной пластинки, в районе переднего нервного валика.

Транскрипционный фактор X-nkx-5 1 жспрессируется в зачатке гочовного мозга и проявляет способность связываться с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1.

При сравнении областей экспрессии генов X-nkx-5 1 и Xanf-1 в нервной пластинке на стадии ранней нейрулы было установлено, что эти области перекрываются так, что область экспрессии гена Xanf-1 целиком лежит внутри области экспрессии X-nkx-5.1 (Рис. 2 К, О) При этом начало экспрессии X-nkx-5.1 в данной области по времени соответствует началу снижения в ней уровня экспрессии гена Xanf-1 (Рис 2 И, К, Н, О). Это наблюдение позволило

предположить, что транскрипционный факюр X-nkx-5.1 может выполнять функцию ингибитора гена Xanf-1.

При скрининге кДНК библиотеки шпорцевой лягушки дрожжевой клон, содержащий кДНК Х-пкх-5 1 был обнаружен в единственной повторности, что оставляло возможность случайного нахождения этого клона. Для подтверждения способности белка X-nkx-5.1 связываться in vitro с потенциальным сайюм связывания в регуляторном элементе промотора гена Xanf-1 был использован метод торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA).

Ранее было показано, что данный участок промотора содержит два элемента - дистальный, включающий 14-п.о. и проксимальный, включающий 22 п о. -которые выполняют разные функции в регуляции экспрессии гена Xanf-1. В настоящей работе, с целью выявления способности этих элементов к образованию ДНК-белковых комплексов с транскрипционным фактором X-nkx-5.1, исследование торможения в полиакриламидном геле было проведено отдельно для каждого из них (Рис. 3, колонки 1-3 и 4-6 соответственно).

Полученные данные показали, что белковый экстракт ооцитов Xenopus, предварительно микроинъецированных мРНК Х-пкх-5 /, вызывает отчетливое снижение электрофоретической подвижности в геле проксимального элемента промотора гена Xanf-1 (22-п.о) (Рис. 3 колонка 6). Гораздо менее отчетливый эффект торможения наблюдается в случае дистального (14 п о.) элемента (Рис 3 колонка 3).

Специфичность связывания в данном случае подтверждается'

1) отсутствием изменения электрофоретической подвижное! и при использовании ооцитов, микроинъецированных мРНК зеленого флуоресцентного белка EGFP (Enhanced green fluorescent protein) (Рис 3, колонка 4),

2) значительным ослаблением сигнала при использовании смсси экстрактов ооцитов микроинъецированных мРНК Х-пкх-5.1 и EGFP в пропорции 110 (Рис. 3, колонка 5).

Наблюдаемое слабое связывание белка X-nkx-5.1 с дистальным (14 п.о) элементом фрагмента промотора гена Xanf-1 (Рис. 3, колонка 3) может объясняться

наличием в этом элементе нуклеотидной последовательности ТААТ, характерной для участков связывания многих гомеодоменных белков.

Сильное связывание белка X-nkx-5.1 с проксимальным элементом фрагмента промотора Xanf-1 (Рис. 3, колонка 6) может быть следствием наличия в данном элементе специфической нуклеотидной последовательности СААТТААСТС. Данная нуклеотидная последовательность во многом сходна с последователпостью оптимального сайта связывания мышиного гомолога Nkx-5.1, которая была определенна ранее в экспериментах in vitro и представляет собой последовательность CA(A/C)TTAA(G/T)TG. Анализ, проведенный для Nkx-5.1 мыши показал, что замены нуклеотидов, фланкирующих коровую последовательность ТТАА в изучаемом сайте связывания Nkx-5.1 только с одного конца выражаются в незначительном снижении способности Nkx-5.1 связываться с данным сайтом. Последовательность нуклеотидов в проксимальном (22 и.о.) элементе фрагмента промотора гена Xanf-1 отличается от приведенной выше последовательности оптимального сайта связывания мышиного Nkx-5.1 по двум положениям: «-1» (соответствует 3'-концевому нуклеотиду приведенной последовательности) и «-3». При этом оба указанных нуклеотида расположены на 3' конце сайта ТТАА Это делает возможным связывание транскрипционного фактора X-nkx-5.1 с представленным проксимальным (22 п.о.) эяемешом промотора гена Xanf-1.

В экспериментах с мышиным Nkx-5.1 было также показано, что замена нуклеотида в последовательности ТТАА рассматриваемого сайта связывания приводит к полному подавлению возможности связывания белка Nkx-5 1 с данным сайтом.

Чтобы дополнительно показать специфичность наблюдаемого в эксперименте связывания белка X-nkx-5 1 с рассматриваемым элементом промотора гена Xanf-1 в данный элемент промотора Xanf-1 была введена точечная мутация в позицию +1 сайта ТТАА. В результате наблюдалось полное отсутствие связывания X-nkx-5 1 с мутантной последовательностью CAAGTAACTC (Рис. 3, колонка 9). Это указывает на специфичность наблюдаемого связывания белка X-nkx-5 1 с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1.

Транскрипиионный фактор X-nkx-51 оказывает прямое ингибиторное влияние на экспрессию гена Xanf-l.

Для установления роли транскрипционного фактора X-nkx-5.1 в регуляции экспрессии гена Xanf-l in vivo были проведены эксперименты по микроинъекции в зародыши шпорцевой лягушки синтетической мРНК X-nkx-5 1, а также мРНК доминантно-репрессорной и доминантно-активаторной конструкций, представляющих собой гибрид гомеодомена (гд) X-nkx-51 с репрессорным доменом транскрипционного фактора Engrailed дрозофилы (EnR) и активаторным доменом белка VP16 вируса герпеса (VP16), соответственно.

Характер изменений экспрессии гена Xanf-l под влиянием экспрессии микроинъецированпого материала исследовался методом гибридизации in situ.

В результате было установлено, что микроинъекции мРНК X-nkx-5.1 приводят к ингибированию экспрессии гена Xanf-l (Рис. 4 Б, Б'). Эффект наблюдался в тех случаях, когда клетки, содержащие микроинъецированный материал (они идентифицировались по наличию в них флуоресцентной метки FLD), располагались в области нормальной экспрессии гена Xanf-l. Такой же эффект наблюдался и при микроинъекциях мРНК доминантно-репрессорной конструкции EnR-X-nkx-5 1гд (Рис. 4 В, В'). Микроинъекции мРНК доминантно-активаторной конструкции VP16-X-nkx-5 hd. напротив, приводили к расширению области экспрессии Xanf-l (Рис. 4 Г, Г') При этом во всех проанализированных случаях, расширения области экспрессии Xanf-l происходили только в переднем или боковом, но не заднем направлениях. Это указывает на то, что в клетках, постериорных по отношению к области нормальной экспрессии гена Xanf-l, имеются ингибиторы его экспрессии, конкурирующие с УР16-Х-пкх-5.1гд

С целью доказательства способности доминано-активаторной конструкции VP16-X-nkx-51гд активировать экспрессию гена Xanf-l был проведен морфологический анализ зародышей, микроинъецированных мРНК доминантно-активаторной конструкции VI'! 6-Х- пкх-5.1гд.

Анализ показал, что гибридный белок VP16-X-nkx-5.1 гд в зародышах вызывает комплекс морфологических аномалий, характерный для случаев эктопической экспрессии Xanf-l.

А £

со О N Ш СО М Ф Т* N N

О ь о н и К о и и и

1

1 1 >

1 1

• * тт ■И1ЦМЫ—»

1

Рис 2 Анализ динамики и паттерна экспрессии гена Х-пкх-5 / в онтогенезе шпорцевой лягушки с помощью ОТ-Г1ЦР (А) и гибридизации т мт (Б-М, С-Ч) Ст 10 14 - стадия развития 10 'А

Ант - передняя (антериорная) область зародыша, Вентр - брюшная (вентральная) сторона зародыша, Доре - спинная (дорсальная) сторона зародыша Лат - вид сбок> (латеральная сторона).

элемент элемент мутантный 14 по 22 п о элемент 22 по

— 1

СП СП. СП

и-> ю ш

i &

С ■г

ж X X 1Л

а. Н: >С а. а_ X а_ а_ X

О О с О О ? О О с

ш ш >< ш ш X ш ш >с

1 2 3 4 5 6 7 8 9

X л: с

-189

элемент 22 л о

-167

X 1аеУ13 САААСАААТАААСААТТААСТС'Ьсс в.даНиз САААСАААТАААСААТТААСТС с t С Я яараелг САААСАААТАМСААТТААСТСс^

САААСАААТАААСАА ТААСТС1:сс

Рис 3 Исстелования торможения ДНК-бе жовых коми ¡ексов в по шакрипамитном геле (РМЬА| при связывании Х-пкх-5 I с рег^ лягорными цементами промотора гена Кип/-1

А резульыгы СМЬА с соо[ве1сгвующими элементами промоюра (см 1екс1) Б сравнение последовательности элемента 22 п о 1 ена Кап/-' шпорцевой тягушки (V 1ае\н) с его гомотогами у курицы (С и человека (Н \apiem) указывает на

высокую эволюционную консервативность данного элемента Желтым цветом выдепен потенциальный сайт связывания Х-пкх-5 1 Нуклеотил, замененный в мугантном э 1ементе 22 п о , выделен красным цветом

Контроль

АкХИ, Ш

Б' - / Л" • 1 - В' .. л- ■ / с \ \ 1

, ' . « ч. •/ __ > - ; -1: ■ ■ ;. Ч . ' 1 - - / __/ \ 1 V ч / __^

Рис 4 Влияние микроинъекиий мРНК Х-пкх-5 I и мРНК дочинантно-репрессорнои (ЕпЯ-Х~пкх-5 1гд) и активаторной (УР/6-Х-пкх-5 1гд) конструкций, содержащих гомеодомен Х-пкх-5 1, на экспрессию гена Хап/-1 (см текст) (А) - зона экспрессии гена Хап)-1 у контрольного зародыша на стадии ранней неирулы (Б, Б') - гкиавление экспрессии гена Хап(-1 (стрелка) в области гародыша чикроинъецированной мРНК Х->,кх-5 / (В, В') - подавление экспрессии гена Хип/-1 (стрелка) в области заро-ьпьа, чикроинъецированной мРНК доминантно-репрессорной конструкции ЕпН-Х-пкх-5 !?<> (Г Г') расширение зоны экспрессии гена Хап(-1 (стрелка) в области зародыш." микроинъецированной мРНК доминантно-активаторной конструкции УР16-Х-пкг-^ 1гд

Рис ^ Морфологические аномалии, вызываемые чикроинъекпиями чРЧК ломичантно-активаторной конструкции УР16-Х-пкх-^ /■><) в зародышах итооиечой лягушки (А) - формирование допо шитечьных осей тела (В) - рас«ченение присо< ки (сравни с (Б) - контро 1ьный зарозыш) 'Д) - формирование выростов передней чона (сравни с (Г) контроль и (р) - последствия эктопической экспрессия Хап

1 з

Б'

/

ХапМ

Контроль

Декс+

Рис. 6. Прямая активация экспрессии гена Хап/-1 гибридным белком \'Р 16-Х-пкх-5 1гд-ВООЯ в условиях тотальной блокады транстяции ииклогексимидом (А) - зона экспрессии 1ена Хап(-1 у контрольного зародыша (Ь, Б') - расширение зоны экспрессии гена Хап[-1 (стрелка) в области зародыша, микроинъецированной мРНК УР16-Х-пкх-5 1гд-ВОСЯ в случае активации продукта трансляции УР16-Х-пкх-5 !гд-ВОСК дексаметаадном

А ХапМ Б ХапМ

л^ышш I

Ст. 15 Контроль Ст.15 Ин: Х-пкх-5.1 МО В ХапМ Г ХапМ

Б' ^

/ N.

