Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения"

ШАРАПОВ МАРС ГАЛИЕВИЧ

КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРОКСИРЕДОКСИИОВ 6 РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2009

003476795

Работа выполнена в лаборатории механизмов рецепции Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Равин Виктор Константинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна кандидат биологических наук, Солонин Александр Сергеевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «о » октября 2009 года в « 11 » часов на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской области, Институтская ул. 3, Институт биофизики клетки РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан « ^ » сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

/

/ ' Т.И.Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Пероксиредоксины (Ргх, КФ 1.11.1.15) - сравнительно недавно открытое семейство селен-независимых пероксндаз. Ргх осуществляют ферментативную деградацию Н2О2, органических гидропероксидов и пероксинитрита [Hofmann В. et al., 2002; Flohe L. et al.,

2007]. Пероксиредоксины - широко представленная группа ферментов обнаруженная как в про - так и в эукариотических организмах. У млекопитающих известно шесть типов пероксиредоксинов. По числу активных остатков цистеина (Cys) в каталитическом центре и механизму ферментативной реакции, Ргх млекопитающих подразделяют на типичные 2-Cys (Ргх1-4), атипичные 2-Cys (Ргх5) и 1-Cys (Ргхб). Особый интерес представляет Ргхб, который в отличие от других Ргх, восстанавливает гидроперекиси фосфолипидов и обладает активностью фосфолипазы А2 [Kim T.S. et al.,1997, 1998], функция которой на сегодняшний день недостаточно изучена.

Ргхб в большей степени представлен в эпителиальных тканях. Так, Ргхб является основной пероксидазой эпителия верхних дыхательных путей и легких крысы и, по-видимому, играет наиболее важную роль в антиоксидантной защите этих органов [Новоселов В.И. и др. 1999, 2003]. Важная антиоксидантная функция Ргхб была продемонстрирована в работах с нокаутом гена ргхб мыши. Нокаутные по гену ргхб мыши, характеризовались снижением выживаемости, высоким уровнем окисления белков и значительными повреждениями многих органов, несмотря на нормальный уровень экспрессии генов других антиоксидантных ферментов таких, как каталаза, глутатионпероксидаза и супероксид дисмутаза [Wang X. et al., 2003].

В ряде работ показана защитная роль Ргхб при различных патологиях: кожи [Kumin А. et al., 2006], легких [Kinnula V.L. et al., 2004; Fisher A.B. et al., 2004], глаз [Kubo E. Et al.,

2008] и нервной системы [Power J. et al., 2008]. Терапевтическая активность Ргхб была продемонстрирована при лечении ран у крыс, после механических и термических травм кожи, а также после химических ожогов верхних дыхательных путей [Новоселов В.И. и др. 2000,2003].

Таким образом, существуют основания полагать, что Ргхб может применяться в терапии заболеваний, патогенез которых связан с окислительным стрессом.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является сравнительное исследование Ргхб из различных источников с перспективой последующего создания на их основе лекарственного препарата антиоксидантного действия.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1) Клонировать и экспрессировать различные гены ргх6.

2) Сравнить ферменты по активности и субстратной специфичности.

3) Определить оптимальные условия ферментативной реакции.

4) Сравнить Ргхб по термостабильности.

5) Провести структурный анализ белков Ргхб методами кругового дихроизма и ЯМР.

Научная новизна

В одних экспериментальных условиях проведено сравнительное исследование физико-химических свойств Ргхб из различных источников. Впервые получены гены и белки Ргхб шпорцевой лягушки Хепорш /аеу«. Изучена динамика экспрессии двух генов ргхб в ходе развития головастика, а также экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки. Методами кругового дихроизма и ЯМР показано, что все изученные Ргхб близки как по вторичной, так и по третичной структуре. Экспериментально подтверждено для одного из Ргхб шпорцевой лягушки и дрозофилы (Хеп1 и ОРхбООб соответственно) отсутствие активности фосфолипазы А2, предсказанное теоретически из аминокислотной последовательности. Помимо активности фосфолипазы А2, для Ргхб человека, дрозофилы ОРх2540 и шпорцевой лягушки Хеп2 обнаружена ранее неизвестная деметилазная активность.

Научно-практическая пенность

Гомологичные ферменты могут довольно сильно отличаться по основным физико-химическим свойствам: активности, специфичности к различным субстратам и термостабильности. Ранее не предпринимались попытки провести сравнительный физико-химический анализ Ргхб из различных источников в одних экспериментальных условиях. Такое сравнение играет важную роль в последующем создании лекарственного препарата на основе Ргхб, так как фермент, для достижения максимального терапевтического эффекта, должен обладать достаточно высокой активностью и стабильностью.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на IV Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Крым, 2008), на Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. академика Н.М. Эммануэля (Москва, 2008), на 12-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2008), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего.?/^источников. Работа изложена на НО страницах машинописного текста и содержит 39 рисунков и -7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Для получения кДНК генов пероксиредоксина б в работе использовали достаточно отдаленные в эволюции организмы: крыса (Rattus norvegicus), шпорцевая лягушка (Xenopus laevis) и плодовая муха (Drosophila melanogaster). Ген prxñ человека был получен из плазмиды pBlueScript/p28h, любезно предоставленной Fenstein S.I. (США).

Выделение РНК проводили как классическими методами, так и с помощью готового набора реактивов RNcasy MiniK.it (Qiagen, Германия), следуя рекомендациям производителя.

Обратная транскрипция и ПЦР. Тотальную РНК обрабатывали ДНКазой RQ1 (Promega, США), затем РНК очищали на колонке (Qiagen, Германия) и использовали в реакции обратной транскрипции, которую проводили с помощью обратной транскриптазы AMV (Promega, США) и праймера олиго-dT, следуя протоколам производителя. Полученную кДНК использовали в ПЦР, которую проводили в термоциклере MJMini (BioRad, США) в следующем режиме: денатурация при 94°С - 2 мин; затем следовало 30 циклов: денатурация 94°С - 30 е., отжиг праймеров 56 59°С - 30 е., синтез цепи 70°С - I мин.; достройка цепи 70°С - 5 мин. Использовали смесь полимераз для высокоточного ПЦР (Fermentas, Литва). Нуклеотидные последовательности праймеров, которые были использованы в работе, приведены в таблице 1 (F-прямой, R-обратный праймер; точки рестрикции подчеркнуты и выделены курсивом).

Таблица 1. Праймеры, которые были использованы при получении генов ргхб.

Организм Праймер Последовательность праймера EMBL

Человек Hum.F 5'-AA CA TA rCATGCCCGGAGGTCTGCTT-3' DI 4662

Hum.R У-AACTCGA GAGGCTGGGGTGTGTA-3'

Крыса Rat.F У-ААСА TA rCATGCCCGGAGGGCTGCTTCT-3 Y17295

Rat.R 5-AACTCGA GAGGCTGGGGCGTATA-3'

Дрозофила Dr2540.F 5'- AACAGC CA TA 7Y7CGTTTGGGACAGACCGT-3' AF31879

Dr2540.R 5'- TAGGCTCGAGA7AGTTCTCAGTGGTGCGGA-2'

Dr6005.F 5'-TATCCCA TA TCTCCGGAAAGGCT-3' AF311878

Dr6005.R 5'-GCTTGTCATCrCG4 CGGGCTGTG-3'

Лягушка Xenl.F 5'-CAGCA CA ТА rGCCAGGTATCCTGCTAG-3' BC054278

Xenl.R 5'-CATTCrC<7/((7rTGTGGCTGAGGTGTGTA-3'

Xen2.F 5'- TTG4 ТА rCCCTGGAATCCTGCTAGGAG-3' BC054309

Xen2.R 5'- AACTCGA GTTGTGGCTGTGCAGTGTATCTC -3'

Мутагенез ргхб человека. Мутагенез проводили с помощью ПЦР по методике перекрывающихся праймеров [Но Б.Ы. е1 а1., 1998]. Праймеры, которые были использованы в работе для мутагенеза гена ргхб человека, приведены в таблице 2 (мутантные участки подчеркнуты и выделены курсивом).