/ \

/ \

/ 1

1 /

\

\ •

/ . \

/ Л х

: % - \

Е'

\

V * / ч /

Рис 7 Ингибирование транс 1яции эндогенной мРНК Х-пкх5 1 путем микроинъекций ли г ис числовых МО приводи! к пространственному расширению об тети жспрессии гена \anj-! и к продлению его экспрессии в нервной пластинке (А, В, Д) - области экспрессии гена Хап/-1 у контрольных зародышей на соответствующих стадиях развития. (Б, Б') -расширение области экспрессии гена Хап/-1 (стрелка) в случае подавления грансляции эндо1енной мРНК Х-пкх-5 1 путем микроинъекций антисмысловых МО (Г, Г', Д, Д') -экспрессия гена Хап{-1 в нервной пластинке в случаях ингибирования трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5 I путем микроинъекций антисмысловых МО

Так. у зародышей, микроинъскцированных мРНК VP16-X-nkx-5 1го наблюдается:

формирование дополнительных (вторых) осей тела в случаях микроинъекции мРНК VP16-X-nkx-5 1гд в область вентральных бластомеров на стадии 4-8 бластомеров (Рис 5 А);

- редукция или расчленение присоски в тех случаях, когда клетки, микроиньецированные мРНК VPl6-X-nkx-5 ¡гд, обнаруживаются в области присоски или образуют поля, перекрывающиеся с этой областью (Рис. 5 В),

- формирование аномальных выростов переднего мозга в тех случаях, когда потомки микроинъецированных бластомеров обнаруживаются в передней нейроэктодерме (Рис. 5 Д);

- частичная или полная редукция глаза.

Наблюдаемый спектр морфологических аномалий подтверждает описанную выше способность доминантно-активаторной конструкции VP16-X-nkx-5 ¡го активировать экспрессию Xanf-1, 4iо приводит к наблюдаемым расширениям области его экспрессии.

Для того чтобы выяснить, является ли гомеобоксный ген Xanf 1 непосредственной мишенью транскрипционного фактора X-nkx-5.1, или X-nkx-5 1 оказывает воздействие на экспрессию Xanf-1 через какие-либо дополнительные факторы-посредники, были проведены эксперименты с использованием гармонии д\ цируемой доминантно-активаторной конструкции VP16-X-nkx-5 1 гд-BDGR

Особенностью VP16-X-nkx-5 1 гд-BDGR является то, что благодаря наличию в его составе связывающего домена глюкокортикоидного рецептора (Binding Domain of Glucocorticoid Receptor, BDGR), данный гибридный белок инактивируек-я в клетках развивающегося зародыша за счет связывания BDGR-домена комплексом белков теплового шока hsp90. В то же время, активацию накопленною в клежах VP16-X-nkx-5 1 гд-BDGR можно осуществить на нужной стадии развития при помощи добавления гормона дексаметазона в среду, в которой культивируются зародыши.

В данном эксперименте зародыши бьли предварительно микроинъецировапи мРНК, кодирующей VP 16-X-nkx-5.1 гд-BDGR. Активацию белка VP16-X-nkx-5 I [Д-BDGR, транслированного с этой мРНК, осуществляли на стадии гаструлы в

условиях тотальной блокады процессов трансляции в зародышах, достигавшейся путем обработки их циклогексимидом. В таких условиях возможна активация доминантно-активаторной конструкцией VPl6-X-nkx-5.lad-BDGR лишь непосредственных генов-мишеней X-nkx-5.1.

В результате, у зародышей микроиньецированных мРНК УР16-Х-пкх-5.1гд-BDGR и обработанных дексаметазоном, наблюдались расширения зоны экспрессии гена Xanf-1 (Рис. 6). Это указывает на то, что в процессе развития зародышей шпорцевой лягушки транскрипционный фактор X-nkx-5.1 может непосредственно связываться с промотором гена Xanf-1, оказывая влияние на его экспрессию.

Ингибирование трансляции эндогенной мРНК X-nkx-51 приводит к расширению области экспрессии гена Xanf-1 и к продлению его экспрессии в области зачатка переднего мозга

Для изучения вовлеченности транскрипционного фактора X-nkx-5.1 в процесс рефляции экспрессии гена Xanf-1 in vivo и, в частности, в процесс стадио-спсцифического ингибирования его экспрессии на стадии нейрулы, были проведены эксперименты по подавлению трансляции эндогенной мРНК X-nkx-5.1 в развивающихся зародышах шпорцевой лягушки. Подавление трансляции производилось при помощи антисмысловых Морфолиновых Олигонуклеотидов (МО) путем их микроипъекций в зародыши шпорцевой лягушки на стадии 4-8 бластомеров.

Было показано, что подавление трансляции мРНК X-nkx-5.1 в области его нормальной экспрессии, как следствие микроинъекции антисмысловых МО, вызывает расширение зоны экспрессии гена Xanf-1 в данной области (Рис. 7 Ь, Б', сфелка) Это указывает на вовлеченность транскрипционного фактора X-nkx-5.1 в механизм пространственной регуляции экспрессии гена Xanf-1 in vivo.

Для изучения роли транскрипционного фактора X-nkx-5.1 в процессе стадио-специфического ингибирования экспрессии гена Xanf-1, которое в норме наблюдается у зародышей шпорцевой лягушки в течение нейруляции, было проанализировано влияние подавления трансляции эндогенной мРНК X-nkx-5.1 на экспрессию rem Xanf-J на стадии поздней нейрулы.

В норме на данной стадии ралвития экспрессия 1ена Xanf-I в нервной пластинке уже отсутствует и сохраняется лишь в клетках будущего гипофиза (Рис 7 В) В случае же подавления трансляции мРНК Х-пкх-5 1 наблюдается нарушение своевременного ингибирования экспрессии гена Xanf-1, и его экспрессия в зародышах, микроинъецированных антисмысловыми МО, в отличие от контрольных зародышей детектируется с помощью гибридизации in ntu внутри нервной пластинки на стадиях поздней нейрулы (стадия 17-18) (Рис 7 Г, Г ) Данное продление экспрессии 1ена Xanf-1 носит, однако, лишь временный характер. Так, к стадии ранней хвостовой почки (стадии 22-23) экспрессия гена Xanf-1 в формирующейся нервной системе зародышей, микроинъецированных антисмысловыми МО. подавляется во всех исследованных случаях, и, как и у контрольных зародышей, наблюдается лишь в клетках будущего гипофиза (Рис 7 Д Е, Е')

Эти данные указываю! на вовлеченность транскрипционного фактора X-nkx-5 1 в механизм стадио-специфического ишибирования экспрессии гена Xanj-i в области зачатка переднего мозга.

Для доказательства специфичности наблюдаемых эффектов изменения паттерна экспрессии гена Xanf-1, была исследована способность микроинъецируемой мРНК доминантно-репрессорной конструкции ЕпК-Х-ши 5 1гд нивелировать эффект антисмысловых МО Данная доминантно-репрессорная конструкция, подобно экспрессии синтетической мРНК Х-пкх-51, вызывает подавление экспрессии гена Xanf-1 При этом, однако, мРНК EnR-X-nkx-5 1гд, в отличие от мРНК Х-пкх-51, не содержит последовательность нукдеотидов, комплементарную антисмысловым МО и, в силу этого, трансляция EnR-X-nkx-5 1гд не может ингибироваться такими МО

Наблюдавшееся в результате микроинъекции смеси антисмысловых МО и мРНК доминантно-репрессорной конструкции EnR-X-nkx-5 1гд ингибирование экспрессии гена Xanf-1, указывает на специфичность эффектов наблюдавшихся в случае подавления трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5 1 антисмысловыми МО

В сумме, полученные в ходе работы результаты указывает на го, что в процессе раннего развития передних отделов нервной системы шпорцевой ля!ушки

транскрипционный фактор Х-пкх-5.1 выполняет функцию непосредственного репрессора гена Хап/-1.

Транскрипционный фактор Х-пкх-51 регулирует экспрессию нейроспеиифических генов - регуляторов развития головного мозга.

Для более полного изучения биологической функции гена Х-пкх-5.1 в развитии зачатка головного мозга были проанализированы морфологические эффекты, вызываемые микроипъекциями в зародыши шпорцевой лягушки мРНК интактного Х-пкх-5.1 и его доминантно-репрессорной конструкции ЕпЛ-Х-пкх-5 1гд, а также морфологические эффекты, наблюдавшиеся в случаях подавления трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5.1 антисмысловыми МО.

Оказалось, что эктопическая экспрессия Х-пкх-5 1 приводи! к формированию у зародышей аномальных выростов переднего мозга, в то время как микроинъекции мРНК ЕпЯ-Х-пкх-5.1гд и подавление трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5 1 вызывают редукцию переднего мозга (не показано). В совокупности с ранее полученными данными, эти результаты указывают на то, что функции транскрипционного фактора Х-пкх-5.1 в клешах области переднего нервного валика шире, чем просто ингибирование экспрессии гена Хап/-1

Для выяснения этих функций был проведен анализ влияния оверэкспрессии мРНК Х-пкх-5.1 и подавления трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-51 антисмысловыми МО на экспрессию ряда генов, вовлеченных в регуляцию развития зачатка переднего мозга: В/-1, ЫСАМ, Шх-2.4, 0{х-2, Рах-б и -3. В результате было установлено, что оверэкспрессия Х-пкх-5.1 приводит к ингибированию экспрессии В/-1, ЫСАМ, 01х-2, Рах-б и й!х-3 и, напротив, к активации экспрессии гена Ыкх-2.4 В то же время, подавление трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5.1 выражается в ингибировании экспрессии генов Ыкх2 4 и СНх-2 а также в различных изменениях паттернов экспрессии В/-1, ЫСАМ, Рах-б, Ба-3.

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том что, в процессе развития передних отделов головного мозга шпорцевой лягушки, гранскрипционный фактор Х-пкх-5.1, помимо участия в регуляции экспрессии гена

Хап/-1, оказывает вчияние на экспрессию других генов-мишеней, вовлеченных в развитие зачатка головного мозга.

ГенХ-пкх-5 1 регулирует дифференцировку эпидермальныхресничных клеток

Как было установлено (см выше), ген Х-пкх-5 / так же экспрессирустся на ранних стадиях развития в клетках-предшественниках ресничных эпидермальны клеток. Экспрессия гомологов X-nkx-51 и их роль в дифференцировке предшественников эпителиальных ресничных клеток сенсорных органов, и в частности, внутреннего уха, ранее была описана у представителей других классов позвоночных.

Для исследования роли Х-пкх-5 1 в дифференцровке эпидермальных ресничных клеток были проведены эксперименты по блокаде трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-51 в данных клетках путем микроинъекций антисмысловых МО.

В качестве молекулярного маркера дифференцированных эпидермальных ресничных клеток использовался fi-тубулин, экспрессия которого в эпидермисе детектировалась методом гибридизации in situ.