Таблица 2. Праймера для мутагенеза ргхб человека

Праймер Последовательность праймера Мутация

21.F 21.R 5'-GGCCAATACCACCGTCCCCCGCATCCGTTTCCACG-3' 5'-CGTGGAAACGGATGCGCGGGACGGTGGTATTGGCC-3' Gly21—»Pro

30.F 30.R 5'-CCACGAC TTTCTGCG4GACTCATGGGGCATTC-3' S'-GAATGCCCCATGAGTCrGGCAGAAAGTCGTGG-3' Gly30—»Pro

115.F 115.R 5*-GCTTGCCATCCTGTTGCCCATGCTGGATCCAGCAGA-3' 5'-TCTGCTGGATCCAGCATGCGCAACAGGATGGCAAGC-3' Glyll5—»Pro

184.F 184.R 5'-AGTTGATTGGAAGGATCCCGATAGTGTGATGGTCCTT-3' 5'-AAGGACCATCACACTATCCCCATCCTTCCAATCAACT-3' Glyl84—»Pro

47.F 47.R 5'-GACTTTACCCCAGTGrCCACCACAGAGCTTGG-3' 5'-CCAAGCTCTGTGGTGCjCACTGGGGTAAAGTC-3' Cys47—*Ser

Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1 %-ном агарозном геле, фрагменты нужной длины вырезали из геля, ДНК выделяли с помощью колонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Полученные фрагменты ДНК были обработаны рестриктазами Ndel и Xhol, для последующего клонирования.

Клонирование и экспрессия генов ргхб. Клонирование генов ргхб проводили в вектор pET-23b(+) («Novagen», США) по точкам рестрикции Ndel и Xhol. Таким образом, ген ргхб находится под контролем промотора Т7, а продукт трансляции на С-конце содержит шесть остатков гистидина (His-tag). Полученными плазмидами трансформировали клетки экспрессирующего штамма Escherichia coli - BL21(DE3) (Novagen, США) Ca2+ методом [Sambrook et al. 1987]. Экспрессию генов ргхб индуцировали добавлением ИПТГ (до конечной концентрации 1 мМ) в питательную среду при оптической плотности 0.6 о.е. (X = 600 нм) и продолжали культивирование еще в течение 4 ч., затем бактерии собирали центрифугированием (4000 об/мин, 20 мин) и замораживали осадок на -20°С.

Выделение и очистка рекомбинантного Ргхб. Осадок бактерий (из объема 500 мл) ресуспендировали в 8 мл буфера следующего состава: 12 мМ Трис-HCl рН 7.8, 10 мМ имидазола и разрушали ультразвуком при 4°С. Клеточный дебрис удаляли

центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин, надосадок наносили на колонку с №-МТА-агарозой (1пуйгс^еп, США). Колонку промывали 100 мл раствора: 12 мМ Трис-НС1 рН 7.8, 20 мМ имидазола, а для элюции использовали 5 мл буфера: 12 мМ Трис-НС1 рН 7.8, 250 мМ имидазола. Белок концентрировали с помощью мембранного концентратора У1УА8С1Е>)СЕ 10.000 М\¥СО (ЗшЮпиэ, Германия) и в нем же диализовали против 1хРВЗ (1.7 мМ КН2Р04, 5.2 мМ Ыа2НР04, 150мМ ЫаС1, рН 7.4). Чистота белка, по электрофорезу в полиакриламидном геле, составляла > 95%.

Антлоксидантная активность Ргхб. Способность Ргхб защищать плазмидную ДНК от активных форм кислорода (АФК), вызывающих однонитевые разрывы ДНК в условиях реакции Фентона, оценивали согласно [1_ип У.Э. й а1., 1993] с небольшими модификациями. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала: 1хРВЗ, 300 нг плазмидной ДНК (рВЬсэспр! II КЗ (+)), 3 мкМ ЕеСЬ, 2 мМ ДТТ и фермент в различной концентрации. Смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч. В качестве контроля использовали фосфорилированный БСА (Ргоп^а, США) в той же концентрации, что и Ргхб. Пробы анализировали с помощью электрофореза в 0.8%-ном агарозном геле.

Определение пероксидазной активности в отношении пероксида водорода и гидропероксида трет-бутила (ГПТБ). Пероксидазную активность Ргхб определяли по методу Канга [Kang БЛУ. е1 а1, 1998] с небольшими модификациями. В качестве отрицательного контроля использовали Ргхб человека с заменой остатка цистеина в активном центре на серин (Су8473ег). Реакционная смесь (150 мкл) содержала 1хРВ5, 2 мМ ДТТ, 100 мкМ пероксид водорода или 100 мкМ гидропероксид трет-бутила (ГПТБ) и фермент в различных концентрациях. Реакцию проводили в течение 10 мин при 37°С и останавливали, добавляя 50 мкл 0.6 М НС1. Затем добавляли 100 мкл 10 мМ Ре^ИО^О^ и 50 мкл 2.5 М КБСЫ, что приводило к образованию комплексного соединения железа красного цвета. Концентрация пероксида пропорциональна интенсивности окраски, которую измеряли при длине волны 492 нм.

Определение констант Михаэлиса (Км). Км рассчитывали по изменению скорости пероксидазной реакции в зависимости от концентрации субстрата. Реакцию проводили, по описанной выше методике, но при постоянной концентрации фермента и различных концентрациях субстрата, в течение 5 мин при 37°С. Рассчитывали скорость реакции в зависимости от концентрации субстрата. Значение, соответствующее 1/2 максимальной скорости (Ктах), принимали за Км.

Определение оптимума рН и температуры для пероксидазной активности Ргхб. Оптимум рН определяли по величине пероксидазной активности Ргхб при различных значениях рН в 50 мМ фосфатном (рН 4-7.5) и 50 мМ карбонатном буферах (рН 7-9).

Температурный оптимум определяли в lxPBS (рН 7.4) по величине пероксидазной активности фермента при разных температурах.

Определение фосфолипазной активности (iPLAi). В качестве субстрата использовали дипальмитоилфосфотидилхолин (Sigma, США). Липосомы готовили на ацетатном буфере (40 мМ CHjCOONa, рН 5.0, 10 мМ ЭДТА) методом экструзии через 100 нм поры мембраны Nuclepore (Whatman, Англия). Размер липосом, по данным светорассеяния, составлял 100 ± 20 нм. К 200 мкл суспензии липосом (10 мг/мл) добавляли 100 мкл раствора белка Ргхб (5 мг/мл). Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 часа. Затем проводили экстракцию липидов смесью метанол:хлороформ (1:2) объемом 1.2 мл. Центрифугированием разделяли фазы и отбирали (нижнюю) фазу хлороформа с липидами. Испаряли хлороформ с помощью вакуума при 40°С, высушенные липиды растворяли в 100 мкл смеси метанол", хлороформ (1:1) и 10 мкл брали для нанесения на селикагелевую пластину (Merck, Германия), для последующего проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ). Восходящую ТСХ проводили в камере с раствором хлороформ: метанол: вода (65:25:5 V/V). Затем пластину подсушивали и проводили окраску фосфолипидов молибденовым сипим по методу Васьковского (чувствительность реакции до 0.5 мкг фосфор содержащих липидов) [Vaskovsky V.E. et al., 1975]. Тест на липиды, содержащие свободные аминогруппы (дипальмитоилфосфотидилэтаноламин) проводили с помощью 0.25% раствора нингидрина в ацетоне.

Определение термостабильности Ргхб. Термостабильность Ргхб определяли по остаточной пероксидазной активности. Ргхб прогревали при различных температурах от 37 до 60°С в течение 30 мин, затем отбирали пробы, добавляли восстановитель - ДТТ (до конечной концентрации 2 мМ) и определяли активность в отношении ГПТБ при 37°С.

Исследование структуры Ргхб. Для исследования вторичной структуры ферментов использовали спектрополяриметр J815 CD (Jasco, Япония). Запись спектров КД проводили со скоростью 0.1нм/сек, в термостатируемой кварцевой кювете с длиной оптического пути 1мм. Концентрация белка составляла 0.1 мг/мл в 50мМ NaP^POi, рН 7.4, температура 25-37°С, Х= 180-250 нм. Третичную структуру белков исследовали с помощью ЯМР спектрометра AVANCE 600 (Bruker, Германия) с рабочей частотой для протонов 600 МГц. Число накоплений (сканов) п=128, спектральная ширина составляла 9000 Гц. Концентрация белка составляла 3 мг/мл в 50мМ NaH2P04, рН 7.4, D20 (Изотоп, Россия) ~ 10 % от объема.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение генов ргхб. Основные этапы получения генов ргхб (на примере ргхб крысы) представлены на рис.1. Гены ргхб клонировали в вектор рЕТ23Ь. Полученные плазмиды

секвенировали и в дальнейшей работе использовали только те конструкции, в которых последовательности генов точно совпадали с последовательностью в ОепВапк.

В

тотальная РНК

5 ООО bp

illlglljpjf

2000 bp

850 toâ

joo bp

200 bp

:

0.5 S 0.25 S

Рис.1. Основные этапы получения генно-инженерных конструкций, содержащих гены ргхб. (А) получение тотальной РНК —> (обратная транскрипция), (Б) ПЦР с кДНК и праймерами на ген ргхб —> (клонирование в рЕТ23Ь), (В) проверка конструкций с помощью рестрикции.

Экспрессия генов ргхб человека [Kim T.S. et al., 1997; Kinnula V.L. et al. 2002, 2004], крысы [Kim H.S. et al., 2001,2003; Wang X. et al. 2004; Nagy N. et al., 2005] и дрозофилы [Radyuk S.N. et al., 2001, 2003, 2009] ранее была изучена. Исследования экспрессии генов ргхб Xenopus laevis (ВС054278, ВС054309) не проводились. Далее в тексте гены ВС054278 и ВС054309 будут обозначаться как хenl и хеп2 (белки Xenl и Хеп2), соответственно. Для исследования изменения экспрессии генов ргхб во время развития шпорцевой лягушки, была получена кДНК (из одного и того же количества тотальной РНК) для разных стадий развития (от стадии оплодотворенной икры «0-5», до стадии прошедшей метаморфоз лягушки «63-64»), С полученной кДНК проводили ПЦР с праймерами на гены xenl и хеп2. Продукты амплификации отбирали на разных циклах ПЦР (20, 25, 30, 35 циклов) и анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. В качестве контроля проводили ПЦР с праймерами на ген цитосклетного актина (тип 5), экспрессия которого существенно не изменяется во время развития [Mohun T.J. et al., 1987]. Мы также не обнаружили существенного изменения уровня экспрессии этого гена, но уровень экспрессии генов ргхб значительно менялся (рис.2). Наблюдается значительное увеличение экспрессия гена хеп2 начиная со стадии «5», а ген xenl проявляется лишь на более поздних стадиях «4748», когда у головастика начинается активное дыхание и увеличение потребления кислорода, и как следствие этого - возрастание уровня АФК в клетках. Эти результаты коррелирует с

данными Риццо А.М. и др. [Rizzo A.M. et al., 2007], которые обнаружили, что у X. laevis

-7-

уровень экспрессии некоторых антиокислительных ферментов (супероксид-дисмутаза, каталаза, глутатионтрансфераза и глутатионредуктаза) значительно увеличивается в связи с началом активного дыхания.

А 0-5 10-14 33-34 42-43 47-48 63-64

Б 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35 20 25 30 35

* * * * ъ

В : ~ ~ :::ЩЦ! — — ШЯ ШК ~~

г — — ~ ___ —

С 28S®| 28S|| 28S§|§ 28SB

C 18Sjj lssjp l8sj| 18sB I8S|Ji

28S 1 ss

Рис.2. Экспрессия генов ргхб Xenopus laevis на разных стадиях развития. А - стадии развития Xenopus laevis (по Nieuwkoop and Faber, 1956); Б - циклы ПЦР; В - ПЦР продукты гена хenl; Г - ПЦР продукты гена хеп2\ Д - ПЦР продукты гена цитоскелетного актина; Е -тотальная РНК (отмечены полосы рибосомальных РНК); (*) - маркер молекулярных весов (850 и 400 п.н.).

Данные по экспрессии генов ргхб в различных органах взрослой лягушки представлены на рис.3, указывают, что ген хеп2 является наиболее активной изоформой ргхб, т.к. экспрессия этого гена обнаруживается во всех исследованных органах; напротив активность гена xenl обнаружена только в сердце, причем уровень его экспрессии сравнительно низкий. Необходимо отметить, что ген хеп2 кодирует белок обладающий фосфолипазной активностью (iPLA2), в то время как белок гена xenl, не обладает этой активностью (см.ниже).

А мозг печепь легкие сердце яичники

30

_________ _____ __ ____________ 35

•мр» = 30

Щ4ЦЩ0 шшмр чляш* шири*'' шшшщ 35

ш

-28s

Б

В

Рис.3. Экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки Хепорш ¡аеу1я. А -органы, из которых получали кДНК; Б - ПЦР продукты гена хеп1, В - ПЦР продукты гена хеп2; Г - тотальная РНК (отмечены полосы рибосомальных РНК).

Ранее для генов ргхб человека, крысы и дрозофилы была показана индукция под действием АФК. Нами было показано, что индукция гена хеп2 вызывается действием Н2О2 (рис.4). Для этого проводили инкубацию оплодотворенной икры Хепорш 1аЫз в фосфатном буфере (рН 7.4) с Н2О2 (ЮмМ) при 22°С в течение 2 часов. Параллельно проводили контроль с икрой в фосфатном буфере без Н2О2. Затем икру собирали, выделяли РНК и проводили обратную транскрипцию, ПЦР как было описано выше.

1 2 850 ьр 30 35 30 35

д

^ЩЬр ..... .........:

^ ^ ллл I- ^и^вкицш^ нимярям^ ^яврмщр^ щтщшишш

Рис.4. Индукция экспрессии гена хеп2. 1- без добавления Н2О2, 2 - после добавления Н2О2. А - ПЦР продукты гена хеп2, Б - ПЦР продукты гена актина. 30 и 35 - циклы ПЦР.

Получение ферментов Ргхб и сравнение их физике — химических свойств. Методы выделения, очистки и определения активности Ргхб в различных лабораториях несколько различаются, поэтому полученные в них результаты трудно сопоставить, а для некоторых Ргхб (для Ргхб Хепорм 1аеу1з) такие данные вообще отсутствуют. В настоящей работе выделение и очистку Ргхб проводили в одинаковых условиях (рис.5), определение активности ферментов проводили одним и тем же методом, с использованием одних и тех же реактивов, что делает возможным их сравнение.

А Б

. 1.. 2 - } 2 3: 4 5

1 §й§: |й§

ц§ -

II

III |||1||

Ш

Рис.5. Общая процедура получения Ргхб. А - индукция экспрессии Ргхб человека в клетках Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ): 1 - до индукции, 2 - после индукции ИПТГ (1мМ); Б - очистка Ргхб человека на N1 - №ГА агарозе: 1- бактериальный лизат, нанесенный на колонку с № -ЭТА - агарозой; 2 - водонерастворимая фракция лизата; 3- несвязавшаяся со смолой часть лизата; 4,5 - элюция Ргхб (чистота белка > 95%).

Антиоксидантную активность Ргхб определяли по защите илазмидиой ДНК от повреждения продуктами реакции Фентона. Защитный эффект Ргхб проявлялся в сохранении нативной - суперскрученной формы плазмидной ДНК, в присутствии АФК - генерирующей системы: ЗмкМ РеСЬ + 2мМ ДТТ + О2. На рис.6 приведен пример с Ргхб человека. Для сравнения антиоксидантных свойств различных Ргхб определяли концентрацию ферментов, при которой 50% плазмиды сохраняется в суперскрученной форме. Были получены следующие значения: 0.16 мг/мл для Ргхб человека; 0.15 мг/мл - для фермента крысы; 0.300.35 мг/мл - для ферментов Ргхб шпорцевой лягушки; 0.05 и 0.15 мг/мл для ОРх2540 и БРх6005 соответственно.

6

ц ¡¡¡л ■

«аймг Ы> № «и» ..'

Р . ^^^^^ ^^^^^^ ^

^ЩРЧР ЩЯННР ЩЦ^Яш ЩЯШКШ ^ИИИР щшттт -*-ШЯЩШ ........... ^^^ ШР

Рис.6. Защита плазмидной ДНК от АФК человеческим Ргхб. Р - релаксированная, Н -нативная (суперскрученная) форма плазмидной ДНК. (1) - исходная плазмида (П) в фосфатном буфере; (2) - П + ЗмкМ РеСЬ + 2мМ ДТТ; (3) - П + ЗмкМ РеСЬ + 2мМ ДТТ + 0.7 мг/мл БСА; П + ЗмкМ РеСЬ + 2мМ ДТТ + 0.08 мг/млРгхб (4), +0,16 мг/мл млРгхб (5), +0,32 мг/мл млРгхб (6).

Пероксидазная активность Ргхб. Результаты сравнения пероксидазной активности различных Ргхб представлены на рис.7, из которых видно, что ферменты довольно сильно отличаются по активности в отношении разных субстратов. Так, Ргхб шпорцевой лягушки, человека и дрозофилы (ОРх2540) примерно в 2 раза активнее по отношению к Н2О2, чем к ГПТБ. Напротив, Ргхб дрозофилы (БРх6005) и крысы проявляют большую активность к ГПТБ, чем к Н2О2. Дрозофила и шпорцевая лягушка, в отличие от человека и крысы, имеют два Ргхб. У дрозофилы - ЭРх2540 и ЭРх6005, причем один из них - ЭРх2540, эффективно синтезируется только в эмбрионах [11а<1уик в-К е1 а1., 2001]. Такая разница в активности ВРх2540 и ОРх6005 в отношении Н2О2 возможно связана с физиологическими особенностями дрозофилы на разных стадиях развития. У шпорцевой лягушки оба фермента Ргхб практически не отличаются по активности как к Н202 так и к ГПТБ.