Рис. 8. Подавление трансляции эндогенной мРНК Х-пкх-5 / путем микроинъекций антисмысловых МО приводит к ингибированию экспрессии ¡¡-тубулина - молекулярного маркера дифференцированных эпидермальных ресничных клеток. (А) - экспрессия р-тубулина в эпидермальных ресничных клетках контрольного зародыша (стрелки). (Б, Б'; -отсутствие экспрессии Р-тубулина в эпидермисе зародышей микроинъецированных антисмысловыми МО к мРНК Х-пкх-5 1

В результате, было обнаружено полное ингибирование экспрессии Р-тубулина в эпидермисе зародышей, микроинъецированных антисмысловыми МО к Х-пкх-5 ! (Рис. 8 Б, Б').

Этот факт указывает на вовлеченность транскрипционного фактора X-nkx-5.1 в процесс дифференцировки эпидермальных ресничных клеток в онтогенезе шпорцевой лягушки.

Роль генов DlxS и Р1х2 в регуляции экспрессии гена Xanf-1 шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

При поиске потенциальных регуляторов экспрессии гена Xanf-1 с помощью одногибридной дрожжевой системы, были идентифицированы два транскрипционных фактора, Dlx5 и Dlx2, гены которых экспрессируются в области, [раничащей с областью экспрессии гена Xanf-1 спереди и сбоку Специфичность наблюдавшегося в эксперименте связывания транскрипционных факторов DlxS и Dlx2 с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1 подтверждается тем фактом, что клоны, содержащие кДНК Dlx5 и Dlx2 были обнаружены в 11 и 3 повторностях, соответственно.

Ранее другими авторами было показано, что данные транскрипционные факторы принимают участие в формировании границы нервной пласшнки Это позволило предположить, что Dlx5 и Dlx2 могут быть вовлечены, наряду с X-nkx-5.1, в механизм регуляции экспрессии гена Xanf-1 в клетках на передней границе нервной пластинки.

Транскрипционный фактор Dlx5 оказывает прямое ингибитоуное влияние на экспрессию гена Xanf-1.

Для изучения влияния транскрипционного фактора Dlx5 на экспрессию гена Xanf-1 были проведены эксперименты по микроинъекциям синтетической мРНК Dlx5 в зародыши шпорцевой лягушки. Помимо этого, для выяснения характера влияния гена DlxS на ген Xanf-1, были изготовлены и микроинъецированы в зародыши шпорцевой лягушки мРНК доминантно-репрессорной и доминантно-активаторной конструкций, содержащих гомеодомен D 1x5 и репрессорный домен Engrailed (EnR) или активаторный домен VP 16 (VP 16), соответственно

В результате было выяснено, что оверэкспрессия мРНК DlxS, как и экспрессия мРНК доминантно-репрессорной конструкции EnR-Dlx5pd, приводит к ингибированию экспрессии гена Xanf-1.

Экспрессия доминант но-активаторной конструкции VP! 6-О1х5г0, напротив приводит к расширению области экспрессии гена Xanf-1

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что транскрипционный фактор Dlx5 оказывает репрессорное влияние на экспрессию i ена Xanf-1.

Эксперименты с использованием гормониндуцируемой доминант но-активаторной конструкции VP16-Dlx5zd-BDGR, содержащей связывающий домен глюкокортикоидного рецептора (Binding Domain of Glucocorticoid Receptor, BDGR) показали, что белок Dlx5 может оказывать прямое влияние на экспрессию rem Xanf-1.

Подавление трансляции эндогенной мРНК Dlx5 путем микроинъекций антисмысловых МО в зародыши приводят к расширению зоны экспрессии Xanf-1 в микроинъецированной области зародыша

В совокупности, полученные данные указывают на вовлеченность транскрипционного фактора Dlx5 в механизм пространственной регуляции экспрессии гена Xanf-1. Влияние D!x5 на экспрессию гена Xanf-1 носш ингибиторный характер, и ген Xanf-1 является непосредственной мишенью транскрипционного фактора Dlx5.

Из сопоставления полученных результатов с литературными данными, можно сделать вывод, что транскрипционный фактор Dk5 может выступать как в риш прямою иншбитора экспрессии Xanf-1, непосредственно взаимодеис гвуя с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1, так и в роли опосредованною регулятора экспрессии гена Xanf-1, принимая учасше в формировании границы нервной пластинки и ненейральното эпидермиса

Транскрипционный фактор Р1х2 оказывает опосредованное ингибиторное влияние на экспрессию гена Xanf-1

Для изучения влияния транскрипционного фактора Dlx2 на экспрессию гена Xanf-1 были проведены эксперименты по микроинъекциям синтетической мРНК Dlx2 в зародыши шпорцевой лягушки Помимо этого, для выяснения характера влияния гена Dlx2 на ген Xanf-1, бычи также изготовлены и микроинъецированы в зародыши мРНК доминантно-репрессорной и доминантно-активаторнои

конструкций, содержащих гомеодомен Dlx2 и репрессорный домен Engrailed (EnR) или активаторный домен VP16 (VP16), соответственно.

В результате было показано, что экспрессия синтетической мРНК Dlx2, приводит к незначительному ингибированию экспрессии гена Xanf-1, и, помимо этого, в ряде случаев к искажению паттерна экспрессии Xanf-1 в зародышах.

Аналогично Dlx5, ингибиторное влияние Dlx2 на Xanf-1 было так же подтверждено в экспериментах по подавлению трансляции мРНК Dlx2 с помощью антисмысловых МО. В этом случае наблюдалось расширение области экспрессии Xanf-1 у зародышей, микроинъецированных такими МО

В то же время, в отличие от Dlx5, экспрессия мРНК доминантно-рспрессорной конструкции EnR-Dlx2zd вызывала расширение области экспрессии 1ена Xanf-1, а экспрессия мРНК доминантно-активаторной конструкции VP16-Dlx2ed -ингибированис экспрессии Xanf-1.

Эти данные указывают на то, что в отличие or Dlx5, Dlx2 ишибирует экспрессию гена Xanf-1 опосредованным образом. Например, можно предположить, что Dlx2 активирует какие-то "промежуточные" гены, продукты которых уже являются прямыми репрессорами Xanf-1.

Таким образом, несмотря на способность продукта гепа Dlx2 связываться с регуляторныч элементом промотора гена Xanf-1, прямого влияния на экспрессию Xanf-1 в онтогенезе шпорцевой лягушки in vivo, данный транскрипционный фактор не оказывает. При этом, наряду с другими Dlx генами, Dlx2 может принимать участие в развитии ненейральной эктодермы в области ее границы с нервной пластинкой, и, таким образом опосредованно влиять на экспрессию нейральных маркеров и, в частности, гена Xanf-1.

Выводы.

1 Идентифицированы три гомеодоменных транскрипционных фактора, X-nkx-5 1, Dlx5 и Dlx2, способных связываться с рсгуляторным элементом промотора гомеобоксного гена Xanf-1, расположенным между позициями «-203» и '<-167» oi сайта начала транскрипции. Впервые клонирована полная кодирующая последовательность гена Х-пкх-5 1 шпорцевой лжушки.

2 Установлено, что гомеодоменный транскрипционный фактор X-nkx-5.1 играет роль непосредственного ишибитора экспрессии i омеобоксного гена Xanf-1, участвуя в процессах пространственной и временной регуляции его экспрессии в зачатке юловного мозга у шпорцевой лягушки

3 Показано, что i омеодоменный транскрипционный фактор Dlx5 оказывает как прямое, так и опосредованное ишибиюрное влияние на экспрессию гена Xanf-1, участвуя в пространственной риуляции экспрессии этого гомеобоксного гена в зачатке головного мозга у шпорцевой лягушки.

4 Показано, что гомеодоменный гранскрипционный фактор Dlx2 напрямую не участвует в пространственной регуляции экспрессии гена Xanf-1, но оказывает опосредованное ингибиторное влияние на его экспрессию в зачатке юловною мозга у шпорцевой лягушки

5 Установлено, что экспрессия гена Х-пкх-51 шпорцевой лягушки обнаруживает ряд особенностей, по сравнению с экспрессией его гомологов у представителей друшх классов позвоночных животных, а именно, данный ген экспрессируется в клетках-предшественниках энидермальных ресничных клеток, а также в клетках головного отдела нервной пластинки

6. Показано, что ген Х-пкх-5 1 вовлечен в развитие нейральных структур и эгшдермальных ресничных клеток шпорцевой ля1ушки Нарушения нормальной экспрессии гена Х-пкх-5.1 приводят к аномалиям развития головного мозга и эпидермальных ресничных клеток.

7. Полученные данные о роли гена Х-пкх 5 1 в процессе дифференцировки эпидермальных ресничных клеток шпорцевой лягушки, в совокупности с данными других авторов о роли гомологов гена Х-пкх-5 1 у рыб и млекопитающих в развитии ресничных клеток внутреннего уха и органа боковой линии, позволяют

выдвинуть гипотезу об общем эволюционном происхождении всех эпидермальных ресничных клеток позвоночных.

Список публикаций по теме диссертации:

Bayramov AV, Martynova NY, Eroshkin FM, Ermakova GV, Zaraisky AG., 2004, The homeodomain-contaming transcription factor X-nkx-5.1 inhibits expression of the horaeobox gene Xanf-1 during the Xenopus laevis forebrain development. MechDev. Dec,121(12).1425-41.

Martynova N, Eroshkin F, Ermakova G, Bayramov A, Gray J, Grainger R, Zaraisky A., 2004, Patterning the forebrain. FoxA4a/Pintallavis and Xvent2 determine the posterior limit of Xanfl expression in the neural plate. Development. May,131(10):2329-38.

Принято к исполнению 23 12 2004 Исполнено 24 12 2004

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autorefeiatiu

РНБ Русский фонд

2006-4 2760

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Байрамов, Андрей Вячеславович

Введение.

Обзор литературных данных. б

1. Гомеобокспые гены и их роль в онтогенезе. Гепы класса Anf.

2. Гены семейства NkxS позвоночных. Ген Nkx-5.1.

2.1. Представители и структурные особенности генов семейства Nkx5.

2.2. Особенности экспрессии гомологов гена Nkx-5.1 и их функиционалъныс роли в развитии представителей разных классов позвоночных животных.

3. Гены семейства Dix и их роль в онтогенезе позвоночных животных. Гены DLxS и Dix 2 шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

3.1. Состав и эволюционное происхождение генов семейства Dix позвоночных.

3.2. Структурные особенности и экспрессия генов семейства Dix позвоночных животных.

3.3. Роль генов семейства Dix в регуляции формирования границ нервной тастинки в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

Результаты.

1. Поиск транскрипционных факторов, связывающихся с регуляториым элементом промотора гена Xaitf-1, при помощи одногибридной дрожжевой системы.

2. Ген X-nkx-5.1 шпорцевой лягушки.

2.1. Клонирование кДНК гена X-nkx-5.1.

2.2. Экспрессия гена X-nkx-5.1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

3. Транскрипционный фактор X-nkx-5.1 играет роль регулятора экспрессии гепа Xanf-1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

3.1. Динамика экспрессии гена X-nkx-5.1 в нервной пластинке обнаруживает обратную корреляцию с динамикой экспрессии гена Xanf

3.2. Исследования, проведенные с помощью метода торможения ДНК-белковых комтексов в геле (EMSA), указывают на способность Х-пкх

5.1 связываться с регуляториым элементом промотора гена Xanf

3.3. X-nkx-5.1 может ингибироватъ экспрессию гена Xanf-1 в эмбрионах шпорцевой лягушки.

3.4. Микроинъекции мРНК домипантно-активаторной конструкции, содержащей гомеодомен X-nkx-5.1 (¥Р1б-Х-пкх-5.1гд), вызывают комплекс морфологических аномалий, характерный для случаев эктопической экспрессии гена Xanf-1.

3.5. Транскрипционный фактор X-nkx-5.1 напрямую взаимодействует с регуляторными элементами гена Xanf-1.

3.6. Подавление трансляции эндогенной мРНК X-nkx-5.1 путем микроинъекций антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов вызывает пространственное расширение и продление экспрессии гена Xanf-1 в нервной тастинке зародышей шпорцевой лягушки.

4. Роль гена X-nkx-5.1 в развитии шпорцевой лягушки.

4.1. Роль гена X-nkx-5.1 в развитии головного мозга не ограничивается регуляцией экспрессии гена Xanf-1.

4.2. Транскрипционный фактор X-nkx-5.1 регулирует экспрессию нейроспецифических генов — регуляторов развития головного мозга.

4.3. Ген X-nkx-5.1 вовлечен в процесс дифференцировки эпидермальных ресничных клеток.

5. Роль генов Dlx5 и Dlx2 в регуляции экспрессии гена Xanf-1 шпорцевой лягушки Хеп opus laevis. б

5.1. Транскрипционный фактор Dlx5 может выступать в роли прямого ингибитора экспрессии гена Xanf-1.

5.2. Транскрипционный фактор Dlx5 оказывает непосредственное влияние па экспрессию гена Xanf-1.

5.3. Подавление трансляции эндогенной мРНК Dlx5 в зародышах шпорцевой лягушки приводит к расширению области экспрессии гена Xanf-1.

5.4. Транскрипционный фактор Dlx2 может опосредованно ингибировать экспрессию гена Xanf-1.

5.5. Подавление трансляции эндогенной мРНК Dlx2 в зародышах шпорцевой лягушки приводит к расширению области экспрессии гена Xanf-1.

Обсуждение.

1. Экспрессия гена X-nkx-5.1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

2. Роль гена X-nkx-5.1 в раннем развитии шпорцевой лягушки.

2.1 Роль X-nkx-5.1 в регуляции экспрессии гена Xanf-1.

2.2. Роль X-nkx-5.1 в развитии передней нейроэктодермы шпорцевой лягушки.

2.3. Роль X-nkx-5.1 в дифферепцировкс эпидермальных реснитчатых клеток.

3. Роль генов Dlx5 и Dlx2 в регуляции экспрессии гена Xanf-1. 78 Выводы. 81 Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Ферментные препараты.

1.3. Лабораторное оборудование.

1.4. Лабораторные животные.

1.5. Буферы и растворы.

1.6. Миробиологические среды.

1.7. Предоставленные тазмиды.

1.8. Предоставленные dig-зонды.

2. Методы.

2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.3. Получение 5'- концевого фрагмента кДПК X-nkx-5.1 при помощи метода быстрой амплификации концевых фрагментов кДНК (RACE).

2.4. Изготовление ДНК конструщий.

2.4.1. Изготовление конструщий содержащих ДНК X-nkx-5.1.

2.4.2. Изготовление конструкций, содержащих ДНК Dlx5 и Dlx2.

2.5. Транскрипция in vitro.

2.6. Получение зародышей шпорцевой лягушки. Микроинъекции синтетических мРНК в зародыши шпорцевой лягушки.

2.7. Блокирование трансляции эндогенной мРНК при помощи микроинъекций аптисмыеловых Морфолино Олигонуклсотадов (МО).

2.8. Синтез dig-меченых гибридизационных зондов.

2.9. Фиксация зародышей.

2.10. Гибридизация in situ.

2.11. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки. 99 Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (RT-PCR).

2.12. Одногибридная дрожжевая система.

2.13. Исследование торможения ДНК-белковых комплексов в геле (EMS/1).

Благодарности.

Список сокращений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гомеобоксные гены X-nkx-5.1, Dlx5 и Dlx2 в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis и их роль в регуляции экспрессии гомеобоксного гена Xanf-1"