0,3 0,4 0,5 Ргхб (мг/мл)

Рис.7. Активность Ргхб по отношению к Н2О2 и гидропероксиду трет-бутша: (1) -человека (дикий тип), (2) - человека (мутант Су547Бсг), (3) - крысы, (4) - шпорцевой лягушки Хеп1, (5) - шпорцевой лягушки Хеп2, (6) - дрозофилы ОРх2540, (7) - дрозофилы ОРх6005.

Субстратная специфичность Ргхб. Кажущиеся значения констант Михаэлиса (Км) для различных Ргхб в отношении перекисей двух типов (неорганической - Н2О2 и органической - ГПТБ) приведены в таблице 3, из которой видно, что наиболее активный фермент -ЭРх2540 имеет более высокие значения Км (по сравнению с другими ферментами), а следовательно обладает наименьшей субстратной специфичностью (меньшим сродством к субстратам). Также, необходимо отметить, что при определении Км для всех ферментов наблюдалась сигмоидальная кинетическая кривая, что может свидетельствовать об кооперативных процессах в ходе реакции.

- И -

Таблица 3. Кажущиеся значения Км (мкМ) различных Ргхб.

человек Крыса лягушка Хеп1 лягушка Хсп2 дрозофила ОРх6005 дрозофила ОРх2540

Н202 125 145 145 95 140 185

ТБГП 100 100 130 130 165 180

Оптимум рН и температуры для пероксидазной активности. Оптимум рН для всех изученных ферментов находится в пределах 6-7 (рис.8), что является характерным для многих цитозольных и секретируемых белков.

рН

Рис.8. Зависимость пероксидазной активности Ргхб от рН: (1) - человека, (2) - крысы, (3) - шпорцевой лягушки Хеп1, (4) - шпорцевой лягушки Хеп2, (5) - дрозофилы БРх2540, (6) -дрозофилы ОРх6005.

Неожиданными оказались результаты определения зависимости активности Ргхб от температуры. Температурный оптимум для всех Ргхб близок к 37°С, при этом ОРх6005, Ргхб крысы и Ргхб шпорцевой лягушки (Хеп1 и Хеп2) сохраняют не менее 50% активности в более широком интервале температур (10-50°С), чем ферменты ОРх2540 и Ргхб человека (25-45°С) (рис.9). Для человека это вполне объяснимо - развитие эмбриона и последующая жизнь человека происходит при температуре близкой к 37°С. Медленное снижение активности Ргхб шпорцевой лягушки и крысы при понижении температуры может отражать особенности развития и жизни этих животных. Шпорцевая лягушка относится к холоднокровным животным, она может жить при температуре много ниже 37°С. Известно, что при определенных условиях (гипоксия, гиперкапния) крысы способны переносить

существенное понижение температуры тела и, следовательно, должны иметь антиоксидантную систему, достаточно активную и при пониженных температурах [В1адо]еую О.Р. и а1., 2007]. Взрослые особи дрозофилы способны нормально жить в широком интервале температур и, возможно, поэтому РРх6005 (ген которого активно экспрессируется у взрослых особей) сохраняет достаточную активность и при пониженных температурах. Напротив, эффективное развитие эмбрионов дрозофилы происходит в узком интервале температур: не ниже 20°С и не выше 37°С, при которых достаточно высокой активностью обладает БРх2540 (ген которого экспрессируется только у эмбрионов) [Яаёуик Э-И. й а1., 2001]. Таким образом, температурная зависимость активности Ргхб, вероятно, отражает особенности физиологии организма.

100 90 80

^ 70

е бо

о

§ 50

0

1 40

^ 30 20 10 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Температура

Рис.9. Зависимость пероксидазной активности Ргхб от температуры: (1) - человека, (2) -крысы, (3) - шпорцевой лягушки Хеп1, (4) - шпорцевой лягушки Хеп2, (5) - дрозофилы ЭРх2540), (6) - дрозофилы ОРх6005.

Фосфолипазная активность (¡Р1А2). Ргхб - бифункциональный фермент, обладающий пероксидазной [Кагщ ХУ.Э. а а1., 1998] и Са2+ независимой фосфолипазной активностью (¡РЬА2) [Ют Т.Э. й а1., 1997, 1998]. Известно, что пероксидазный активный центр Ргхб расположен в кармане глобулы и сформирован триадой аминокислот: НЮЭ, Сух47 и А^132, а фосфолипазный активный центр находится на поверхности молекулы и включает в себя: №26, 5сг32 и Азр140 (рис.10).

His26' Ser32

Рис.10. Каталитаческие центры Ргхб. Пероксидазный центр: His39, Cys47, Argl32. Фосфолипазный центр: His26, Ser32, Aspl40.

Из сравнения последовательности аминокислот белков БРх2540 и ОРх6005, и соответственно Хеп1 и Хеп2 видно, что у всех белков имеется нормальный центр пероксидазной активности, однако в центре фосфолипазной активности у белков Хеп1 и БРх6005 имеются замены аминокислот (рис.11). Таким образом, теоретически белки Хеп1 и ОРх6005 не должны иметь фосфолипазной активности, что и было подтверждено нами экспериментально (рис.12).

10 3)

DPI6005 1 M50KAl.ll I|DOFHI|E] DM540 1.....UHlorviMElc:

i .-I»!. "li ' oiv NSliiii i С10 I P

100 110 1201 130

DPjiOOj M J$Iii?TT*lil|Eniu K1 OS NAtilPli DPx2SW ti eoIi>LuiunlcU. k* E kopevok!

200

ro

DM05 DPx2S40i«e

ETIELi DKVSUi

¡POP

Sony

mj

iiHi.il I sP0H|vlBjflli.i5Mlivliiii^ pItI'.'Ii

*

t

10 20 ¡j. 3<^ t « , 50 SO 70 eo 80

Xenl 1 ршЩе рПоШгпШШ^ЕШО pfmiMHwi^iKHitftUrif№№iuu^f»ivtHiM№MTii»№i Xen2 ipiuviiuiiiiu гайашшшяимшн^

100 ^ 110 120 i 130 1« 150 130 170 180

Xen. , ^шшхвшиишшшишмшнишм

200 210 220

Рис.11. Выравнивание DPx2540 и DPx6005, Xenl и Xen2 (ClustalW). Темным цветом выделены идентичные аминокислотные остатки. Аминокислоты, образующие активный центр iPLA2 обозначены (*); пероксидазный активный центр обозначен точками. Стрелками указаны замены в фосфолипазном активном центре.

- 14-

(I)

(II)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

В Ф ц. ф

Рис.12. Фосфолипазная активность различных Ргхб. А - дипальмитоилфосфотидилхолин, Б - монопальмитоилфосфотидилхолин (лизофосфотидилхолин), В - дипальмитоилфосфо-тидилэтаноламин; (I) - ТСХ фосфолипидов после инкубации в течение 1 часа при pH 5.0 с Ргхб: (1) - человека, (2) - шпорцевой лягушки Xenl, (3) - шпорцевой лягушки Хеп2, (4) -дрозофилы DPx2540, (5) дрозофилы - DPx6005, (6) - отрицательный контроль - липосомы без Ргхб. (II) - ТСХ экстрактов из белка Xen2: (1) - 500 мкг (в таком количестве брали белок для определения iPLA2), (2) - 1мг, (3) - 2 мг, (4) - Змг.

Появление лизофосфотидилхолина («Б» на рис.12), образующегося в результате отщепляется пальмитоила во 2-м положении триглицерида, свидетельствует об активности iPLA2 ферментов Ргхб человека, шпорцевой лягушки Хеп2 и дрозофилы DPx2540. Ферменты Xenl и DPx6005 не обладают активностью iPLA2.

Интересно отметить, что для Ргхб человека, DPx2540 и Хеп2 помимо активности iPLA2 была обнаружена ранее неизвестная активность (предположительно - деметилазная), в результате которой дипальмитоилфосфотидилхолин (DPPC - «А» на рис.12) переводится в дипальмитоил-фосфотидилэтаноламин (DPPE - «В» на рис.12), что может быть результатом отщепления трех метальных групп от молекулы холина. В качестве контроля проводили экстракцию метанол:хлороформом (1:2) из различного количества Ргхб, с целью проверки -не является ли новая активность лишь результатом связывания Ргхб с бактериальным DPPE во время синтеза в E.coli. Как видно из рис Л 2 (II) напротив маркера DPPE нет пятен из экстрактов белка Ргхб Хеп2, что свидетельствует о появлении DPPE в ходе реакции, катализируемой Ргхб. Таким образом, по-видимому, для Ргхб найдена новая, ранее не изученная активность. Однако роль этой активности пока неясна и требует дальнейших исследований.