Главная фундаментальная задача функциональной геномики изучение механизмов реализации информации, заложенной в геноме. Большая часть этой информации иснользуется в эмбриогенезе, в процессе дифференцировки основных типов тканей и систем органов развиваюпегося организма. В связи с этим, изучение молскулярно-генетических механизмов эмбриогенеза представляется одним из наиболее важных направлений современной геномики. Одним из важнейших событий эмбриогенеза позвоночных животных ЯЕШяется закладка и форлшроваппе центральной нервной системы, и, в частности, головного мозга. Головной мозг позвоночных, в том числе, и человека нринципиальпо отличается от головного мозга всех других организмов наличием переднего мозга, состоящего из двух отделов промеж>точного и конечного мозга. Все другие животные, включая ближайших родственников позвоночных низших хордовых (асцидии, ланцетники, сальны), не имеют анатомических структ>р, гомологичных переднем люзгу позвоночных. Ганс и Иорткат (1983) рассматривают воз1Н1Кновение Г Л В Ю О мозга позвоночных как важнейшее эволюционное приобретение, ОО1 Г предлагая конпепцию «повой головы», включающей формирование еложноустроенного переднего мозга, а также производных нервного гребня и плакодных структ>р. Несмотря на очевидную важность выяснения мехашпмов развития переднего мозга, люлекулярпо-генетическнй аппарат, обеспечиваюпщй ранние этагнл дифференцировки этой структ>ры, изучен в гораздо меньншй стенепи, чем многие другие процессы эмбриогенеза. Предшественником мозга в эмбриогенезе является образуемый при гаструляции пласт нейроэпителиальных клеток, называемый нервной иластинкой. В процессе нейрулящш нервная пластинка сворачивается в нервную трубку, в которой в да:н.нейшем размечаются приблизительные границы между зачатками основных отделов мозга: передним, средним и задним. На сегодняшний день только начинают выясняться генетические меха1П1змы, лежащие в основе регионализации передней части нервной пластинки.Одним из ключевых звеньев молекулярного механизма, обеспечивающего painiee развитие переднего мозга у позвоночных, являются гомеобоксные гены класса Anf. Представитель генов класса Anf у шпорцевой лягушки гомеобоксныи ген Xanf-1. Экспрессия гена Xanf-1 в ран!1ем развитии шпорцевой ляг>Н1ки ограничена областью зачатка переднего мозга. Нарупгенпя нормальной экспрессии Xanf-1 приводят к аномалиям развития этой структ>ры. Поэтому, исследование регуляшп! экспрессии гена Xanf-1 является перспективным механизмов развития переднего мозга позвоночных. Выбор ппюрцевой ляг>шкп Xenopus laevis в качестве модели для подобного рода исследований объясняется в первую очередь экспериментальным удобством этого объекта. С одной стороны, для пего разработан обпшрпый ряд методик, П03В0ЛЯЮПП1Х исследовать .молекулярные .механизмы раннего э.мбриогспеза. С другой стороны, в силу высокого консерватиз.ма базовых .механизмов раннего эмбриогенеза у позвоночных, данные, полученные на Xenopus, .мог>т быть легко перенесены на других представителей позвоночных, в то.м числе и на человека. подходом к пониманию Обзор литературных данных. 1. Гомеобоксиые гены и ILK роль в онтогенезе. Гены класса Anf. Гомеобоксные гены играют важную роль в регионализации и клсточ1Юй днфференцпровке в ходе разв1ггия, как позвоночных, так и беспозвоночных многоклеточных организмов (McGuinnes and Krumlauf, 1992), Белковые продукты гомеобоксных генов являются транскрипционны.\н1 фактора.лн! и связываются с рег>ляторными элементами генов мишеней. Они содержат в своем составе консервативную последовательность из 60 аминокислот, называемую гомеодоменом. Гомеодомен определяет специфичность связывания этих белков с ДПК. На сегодняпншй день известно уже несколько десятков классов гомеобоксных генов, каждый из которых характеризуется специфической последовательностью гомеодомена (Карреп et al., 1993). Один из представителей гомеобоксных генов ген Xanf-l был обнаружен у амфибий {Xenopus laevis) при поиске генов, специфически экспрсссируюшихся в раннем зачатке переднего мозга. Само название гена отражает специфичность области его экспрессии: Xenopus Anterior Neural Fold (передний нервнглй валик эмбриона Хе/;о/?г/5) (Рис. 1). Голюлогн гена Xanf-l были обнаруженгл и у других представителе!"! !!03во1!ОЧ!плх, В част1!ост!!, чсловска, мыши, кур!1!пл, тр!1тона, Danio rerio, осетра (Kazanskaya et al., 1997; Thomas et al., 1995; Hermesz et al., 1996). Оказалось, что кодирусмгле эт!!М!1 ге!!ами транскрипцио!1П!ле факторы образу!ОТ отдельный класс гомеодоменных белков. Этот класс был назван Anf. Исследования показали, что ге1!ы да1!!1ого класса являются од!!!1м из ключевых зве!!ьев молекулярного .меха1!!!зма, обес11счива!0!цего развитие переднего мозга у !!озво!!Очных (Зарайский, 2004). Ген Xanf-l является наиболее ранним из известнглх маркеров зачатка переднего мозга (Zaraisky et al., 1992, 1995, Kazanskaya et al., 1997). Экспрессия его нач!11!ается на стад!1!1 гаструлы в области нейроэктодермЕл, которая в последствии Д!1ффере!!!1!!руется в зачаток 1!ереднего мозга (Рис. 1). При этом, экс11ресс1!я Xanf-l в передней части нервной пластинки наблюдается в коротком временном промежутке: со стадии гаструлы до окончания стадии нейрулы. ХапМ fcjT Ст. нейрулы 5-ти дне головас Рис. 1. Область экспрессии гена Xanf-1 на стадии нейрулы (А) в дальнейшем развивается в передний мозг (Б, стрелка). (В) экспрессия GFP (Greenfluorescentprotein) под контролем промотора генл Xanf-I обнаружршается в области переднего мозга. Своевременное снижение уровня экспрессии Xanf-1 внутри нервной пластинки является важным фактором нормального развития неиральных структур. Аномальное продление экспрессии гена Xanf-1 в передней части нервной пластинки приводит к нарушению экспрессии ряда неиральных маркеров, таких как Bf-1, Otx-2 и Рах-6 и морфологическим аномалиям развития структур переднего мозга (Ermakova et al., 1999). Эктопическая экспрессия гена Xanf-1 также приводит у амфибий к развитию аномальных выростов переднего и среднего отделов мозга (Ermakova et al., 1999). При этом клетки формирующихся выростов дифференцируются каждый раз по типу того отдела мозга, на котором развивается данный аномальный вырост. Это указывает на то, что, хотя экспрессия Xanf-1 и является необходимым условием для развития переднего мозга, сама по себе она не достаточна для его дифференцировки. По всей видимости, экспрессия Xanf-1 стимулирует развитие полипотентной нервной ткани переднеголовного типа, которая уже в дальнейшем, под 2004). воздействием дополнительньпс регионально-специфических сигналов, способна дифференцироваться в передний мозг (Ermakova et al., 1999; Зарайский, Белок Xanf-1 является транскрип1Н1оип1>1м репрсссором и способен подавлять экспрессию, по меньшей мере, двух генов регуляторов развития задних отделов мозга Otx-2 и /a.v-6(Ermakova ctal., 1999), В то же время, экспрессия Xanf-1 в передней части нервной пластинки косвенно необходима для активации таких рег>ляторов развития переднего мозга, как Bf-1, Bf-2, Fgf-8, Nkx-2.4 (Зарайский, 2004). Другие представители класса Anf также играют важные роли в развития переднего .\юзга. Так, м>тации, парупшющие экспрессию, мьнпиного го.%юлога Xanf-1 гена Hesxl/Rpx приводят к нарушениям развития переднего люзга и глаза (синдром септооптической диплазии) (Dattani ct al,, 1998). Отсутствие генов класса Anf в распп1фрованных геномах беспозвоночных организ\юв коррелирует с отсутствием у них апатолп1ческих структур, гомологичных нереднему мозг> позвоночных. Появление генов класса Anf у позвоночных могло быть од1Н1.м из событий, приведишх к возникновению у них в процессе эволюции этого отдела центральной первной системы. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что развитие передних отделов люзга у позвоночных стало возможным в результате подавления в передней части фор.мируюшейся нервной трубки экспрессии тех генов, которые у предков позвоночных рег>лировали в этой области развитие структур, гомологичным зад1Н1м отделам .\юзга позвоночных. И ген Xanf-1 п1порцевой лягушки, вoзюжнo, является одним из звеньев данного механизма ингибировапия. Действительно, гомеобокспые гены Otx-2 и Рах-6 в нервной пластинке ближайншх родственников позвоночных, асцидии и ланцетника, экспрессируются вплоть до переднего края нервной пластинки. У позвоночных же их экспрессия оказывается подавленной в центральном секторе передней части нервной пластинки, т.е. в области, из которой в последствии развивается зачаток переднего мозга. И.менпо в этой области экспрсссируется ген Xanf-1, продукт которого способен подавлять экспрессию Otx-2 и Рах-6 (Ermakova et al., 1999). Искусственное пнгибирование экспрессии гена Xanf-1 приводит у шпорцевой ляг>шки к сдвиг> экспрессии Otx-2 и Рах-6 в переднем направлении, вплоть до переднего края нервной пластинки, что в дальнейшем приводит к редукции переднего мозга. Т.е. в отсутствие экспрессии Xanf-1 у эмбрионов наблюдается формирование фенотипа предшественников позвоночных (Зарайский, 2004). Эксиериментальные данные, указывающие на принциниальную важность установления нормального паттерна экспрессии гена Xanf-1 для развития псреднсмозговых структур, гюслужилн предпосылкой для изучения .Mexaini3Mon рег>лянии экспрессии гсиа Xanf-1 в раннем развитии шпорцевой лягушки. Для этого в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН был проведен поиск цис-рег>ляторных элементов, обеснсчиваюших регуляцию экспрессни гена Xanf-1. Анализ экспресспн делеционпых мутантов промоторной области гена Xanf-1 в трансгенных эмбрионах Xenopiis laevis позволил выявить два цис-регуляторных элемента, ответственных за рег>ляцию экспрессии Xanf-1. позвоночных, включая человека (Eroshkin ct al., 2002). Удаление хотя бы одного из этих элементов приводит к аномальному распространению экспрессии гена Xanf-1 на зад1ше отделы головного мозга. Этот факт указывает на то, что механизм локализации экспрессии Xanf-1 в головной иейроэктодермс основан не на локальном действии какого-либо активатора, а на тотальной активации экспрессии Xanf-1 в иейроэктодермс, в формирующейся нервной пластинки (Martynova et al., 2004). Для поиска транскрииционпых идептифицированшлми проведен скрининг регуляторными кДНК библиотеки факторов, способных элементами шпорцевой лягушки связываться Xanf-1 с с про.\ютора был сочетании с областях ингибировапием его экспрессии в туловипцюй и заднеголовной Обпаружеппые регуляторшле элементы оказались консервативными для всех исследовашилх видов по.\юпи.ю одногибридной дрожжевой системы. В результате был обнаружен ряд транрег>ляторпых элементов тепа Xanf-1. Для некоторых из обнаруженных транскринциоииых факторов уже показана роль в рег>ляции экспрессии тепа Xanf-1. Так, продукты геиов Pintallavis \\Xvent-2 обеспечивают постериорную границу области экснрессии гена Xanf-1, в норме ингибируя его в туловищном и заднеголов1юм отделах тела (Martynova et al., 2004). Среди прочих траискрипционных факторов способность связываться с рег>ляторными элементами промотора гена Xanf-1 обнаружил пе известный ранее у шпорцевой ляг>Ц1ки гомсодоменный транскрипционный фактор семейства Nkx5, а также такие гомеодоменные транскринциоппые факторы семейства Dlx, как Dlx5 и Dlx2. 2. Гены семейства Nkx5 позвоночных. Ген Nkx-5.1. 2.1 Представители и структурные особенности генов семейства Nkx5. Гомеобоксиый ген Nkx-5.1 у представителей позвоночных животных впервые был обнаружен у мынш, Mus muscitlus (Bober et al., 1994). Nkx-5.1, наряду с белковыми продуктами двух других гомеобоксных генов Nkx-5.2 и Nkx1.1, оказался гомологичен гомеодоменному транскрипционному фактору NK1 Drosophila. Однако, степень гомологии последовательностей гомеодомеиов Nkx-5.1 и NK1 составляла лишь 58%, в то время как прямой гомолог NK1 у позвопочшлх Nkx-1.1 демонстрировал степень гомологии своего гомеодомена гомеодомену NK1, нревышаюшую 90% (Bober ct al., 1994). Поэтому Nkx-5.1, вместе с обнаруженным транскришшонным фактором Nkx-5.2, были выделены в новое семейство Nkx5 (Mcnnench et al. 1999). Поскольку к этому же семейству были отнесены и другие близкие к Nkx-5.1 и Nkx-5.2 гены позвоночных, в частности, ген Н6 (Jlmxl Stadler et al, 1992) человека, ген Hmxl (Yoshiura et al, 1998) мьшш, гены GH6 и SOHol курицы (Deitcher ct al., 1994; Stadler and Solursh, 1994; Kieman et al, 1997) и два гена асцидии TgHbox (Wang et al., 1990) и SpHmx (iMartincz and Davidson, 1997), семейству были также присвоены назва1тя Нтх (Wang et al., 1998) и//5 (Stadler et al., 1995). Степень гомологии гомеодомеиов разных представителей семейства Nkx5 превышает 85%. Гомология наблюдается также между последовательностя,\п1, лежащими к С-концу от гомеодомена (Martinez and Davidson, 1997). Анализ аминокислотной последовательности гена Nkx-5.1 мьпии выявил наличие у пего последовательности, гомологичной одному из репрессорных 10 доменов (ehl участку) гомсодоменного белка Engrailed дрозофшты (Smith and Jaynes, 1996). Исследования геномной oprainnannn генов Nkx-5.1 у разных представителей позвоночных обнаружили, что позиция единственного нитрона консервативна для всех известных гомологов Nkx-5.1. За исключением двух коротких последовательностей в 5-области гена Nkx-5.1 мыши, длина экзонов также сходна у всех изученных гомологов Nkx-5.1. Некодируюпше области генов Nkx-5.1 у разных представителей позвоночных никакой го.