Термостабильность Ргхб. Важная характеристика фермента - его термостабильность. Из рис.13 видно, что ферменты довольно сильно различаются по термостабильности, наибольшей обладают йРх6005 и Ргхб крысы, наименьшей - ОРх2540. В целом, полученные результаты подтверждают существующее мнение об обратной корреляции между термостабильностью и активностью фермента, что особенно хорошо видно при сравнении ферментов дрозофилы: ОРх2540 и ОРх6005.

30 60 90 120 150 180 210 240 Время (мин)

38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 Температура

Рис.13. Темостабильность Ргхб. А - изменение активности ферментов в зависимости от времени инкубации при 50°С. Б - остаточная активность Ргхб, после инкубации в течение 30 минут при разных температурах (37 - 70 °С). Ргхб: (1) - человека; (2) - крысы; (3) -шпорцевой лягушки Хеп1; (4) - шпорцевой лягушки Хеп2; (5) - дрозофилы БРх2540; (6) -дрозофилы ОРх6005.

Взаимосвязь между активностью и термостабильностью ферментов является предметом многочисленных исследований. Хотя точных закономерностей до сих пор не установлено, принято считать, что нерегулярные участки вторичной структуры (не входящие в состав а-спиралей и p-структур), способствуют большей гибкости полипептидной цепи, что может привести к повышению активности фермента, но при этом может сделать белок менее стабильным [Arnold F. et al., 2001; Shakhnovich E., 2005].

Структура Ргхб. Для понимания функции белка, необходимы данные о его структуре, поэтому, чтобы попытаться понять, за счет чего изучаемые Ргхб так сильно отличаются по активности и термостабильности, мы провели структурный анализ белков методами КД и ЯМР.

Из спектров КД (рис.14) видно, что исследуемые Ргхб очень близки по вторичной структуре, что также было показано теоретически с помощью программы APSSP2 (http://www.imtech.res.in/raghava/apssp2A). В таблице 4 суммированы данные о вторичной структуре различных Ргхб, полученные теоретически с помощью программы APSSP2 (точность предсказания >80%) и экспериментально из спектров КД с помощью программы CDPro, CONTINLL (RMSD = 0.063). Для Ргхб человека приведены значения процентного содержания а-спиралей и Р-струкгур, полученные на основе рентгеноструктурного анализа [Choi H.J. et al., 1998].

15000

"7 12000

•а

1 9000

ч

6000

U

g 3000

е-

*Г 0

as

2 -зооо

® -6000

-9000

190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 X, нм

Рис.14. Спектры кругового дихроизма Ргхб: (1) - человека, (2) - крысы, (3) - шпорцевой лягушки Xenl, (4) - шпорцевой лягушки Хеп2, (5) - дрозофилы DPx2540, (6) - дрозофилы DPx6005.

Таблица 4. Вторичная структура различных Ргхб: предсказанная по аминокислотной

последовательности с помощью APSSP2 и предсказанная CDPro из спектров КД.

а-спираль В-структура Нерегулярные участки

Ргхб (%) (%) (%)

APSSP2 CDPro APSSP2 CDPro APSSP2 CDPro

человек* 29 (29.5) 26,2 17 (16.0 22,9 54 (54.4) 51

Крыса 27 27,2 21 23,2 52 49,6

Xenl 28 26,5 19 24,1 53 49,4

Хеп2 28 27,5 19 22,5 53 50

DPx6005 32 27,8 18 22,9 50 49,3

DPx2540 30 29,9 13 16 57 54,1

Из данных по КД и предсказаниям АР85Р2 (которые достаточно хорошо коррелируют) видно, что все исследуемые Ргхб очень близки по вторичной структуре, несмотря на значительные отличия в аминокислотной последовательности (таблица 5).

Таблица 5. Гомология аминокислотных последовательностей Ргхб.

крыса Лягушка Xenl лягушка Хеп2 Дрозофила DPx6005 дрозофила DPx2540

Идентичность с Ргхб человека (%) 91,5 80,4 79 60 53,7

Консервативность вторичной структуры может свидетельствовать о сходстве исследуемых Ргхб и по третичной структуре. На сегодняшний день трехмерная структура Ргхб известна лишь для человека [PDB code: lPrx; Choi H.J. et al., 1998]. Получение кристалла белков и последующий рентгеноструктурный анализ является долгим и трудоемким процессом, поэтому для исследования третичной структуры (также как с исследованием вторичной структурой) применили два подхода:

1) предсказание 3-й структуры с помощью доступных в сети интернет программ:

SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasv.orgA)

EsyPred3D (http://www.fandp.ac.be/sciencesfoiolopie/urbnVbioinfo/esvpred/)

2) исследование структуры Ргхб с помощью ЯМР.

Из предсказаний, полученных с помощью программ SWISS-MODEL и EsyPred3D, можно заключить, что все Ргхб имеют общую топологию пространственной структуры -тиоредоксиновую укладку, что неудивительно, так как эта укладка является специфичной для всех пероксиредоксинов Prxl - б [Copley S.D. et al., 2004]. Из данных ЯМР также следует, что все исследуемые Ргхб имеют очень близкую укладку, так как спектры в

«высоких полях», отражающие взаимодействия внутри гидрофобного ядра белковой

А Б

Рис.15. А - общий 'Н-ЯМР спектр Ргхб человека, Б - 'Н-ЯМР спектры некоторых Ргхб в области высоких полей.

Из данных по структуре можно заключить, что все исследуемые Ргхб довольно консервативны как по вторичной, так и по третичной структуре. Значительные отличия по термостабильности и активности различных Ргхб, возможно, связаны с большей или меньшей подвижностью в неструктурированных участках белков, на которые приходится большая часть отличий в аминокислотной последовательности между гомологами. С целью проверки данного предположения и повышения термостабильности, был проведен сайт -направленный мутагенез в неструктурированных участках Ргхб человека ((3 - изгибы, петли) с заменой остатков глицина (21, 30, 115, 184) на пролин, основываясь на так называемом «пролиновом правиле» [Watanabe К. ct al., 1996]. Известно, что остаток глицина практически не оказывает пространственных ограничений при вращении соседних пептидных связей относительно С" атома глицина, напротив остаток пролина создает сильные ограничения. Таким образом, уменьшив гибкость полипептидной цепи в неструктурированных участках, ожидалось увеличение термостабильности Ргхб человека, однако, замены Gly на Pro в

положениях 21, 184 не оказали существенного влияния на термостабильность и активность Ргхб человека; напротив замены 01у в положении 30 и 115 дестабилизировали структуру -фермент при синтезе полностью переходил в водонерастворимую фракцию (образуя тельца включений в экспрессирующих бактериях, что нехарактерно для белка дикого типа) и после очистки в денатурирующих условиях не обладали пероксидазной активностью. По -видимому, в этом случае, данный метод повышения термостабильности Ргхб не подходит и необходимо искать иные пути стабилизации структуры.

Одним из возможных путей решения проблемы термостабильности Ргхб является подбор условий хранения белка. Например, лиофильно высушенный фермент способен переносить (не теряя активности) значительно более высокие температуры, чем в растворе. Так оказалось, что Ргхб человека хорошо переносит лиофилизацию, при этом, после растворения сухого белка в исходном фосфатном буфере, не наблюдалось изменений в структуре (по данным ЯМР) и активности фермента (рис.16). Эти данные могут найти применение при создании лекарственного препарата на основе Ргхб.

'Н-ЯМР спектры Ргхб человека

Пероксидазная активность

Рис.16. Влияние лиофилизации на структуру и активность Ргхб человека. (А) - до лиофильной сушки и (Б) - после. (1) - активность по отношению к Н2О2, (2) - активность по отношению к гидропероксиду трет-бутша.

выводы

1) В одних экспериментальных условиях проведено сравнительное исследование физико-химических свойств пероксиредоксинов 6 из различных источников. По активности в отношении пероксида водорода ферменты располагаются в следующей последовательности: ОРх2540>человек>Хеп1=Хсп2>крыса>ОРх6005, в отношении гидропероксида трет-бутила: ОРх2540=ОРх6005>крыса>Хеп1=Хеп2>человек и по защите от продуктов реакции Фентона: ОРх2540>ОРх6005=крыса=человек >Хеп1 =Хеп2.

2) Все изученные ферменты имеют температурный оптимум 37°С, при этом ОРх6005, Ргхб крысы, Хеп1 и Хсп2 сохраняют не менее 50% активности в более широком интервале температур (10-50°С), чем ферменты БРх2540 и Ргхб человека (25-45°С).

3) По термостабильности ферменты располагаются в последовательности: ОРх6005>крыса>человек>Хеп1=Хсп2>ОРх2540. Наблюдается обратная корреляция между активностью и термостабильностью изученных ферментов.

4) Методами кругового дихроизма и ЯМР показано, что все изученные Ргхб довольно близки как по вторичной, так и по третичной структуре.

5) Впервые получены гены и белки Ргхб шпорцевой лягушки Хепорив 1аеу15. Изучена динамика экспрессии двух генов ргхб в ходе развития головастика, а также экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки. Установлено, что ген хеп1 экспрессируется на более поздних стадиях развития (47-48) головастика, а во взрослой лягушке активность этого гена обнаружена только в сердце. Ген хеп2 активно экспрессируется с самых ранних стадий развития (5-10), а также активно транскрибируется во всех исследованных органах лягушки. Для гена хеп2 на ранних стадиях развития показана индукция пероксидом водорода.

6) Помимо активности фосфолипазы А2, для Ргхб человека, дрозофилы ОРх2540 и шпорцевой лягушки Хеп2 обнаружена ранее неизвестная деметилазная активность.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1) Шарапов М.Г., Новоселов В.И., Равин В.К. Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения.// Молекулярная биология, 2009, том 43, № 3, с. 505-511.

2) Шарапов М.Г., Равин В.К. Пероксиредоксин 6 шпорцевой лягушки Xenopus laevis: клонирование кДНК, характеристика фермента и экспрессия гена во время развития. // Биохимия, 2009, том 74, № 8, с. 1103-1108.

Тезисы докладов

1) Шарапов М.Г.. Равин В.К., Новоселов В.И. Анализ стабильности пероксиредоксина 6 из различных источников.// XV международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф. 2007 г. с. 438-440.

2) Шарапов М.Г.. Мубаракшина Э.К., Новоселов В.И. Перспективы использования модифицированных пероксиредоксинов при лечении патологий, связанных с окислительным стрессом.// Четвертая крымская конференция «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». Крым. 2008 г. с. 38.

3) Мубаракшина Э.К., Шарапов М.Г.. Янин В.А., Новоселов В.И. Создание нового класса лекарственных препаратов антиоксидантного действия на основе пероксиредоксинов для лечения социально значимых заболеваний.// Четвертый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2008 г. с. 206-207.

4) Шарапов М.Г.. Равин В.К. Перспективы использования различных гомологов пероксиредоксина 6 при лечении патологий, вызванных окислительным стрессом.// Всероссийская конференция молодых ученых и III школа «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты " им. академика ИМ. Эммануэля. Москва. 2008 г. с. 285-287.

5) Шарапов М.Г.. Равин В.К. Сравнение активности и стабильности гомологов пероксиредоксина 6.//12-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2008 г. с. 62-63.

6) Шарапов М.Г.. Симонова Т.Н., Шуваева Т.М., Равин В.К. Исследование гомологов пероксиредоксина 6 в качестве потенциального лекарственного препарата. // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань. 2009 г. с. 281.

7) Шарапов М.Г.. Софин А.Д., Ковалевская М.А., Вердинцев Н.В., Новоселов В.И. Антиоксидантные системы глаза.// Пятый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2009 г. с. 244.

Подписано в печать 02.09.2009 г.

Заказ №2419 Тираж: 90 экз.

Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шарапов, Марс Галиевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.АФ К.

1.1 .Источники возникновения АФК.

I.2. Последствия действия АФК.

2. Антиоксиданты.

2.1. Супероксиддисмутазы (БСЮ).

2.2. Каталаза.

2.3. Глутатионпероксидазы (ОРх).

2.4. Пероксиредоксины (Ргх).

2.4.1. Открытие пероксиредоксинов. Эволюция Ргх и их классификация.

2.4.2. Каталитический цикл Ргх.

2.4.3. Структура Ргх.

2.4.4. Регуляции активности Ргх.

2.4.5. Ргх из различных организмов.

Ргх прокариот.

Ргх архебактерий.

Ргх эукариот.

2.4.6. Ргх человека.

Ргх1.

Ргх2.

РгхЗ.

Ргх4.

Ргх5.

Ргхб.

2.4.7.Возможное применение Ргх в медицине.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Выделение РНК.

2.2. Определение чистоты и концентрации нуклеиновых кислот.

2.3. ОТПЦР.

2.4. Мутагенез Ргхб человека.

2.5. Электрофорез ДНК.

2.6. Сравнение уровня экспрессииргхбХ. laevis на разных стадиях развития.

2.7. Клонирование и экспрессия генов ргхб.

2.8. Выделение и очистка белков Ргхб.

2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.10. Иммунноблоттинг.

2.11. Определение активности SOD слитой конструкции Mn-SOD-Ргхб.

2.12. Определение антиоксидантной активности.

2.13. Определение пероксидазной активности.

2.14. Определение констант Михаэлиса.

2.15. Определение оптимума рН и температуры.

2.16. Определение фосфолипазной активности.

2.17. Определение термостабильности.

2.18. Исследов ание структуры Ргхб.

2.19. In silico методы.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение генов ргхб.

2. Экспрессия генов ргхб.

3. Получение ферментов Ргхб.

4. Антиоксидантная активность Ргхб.

5. Пероксидазная активность Ргхб.

6. Субстратная специфичность Ргхб.

7. Оптимум рН и температуры пероксидазной реакции.

8. Фосфолипазная активность Ргхб.

9. Термостабильность Ргхб.

10. Структура Ргхб.

11. Перспективы применения Ргхб в медицине.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов 6 различного происхождения"

Актуальность проблемы

Пероксиредоксины (Ргх, КФ 1.11.1.15) - сравнительно недавно открытое семейство селен-независимых пероксидаз. Ргх осуществляют ферментативную деградацию Н2О2, органических гидропероксидов и пероксинитрита [Hofmann В. et al., 2002; Flohe L. et al., 2007]. Пероксиредоксины - широко представленная группа ферментов обнаруженная как в про - так и в эукариотических организмах. У млекопитающих известно шесть типов пероксиредоксинов. По числу активных остатков цистеина (Cys) в каталитическом центре и механизму ферментативной реакции, Ргх млекопитающих подразделяют на типичные 2-Cys (Prxl-4), атипичные 2-Cys (Ргх5) и 1-Cys (Ргхб). Особый интерес представляет Ргхб, который в отличие от других Ргх, восстанавливает гидроперекиси фосфолипидов и обладает активностью фосфолипазы А2 [Kim T.S. et al., 1997, 1998], функция которой на сегодняшний день недостаточно изучена.

Ргхб в большей степени представлен в эпителиальных тканях. Так, Ргхб является основной пероксидазой эпителия верхних дыхательных путей и легких крысы и, по-видимому, играет наиболее важную роль в антиоксидантной защите этих органов [Новоселов В.И. и др. 1999, 2003]. Важная аптиоксидантная функция Ргхб была продемонстрирована в работах с нокаутом гена ргхб мыши. Нокаутные по гену ргхб мыши, характеризовались снижением выживаемости, высоким уровнем окисления белков и значительными повреждениями многих органов, несмотря на нормальный уровень экспрессии генов других антиоксидантных ферментов таких, как каталаза, глутатионпероксидаза и супероксид дисмутаза [Wang X. et al., 2003].

В ряде работ показана защитная роль Ргхб при различных патологиях: кожи [Kumin A. et al., 2006], легких [Kinnula V.L. et al., 2004; Lehtonen S.T. et al. 2004; Fisher A.B. et al., 2005], глаз [Kubo E. Et al., 2008] и нервной системы [Power J. et al., 2008]. Терапевтическая активность Ргхб была продемонстрирована при лечении ран у крыс, после механических и термических травм кожи, а также после химических ожогов верхних дыхательных путей [Новоселов В.И. и др. 2000, 2003].

Таким образом, Ргхб представляет большой интерес исследователей в качестве потенциального лекарственного препарата антиоксидантного действия, который может найти применение в терапии заболеваний, патогенез которых связан с окислительным стрессом.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Активные формы кислорода

Молекулярный кислород — неотъемлемый компонент жизни аэробных организмов. Однако в результате клеточного дыхания и некоторых других реакций, в качестве побочных продуктов образуются активные формы кислорода (АФК), которые повреждают важнейшие биологические макромолекулы (нуклеиновые кислоты, белки, липиды и углеводы) и тем самым являются причиной различных патологий.

АФК можно разделить на несколько больших групп: радикалы кислорода, радикало-образующие молекулы и ионы, радикалы антиоксидантов и др. [КоЬеп И., Ыуэка А., 2002] (табл.1).

Таблица 1. Основные АФК и их предшественники в биологических системах.