\юлогией не обладают. Длина нитронов у разных генов также может варьировать (Adamska et al., 2001). 2.2. Особенности экспрессии гомологов гена Nkx-5.1 и их роль в развитии представителей разных классов позвоночных животных. Эксирессия Nkx-5.1 у мыши впервые была описапа Bober et al., (1994) а затем, более детально, Rinkwitz-Brandt et al., (1995, 1996). Впервые детектируемый уровень экспрессии наблюдается у эмбрионов М. musculus на стадии 10.5 дней после оплодотворения в уин1ых пузырьках, дорсолатеральнь1х участках нервной трубки, дорсальном хвостовом ганглии и, на более низком уровне в глазных бокалах. При этом, в перед1П1х участках нервной трубки и хвостового ганглия уровень экспрессии выше, че.м в зад1П1х. У э.мбрионов на стад1Н1 11.5 дней после оплодотворения обнаруживается экспрессия Nkx-5.1 в отделыплх участках развнваюпегося \юзга, а именно в двух тяжах клеток лежащих в районе вентрального диенцефагюна, мезенцефалона и метенцсфалона. В районе миелснцсфалона экспрессия Nkx-5.1 наблюдается как в вентральной, так и в дорсальной областях (Bober ct al., 1994). Наиболее высокий уровень экспрессии Nkx-5.1 наблюдается в слуховглх пузЕлрьках, что указывает на участие Nkx-5.1 в процессах формирования структ>р внутреннего уха (Bober et al., 1994). Ген Nkx-5.1 курицы (G. galhis), в отличие от гена Nkx-5.1 нлнпI, экспрсссируется только в сл>ховых плакодах и пузырьках (Ilerbrand ct al., 1998).. Было показано, что экспрессия Nkx-5.1 курицы как и фор.\трование слуховых структ>р зависит от тканевого окружения. Степень устойчивости II формируюи1еися структуры вн>трепиего уха к изменениям тканевого окружения при этом зависит от стадии развития, на которой производится трансплантаиия. Чем позже производится пересадка, тем выпш вероятность установления в пересажеппом материале нормального паттерна гена Nkx-5.1 и формирования эктон[1ческих слуховых структур. При этом, экспрессия Nkx-5.1 проявляет MCHbniyio зависимость от тканевого окружения и регулируется, по-видимому, другими механизмами по cpaBneiniio с экспрессией другого маркера структур вн>трспнего уха гена Рах-2 (Herbrand et al., 1998). Ген Nkx-5.1 бьш также обнаружен у рыб, в частности у данио (Danio rerio) и медаки {Oryzias latypes). У данио экспрессия zNkx-5.1 начинается на стадии четырех сомитов (11.3 часа после ошюдотворешш) в плакодах боковой линии тела (Рис. 2, Л) (Adamska et al., 2000). На стадии 14 сомитов (16 часов после оплодотворения) обнаруживается также область экспрессии zNkx-5.1 в унинлх илакодах (Рис. 2, В), а затем, через 30 часов после оплодотпорепия, экспрессия zNkx-5.1 наблюдается и в ОТДСЛЬПЕЛХ участках головного мозга (Рис. 2, D). При формировании слуховых структур экспрессия zNkx-5.1, как и в случае его мыиииюго и куриного гомологов, наблюдается сначала в передней части слуховых плакод (Рис, 2, С), затем, сразу после формирования слухового пузырька, экспрессия zNkx-5.1 обнаруживается п его аптерио-медиальной области, в дальнейшем, перемепшется в латеральном направлении (Adamska et al,, 2000). У другого представителя класса рыб медаки (Oryzias latypes) были обнаружены два гомолога гена Nkx-5.1, которые получили названия Nkx-5.1.1 и Nkx-5.1.2 (Adamska et al,, 2001). Последовательности гомеодоменоп обнаруже1Н1ых генов различаются всего по одному положению, и наблюдается, также, значшгельная консервативность последовательностей за пределами гомеодоменов. Анализ пуклеотидных последовательностей показал, что ген Nkx-5.1.1 проявляет большую степень гомологии с ранее изученными гомологами Nkx-5.1 других позвоночных, чем геи Nkx-5.1.2, что позволяет предположить, что последний является новым 4iicuoMNkx5 семейства, специфическим для амедаки. 12 .3h А 16h -Ov nt г. Z* ЗОИ 6r.<Sk 1 Рис. 2. Анализ экспрессии гена zNkx-5.1 Danio rerio с помощью гибридизации in situ. Ген zNkx-5.1 экспрессируется в слуховых пузырьках, зачатке боковой линии тела и участках головного мозга. (А) Экспрессия гена zNkx-5.1 детектируется через 11.3 часа после оплодотворения в плакоде боковой линии тела (стрелки). (В) Через 16 часов после оплодотворения экспрессия генагЛЪг-5./ наблюдается в слуховой плакоде (указатель). (С) Через 19 часов после оплодотворения экспрессия гена zNkx-5.1 наблюдается в головном и туловищном отделах плакоды боковой линии (hll и tU) и слуховых пузырьках (ov). (D) Через 30 часов после оплодотворения экспрессия гена zNkx-5.1 помимо латеральной линии (тонкие стрелки), и слуховых пузырьков (указатель) наблюдается в двух участках головного мозга (толстые стрелки). (Adamska et al., 2000).Паттерн DKcnpecciHi генов Nkx-5.1.1 и Nkx-5.1.2 в целом сходен с таковЕлм у гена zNkx-5.1, однако был вьшвлен и ряд интересных особенностей. Гены Nkx-5.1.1 и Nkx-5.1.2 начинают эксирессироваться у мсдаки на стадии 20 в уппюй плакоде и, в далшейшсм, экснрессируются в слуховых нузЕлрьках. Но, при этом, если экспрессия гена Nkx-5.1.1 обнаруживается в области, характерной для всех ранее изученшлх гомологов Nkx-5.1, а именно, в передней части слухового пузырька, то ген Nkx-5.1.2 сначала экспрессируется, напротив, в его задней части, а лишь позже экспрессия смещается вперед. К 24 стадии зона экспрессии гепа Nkx5.1.2 уже пространственно перекрывается с зоной экснрсссин гена Nkx-5.1.1. Интересно, что дина.\н1ка экспрессии гена Nkx-5.1.2 сходна с динамикой экспрессии гена SOIlo-1 курицы другого представителя ccMciicTBa Nkx5, который также экспрессируется в структ>рах внутреннего уха (Kicman et al., 1997). Начиная с 27 стадии, ген Mx-J.7./экспрессируется также в пейробластах, выщинляющихся из слухового пузырька, и формнруюпщх вестибулярный ганглий. Эта область экспресспн также консервативна для всех описанных гомологов Nkx5.1 (Bober et al., 1994; Herbrand et al.,1998; Adamska ct al., 2000). Экспрессии гена Nkx-5.1.2 в данной структуре не наблюдается (Adamska et al., 2001). Начиная со стадии 22, экспрессия гена Nkx-5.1.1 наблюдается в каналах боковой линии тела. В процессе онтогенеза предшественники тловипщых структ>р органа боковой линии тела мигрируют от места своей закладки в каудалыю.м паиравленин (Metcalfe, 1985; Adamska ct al., 2000). В то же время, плакоды, фор.мируюпщс сенсорные каналы головной области, напротив, мигрируют антсриорно от места закладки. Экспрессия гена Nkx-5.1.1 в лщгрируюпщх зачатках органа боковой линии тела наблюдается, по крайней мере, до стадии 29, когда лшгрирующий зачаток туловщцпых сенсорных каналов достигает каудального конца т>ловнща. Экспрессии гена Nkx-5.1.2 в каналах боковой линии не обнаружено. Таким образом, с одной стороны, гены Nkx-5.1.1 и Nkx-5.1.2 различаются по нуклеотидным послсдоватсльностя.м. Особещю сильно это проявляется в некодируюп1ей области, и указывает па то, что дупликация, по всей види.\юсти, имевшая место в эволюции генома медаки, произопша довольно давно. С другой стороны, обнаружены и значительные различия в паттернах экспрессии этих двух 14 генов. Если паттерн экспрессии гена Nkx-5.1.1 в целом идентичен таковому для zNkx-S.l, то экспрессия гена Nkx-5.1.2 обнаруживает ряд серьезных отличий. Это, в свою очередь, указьшает на различия в рег>ляторнь1х механизмах, уиравляюни1х экспрессией двух гомологов Nkx-5.1 у медаки. ПаблюдаемЕлй факт наличия двух сходных, по различаюншхся между собой генов, В03НИКНН1Х, очевидно, в результате дупликации од1Юго предкового гена, соответствует «нолуконсервативной модели» генной эволюции, впервые предложенной Ohno в 1970 году, и развиваемой Ruddle (1997). Согласно этой люделн, после произонюдшей дупликации один из парных генов «берет на себя» функции предшественника (в данном случае это ген Nkx-5.1.1), а второй (в данном случае ген Nkx-5.1.2) при этом получает возможность свободно эволюционировать. В целом, можно отметить, что у всех исследованных представителей П03В01ЮЧПЫХ наблюдается сходный характер экспрессии соответствуюищх го.\шлогов гена NLx-5.1 в форли1руюци1хся слуховых структ>рах. Функциональное участие гена ЛЬг-5,/ в фор.мировании структур внутреннего уха было показано на мышах п>тс.м нарушення функции данного гена. В результате наблюдались серьезные аномалии формирования поведения (Hadrys et al., 1998; Wang ct al., 1998). Ген Nkx-5.1, таким образом, оказался первым геном, для которого была показана специфичность экспрессш! и ключевая роль в формировании Роль Nkx-5.1 в вестибулярной системы млеконитаюишх (Hadrys et al., 1998). формировагпн! переднего мозга при этом не исследовалась. Помимо этого, тот факт, что ген Nkx-5.1 у данио экспрессируется в ynnibix плакодах и нлакодах боковой лишш тела говорит в пользу ГППОТСЗЕЛ О происхождении сенсориглх структ>р боковой линии и внутреннего уха от едшюго предкового сенсорного органа (Jorgcnscn, 1989). При этом показано, что ресничные клетки, выполняющие собствешю сенсорную функцию во внутреннем ухе и каналах боковой линии тела идентичны (Jorgcnscn, 1989). У Danio rcrio были предприняты попытки исследования механизма рег>ляции экснрессии гена NLx-5.1 (Adamska et al., 2000), Предпосылкой для этого 15 вестибулярного агишрата, одной из структур вн>треннего уха, и, как следствие, расстройство послужили данные о вовлеченности FGF сигнала и, в частности, гена FGF-8 в развитие мозга и слуховых структур у данио. Так, у асс-мутаптов с нарутенной функцией гена FGF-8 наблюдаются серьезные дефекты развития среднего и заднего отделов мозга (Reifcrs ct al., 1998). Оказалось, что у таких мутантов происходит значительное уменьшение уровня экспрессии гепа zNkx-5.1 в слуховых плакодах. Напротив, экспрессия zNkx-5.1 в нлакодах боковой линии тела и более поздняя экспрессия в мозге не зависят от функщюнальной активности гена FGF-8 (Adamska et al., 2000). Это указывает на то, что экспрессия гена zNkx-5.1 в разных структурах развиваюпегося организма может рег>Лироваться разны.чт механизмами. 3. Гены семейства Dbc и ILK роль в онтогенезе позвоночных э1сиеотных. Гены DLxS н DLx 2 шпорцевой лягушки Xenopns lacvis. Гены семейства Dlx, а именно Dlx5 и Dlx2, были идентифицированы в качестве транскрипционных факторов, способных связываться с рсг>ляторным элементом промотора гена Xanf-1. Это позволило предположить, что данные гетл мог>т быть вовлечены в механизм регуляции экспрессии гена Xanf-l в раннем развитии шгюрцевой лягушки, ЗЛ. Состав и эволюционное позвоночных. происхолсдепие генов семейства Dlx ГомеобокснЕле гены семейства Distall-less (Dlx) обнаружены у всех изученных груни животных. Подобно генам класса Anf и генам семейства Nkx5, гены Dlx кодируют гомеодомен-содержашие транскрипционные факторЕЛ. Впервые представитель Dlx семейства (ген Dll) был обнаружен у насекомых (Drosophila) в качестве гена, специфически эксирсссируюшегося в развиваюпщхся конечностях. У Drosophila геи Dll вовлечен в установление пpoкcн.юдиcтaьнoгo паттерна сегментов развиваюпщхся конечностей. У особей с нарушениями 16 функпии гена Dll не происходит формирование рудиментар1илх личиночных конечностей (Cohen and Jurgens, 1989). По.\П1мо этого, показано участие гена Dll в формировании антенн у Drosophila. функтн!. Ген Dll у Drosophila также пр1ПН1мает участие в развитии челюстного аппарата (Cohen and Jurgens, 1989) и analia (Gorfinkiel et.al., 1999), a также в формировании структ>р периферической нервной системы (Panganiban and Rubenstcin, 2002). У позвоночных, в отличие от дрозофилы, было обнаружено больнюс разнообразие генов семейства Dlx. Гены семейства Dlx хюзвоночных, подобно Dll гену дрозофилы, также вовлечены в рег>ляиию развития лнюгих эмбриональных структур и, в частности, принимают участие в рег>ляпии развития переднего мозга, жаберных дуг, сенсорных органов и конечностей. Семейство Dlx генов позвоночных включает в себя гены, гомологи которых обнаружены у всех групп позвоночных, включая человека (Nakamura et al., 1996; Scherer et al., 1995; Simeone et al., 1994), мьнпь (Liu et al., 1997; Nakamura et al., 1996; Porteus et al., 1991; Price et al., 1991; Robinson ct al., 1991; Simeone et al., 1994; Stock et al., 1996; Weiss et al., 1995), крысу (Zhao et al., 1994), курину (Ferrari et al., 1995; Pera and Kessel 1999), тритона (Beauchemin and Savard 1992), аксолотля (Mullen et al., 1996), пнюрневую лягушку (Asano ct al., 1 992; Dirksen ct al., 1 993; Papalopulu and Kintner 1993), Eleutherodactylus coqui (Fang and Elinson, 1996) и Danio rerio (Akimenko ct al., 1994; Ekker et al., 1992; Stock ct al., 1996). Ha 0С1Юве ГОМОЛОГИЧЕЮСТН Этот факт представляет особы!! интерес, поскольку да1Н1ый орган у Drosophila выполняет обонятельную и слуховую нуклеотидпых последовательностей последовательности гомеодоме1ЮВ Dlx гены