Вид Название Формула

Радикалы кислорода Супероксидный радикал Оз

Гидроксильный радикал он'

Пергидроксильный радикал ноо*

Алкоксильный радикал яо*

Пероксильный радикал ШЭО"

Оксид азота N0"

Радикалоообразующие Перекись водорода Н202 молекулы и ионы

Синглетный кислород '02

Гипохлорит НОС1

Пероксинитрит ОЖЮ"

Озон Оз

Гидро(липо-)перекиси 1ЮОН, шон

Радикалы антиоксидантов Убихинона, токоферола, аскорбиновой кислоты и др. 1п\ 1пО*2

Другие радикалы Тиильные, оксисерные Яв', ЯБО'

Производные пероксинитрита, радикалы N00*, гемопротеинов, аминокислот и др. Ш2+

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шарапов, Марс Галиевич

выводы

1) В одних экспериментальных условиях проведено сравнительное исследование физико-химических свойств пероксиредоксинов б из различных источников. По активности в отношении пероксида водорода ферменты располагаются в следующей последовательности: DPx2540 > человек > Xenl = Хеп2 > крыса > DPx6005, в отношении гидропероксида mpem-бутила: DPx2540 = DPx6005 > крыса > Xenl = Xen2 > человек и по защите от продуктов реакции Фенгона: DPx2540 > DPx6005 = крыса = человек > Xenl = Хеп2.

2) Все изученные ферменты имеют температурный оптимум 37°С, при этом DPx6005, Ргхб крысы, Xenl и Хеп2 сохраняют пе менее 50% активности в более широком интервале температур (10-50°С), чем ферменты DPx2540 и Ргхб человека (25-45°С).

3) По термостабильности ферменты располагаются в последовательности: DPx6005 > крыса > человек > Xenl = Xen2 > DPx2540. Наблюдается обратная корреляция между активностью и термостабильностью изученных ферментов.

4) Методами КД и ЯМР показано, что все изученные Ргхб довольно близки как по вторичной, так и по третичной структуре. По-видимому, значительные отличия по активности и термостабильности между изученными Ргхб связаны с нерегулярными участками структуры белка.

5) Впервые получены гены и белки Ргхб шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Изучена динамика экспрессии двух генов ргхб в ходе развития головастика, а также экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки. Установлено, что ген xenl экспрессируется на более поздних стадиях развития (47-48) головастика, а во взрослой лягушке активность этого гена обнаружена только в сердце. Ген хеп2 активно экспрессируется с самых ранних стадий развития (5-10), а также активно транскрибируется во всех исследованных органах лягушки. Для гена хеп2 на ранних стадиях развития показана индукция пероксидом водорода.

6) Помимо активности фосфолипазы А2, для Ргхб человека, дрозофилы DPx2540 и шпорцевой лягушки Хеп2, по-видимому, обнаружена ранее неизвестная активность, предположительно - деметилазная.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1) Шарапов М.Г., Новоселов В.И., Равин В.К. Клонирование, экспрессия и сравнительный анализ пероксиредоксинов б различного происхождения.// Молекулярная биология, 2009, том 43, № 3, с. 505-511.

2) Шарапов М.Г., Равин В.К. Пероксиредоксин б шпорцевой лягушки Xenopus laevis: клонирование кДНК, характеристика фермента и экспрессия гена во время развития. // Биохимия, 2009, том 74, № 8, с. 1103-1108.

Тезисы докладов

1) Шарапов М.Г., Равин В.К., Новоселов В.И. Анализ стабильности пероксиредоксина б из различных источников.// XV международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф. 2007 г. с. 438-440.

2) Шарапов М.Г., Мубаракшина Э.К., Новоселов В.И. Перспективы использования модифицированных пероксиредоксинов при лечении патологий, связанных с окислительным стрессом.// Четвертая крымская конференция «Окислительный стресс и свободнорадикалъные патологии». Крым. 2008 г. с. 38.

3) Мубаракшина Э.К., Шарапов М.Г., Янин В.А., Новоселов В.И. Создание нового класса лекарственных препаратов антиоксидантного действия на основе пероксиредоксинов для лечения социально значимых заболеваний.// Четвертый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2008 г. с. 206-207.

4) Шарапов М.Г., Равин В.К. Перспективы использования различных гомологов пероксиредоксина б при лечении патологий, вызванных окислительным стрессом.// Всероссийская конференция молодых ученых и III школа «Окисление, окислительный стресс и антиоксид анты" им. академика Н.М. Эммануэля. Москва. 2008 г. с. 285-287.

5) Шарапов М.Г., Равин В.К. Сравнение активности и стабильности гомологов пероксиредоксина 6.//12-Я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наукаXXIвека». Пущино. 2008 г. с. 62-63.

6) Шарапов М.Г., Симонова Т.Н., Шуваева Т.М., Равин В.К. Исследование гомологов пероксиредоксина 6 в качестве потенциального лекарственного препарата. // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань. 2009 г. с. 281.

7) Шарапов М.Г. Софин А.Д., Ковалевская М.А., Вердинцев Н.В., Новоселов В.И. Антиоксидантные системы глаза.// Пятый международный междисциплинарный конгресс «.Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2009 г. с. 244.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые в одних экспериментальных условиях проведено сравнительное исследование физико-химических свойств Ргхб из различных источников. Такое сравнение Ргхб является необходимым этапом в процессе создании лекарственного препарата на основе рекомбинантного Ргхб, так как фермент, для достижения максимального терапевтического эффекта, должен обладать достаточно высокой активностью и стабильностью. Между исследованными нами ферментами Ргхб наблюдается обратная корреляция по активности и термостабильности. По-видимому, иа сегодняшний день наиболее оптимальным Ргхб в качестве потенциального лекарственного препарата является Ргхб человека, т.к. он обладает достаточно высокой активностью и стабильностью. Однако помимо исследований in vitro, необходима проверка стабильности и активности различных Ргхб в экспериментах in vivo (на клеточных культурах и лабораторных животных).

Методами КД и ЯМР показано, что все изученные Ргхб близки как по вторичной, так и по третичной структуре. По-видимому, значительные отличия по активности и термостабильности между изученными белками связаны с нерегулярными участками структуры. На основании «пролинового правила», были проведены замены остатков Gly (21,30,115,184) на Pro в нерегулярных участках Ргхб человека, но это не привело к повышению термостабильности белка. Возможным направлением в повышении термостабильности Ргхб человека является сайт-направленный мутагенез, на основе теоретического сравнительного анализа структур Ргхб человека и крысы (наиболее термостабильного из исследованных белков), которые идентичны на 91.5 %.

Показано, что Ргхб человека может сохранять активность после лиофильной сушки, что может являться решением проблемы хранения лекарственного препарата на основе Ргхб.

Проведено исследование фосфолипазной активности различных Ргхб и экспериментально подтверждено для одного из Ргхб шпорцевой лягушки и дрозофилы (Xenl и DPx6005 соответственно) отсутствие активности фосфолипазы А2, предсказанное теоретически из аминокислотной последовательности. Помимо активности фосфолипазы А2, для Ргхб человека, дрозофилы DPx2540 и шпорцевой лягушки Хеп2 по-видимому обнаружена ранее неизвестная (предположительно — деметилазная) активность, которая может быть предметом дальнейших исследований.

Впервые получены гены и белки Ргхб шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Изучена динамика экспрессии двух генов ргхб в ходе развития головастика, а также экспрессия генов ргхб в различных органах взрослой лягушки. Ген хеп2 (Ьс054309) является наиболее активно экспреесируемой изоформой ргхб. Показана индукция гена хеп2 пероксидом водорода на ранних стадиях развития лягушки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шарапов, Марс Галиевич, Пущино

1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. (2000). Методы оценки свободно-радикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекоменднации. // С.-Пб.: «Фолиант». 104 стр.

2. Быстрова М.Ф., Буданова Е.Н., Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. (2007). Исследование четвертичной структуры 1-Cys пероксиредоксина крысы // Биофизика, том 52, стр. 436-442.

3. Дероум Э. (1992). Современные методы ЯМР для химических исследований. // М.: «Мир». 401 стр.

4. Новоселов В.И., Барышникова Л.М., Янин В.А., Амелина С.Е., Фесенко Е.Е. (2003). Влияние пероксиредоксина VI на заживление резаной раны у крыс. // Доклады Академии паук, том 393, стр. 412-414.

5. Новоселов В.И., Пешенко И.В., Новоселов С.В., Камзалов С.С., Быстрова М.Ф., Евдокимов В.А., Николаев Ю.В., Фесенко Е.Е. (1999). Протекторные свойства 28-кДа пероксиредоксина определяются его пероксидазной активностью.// Биофизика, том.44, стр. 568-570.

6. Akiba S., Dodia С., Chen X., Fisher А.В. (1998). Characterization of acidic Ca2+-independent phospholipase A2 of bovine lung. // Сотр. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. Vol.120, pp. 393-404.

7. Al-Chalabi A., Leigh P.N. (2000). Recent advances in amyotrophic lateral sclerosis.// Curr. Opin. Neurol. Vol. 13, pp.397-405.

8. Arnold F.H., Wintrode P.L., Miyazaki K. and Gershenson A. (2001). How enzymes adapt: lessons from directed evolution. // TRENDS in Biochemical Sciences No\.26, pp. 100-106.

9. Bhanot P., Schauer K., Coppens I., Nussenzweig V. (2005). A surface phospholipase is involved in the migration of Plasmodium sporozoites through cells. // J. Biol. Chem. Vol.280, pp. 6752-6760.

10. Bryk, R., Griffin, P. and Nathan, C. (2000). Peroxynitrite reductase activity of bacterial peroxiredoxins. // Nature, Vol.407, pp. 211-215.

11. Budanov, A.V., Sablina, A.A., Feinstein, E„ Koonin, E.V. and Chumakov, P.M. (2004). Regeneration of peroxiredoxins by p53-regulated sestrins, homologs of bacterial AhpD. // Science, Vol.304, pp 596-600.

12. Burdon R.H., Alliangana D. and Gill V. (1995). Hydrogen peroxide and the proliferation of BHK-21 cells. // Free Radic Res. Vol.23, pp. 471-486.

13. Carmody R.J., Cotter T.G. (2001). Signalling apoptosis a radical approach. // Redox Rep. Vol. 6, pp. 77-90.

14. Jacobson F.S., Morgan R.W., Christman M.F., Ames B.N. (1989). An alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium involved in the defense of DNA against oxidative damage. Purification and properties. // J. Biol. Chem., Vol.264, pp. 1488-1496.

15. Jaeger, T., Budde, H., Flohe, L., Menge, U., Singh, M., Trujillo, M. and Radi, R. (2004). Multiple thioredoxin-mediated routes to detoxify hydroperoxides in Mycobacterium tuberculosis. // Arch.Biochem. Biophys. Vol.423, pp.182—191.

16. Jaschke A., Mi H., Tropschug M. (1998). Human T cell cyclophilinl8 binds to thiol-specific antioxidant protein Aopl and stimulates its activity. // J. Mol. Biol. Vol.277, pp. 763-769.

17. Jeong W., Park S.J., Chang T.S., Lee D.Y., Rhee S.G. (2006). Molecular mechanism of the reduction of cysteine sulfinic acid of peroxiredoxin to cysteine by mammalian sulfiredoxin. // J. Biol.Chem.,Vol.281,pp. 14400-14407.

18. Jin D.Y., Chae H.Z., Rhee S.G., Jeang K.T. (1997). Regulatory role for a novel human thioredoxin peroxidase in NF-kappaB activation. // J. Biol. Chem. Vol.272, pp. 3095230961.

19. Kang S. W., Baines I. C., Rhee S. G. (1998). Characterization of a mammalian peroxiredoxin that contains one conserved cysteine. II J. Biol. Chem. Vol.273, pp. 63036311.

20. Kang S.W., Rhee S.G., Chang T.S., Jeong W., and Choi M.H. (2005). 2-Cys peroxiredoxin function in intracellular signal transduction: therapeutic implications. // Trends Mol. Med. Vol. 11, pp. 571-578.

21. Karihtala P., Mantyniemi A., Kang S.W., Kinnula V.L., Soini Y. (2003). Peroxiredoxins in breast carcinoma. // Clin. Cancer Res. Vol.9, pp. 3418-3424.

22. Karplus P.A., Hall* A. (2007). Peroxiredoxin Systems. Structural survey of the peroxiredoxins. // Subcellular Biochemestry, Vol.44, pp. 46-60.

23. Kawai S., Takeshita S., Okazaki M., Kikuno R., Kudo A., Amann E. (1994). Cloningand characterization of OSF-3; a new member of the MER5 family; expressed in mouse osteoblastic cells. // J.Biochem. (Tokyo), Vol.115, pp.641-643.

24. Kim H.S., Kang S.W., Rhee S.G., Clerch L.B. (2001). Rat lung peroxiredoxins I and II are differentially regulated during development and by hyperoxia. // Am. J. Physiol. Lung Cell Physiol. Vol.280, pp.1212-1217.

25. Kim H.S., Manevich Y., Feinsteine S.I., Pak J.H., Ho Y.S., Fisher A.B. (2003). Induction of 1-Cys Peroxiredoxin expression by oxidative stress in lung epithelial cells. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. Vol. 285, pp.363-369.

26. Maines M.D. (1997). The heme oxygenase system: a regulator of second messenger gases. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. Vol.37, pp. 517-554.

27. Maksimenko A.V. (2005). Experimental antioxidant biotherapy for protection of the vascular wall by modified forms of superoxide dismutase and catalase. // Curr. Pharm. Des. Vol.11, pp. 2007-2016.

28. Manevich Y., Feinstein S.I. and Fisher A.B. (2004). Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. UProc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.101, pp. 3780-3785.

29. McCord J.M., Fridovich I. (1988). "Superoxide dismutase: the first twenty years (19681988)". Free Radic. Biol Med. 5 (5-6): 363-369.

30. Mizohata E., Sakai H., Fusatomi E., Terada T., Murayama K., Shirouzu M., Yokohaya S. (2005). Crystal structure of an archaeal peroxiredoxin from the aerobic hyperthermophilic crenarchaeon Aeropyrum pernix Kl. // J. Mol. Biol., Vol. 354, pp. 317-329.

31. Park S.G., Cha M.K., Jeong W., Kim I.H. (2000). Distinct physiological functions of thiol peroxidase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae. //J. Biol. Chem., Vol.275, pp. 5723-5732.

32. Park S.H., Chung Y.M., Lee Y.S., Kim I.H., Kim J.S., Chae H.Z., Yoo Y.D. (2000). Antisense of human peroxiredoxin II enhances radiation-induced cell death. // Clin. Cancer Res. Vol.6, pp. 4915-4920.

33. Peshenko I. V., Shichi H. (2001). Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite. // Free Radic. Biol. Med. Vol.31, pp. 292-303.

34. Peterson T.M., Luckhart S. (2006). A mosquito 2-Cys peroxiredoxin protects against nitrosative and oxidative stresses associated with malaria parasite infection. // Free Radic. Biol. Med., Vol.40, pp. 1067-1082.

35. Power J. H., Nicholas T. E. (1999). Immunohistochemical localization and characterization of a rat Clara cell 26-kDa protein (CC26) with similarities to glutathione peroxidase and phospholipase A2. II Exp. Lung Res. Vol.25, pp. 379-392.

36. Schroder E., Littlechild J.A., Lebedev A.A., Errington N., Vagin A.A., Isupov M.N. (2000). Crystal structure of decameric 2-Cys peroxiredoxin from human erythrocytes at 1.7 A resolution. // Structure FoldDes Vol.8, pp. 605-615.

37. Schroder E., Willis A.C., and Ponting, C.P. (1998). Porcine natural-killer-enhancing factor-B: oligomerisation and identification as a calpain substrate in vitro. // Biochim. Biophy. Acta, Vol.1383, pp 279-291.

38. Seaver L.C., Imlay J.A. (2001). Alkyl hydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli. //J. Bacteriol., Vol.183, pp. 7173— 7181.

39. Shau H., Butterfield L.H., Chiu R., Kim A. (1994). Cloning and sequence analysis of candidate human natural killer-enhancing factor genes. // Immunogenetics Vol.40, pp. 129-134.

40. Yanagawa T., Iwasa S., Ishii T., Tabuchi K., Yusa H., Onizawa K., Omura K., Harada H., Suzuki H., Yoshida H. (2000). Peroxiredoxin I expression in oral cancer: a potential new tumor marker. // Cancer Lett, Vol.156, pp. 27-35.

41. Yano K., Komaki-Yasuda K., Kobayashi T., Takemae H., Kita K., Kano S., Kawazu S. (2005). Expression of mRNAs and proteins for peroxiredoxins in Plasmodium falciparum erythrocytic stage. // Parasitol. Int., Vol.54, pp. 35-41.

42. Yoo Y.D., Chung Y.M., Park J.K., Ahn C.M., Kim S.K., Kim H.J. (2002). Synergistic effect of peroxiredoxin II antisense on cisplatin-induced cell death. // Exp. Mol. Med., Vol.34, pp. 273-277.

43. Zhang P., Liu B., Kang S.W., Seo M.S., Rhee S.G., Obeid L.M. (1997). Thioredoxin peroxidase is a novel inhibitor of apoptosis with a mechanism distinct from that of Bcl-2. II J. Biol. Chem., Vol.272, pp. 30615-30618.

44. Zhou Y„ Kok K.H., Chun A.C., Wong C.M., Wu H.W., Lin M.C., Fung P.C., Kung H., Jin D.Y. (2000). Mouse peroxiredoxin V is a thioredoxin peroxidase that inhibits p53-induced apoptosis. // Biochem.Biophys. Res. Commun., Vol.268, pp. 921-927.