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Байрамов, Андрей Вячеславович, Москва

1. Изучение молскулярпо-генетических механизмов развития мозга на модели эмбрионов ниюрцевой лягушки. Молекулярная биология, Т.38, Кч 1, с. 40-47 Adam J., Myat А., Le Roux I., Eddison M., Henrique D., Ish-IIoronicz D. and Lewis, J. 1

2. Cell fate choices and the expression of Notch, Delta and Development 125, 4645-4

3. Adamska M., Wolff A., Krcusler M., Wittbrodt J., Braun T. and Bober E., 2

4. Five Nkx5 genes show differential expression patterns in anlagen of sensory organs in medaka: insight into the evolution of the gene family. Dev. Genes Evol. 211, 338-

5. Adamska M., Lcgcr S., Brand M., Hadrjs Т., Braun T. and Bober E., 2

6. Inner ear and lateral line expression of a zebrafish Nkx5-1 gene and its dovvnregulation in the ears of FGF8 mutant, ace. Mechanisms of Development 97, 161-

7. Akimenko iMA, Ekker M, Wcgncr J, Lin W, Wcsterfield M., 1994, Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J Ncurosci. Jrm; 14(6):3475-

8. Amorcs A, Force A, Yan YL, Joly L, Amcmiya C, Fritz A, Ho RK, Langcland J, Prince V, Wang YL, Wcsterfield M, Ekker M, Postlethwait JIL, 1998, Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. Nov 27;282(5394):1711-

9. Artavanis-Tsakonas, S., Matsuno, K. and Fortini, M. E., 1995, Notch signaling. Science 267, 225-

10. Asano M, Emori Y, Saigo K, Shiokawa K., 1992, Isolation and characterization of a Xenopus cDNA which encodes a homcodomain highly homologous to Drosophila Distal-less. Ji?/o/ Chem. Mar 15;267(8):5044-

11. Ault KT, Xu RH, Kung HF, Jamrich M., 1997, The homeobox gene PV.l mediates specification of the prospective neural ectoderm in Xenopus embryos. Dev Biol. Dec 1;192(1):162-

12. Bachillcr D, Klingcnsmith J, Kemp C, Bcio JA, Anderson RM, May SR, McMahon JA, iMcMahon AP, Harland RM, Rossant J, De Robertis EM., 2000, The Serrate homologues in the chick inner ear: parallels with Drosophilasense-organ development. 106

13. Baker CV, Bronner-Fraser M., 2001, Vertebrate cranial placodes I. Embryonic induction. Dev Biol. Apr 1 ;232( 1): 1 -

14. Balak K, Jacobson M, Sunshine J, Rutishauser U., 1987, Neural cell adhesion molecule expression in Xenopus embryos. Dev Biol. Fcb;l 19(2):540-

15. Beanan MJ, Fclcdy JA, Sargent TD., 2000, Regulation of early expression of Dlx3, a Xenopus anti-neural factor, by beta-catenin signaling. Mech Dev. Mar 1 ;91(12):227-

16. Beauchemin M, Savard P., 1992, Two distal-less related homeobox-containing genes expressed in regeneration blastemas of the newt. Dev Biol. Nov;154(l):55-

17. Bobcr E, Baum C, Braun T, Arnold HH., 1994, Л novel NK-related mouse homeobox gene: expression in central and peripheral nervous structures during embryonic development. Dev Biol. Mar;162(l):288-

18. Chang C, Flemmati-Brivanlou A., 1998, Neural crest induction by Xwnt7B in Xenopus. Z)cv Л/о/. Feb 1; 194(1): 129-

19. Chomczynski P, Sacchi N., 1987, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. Apr; 162(1): 1

20. Cohen SM, Jurgcns G., 1989, Proximal-distal pattern formation in Drosophila: cell autonomous requirement for Distall-less gene activity in limb development, EMBO J, 8, 2045-2

21. Dattani M. Т., Martinez-Barbcra J. P., Thomas P. Q., Brlckrnan J. M., Gupta R., Mortensson I. L., Toresson H., Fox iM., Wales J. K., Hindmarsh P. C Krauss S., Beddington R. S. and Robinson I. C 1

22. Mutations in the homeobox gene HESXl/Hesxl associated with septo-optic dysplasia in human and mouse. Nat. Genet. 19, 125-

23. Dcblandre G. A., VVcttstcin D.A., Koyano-Nakagawa N. and Klntncr C 1999. A two-step mechanism generates the spacing pattern of the ciliated cells in the skin of Xenopus embryos. Development 126,4715-4

24. Deitchcr DL, Fckete DM, Ccpko CL., 1994, Asymmetric expression of a novel homeobox gene in vertebrate sensory organs. JNeurosci, Feb;14(2):486-98. 107

25. Dirkscn ML, Mathers P, Jamrich M., 1993, Expression of a Xenopus Distal-less homeobox gene involved in forebrain and cranio-facial development. Mech May;41(2-3):121-

27. Colinearity and functional hierarchy among genes of the homeotic complexes. Trends Genet. 10,358-

28. Eisenstat DD, Liu JK, Mione M, Zhong W, Yu G, Anderson SA, Ghattas I, Puellcs L, Rubcnstcin JL., 1999, DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. Nov 15;414(2):217-37. Ekl<cr M, Akimcnko MA, Bremlllcr R, Wcsterfield M., 1992, Regional expression of three homeobox transcripts in the inner ear of zebrafish embr>os. Neuron. Jul;9(l):27-

29. Ellics DL, Stock D\V, Hatch G, Giroux G, Weiss KM, Ekker ЛЬ, 1997, Relationship between the genomic organization and the overlapping expression patterns of the zebrafish dlx genes. Genomics. Nov l;45(3):580-

30. Erniakova, G.V., Alcxandrova, Е.ЛЬ, Kazanskaya, O.V., Vasillcv, O.L., Smith, and Zaraisky, A.G., 1999. The homeobox gene, Xanf, can control both neural embryonic Dev. differentiation and patterning in the presumptive anterior neurectoderm of the Xenopus laevis embryo. Development \2в,45\3-Л52Ъ. Eroshkin F, Kazanskaya O, Л1аг1упоуа N, Zaraisky A., 2

31. Characterization of cis-regulatory elements of the homeobox gene Xanf-

33. Fang H, Elinson RP., 1996, Patterns of distal-less gene expression and inductive interactions in the head of the direct developing frog Eleutherodactylus coqui. Dev Biol. Oct 10;179(l):160-

34. Fclcdy JA, Beanan Ли, Sandoval JJ, Goodrich JS, Lim JH, Лatsuo-Takasaki Л1, Sato SЛI, Sargent TD., 1999, Inhibitory patterning of the anterior neural plate in Xenopus by homeodomain factors Dlx3 and MsxX.Dev Biol. Aug 15;212(2):455-64. IDS

35. Ferrari D, Sumoy L, Gannon J, Sun H, Brown AM, Upholt \VB, Kosher 1Ъ\., 1995, The expression pattern of the Distal-less homcobox-containing gene Dlx-5 in the developing chick limb bud suggests its involvement in apical ectodermal ridge activity, pattern formation, and cartilage differentiation. Mech Dev. Aug;52(2-3):257-

37. Identification of otx2 target genes and restrictions in ectodermal competence during Xenopus cement gland formation. Development 471-

38. Gans C, Northcutt RG, 1983 Neural crest and the origin of vertebrates: a new head. Science 220, 268-

39. Ghanbari И, Seo ПС, Fjosc A, Brandli AW., 2001, Molecular cloning and embryonic expression of Xenopus Six homeobox genes. Mech Dev. Mar;101(l-2):271-

40. Gomcz-Skarmcta JL, Glavic A, de la Callc-Mustienes E, Modolell J, Л1ауог R., 1998, Xiro, a Xenopus homolog of the Drosophila Iroquois complex genes, controls development at the neural plate. EMBOJ. Jan 2;17(l):181-

41. GorfinkicI N, Sanchez L, Guerrero I., 1999, Drosophila terminalia as an appendage-like structure. Mech Dev. Aug;86(l-2):113-

42. Hadr>s T, Braun T, Rinkwitz-Brandt S, Arnold HH, Bober E., 1998, Nkx5-1 controls semicircular canal formation in the mouse inner ear. Development. 124(2), Jan;125(l):33-

43. Harland R. M., 1991. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-

44. Herbrand H., Guthrie S., Hadrys Т., Hoffmann S., Arnold H-H., RinkvvitzBrandt S., and Bober E. 1998. Two regulatory genes, cNkx5-l and cPax2, show different responses to local signals during otic placode and vesicle formation in the chick embryo. Development 125, 645-

45. Hermesz E., Mackem S., iMahon K. A., 1996. Rpx: a novel anterior-restricted homeobox gene progressively activated in the prechordal plate, anterior neural plate and Rathkcs pouch of the mouse cmbr>o. Development 122, 41-52. 109

46. Holland ND, Panganiban G, Hcnyey EL, Holland LZ., 1996, Sequence and developmental expression of AmphiDll, an amphioxus Distal-less gene transcribed in the ectoderm, epidermis and nervous system: insights into evolution of craniate forebrain and neural crest. Development. Sep; 122(9):2911-

48. Active repression of transcription by the engrailed homeodomain protein. ЕЛ/ZJOy. 10, 1427-1

49. Jorgensen J.M., 1989, Evolution of octavolateralis sensory cells. In: Coombs,S., Gomer, P. and Munz, H. (Ed) The Mcchanosensory Lateral Line: neurobiology and Evolution, Springer-Verlag, New York, pp. 187-

50. Kablar B, Vignali R, Menotti L, Panncse M, Andreazzoli M, Polo C, Giribaldi MG, Boncinclli E, Barsacchi G., 1996, Xotx genes in the developing brain of Xenopus laevis. Mech Dev. Apr;55(2): 145-

51. Kappcn C, Schughart K, Ruddle FH., 1993, Early evolutionary origin of major homeodomain sequence classes. Genomics. Oct;18(l):54-

52. Kazanskaya O. V., Sevcrtzova E. A., Barth K. A., Ermakova G. V., Lukyanov S.A., В enyuniov A., Panncse M., В oncinclli E., W ilson S .W. a nd Zaraisky A G., 1997. ANF: a novel class of homeobox genes expressed at the anterior end of the main embryonic axis of vertebrates. Gene 200, 25-

53. Kiernan AE, Nunes F, Wu DK, Fekcte DM., 1997, The expression domain of two related homeobox genes defines a compartment in the chicken inner ear that may be involved in semicircular canal formation. Dev Biol. Nov 15;191(2):215-

55. Lassar AB, Munsterberg AE., 1996, The role of positive and negative signals in somite patterning. Citrr Opin Neurobiol. Feb;6(l):57-63. 110

56. Marchant L, Linker C, Ruiz P, Guerrero N, Mayor R., 1998, The inductive properties of mesoderm suggest that the neural crest cells arc specified by a BMP gradient. Dev Biol. Jun 15; 198(2):319-

57. Martinez P, Davidson EIL, 1997, SpHmx, a sea urchin homeobox gene expressed in embryonic pigment cells. Dev Biol. Jan 15;181(2):213-

58. Mennerich D., Hoffmann S., Hadrys Т., Arnold H-H. and Bober E. 1999. Two highly related homeodomain proteins, Nkx5-1 and Nkx5-2, display different DNA binding specificities. Biol. Chem. 380, 1041-1

59. Metcalfe WK., 1985, Sensory neuron growth cones comigrate with posterior lateral line primordial cells in zebrafish. У Cow/? Neurol. Aug 8; 238(2):218-24. Ill

60. Morgan R, Sargent iMG., 1997, The role in neural patterning of translation initiation factor eIF4AII; induction of neural fold genes. Development. Jul; 124(14):275

61. Moury JD, Jacobson AG., 1990, The origins of neural crest cells in the axolotl. Dev Biol. Oci; 141(2):243-

62. Mullen LM, Br>ant SV, Torek MA, Blumberg B, Gardiner DiM., 1996, Nerve dependency of regeneration: the role of Distal-less and FGF signaling in amphibian limb regeneration. Development. Nov; 122(11):3487-

63. Myojin M, Ueki T, Sugahara F, Murakami Y, Shigetani Y, Alzawa S, Hirano S, Kuratani S., 2001, Isolation of Dlx and Emx gene cognates in an agnathan species, Lampetra japonica, and their expression patterns during embryonic and larval development: conserved and diversified regulatory patterns of homeobox genes in vertebrate head evolution, J Exp Zool. Apr 15; 291(l):68-

64. Nakamura S, Stock DW, Wydncr KL, BoUekcns JA, Takcshita K, Nagal BM, Chiba S, Kitamura T, Frccland TM, Zhao Z, MInowadaJ, Lawrence J B, Weiss KM, Ruddle FH., 1996, Genomic analysis of a new mammalian distal-less gene: Dlx

66. Nakata K, Nagal T, Aruga J, MIkoshiba K., 1997, Xenopus Zic3, a primary regulator both in neural and neural crest development. Proc Natl Acad Sci USA. Oct 28; 94(22):11980-

67. Ncidcrt AH, Virupannavar V, Hooker GVV, Langeland JA., 2001, Lamprey Dlx genes and early vertebrate evolution. Proc Natl Acad Sci USA Feb 13;98(4): 1665-

68. Nguyen VH, Schmid B, Trout J, Connors SA, Ekkcr M, Mulllns MC, 1998, Ventral and lateral regions of the zebrafish gastrula, including the neural crest progenitors, arc established by a bmp2b/swirl pathway of genes. Dev Biol. Jul 1;199(1):93-110. NIeuvvkoop, P. D. and Faber, J., 1

69. Normal Table of Xenopus laevis. Amsterdam North Holland. 112

70. Comparison of тофЬоНпо based translational inhibition during the development of Xenopus laevis and Xcnopus tropical is. Genesis 30, 110-113. Oh no S., 1970 Evolution by gene duplication". Springer-Verlag, New York. Okada Л, Ohta Y, Inoue S, Hiroi H, Muramatsu M, Iguchi Т., 2

71. Expression of estrogen, progesterone and androgen receptors in the oviduct of developing, cycling and pre-implantation rats. J Mol Endocrinol 30(3), 301-

72. Ozcelik T, Portcus MH, Rubenstein JL, Francke U., 1992, DLX2 (TESl), a homeobox gene of the Distal-less family, assigned to conserved regions on human and mouse chromosomes

74. Panganlban G, Rubenstein JL., 2002, Developmental functions of the Distalless/Dlx homeobox genes. Development. Oct; 129(19):4371-

75. Panncse M, Polo C, Andrcazzoli M, Vignali R, Kablar B, Barsacchi G, Boncinclli E., 1995, The Xcnopus homologuc of Otx2 is a maternal homeobox gene that demarcates and specifies anterior body regions. Development. Mar;121(3):707-

76. Papalopulu N, Kintncr C 1993, Xenopus Distal-less related homeobox genes are expressed in the developing forebrain and arc induced by planar signals. Development. Mar; 117(3) :961-

77. Pera E, Kesscl M., 1999, Expression of DLX3 in chick embryos. Mech Dev. Dec;89(l-2): 189-

78. Perera M, Merlo GR, Verardo S, Palcari L, Corte G, Levi G., 2004, Defective neuronogenesis in the absence of Dlx5. Mol CellNeiirosci. Jan;25(l): 153-

79. Porteus MH, Bulfonc A, Ciarancllo RD, Rubenstein JL., 1991, Isolation and characterization of a novel cDNA clone encoding a homeodomain that is developmentally regulated in the ventral forebrain. Neuron. Aug;7(2):221-

80. Pourquie O., 2000, Segmentation of the paraxial mesoderm and vertebrate somitogenesis. Curr Top Dev Biol.;47:81 -

81. Price M, Lemaistre M, Pischetola M, Di Lauro R, Duboule D., 1991, A mouse gene related to Distal-less shows a restricted expression in the developing forebrain. Nature. Jun 27;351(6329):748-

82. Puelles L, Kuwana E, Puelles E, Bulfonc A, Shimamura K, Keleher J, Smiga S, Rubenstein JL., 2000, Pallial and subpallial derivatives in the embryonic chick and 113

83. Quint E, Zcrucha T, Ekker M., 2000, Differential expression of orthologous Dlx genes in zebrafish and mice: implications for the evolution of the Dlx homeobox gene family. У £л-р Zoo/. Oct 15;288(3):235-

84. RaffinM, LeongLM, Rones MS, Sparrow D, Mohun T, Mercola M., 2000, Subdivision of the cardiac Nkx2.5 expression domain into myogenic and nonmyogenic compartments. Dev Z?/o/, Feb 15;218(2):326-

85. Reifers F, Bohli H, Walsh EC, Crossley PH, Stainier DY, Brand M., 1998, Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain Jul;125(13):2381-

86. Rinkwitz-Brandt S, Arnold HH, Bober E., 1996, Regionalized expression of Nkx5-1, Nkx5-2, Pax2 and sek genes during mouse inner car development. Hear Res. Sepl5;99(l-2):129-

87. Rinkwitz-Brandt S., Justus M., Oldencttel I., Arnold H-H., and Bober E., 1

88. Distinct temporal expression of mouse Nkx-5.1 and Nkx-5.2 homeobox genes during brain and car development. Mech. Dev. 52, 371-

89. Robinson GVV, Mahon KA., 1994, Differential and overiapping expression domains of Dlx-2 and Dlx-3 suggest distinct roles for Distal-less homeobox genes in craniofacial development. Mech Dev. Dec;48(3): 199-

90. Robinson GW, Wray S, Mahon KA., 1 991, Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. New Biol. Dec;3(12):l 183-

91. Ruddle FII., 1997, Vertebrate genome evolution—the decade ahead. Genomics. Dec 1;46(2): 171-

92. Sarasa M, Climcnt S., 1987, Effects of catecholamines on early development of the chick embryo: relationship to effects of calcium and cAMP. J Exp Zool. Feb;241(2): 181-

93. Scherer S\V, Hcng HH, Robinson GVV, Mahon KA, Evans JP, Tsui LC., 1995, Assignment of the human homolog of mouse Dlx3 to chromosome 17q21.3-q22 by boundary development and somitogenesis. Development. 114

94. Sclleck MA, Bronncr-Frascr iM., 1995, Origins of the avian neural crest: the role of neural plate-epidermal interactions. Development. Feb;121(2):525-

95. Simeone A, Acampora D, Pannese M, DEsposito M, Stornaiuolo A, Gultsano M, iVIallamaci A, Kastury K, Druck T, Huebncr K, Boncinclli, E., 1994, Cloning and characterization of two members of the vertebrate Dlx gene family. Proc Natl Acad Sci U 6Л.Маг15;91(6):2250-

96. Sive H.L., Grainger R. M., Harland R. M., 1994, Early development of Xenopus laevis., Cold spring harbor. Small EM, Vokcs SA, Garrlock RJ, Li D, Kricg PA., 2000, Developmental expression of the Xenopus Nkx2-1 and Nkx2-4 genes. Mech Dcv. Sep;96(2):259-

97. Smith S.T., and Jaynes J.B., 1996. A conserved region of engrailed, shared among all en-, gsc-, Nkl-, Nk2- andmsh-class homeoproteins, mediates active transcriptional repression in vivo. Development 122,3141-3

98. Stadler HS, Murray JC, Lcyscns NJ, Goodfcllow PJ, Solursh M., 1995, Phylogenetic conservation and physical mapping of members of the H6 homeobox gene family. Mamm Genome. Jun;6(6):383-

99. Stadler IIS, Padanilam BJ, Buctow K, Murray JC, Solursh M., 1992, Identification and genetic mapping of a homeobox gene to the 4pl6.1 region of human chromosome

100. Proc Natl Acad Sci U S A Dec 1;89(23):11579-

101. Stadler HS, Solursh M., 1994, Characterization of the homeobox-containing gene GH6 identifies novel regions of homeobox gene expression in the developing chick embryo. Dev Biol. Jan;161(l):251-

102. Stock DW, Ellles DL, Zhao Z, Ekkcr M, Ruddle FH, Weiss KM., 1996, The evolution of the vertebrate Dlx gene family. Proc Natl Acad Sci USA. l;93(20):10858-

103. Strcit A, Stern CD., 1999, Establishment and maintenance of the border of the neural plate in the chick: involvement of FGF and BMP activity. Mech Dev. Apr;82(l2):51-66. Oct 115

105. Thomas P.Q., Johnson B.V., Rathjen J., Rathjcn P.D., 1

106. Sequence, genomic organization, and expression of the novel homeobox gene Hesxl. J. Biol. Chem. 270, 3869-3

107. Tichclaar J\V, Lim L, Costa RH, Whitsctt J A., 1999. HNF-3/forkhead homologue-4 influences lung moфhogcnesis and respiratory epithelial cell differentiation in vivo. DevBiol. 213(2), 405-

108. Tichclaar JVV, Wert SE, Costa RH, Kimura S, Whitsctt JA., 1999. HNF3/forkhead homologue-4 (HFH-4) is expressed in ciliated epithelial cells in the developing mouse lung. JHistochem Cytochem. 47(6), 823-

109. Turner DL, Wcintraub H., 1994, Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. Jun 15;8(12): 1434-

110. Wang GV, Dolccki GJ, Carlos R, Humphreys Т., 1990, Characterization and expression of two sea urchin homeobox gene sequences. Dev Genet.;\ l(l):77-

111. Wang W, Van Do Water T, Lufkin Т., 1998, Inner ear and maternal reproductive defects in mice lacking the Hmx3 homeobox gene. Development. Feb; 125(4):621-

112. Weiss KM, Ruddle FH, Bollekens J., 1995, Dlx and other homeobox genes in the moфhological development of the dentition. Connect Tissue Kes.;32{l-4):35-

113. Wilson PA, Lagna G, Suzuki A, Hemmati-Brivanlou A., 1997, Concentrationdependent patterning of the Xenopus ectoderm by BMP4 and its signal transducer Smadl. Development. Aug; 124(16):3177-

114. Wilson SI, Rydstrom A, Trimborn T, Willcrt K, Nusse R, Jessell TM, Edlund Т., 2001, The status of Wnt signalling regulates neural and epidermal fates in the chick embryo. Nature. May 17;411(6835):325-

115. Woda JM, Pastagia J, Mercola M, Artingcr КВ., 2003, Dlx proteins position the neural plate border and determine adjacent cell fates. Development. Jan; 130(2):331-

116. Yang L, Zhang H, Hu G, Wang H, Abate-Shen C, Shen MM., 1998, An early phase of embr>onic Dlx5 expression defines the rostral boundary of the neural plate. J Neurosci. Oct 15;18(20):8322-30. 116

117. Zerucha T, Ekker M., 2000, Distal-less-related homeobox genes of vertebrates: evolution, function, and regulation. Biochem Cell Biol.\1 (5):593-

118. Zhao GQ, Zhao S, Zhou X, Eberspaecher H, Solursh M, de Crombrugghe В., 1994, rDlx, a novel distal-Iess-likc homeoprotein is expressed in developing cartilages and discrete neuronal tissues. Dev Biol. Jul;164 (1):37-

119. Ziman MR, Rodger J, Chen P, Papadimitriou JM, Dunlop SA, Beazley LD., 2001, Pax genes in development and maturation of the vertebrate visual system: implications for optic ner\e regeneration. Histol Histopathol. Jan;16(l):239-49. development of the Spemann organizer. Development 121, 3839-3847. 117